TD2 : Etude de la pharmacocinétique-toxicocinétique du paracétamol

Introduction
Du point de vue du toxicologue, le parcours d’un xénobiotique dans l’organisme peut se
schématiser selon quatre étapes majeures. La première correspond à l’absorption, c’est-à-dire
le passage du milieu extérieur vers le milieu intérieur. La seconde est la distribution du
composé dans les différents compartiments de l’organisme, les compartiments se traduisant
par un ou plusieurs sites de stockage, des organes ou des tissus cibles, et des sites de
biotransformation de la substance absorbée (3ème étape). Enfin, l’étape d’élimination consiste à
rejeter dans le milieu extérieur le xénobiotique préalablement absorbé.
La toxicocinétique couvre les phénomènes d’absorption, de distribution tissulaire, de
métabolisme et d’excrétion, c’est-à-dire qu’elle a pour principal objectif de déterminer la
quantité de substance toxique susceptible d’atteindre sa cible et de préciser sous quelle forme
(composé initial ou métabolites) elle y parvient. La toxicodynamie se préoccupe de
l’interaction du xénobiotique avec sa cible et de l’effet toxique que cela produit.
La pharmacocinétique : étude de la manière dont un médicament se comporte après son
introduction dans l’organisme
I) Pharmacocinétique du paracétamol
1) Absorption du paracétamol
Par voie orale
Par voie orale, le pic plasmatique du paracétamol est obtenu au bout de 15 minutes à 2 heures
après ingestion selon les formes pharmaceutiques :
- en 15 minutes pour les comprimés effervescents et les sirops
- en 1 à 2 heures pour les comprimés et poudres.
L’absorption est plus importante au niveau de l’intestin grêle que de l’estomac.
Par voie rectale
Par voie rectale, le pic plasmatique du paracétamol est moins élevé et est obtenu plus
tardivement que par voie orale. Les concentrations maximales sont enregistrées au bout de 2
heures après ingestion.
Par voie intraveineuse
Par voie intraveineuse, le pic plasmatique est atteint dès la fin de la perfusion soit au bout de
15 minutes. Les concentrations plasmatiques maximales obtenues seront jusqu’à 2 fois
supérieures à celles obtenues après la prise d’une même dose par voie orale.
Au bout d’1 heure, les formes orales et intraveineuses montrent des concentrations
plasmatiques identiques.
2) Distribution du paracétamol
Le paracétamol se répartit relativement uniformément dans les tissus (excepté dans les
graisses du fait de sa faible liposolubilité) et avec une concentration au niveau du foie et des
reins. Il traverse la barrière fœto-placentaire grâce à sa faible masse moléculaire et passe dans
le lait. Il est aussi retrouvé dans la salive.
Le paracétamol se lie peu aux protéines plasmatiques. Il diffuse rapidement à travers la
barrière hémato-encéphalique et ses concentrations dans le liquide céphalo-rachidien sont
proches des concentrations plasmatiques
3) Métabolisation du paracétamol

1
Le foie est le site essentiel de la métabolisation du paracétamol. Le foie est caractérisé par un
équipement enzymatique très important nécessaire à la biotransformation des médicaments.
Les microsomes hépatiques isolés des différents réticulums endoplasmiques lisses et rugueux
sont le siège de ces réactions enzymatiques. Ils assurent le processus de biotransformation des
xénobiotiques liposolubles en métabolites plus polaires, hydrosolubles qui seront alors plus
facilement éliminables par les émonctoires habituels (vésicule biliaire, rein, poumon, vessie),
ce qui diminue leur demi-vie d’élimination. Ces biotransformations sont assurées par deux
types de réactions enzymatiques : les réactions de fonctionnalisation et les réactions de
conjugaison. Elles agissent de façons indépendantes ou couplées.
La biotransformation du paracétamol est réalisée en deux principales étapes :
- la réaction de fonctionnalisation oxydative des CYP va le transformer en
hydroxyparacétamol,
- et la réaction de conjugaison va permettre le transfert d’un groupe fonctionnel polaire sulfate
ou glucuronide pour le rendre suffisamment hydrosoluble et susceptible d’être éliminé.
À doses thérapeutiques, 90 % du paracétamol sera ainsi transformé en métabolites non
toxiques : paracétamol-O-glucuronide et paracétamol-O-sulfate. Ces réactions sont catalysées
par des UDP-glucuronosyltransférases (UGTs) et des sulfotransférases.
Les UDP-glucuronosyltransférases (UGTs) permettent le transfert de l’acide
UDPglucuronique sur le N-hydroxyparacétamol pour obtenir un paracétamol-Oglucuronide.
Les sulfotransférases transfèrent par addition un groupement sulfate à partir du 3’-phospho
adénosine-5’-phosphosulfate (PAPS) sur le N-hydroxyparacétamol.
Légende :
Le groupe hydroxyl (1) de
l’hydroxyparacétamol peut être conjugué :
- à 1 groupement sulfate et produire du
paracétamol-O-sulfate (2)
Figure 1 : Les principaux métabolites issus de la
- à 1 groupement glucuronide et produire
métabolisation du paracétamol
du paracétamol-O-glucuronide (3)

Les 10 % restants seront oxydés par des monooxygénases à cytochrome P450, principalement
par les cytochromes P450 2E1, 1A2, 3A4, 2A6, et aboutiront à un métabolite réactif N-
acétyl-parabenzoquinone imine (NAPQI) très toxique pour le foie. La NAPQI est capable de
stimuler la réduction de l’oxygène par les cytochromes P450 entrainant la formation d’anion
superoxyde et de radicaux hydroxyles OH.potentiellement très toxiques pour les hépatocytes.
À doses thérapeutiques de paracétamol, ce métabolite cytotoxique est rapidement détoxifié en
se conjuguant au glutathion et devient un métabolite inactif éliminé par les urines conjugué à
l’acide mercapturique et à la cystéine.

2
 Figure 2 : Schéma récapitulatif de la métabolisation du paracétamol
4) Élimination du paracétamol
L’élimination du paracétamol se fait par voie rénale :
• 5% sous forme inchangée, • 90% sous forme de dérivés sulfo ou glucoconjugués, • 5% sous
forme de dérivés N-hydroxylés avec la cystéine ou l’acide mercapturique. La demi-vie
plasmatique est de 2,7 heures et la clairance corporelle totale est d’environ 18 l/h.La clairance
plasmatique totale représente le volume de plasma totalement épuré du médicament par unité
de temps.
II) Mécanismes d’hépatotoxicité du paracétamol
Le mécanisme d'hépatotoxicité du paracétamol a été analysé chez l'homme et chez l’animal.
Le paracétamol est largement converti en glucuro- et sulfoconjugués non toxiques puis
excrétés dans les urines. Une petite quantité de paracétamol est métabolisée par les
cytochromes P450 en produit intermédiaire toxique, la N-acétyl-p-benzoquinone imine. Ce
métabolite intermédiaire fortement électrophile est rapidement inactivé par conjugaison avec
le glutathion réduit. Lors d’un surdosage, les niveaux de glutathion sont faibles car
surconsommés et la voie est saturée par de fortes doses de paracétamol. L’intermédiaire
réactif, le NAPQI s'accumule et se lie aux protéines cellulaires hépatiques conduisant à des
lésions cellulaires provoquant l’apoptose, et aboutissant à une nécrose hépatocytaire
centrolobulaire.
D’autres mécanismes, souvent associés, sont à l’origine de la toxicité hépatique. En effet, la
forte présence de NAPQI provoque la dégradation des lipides membranaires à l’origine
d’altérations de la membrane des hépatocytes. Ces derniers perturbent également
l’homéostasie calcique responsable de l’activation d’enzymes cytolytiques.
Concernant le mécanisme lésionnel retardé du paracétamol, cela est peu documenté à ce jour.
La synthèse de cytokines et la présence d’espèces réactives de l’oxygène, activent les cellules
inflammatoires in situ présentes, les cellules de Küpfer (macrophages hépatiques) et
macrophages, jouant certainement un rôle essentiel dans le processus d’apoptose. Une
hypothèse soulèverait un lien entre la toxicité hépatique retardée du paracétamol et la
production d’Interleukine 1(IL-1) et de Facteur de Nécrose Tumorale α (TNFα).
Les facteurs qui augmentent le métabolisme du paracétamol par le système du cytochrome
P450 (certains médicaments, l'éthylisme chronique) ou qui diminuent la disponibilité du

3
glutathion (jeûne, malnutrition) peuvent prédisposer à la toxicité du paracétamol. Les facteurs
qui influent sur la toxicité en aval des intermédiaires métaboliques du paracétamol peuvent
aussi influer sur la toxicité. Ces facteurs sont importants dans la conception de thérapies pour
l'hépatotoxicité du paracétamol.

Légende :
A : Induction liée à :
- l’augmentation doses de
paracétamol
- à l’éthylisme chronique
- au tabagisme
- à certains médicaments
(antiépileptique, anti rétroviraux,
anticoagulants)
B : Expression diminuée par le
jeûne
C : Expression inhibée par un
déficit en glutathion, le jeûne et
l’éthylisme chronique
D : Apport de cystéine :
indispensable à la néosynthèse du
glutathion

Figure 3 : Mécanisme cellulaire de l’intoxication au

paracétamol
III) Biomarqueurs d’hépatotoxicité
Chez l’Homme, la dose toxique de paracétamol est de 5 à 10 g chez l’adulte et de 100 mg/kg
chez l’enfant, mais il faut noter que les cas graves ne surviennent habituellement que pour des
doses allant de 10 à 15 g en une prise chez l’adulte. Chez l’Animal, les doses toxiques sont
plus faibles. En pratique, les doses ingérées lors d’intoxications animales oscillent le plus
souvent entre 125 et 1000 mg en une ou plusieurs fois ce qui correspond aux dosages des
présentations à usage humain du commerce.
Les différents cas d’intoxications accidentels ou expérimentaux montrent que les
présentations commercialisées pour l’homme et administrées aux animaux aboutissent
souvent à une intoxication aiguë et parfois à la mort, en particulier dans l’espèce féline.
1) Alanine aminotransférase (ALAT) et aspartateaminotransférase (ASAT)
L’ALAT et l’ASAT sont les principaux marqueurs de la souffrance hépatocellulaire. Lors
d’une intoxication aigüe au paracétamol, il y a rupture des membranes plasmiques et ALAT et
ASAT se retrouvent dans le flot sanguin, ce qui explique l’augmentation de leurs
concentrations sériques.
2) Bilirubinémie totale

4
 Ce produit de dégradation de l’hémoglobine est un marqueur de l’atteinte cholestatique. Dans
le foie, l’UDP-glucuronyl-transférase conjugue la bilirubine libre insoluble à l’acide
glucuronique pour former la bilirubine conjuguée excrétée vers la bile.
3) Phosphatases alcalines
L’élévation de ce biomarqueur traduit une atteinte cholestatique par libération de l’enzyme
du tissu hépatocytaire vers le compartiment plasmatique.
4) Gamma-glutamyl-transférase (γ-GT)
C’est une enzyme impliquée dans la catalyse du transfert de groupement γ-glutamyl aux
acides aminés et au glutathion, et dans l’hydrolyse de ce dernier. C’est un marqueur
hautement sensible de l’atteinte hépatobiliaire avec une spécificité modérée.
5) Lactate déshydrogénase (LDH)
La lactate déshydrogénase est une enzyme cytoplasmique ubiquitaire catalysant la
transformation de pyruvate en lactate. Son dosage est bien moins spécifique que celui des
transaminases lors d’une atteinte hépatique.
6) Sorbitol déhydrogénase (SDH)
Cette enzyme catalyse la réaction d’oxydoréduction du sorbitol, du fructose et du NADH.
C’est un indicateur spécifique et peu sensible d’atteinte hépatocellulaire touchant l’espace
périportal. Elle possède avec les ALAT et la GLDH la puissance diagnostique la plus élevée.
7) Glutamate déhydrogénase (GLDH)
Présente dans les mitochondries, cette enzyme intervient dans la déamination oxydative
du glutamate. C’est un biomarqueur de l’atteinte hépatocellulaire plus spécifique que les
transaminases, témoignant de l’atteinte centrolobulaire.
8) Alpha-glutathion-S-transférase (α-GST)
C’est une enzyme de phase II qui catalyse la conjugaison du glutathion aux métabolites
réactifs, facilitant leur excrétion urinaire. Elle est de localisation centrolobulaire et est plus
sensible que les transaminases pour les atteintes toxiques de cette localisation.
9) Dosage sanguin du paracétamol (Paracétamolémie) ou de ses métabolites (APAP-Sul :
Conjugué sulfate du paracétamol, APAP-Glu : Conjugué glucuronide du paracétamol, APAP-
GSH : Conjugué glutathion du paracétamol, APAP-Cys : Conjugué cystéine du paracétamol,
APAP-Mer : Conjugué mercapturique du paracétamol)
La paracétamolémie sera réalisée seulement à partir de la quatrième heure après ingestion
ce qui correspond au délai nécessaire pour que le paracétamol soit entièrement distribué dans
l’organisme.
La paracétamolémie déterminée dans les premières 24 heures suivant l'ingestion est
judicieuse et permet une évaluation du risque d'hépatotoxicité encouru grâce au nomogramme
de Prescott.
Nomogramme de Prescott
Le nomogramme représente un graphique donnant en abscisses le temps écoulé après
ingestion d'une dose inconnue de paracétamol et en ordonnées la concentration plasmatique
en paracétamol, et partagé diagonalement par deux tracés parallèles en deux zones de risque
de toxicité : la zone supérieure où l'intoxication est possible et la zone inférieure où le risque
de toxicité est nul.

5
- Pour des concentrations au-dessus du tracé supérieur (rouge) :
 supérieures à 200 mg/L à la 4ème heure ou
 supérieures à 30 mg/L à la 15ème heure
Le risque de lésions hépatiques est probable.
- Pour des concentrations en-dessous du tracé inférieur (vert) :
 Inférieures à 150 mg/L à la 4ème heure ou
 Inférieures à 25 mg/L à la 15ème heure
Le risque d’atteinte hépatique est peu probable.
Le risque serait considéré comme incertain entre les deux courbes. Figure 4 : Diagramme de prescott
10) Micro-ARN 122
Les micro-ARN peuvent réguler l’expression des gènes apres exposition à certains facteurs
environnementaux ou toxiques.
11) HMGB-1 (High Mobility Group Box 1)
C’est une protéine liée à la chromatine qui est passivement relarguée en cas de nécrose
hépatocytaire et qui participe à l’activation de système immunitaire comme c’est le cas dans
certaines hépatites idiosyncrasiques. Elle augmente précocement en cas de lésion hépatique,
avant l’ALAT.
12) Cytokératine 18
C’est une protéine du cytosquelette très abondante au niveau hépatique mais non spécifique.
Elle est relarguée en cas de nécrose hépatocytaire. Son augmentation est précoce en cas de
toxicité hépatique, avant celle des ALAT.
IV) Étude de quelques biomarqueurs d’hepatotoxicité suite à une intoxication aiguë au
paracétamol chez le rat
1) Protocole expérimentale
12 rats mâles Wistarpèsant entre 150 et 200 g vont être divisé en deux groupes de six rats
chacun. Les rats du groupe I vont recevoir de l’eau distillée de l'eau et vont servir du témoin.
Les animaux du groupe II vont servir de témoins intoxiqués au paracétamol et vont recevoir
une unique administration orale de paracétamol (3 g/kg). Après 48 heures d'administration de
paracétamol, les rats vont être anesthésié avec de l'éther diéthylique. Le sang de chaque rat
sera prélevé par ponction du plexus rétro-orbitaire dans un tube à centrifuger sec stérilisé pour
les marqueurs biochimiques de lésions hépatiques. Après le prélèvement sanguin, les animaux
de deux groupes seront sacrifiés par décapitation et des spécimens de foie seront récoltés pour
examen histopathologique. Le sérum a été séparé par centrifugation à 3000 tr/ min pendant
pendant 10 min et analysés pour divers paramètres biochimiques. Les sérums ont été
conservés au congélateur à -80 °C avant d'être analysés.
2) Etude des biomarqueurs biochimiques
Dosage sanguin des transaminases (ASAT/ALAT)
La concentration de ces enzymes est exprimée en unité internationale par litre de substrat
(UI/L). 1UI correspond à la quantité d’enzymes qui transforment 1μmol de substrat/min.
*Principe
Aspartate aminotransférase (ASAT)
L’aspartate aminotransférase (ASAT) appelée aussi le glutamate oxaloacétate transaminase
(GOT) catalyse le transfert d'un groupe aminé à partir de l'aspartate à l’αcétoglutarate formant

6
le glutamate et l'oxaloacétate. Ce dernier est réduit en malate par la malate déshydrogénase
(MDH) et le NADH,H+ (Nicotinamide adénine dinucléotide) selon les réactions suivantes:

Le taux de diminution de la concentration en NADH,H+ mesuré par spectrophotométrie à 340

nm, est proportionnel à l’activité catalytique de ASAT.
Alanine amino transférase (ALAT)
L’alanine amino transférase (ALAT) appelée aussi le glutamate-pyruvate transaminase (GPT)
catalyse le transfert d'un groupe aminé à partir de l'alanine à l’αcétoglutarate formant le
glutamate et le pyruvate. Ce dernier est réduit en lactate par la lactate déshydrogénase (LDH)
et le NADH,H+ selon les réactions suivantes:

Le taux de la diminution de la concentration en NADH,H+ mesuré par spectrophotométrie à

340 nm, est proportionnel à l’activité catalytique de l'ALAT.
* Mode opératoire
La récolte du sang doit se faire dans des tubes héparines. Ces derniers vont être soumis à une
centrifugation à 4000 g/5 min. Le sérum sera ensuite récupéré et utilisé pour le dosage des
transaminases (ASAT et ALAT) grâce à des kits enzymatiques BIOLABO en utilisant 1000
µL du réactif pour 100 µl du sérum. Après agitation, l’absorbance à 340 nm a été mesurée en
utilisant un spectrophotomètre.
3) Etude des Biomarqueurs histopathologiques
Les coupes histologiques sont réalisées au niveau de l’organe cible de la toxicité par le
paracétamol : foie. Pour ce faire, les tissus hépatiques d'environ 5 mm d'épaisseur vont être
fixés dans une solution de formol à 10 % pendant 48 h et ensuite suite placés dans des
cassettes en plastique en vue de déshydratation avec des séquences croissantes de
concentrations d'alcool de 50 % (2 h), 70 % (une nuit), 90 % (2 h) et 100 % (2h durant toute
une nuit). Les échantillons subiront ensuite les étapes d’imprégnation par du xylène et
d’inclusion dans de la paraffine. Les échantillons seront coupés en 5 mm à 7 mm d'épaisseur
et colorés avec un colorant hématoxyline et éosine pour l'observation microscopique des
changements histopathologiques.

Exercices d’application

Exercice 1 : Définir les termes suivants : toxicocinétique, pharmacocinétique, toxicodynamie,

réactions de fonctionnalisation, réactions de conjugaison, réactions de biotransformation,
cytochromes P450 cytochromes P450 est la principale actrice du
métabolisme du médicament dans l'organisme

Exercice 2 : Compléter la légende de la figure suivante et lui donner un titre

7
 ………………
………………

Figure 5:

………………

Exercice 3 : Compléter la légende de la figure suivante

……………… ………………

Figure 6: Mécanisme de la toxicité de l'acétaminophène (APAP)

Exercice 4 : Les documents ci-dessous présentent les résultats du dosage des activités des
enzymes hépatiques dans le sérum, des biomarqueurs du stress oxydant (MDA, et SOD)
mesuré dans le foie, ainsi que les résultats des biomarqueurs histopathologiques chez des rats
mâles témoins et des rats ayant subi une intoxication aigue de 48heures au paracétamol (3
g/kg) par voie orale.

8
 AST : Aspartate aminotransférase,
ALT : alanine aminotransférase,
ALP : phosphatase alcaline.
Les astérisques indiquent une
différence statistiquement
significative par rapport au groupe
du site de référence: *P < 0,05

Figure 7: Activités des enzymes hépatiques dans le sérum de rats témoins et traités

Tableau : Activités du MDA et de SOD le foie de rats témoins et traités

Groupes SOD (mmol/min/mg tissue) MDA (μmol/g protéines)
Témoins 76,17±5,74 2,12±0,30
Traités 27,83±24,18* 6,81±0.37*
MDA=Malondialdehyde, SOD=superoxide dismutase ;Les astérisques indiquent une
différence statistiquement significative par rapport au groupe du site de référence: *P < 0,05

Figure 8: Photomicrographies histopathologiques (×400) de foies de rats colorés à l'hématoxyline et à l'éosine.

(a) Architecture normale du foie de rat, (b) Nécrose et dégénérescence graisseuse hépatocellulaire (noyaux
excentriques) dans le foie intoxiqué par l'acétaminophène et congestion de la veine porte et infiltration péri-
portale de cellules inflammatoires
1) Définir les termes suivants : aspartate aminotransférase, alanine aminotransférase,
phosphatase alcaline, malondialdehyde Le MDA ou Malondialdéhyde
plasmatique est un marqueur de l'oxydation des lipides , superoxyde
dismutase La SOD ou superoxyde dismutase est une enzyme antioxydante que l'on
trouve naturellement dans tous les organismes vivants.
2) Donner le protocole expérimental permettant l’étude de ces biomarqueurs
3) Analyser et interpréter les résultats obtenus
4) La figure ci-dessous indique toutes les étapes nécessaires pour l’étude des biomarqueurs
histopathologiques. Compléter sa légende et donner les buts des étapes 2, 3, 4 et 5

9
Figure 9:

10