Purification des protéines

La purification d'une protéine est un processus qui prend plusieurs étapes: extraction initiale, précipitation
différentielle, dialyse, chromatographies de divers types, etc
Principales étapes d'une purification
Typiquement, on broie tout d'abord le matériel d'où on veut extraire la protéine (tissu animal, partie de plantes,
bactéries, etc). Divers appareils ("Waring Blender", appareil Potter-Eveljhem, "Polytron", etc.) peuvent être
employés à cette fin. Cette homogénéisation se fait dans un tampon de composition appropriée. Cette étape est
évidemment la première.
L'homogénat ainsi obtenu est ensuite clarifié, le plus souvent par centrifugation, pour éliminer les grosses
particules peu ou mal broyées ou encore pour obtenir la fraction cellulaire contenant la protéine recherchée. Si
la protéine est justement dans un compartiment cellulaire, on utilise généralement un détergent doux (Triton,
Tween, etc., quelquefois déoxycholate) pour la libérer en dissolvant les membranes de ce compartiment.
L'emploi de détergent doit souvent être fait de façon contrôlée car ils peuvent briser les lysosomes, ce qui
libèrent des enzymes hydrolytiques (protéases, nucléases, etc) qui peuvent attaquer et détruire les protéines ou
autres molécules qu'on veut isoler. Des précautions particulières doivent être prises si on travaille avec des
protéines sensibles à la dégradation ou peu nombreuses. Certains tissus comme le pancréas et de foie sont
reconnus pour contenir de grandes quantités de ces enzymes, ce qui pose tout un défi quand on travaille avec
ces tissus. Une solution fréquente à ce problème est l'inclusion dans les solutions d'inhibiteurs de protéases qui
sont soit physiologiques (inhibiteur de trypsine, antipaïne. leupeptine...) ou artificiels (E64, PMSF...). Pour
maximiser leur action, on les emploie souvent en mélange ("cocktails") à large spectre d'action.
Ensuite on utilise diverses techniques pour séparer la protéine recherchée de toutes les autres présentes.
Habituellement les premières étapes sont des techniques peu spécifiques mais bien adaptées à la manipulation
de gros volumes. Ensuite, au fur et à mesure des étapes, on utilise des techniques de plus en plus spécifiques qui
sont souvent applicables à des préparations de volume réduit.
Une des méthodes se prêtant le mieux à de gros volumes est la précipitation différentielle au sulfate
d'ammonium. C'est pourquoi on l'utilise très souvent immédiatement après l'homogénéisation pour se
débarrasser du gros des contaminants.
Les chromatographies d'échange ionique ou les chromatographies d`affinité, applicables à de bons volumes
d'échantillon mais ayant un assez bon pouvoir de séparation, constituent de bonnes méthodes intermédiaires.
En finale, on utilise souvent le tamisage moléculaire ou l'isofocalisation qui permettent de raffiner la pureté,
mais nécessitent de très petits volumes de protéines concentrées.
Souvent, entre ces étapes, il faut éliminer les sels ou produits utilisés dans ces chromatographies. On utilise
alors une dialyse ou une ultrafiltration. Si on a besoin de concentrer la préparation, on la lyophilise. Si on veut
éviter ces procédures, on doit choisir des méthodes qui ne sont pas affectées négativement par ces produits.
Dosage des protéines et dosage de l'activité des protéines
Toutes ces étapes doivent être suivies de près pour vérifier si les techniques fonctionnent bien. Pour cela, il est
très courant de doser la protéine à purifier après chaque étape. Il faut donc posséder une méthode de dosage
(enzymatique, immunologique, biologique, etc.) pour suivre le processus. On mesure aussi la quantité totale de
protéines. Cette dernière valeur servira à calculer l'activité spécifique (voir tableau de purification)
Dans le cas où il s'agit de la première fois que la protéine est isolée, il faudra développer la méthode de dosage
avant même de développer la méthode de purification.
Tableau de purification et critères de pureté
Durant toutes ces étapes, il est essentiel d'évaluer les deux facteurs clef, pureté et rendement. Le rendement (la
quantité de protéine obtenue) peut facilement être mesuré par dosage enzymatique, RIA, etc. Un tableau de
purification (voir section "calculs") est aussi un outil très utile à cette fin. Si on s'aperçoit qu'une des étapes de
purification provoque une perte substantielle d'activité ou de quantité de la protéine, on doit remettre en
question son utilité ou la qualité de son exécution. L'activité spécifique est une mesure quantitative de la pureté
de la préparation. Encore ici, si on s'aperçoit qu'une étape ne permet pas l'augmentation de la pureté, il faut
alors s'interroger sur sa pertinence. Pour être en mesure de calculer le rendement et la purification, il ne faut pas
oublier de mesurer le volume total de la fraction obtenue après chaque étape et d'en prélever des échantillons
qui permettront de doser les protéines totales et la quantité de la protéine qu'on cherche à isoler.
La pureté d'une préparation de protéine peut aussi être évaluée selon des critères qualitatifs. Ainsi elle peut être
facilement visualisée qualitativement par électrophorèse à haute résolution ou focalisation isoélectrique. Si on
n'aperçoit qu'une seule bande protéique, on peut conclure que la préparation ne contient qu'une protéine. Cette
évaluation qualitative peut cependant être faussée si la protéine est contaminée par une ou plusieurs autres de
même mobilité dans les conditions d'électrophorèse ou de focalisation. Ces techniques permettent aussi de
suivre la purification et de voir si le nombre de protéines contaminantes diminue au fur et à mesure du
processus pour finir, idéalement, par une seule espèce protéique.
MÉTHODOLOGIE ET APPAREILLAGE
Durant toutes ces étapes, il faut évidemment éviter de dénaturer la protéine qu'on veut isoler. Il faut donc
utiliser des milieux dont les caractéristiques sont compatibles avec la stabilité des protéines (pH, force ionique,
osmolarité, sels, antioxydants, etc.). Pour cela on fabrique certains milieux plus ou moins "physiologiques",
comme le PBS ou le salin, qui possèdent quelques-unes de ces propriétés. Ainsi, le salin (NaCl 150 mM ou 0.85
%) a une osmolarité presque physiologique de 300 mOs. On utilise souvent un tampon destiné à maintenir le
pH (généralement aux alentours de 7.4). Le PBS ("phosphate buffered saline") contient un tampon phosphate
pH 7.4 et l'osmolarité de la somme de toutes ses composantes est de 315 mOs. Les millieux physiologiques sont
discutés dans la section "solutions physiologiques" du SIITUB.
Pour maintenir le pH à un niveau adéquat on inclut généralement un produit tampon dans les solutions. Le
phosphate (en mélange mono- et dibasique) est utilisé dans le PBS. Le Tris (trishydroxy-méthyl-
aminométhane) est très fréquemment utilisé en raison de son coût peu élevé, même s'il est peu efficace à pH 7.4
et inhibe certaines réactions physiologiques. L'hepes (hydroxyéthyl-pipérazine-éthane-sulfate) est aussi souvent
employé. Les qualités et défauts des principaux produits utilisés pour tamponner le pH dans les solutions
physiologiques sont discutés dans la section "pH métrie" du SIITUB.
Il faut aussi éviter de dénaturer les protéines en les exposant à l'air ou en les faisant mousser, ce qui cause une
dénaturation et favorise l'oxydation. C'est particulièrement le cas de l'oxydation de la fonction thiol des
cystéines en cystines, i.e. formation d'un lien disulfure. Les protéines cytoplasmiques sont particulièrement
sensibles car leur milieu naturel, le cytosol, est légèrement réducteur. Elles supportent donc mal leur
solubilisation dans le milieu ambiant qui est oxydant. L'emploi d'agents antioxydants comme le ß-mercapto-
éthanol ou un des réactifs de Cleland, dithiothréitol ou dithiothréitréol, est souvent recommandé pour protéger
ces protéines. Les protéines des compartiments extracellulaires (sang, liquide céphalo-rachidien, etc.) sont
beaucoup moins susceptibles à ce problème car ce sont des milieux légèrement oxydants. Les protéines de ces
compartiments ne contiennent pas ou très peu de thiols libres mais plutôt des liens disulfures.
Quand on travaille avec des protéines en quantités très faibles, il est important d'éviter de contaminer la
préparation avec des protéases. Les sources de protéases peuvent être endogènes, présentes dans la préparation
même, par exemple dans les lysosomes qui sont brisés lors du broyage des cellules ou par la présence de
détergents. Il y a également des sources exogènes, venant de l'extérieur, comme les mains, la salive, etc.
Conservation et rangement des protéines
Les protéines purifiées sont souvent peu stables et doivent généralement être conservées dans des conditions les
protégeant de la dégradation. La conservation à basse température est de rigueur. Certaines protéines sont
beaucoup plus exigeantes que d'autres et doivent être gardées à -80°C, cependant beaucoup se conservent aux
alentours de -20°C. Si les protéines sont stables sous forme sèche (en poudre), c'est la meilleure façon de les
conserver. Il est possible aussi de garder des protéines qui se dénaturent durant la congélation dans une solution
de glycérol. Cette méthode a l'avantage que le glycérol ne dénature pratiquement jamais les protéines et ne gèle
pas aux températures de l'ordre de -20°C. Certaines enzymes peuvent aussi être conservées dans une suspension
de cristaux de sulfate d'ammonium. Ces cristaux semblent stabiliser certaines protéines. Il convient aussi
d'éviter de répéter des cycles de congélation et de décongélation. La façon la plus commune d'éviter ce
problème est de congeler la préparation en petites fractions qui pourront être décongelées une à la fois. Le
rangement dans des solutions de glycérol ou des suspensions de sulfate d'ammonium permet aussi d'éviter ce
problème puisqu'elles restent liquides à -20°C; mais il faudra probablement se débarrasser de ce glycérol ou de
ce sulfate d'ammonium pour travailler avec ces protéines
Durant toutes ces étapes, il faut évidemment éviter de dénaturer la protéine qu'on veut isoler. Il faut donc
utiliser des milieux dont les caractéristiques sont compatibles avec la stabilité des protéines (pH, force ionique,
osmolarité, antioxydant, etc.). Pour cela on fabrique certains milieux plus ou moins "physiologiques", comme le
PBS ou le salin, qui possèdent quelques-unes de ces propriétés. Pour maintenir le pH à un niveau adéquat on
inclut généralement un produit tampon dans les solutions. Il faut aussi éviter de dénaturer les protéines en les
exposant à l'air ou en les faisant mousser, ce qui cause une dénaturation et favorise l'oxydation, particulièrement
des cystéines en cystine (i.e. formation d'un lien disulfure). Les protéines cytoplasmiques sont particulièrement
sensibles car leur milieu naturel, le cytosol, est légèrement réducteur. Elles supportent donc mal une
solubilisation dans le milieu ambiant qui est oxydant. Une oxydation peut non seulement inactiver ou dénaturer
les protéines, mais aussi causer leur agrégation si la cystéine d'une protéine forme un lien disulfure avec celle
d'une autre protéine. L'emploi d'agents antioxydant comme le ß-mercapto-éthanol ou un des réactifs de Cleland
(dithiothréitol ou dithiotréitréol) est recommandé pour protéger ces protéines particulièrement sensibles. Ces
deux derniers remplacent de plus en plus souvent le ß-mercapto-éthanol, car ils sont beaucoup moins
"odorants".
La présence d'EDTA, pour chelater les ions métalliques, peut être utile car ces derniers accélèrent les réactions
d'oxydation des protéines. Le travail à basse température,"sur glace", ralentit aussi les processus de
dénaturation. Les opérations d'homogénéisation mécanique et de centrifugation sont particulièrement à
surveiller, car elles causent souvent une surchauffe de l'extrait.
Quand on isole ou on travaille avec de faibles quantités de protéines, il est important d'éviter de contaminer la
préparation avec des protéases. Les sources de protéases peuvent être endogènes, présentes dans la préparation
même, par exemple dans les lysosomes} qui sont brisés lors du broyage des cellules. Certains tissus comme le
pancréas en contiennent de grandes quantités. Elles peuvent aussi être exogènes, provenant de l'extérieur,
comme les mains, la salive, etc. Il existe de nombreuses préparations commerciales d'inhibiteurs ayant des
spécificités diverses par rapport au type de protéase. Ces inhibiteurs peuvent être des produits chimiques
simples comme l'EDTA qui bloque les métalloprotéases. On retrouve aussi des produits chimiques spécialisés,
comme le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) qui inhibe les protéases à sérine. Des inhibiteurs
biologiques sont aussi employés, comme la pepstatine, la a2-macroglobuline, etc. On peut même se procurer des
mélanges contenant un "cocktail" de divers inhibiteurs.
CALCULS
Tableau de purification
On exprime la pureté d'une préparation de protéines en parlant de son activité spécifique. L'activité est la
quantité de la protéine exprimée non pas en termes de poids mais de capacité catalytique ou biologique.
L'activité spécifique est l'activité par rapport à la quantité totale de l'ensemble des protéines dans la préparation.
Elle est généralement exprimée en unités (enzymatique ou autre) par poids de protéines totales (e.g. 12.34
U/mg de protéines). Plus l'activité spécifique est élevée, plus la protéine est pure. Il est fréquent d'obtenir des
facteurs de purifications de l'ordre de 5000 fois et des rendements de l'ordre de 5%.
La concentration des protéines totales est généralement obtenue en dosant les protéines totales d'échantillons
récoltés lors des différentes fractions obtenues lors de la purification. On fait de même pour la protéine
spécifiquement isolée: on mesure la quantité de cette protéine, pas dosage enzymatique s'il s'agit d'une enzyme.
Si la protéine n'a aucune activité enzymatique, on peut recourir à des bio-dosages, des Eliza, RIA, etc. Pour
connaitre la quantité totale de protéines (totales ou d'intérêt) il faut également connaitre le volume de la fraction
en question: [protéines dans la fraction] * volume de fraction (par exemple mg/mL * mL).
Il est courant de résumer les étapes de purification des protéines par un tableau de purification. Un tableau de

Étape Protéines Activité Activité spécifique Facteur de Rendement

totales totale purification
(mg) (U/mg protéines) (%)
(U)
Homogénat initial 600 6000 10.0 1 100
Surnageant 150 3750 25.0 2.5 63
Fraction 20-50% sat. (NH4)2SO4 40 2500 62.5 6.3 42
Chromatographie d'échange
8 2000 250.0 25.0 33
ionique
purification a l'allure suivante:
Ce tableau sert à montrer le rôle et l'efficacité de chaque étape dans le processus de purification. Il fait appel à
des notions et à des termes précis. Le facteur de purification est le nombre de fois qu'on a pu concentrer
l'activité spécifique (par rapport à la première étape) durant chacune des autres étapes de la procédure.
Normalement cette valeur est de plus en plus élevée au fur et à mesure des étapes. En effet la purification a
justement pour but d'obtenir une protéine de plus en plus pure, ayant donc une préparation dont l'activité
spécifique de plus en plus élevée. Le rendement de la purification est la proportion, en %, de la quantité de la
protéine purifiée qui reste par rapport à la quantité initiale. Le rendement diminue à chaque étape puisqu'il est
inévitable qu'on ait des pertes de matériel à chacune. Une purification est donc un "compromis" entre le désir
d'obtenir une protéine la plus pure possible (facteur de purification élevé) en quantité maximale (rendement
élevé). En effet, chaque étape supplémentaire, qui permet d'augmenter la pureté, cause des pertes de matériel,
donc diminue le rendement. Au cours d'une purification typique le facteur de purification augmente au fur et à
mesure des étapes tandis que, parallèlement, le rendement diminue.
Pour construire un tel tableau, on dose à chaque étape de purification la quantité de protéines totales et l'activité
volumique de la protéine en question. Généralement il s'agit d'une enzyme et son activité est exprimée en unités
enzymatiques. D'autres unités peuvent servir à définir des protéines sans activité enzymatique. Sachant le
volume de chaque fraction, la concentration des protéines totales et l'activité volumique, il devient facile de
construire le tableau de purification.
On peut obtenir les valeurs du tableau précédent avec les données suivantes. Pour chacune des fractions qu'on a
obtenues lors de la purification, on a mesuré le volume et prélevé des aliquotes pour doser les protéines totales
et l'activité de la protéine qu'on voulait isoler. Par exemple, l'homogénat du tableau a un volume de 150 mL et
contient 4 mg de protéines/mL et 40 U d'enzyme/mL. Cela permet d'obtenir la quantité de protéines totale (150
mL x 4 mg/mL = 600 mg de protéines totales), l'activité totale (40 U/mL x 150 mL = 6000 U) et l'activité
spécifique (6000 U ÷ 600 mg = 10 U/mg). De la même façon on obtient les valeurs des autres fractions. La
purification et le rendement se déduisent ensuite facilement. Ainsi pour le surnageant, on peut calculer la
purification (25 U/mg ÷ 10 U/mg = 2.5X) et le rendement (3750 U ÷ 6000 U = 62.5%).
Les étapes de purification vont faire appel à des techniques chromatographiques : (bio) affinité (AC),
échange d'ions (IEXC), interaction hydrophobe (HIC), exclusion-diffusion = gel filtration (GFC). La lecture
de ce paragraphe implique des connaissances de base concernant ces différentes chromatographies. Elles sont
détaillées dans des paragraphes dédiés.
1. Stratégie idéale de purification
1.1 Description générale
Dans l'idéal, il s'agirait de pratiquer une chromatographie avec une phase stationnaire et des conditions de
phase mobile qui retiendraient la seule protéine d'intérêt avec élution de toutes les autres protéines. Il suffit
de déclencher, dans un 2° temps, la sortie de la protéine d'intérêt. Pour cela, les chromatographies d'affinité
biospécifiques (AC) sont presque parfaites (pas tout à fait malheureusement, voir la suite ...).
Les étiquettes de type poly-histidinyls (his6) ou GST ajoutées en Nt ou Ct des protéines à purifier (on parle de
protéines de fusion) grâce aux technologies génétiques permettent de mettre en œuvre de façon très
systématique cette "stratégie idéale". A défaut d'étiquette, la "stratégie idéale" est possible si on peut mettre en
œuvre une chromatographie d'affinité traditionnelle avec un ligand judicieux à conjuguer au support de
chromatographie (voir le paragraphe dédié AC).
1.2 Exemples d'étiquettes de purification
Méthode d'élution de
Étiquette (Tag) Motif de liaison spécifique la POI étiquetée
retenue
His6-étiquette (parfois jusqu'à His10)
La plus célèbre des étiquettes de purification. Petite
étiquette placée en Nt ou Ct qui ne perturbe Compétiteur
généralement quasiment pas les repliements natifs imidazole (250-500
...Utilisable pour purification de protéines non Ni2+ chélaté (ou Cu2+)
mM) ou abaissement
natives en corps d'inclusions. Voir paragraphe du pH vers ~pH 5
dédié complémentaire ci-après. On utilise
l'acronyme IMAC, Ion Metal Affinity
Chromatography.
Glutathione S-transferase (GST). Étiquette de Glutathion immobilisé Glutathion (réduit)
nature protéique à 220 aminoacides ! C'est gros. (GSH) (10-20 mM)
Compétiteur maltose
Maltose-binding protein (MBP). Une grosse
Amylose (10 mM). C'est pas
protéine, donc une très grosse étiquette.
cher !
Compétiteur
Strep-tag () / StrepII-tag Strep-TactinTM (comme si
Desthiobiotin (2.5
de la streptavidine était
Petite étiquette assez inerte pour les repliements mM) puis
immobilisée sur support
natifs de la protéine d'intérêt. se comporte comme régénération du
pour retenir de la biotine (le
de la biotine pour l'avidine. support à la
Strep-tag)
compétition HABA
 1.3 Raffinage (polishing)
Souvent (tout dépend de l'état de pureté que l'on veut atteindre), la purification par bioaffinité devra être
suivie d'un raffinage (polishing). C'est par exemple le cas si on souhaite une protéine très pure après une
étape de type affinité IMAC (l'IMAC utilise l'étiquette 6-hitidinyls et la chélation sur support Ni2+ chélaté
...voir le paragraphe dédié) qui ne conduit pas à des puretés parfaites (voir paragraphe dédié).
Pour le raffinage, on met classiquement en œuvre une chromatographie d'échange d'ions (IEXC, élution en
gradient de force ionique) puis une exclusion-diffusion (GFC, gel filtration). La gel filtration est très
intéressante pour séparer différentes formes oligomériques par exemple.
2. Stratégie pas par pas sans bioaffinité
Il est très classique de débuter par une étape de précipitation fractionnée, souvent au sulfate d'ammonium
(pas forcément, voir le chapitre dédié) qui peut présenter l'avantage de concentrer l'échantillon protéique à
purifier. Si on souhaite purifier par une IEXC à la suite, il faudra éliminer le sulfate d'ammonium. Ce ne sera
pas le cas si on souhaite mettre en œuvre une HIC.
A propos des chromatographies d'affinité
1. Description générale
2. Les supports de phase stationnaire et la conjugaison du ligand de capture au support
2.1 Principes
2.2 Exemple 1
Voici un exemple de "chimie historique et classique au bromure de cyanogène" permettant d'activer et de
fixer un ligand (petite molécule ou protéine) présentant une fonction amine à un support agarose
Après conjugaison du ligand choisi (qui doit porter une fonction amine accessible), les sites activés ayant non
réagi seront éteints avec un réactif type éthanolamine.
2.3 Exemple 2
Exemple avec un support polyacrylamide (qui porte donc au départ des fonctions amides en surface),
activation, greffage d'un bras espaceur, activation et greffage d'un ligand à fonction amine.

2.4 Exemple 3
Exemple avec un support polyacrylamide (qui portait donc au départ des fonctions amides en surface)
commercialisé déjà activé et utilisable pour conjuguer des ligands à fonction amine.
Après conjugaison du ligand choisi (qui doit porter une fonction amine accessible), les sites activés ayant non
réagi seront éteints avec un réactif type éthanolamine.
3. Quelques exemples de phases stationnaires pour AC
3.1 Supports à ligand fixé prêts à l'emploi
On a vu au paragraphe 1 les supports classiques prêts à l'emploi pour purifier les protéines recombinées
étiquetées. On retiendra les chromatographies IMAC pour les protéines à étiquette 6-his et les supports à
glutathion immobilisé pour les protéines à étiquette GST.
Les supports prêts à l'emploi à protéine A ou à protéine G greffée (2 protéines à affinité pour le fragment Fc
des IgG) sont commercialisés par de nombreux fabricants. Les supports à bleu cibacron greffé sont aussi
commercialisés par de nombreux fabricants. Le bleu cibacron fixe de façon très affine la sérumalbumine
(chromatographie de nettoyage de l'albumine dans les purifications d'igG) et présente une affinité pour les
motifs nucléotidiques ce qui permet son utilisation pour la purification de déhydrogénases à NAD+ aou
autres enzymes...
3.2 Supports activés pour conjuguer le ligand de son choix
On l'a vu ci-dessus sur 2 exemples, la plupart des supports activés sont des supports réactifs aux fonctions
amines. Mais on en trouve des réactifs aux fonctions -SH ou aux fonctions aldéhydes. La réactivité aux
fonctions aldéhydes est intéressante puisqu'il est facile de faire apparaître de telles fonctions sur les motifs
oses des glycoprotéines par oxydation au périodate.

4. Elutions en AC
Pour éluer les protéines retenues (donc la protéine d'intérêt), il y a 2 grandes méthodes en AC :
• l'élution compétition ;
• l'élution par modification des conditions physico-chimiques de milieu.
4.1 Elutions compétitions
Elles sont de 2 types selon les 2 schémas ci-dessous.
Par exemple, en IMAC, c'est le deuxième type de compétition qui est très souvent utilisé pour éluer la POI
étiquetée 6-his retenue. On va éluer grâce au compétiteur imidazole à concentration élevée qui va chélater le
Ni2+ du support et déplacer la POI. La POI sera éluée en présence de l'imidazole (en excès). Une dialyse ou
un dessalage par gel filtration ou par diafiltration permettront d'éliminer l'imidazole de la préparation de POI.
Le support IMAC devra être rééquilibré par un tampon sans imidazole pour en chasser peu à peu l'imidazole
chélaté (de l'eau prendra sa place).
4.2 Elution par modification des conditions physico-chimiques de milieu
Par exemple, en IMAC, si on abaisse le pH vers 5, on va protoner les N des noyaux imidazoles des histidines
(perte de disponibilité du doublet libre de chélation avec Ni2+ du support) et la POI se décroche. Encore faut-
il qu'elle supporte pH vers 5...
A propos de la chromatographie IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography)
Ni2+ (ou Co2+) peut former des complexes avec 4 ou 6 liaisons. On peut l'immobiliser sur des phases
stationnaires greffées de motifs chimiques qui pourront le lier avec 4 coordinences et telles que Ni2+ (ou
Co2+) ainsi immobilisé puisse réaliser ses 2 dernières liaisons de coordinence avec une étiquette his-6 ajoutée
à une protéine à purifier. Les 2 figures ci-dessous présentent une résine « classique » nickel-NTA(nickel-
nitrilotriacetic acid). Le motif acide nitriloacétique greffé forme un chelate tétradentate avec Ni2+. Il reste 2
coordinences pour interagir avec les atomes d'azote du cycle de la chaîne latérale de deux résidus histidines.
Certains appellent l'IMAC chromatographie d'affinité cation métallique-chélate, c'est une meilleure
appellation que chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (Immobilized Metal Affinity
 Chromatography) mais cette dénomination est peu fréquente

« A possible model is that of an interaction of a metal ion with histidine residues n and n+2 of a His tag. This
is confirmed by the fact that IMAC ligands can bind to His tags consisting of consecutive histidine residues
as well as to alternating tags. As at least consecutive His tags are usually unstructured and thus flexible, other
interaction patterns such as n:n+1, n:n+3, n:n+4, and so on could be imagined as well... » D'après Helena
Block et al. ; Methods in Enzymology, 2009 ; Volume 463, 439:473.
À pH <6 les résidus histidines vont se protoner (le doublet libre de N devient ainsi indisponible pour établir
une liaison de coordinence avec Ni2+) et ne pourront plus lier le nickel. On pourrait donc utiliser une
variation de pH pour éluer. Cependant, les élutions usuelles sont réalisées à l’aide d'un compétiteur :
l'imidazole.
La sélectivité pour l'étiquette his-6 n'est pas parfaite. « In E.coli, the proteins observed to copurify with His-
tagged target proteins can be divided into four groups: (i) proteins with natural metal-binding motifs, (ii)
proteins with histidine clusters on their surfaces ... » (Pour de telles protéines, une colonne Ni-NTA peut
servir de colonne d'affinité même sans l'ajout d'une étiquette...)
Les élutions en mode gradient sont recommandées.
Le nickel peut être chélaté par l'EDTA ou l'EGTA, aussi ces composés doivent être utilisés avec parcimonie.
A propos des chromatographies de gel filtration (exclusion-diffusion, exclusion de taille) (GF)
Un schéma adapté de http://www.bbioo.com/uploadfile/200806/2008060221240272.jpg

Les gel filtrations sont très utilisées comme dernière étape de purification (polissage), elles permettent
notamment de séparer les formations oligomériques non désirées comme le montre l'exemple ci-dessous tiré
de la documentation technique GE healthcare.

Les protéines sont des molécules sensibles à leur environnment et peuvent être facilement dénaturées. C'est à
dire que leur structure peut être modifiée jusqu'au point où elles perdent temporairement ou définivement leurs
propriétés biologiques.
D'autre part, il arrive fréquemment qu'on veuille séparer les protéines d'une solution, soit pour se débarrasser
des protéines et ne garder que les petites molécules de solution, soit au contraire pour se débarrasser des petites
molécules. On peut aussi vouloir se débarasser d'une partie des protéines. Une des façons les plus rapides est
évidemment de les précipiter. La précipitation peut aussi être contrôlée de façon à ne toucher que certaines
d`entre elles, par précipitation différentielle, ce qui permet de les séparer dans des procédures d'isolement.
Très souvent la dénaturation cause la perte de solublité des protéines. C'est pourquoi nous verrons ces deux
phénomènes ensemble
PRINCIPES DE BASE
Un changement des conditions environnement les protéines leur fait souvent perdre leur propriétés biologiques
et même physique.
Donc, la solubilité des protéines dans une solution aqueuse dépend, entre autres, des conditions ioniques et de
pH. Trois phénomènes de base agissent pour affecter la solubilité des protéines en solution aqueuse:
l'hydratation, la charge électrostatique et la leur conformation. Ces explications valent évidemment pour les
protéines hydroslubles et non pas pour les protéines hydrophobes des membranes. Très souvent ils se
conjuguent ensemble et la précipitation résulte de plusieurs phénomènes additifs.
Chaque protéine a évidemment des caractéristiques particulières à ce niveau. Le comportement général de
toutes les protéines est cependant le même.
Les protéines, sauf celles intégrées dans les membranes cellulaire, sont d'autant plus solubles en solution
aqueuse qu'elles sont hydratées. Cette coque d'hydratation les empêche de s'aggréger ensemble. Une trop
grande agrégation les fait précipiter puisque la solvatation de ces agrégats est proportionnellement moins
grande que celle des protéines individuelles. En ajoutant des produits déshydratants qui compétitionnent avec
les protéines pour l'eau d'hydratation, on peut donc provoquer la précipitation des protéines. Des produits
comme le polyéthylène glycol agissent de cette façon.
Se superposant à ce phénomène, les conditions ioniques d'une solution affectent aussi la solubilité des
protéines. En effet, si les protéines sont électriquement chargées de la même façon, elles auront tendance à se
repousser, donc à ne pas s'aggréger. Au contraire, si elles sont électriquement neutres, cette répulsion disparaît,
et l'agrégation devient possible. On peut utiliser ce phénomène soit en jouant sur le pH de la solution ou avec
des électrolytes. Les électrolytes employés ici sont des sels très solubles en milieu aqueux Les cations peuvent
neutraliser les charges négatives des chaînes latérales des acides aminés et les anions neutralisent les charges
positives. Ces protéines neutralisées ne se repousseront plus, elles pourront s'agréger en complexes de solubilité
substantiellement réduite pouvant facilement précipiter. Au point isoélectrique les protéines sont également
neutres. En amenant le pH au pI de certaines protéines, on peut donc aussi précipiter celles-ci. Dans les deux
cas, pH ou électrolytes, les protéines ne précipiteront pas toutes en même temps puisque leur pI ou le nombre et
la nature de leurs charges ne sont pas identiques. La plupart des électrolytes combinent à la fois la
déshydratation et la neutralisation des protéines.
Un troisième phénomène peut aussi entrer en jeu, la structure des protéines et leur dénaturation. A leur état natif
les protéines les groupes latéraux des acides aminés qui les composent leur permettent d'être solubles en milieu
aqueux. En effet les chaines latérales chargées (glu, asp, lys, arg. etc.) ou faciles à hydrater ou formant des
ponts hydrogène avec l'eau (ser, thr, etc.) sont souvent dirigés vers l'extérieur de la molécule maximisant leur
contact avec le milieu aqueux. Au contraire, les acides possédant des chaines latérales hydrophobes (phe, trp,
tyr) sont généralement camouflés à l'intérieur, minimisant ces contacts. La dénaturation brise cette organisation
et ramène à la surface des groupements hydrophobes qui vont avoir tendance à s'agréger entre eux et avec les
groupements hydrophobes des autres protéines dénaturées. Non seulement les protéines dénaturées sont
agrégées, mais leurs groupements hydrophobes sont plus exposés au milieu aqueux, diminuant encore plus leur
solubilité. Les solvants organiques (acétone, phénol), les acides forts peu concentrés ou des températures
élevées sont souvent utilisés à cette fin
MÉTHODOLOGIE ET APPAREILLAGE
Précipitation totale
Comme son nom l'indique les méthodes de précipitation totale des protéines visent à éliminer l'ensemble des
protéines d'une solution. ce résultat s'obtient par des conditions plutôt draconiennes qui, le plus souvent,
dénaturent irréversiblement les protéines. La précipitation totale est utilisée quand on veut séparer les protéines
des autres petites molécules contaminantes, acides aminés, sucres, etc.., ou, quelquefois, des autres
macromolécules. Cette approche est donc incompatible à des procédures ou on veut récupérer une protéine
intacte et fonctionnelle.
Suivent certaines techniques de dénaturation totale.
Précipitation à l'éthanol ou à l'acétone: On peut facilement précipiter les protéines en présence d'éthanol 80%
(EtOH) en les gardant à -20°C quelques heures ou en amenant le mélange à ébullition durant quelques minutes.
Une centrifugation permet alors de sédimenter les protéines précipitées. L'éthanol résiduel peut être enlevé par
extraction des protéines resuspendues en milieu aqueux avec du chloroforme. Le principal inconvénient de cette
méthode est le grand volume d'EtOH qu'on doit utiliser, au moins quatre fois celui de la solution protéique
aqueuse. Il faut souligner en plus que la précipitation n'est pas complète, car certaines protéines sont plus ou
moins solubles dans l'éthanol. Une variante plus efficace utilise de l'acétone au lieu de l'EtOH. Deux fois le
volume de solution protéique est suffisant. La précipitation à l'acétone est aussi plus efficace car, contrairement
à l'éthanol, très peu de protéines sont solubles dans l'acétone. Cependant la préparation de protéines résultante
est très difficile à redissoudre.
Précipitation au phénol: Une méthode a été développée spécifiquement pour extraire des petites quantités de
protéines avec du phénol. Les protéines se dénaturent et beaucoup deviennent solubles dans le phénol ou
s'agglomèrent à l'interface phénol-eau, contrairement aux petites molécules et aux acides nucléiques qui restent
solubles dans la phase aqueuse. Il faut remarquer que cette méthode est souvent utilisée pour des fins inverses,
récupérer les acides nucléiques débarrassés des protéines.
Milieux alcalins ou acides:
Les protéines ne sont souvent solubles qu'à l'intérieur d'une gamme restreinte de pH. Donc acidifier ou
alacaliniser fortement une solution rendra les protéines insolubles. Même des concentrations modérées d'acides
peuvent induire une dénaturation et une précipitation des protéines.

Précipitation à l'acide trichloroacétique (TCA): Cette approche consiste à mettre la solution de protéines en
présence de TCA pour obtenir une concentration finale de l'ordre de 5-10% de l'acide. Pour éviter une
dégradation des protéines, il faut toujours travailler à 2-4°C. Une exposition de 10 minutes est généralement
suffisante. On peut ensuite séparer les protéines précipitées par centrifugation à faible vitesse. On peut se
débarrasser du TCA résiduel par quelques lavages à l'éther. Le sédiment de protéines résultant est très difficile à
redissoudre. Il faut une quantité relativement grande de protéines en solution pour obtenir une précipitation
quantitative. Pour les très petites quantités de protéines, on peut les traiter avec le détergent désoxycholate de
sodium. Les micelles résultantes sont relativement faciles à précipiter (Peterson, 1976). Parmi les inconvénients
de la précipitation au TCA, il y a le fait que c'est un produit très corrosif et qu'il doit être manipuler avec
prudence. Il faut également se souvenir que le TCA n'est pas très stable à des concentrations inférieures à
30%v/v et qu'il faut préparer des solutions stock concentrées. La préparation de TCA 100% (100 g de TCA
dans 100 mL de solution) comme solution stock se fait facilement et permet de faciliter les calculs de dilution.
Précipitation à l'acide perchlorique (PCA): Une autre méthode similaire de précipitation à l'acide est celle à
l'acide perchlorique. Des concentrations finales de 5-7% sont normalement suffisantes. Un des avantages du
PCA sur le TCA est qu'on peut le précipiter avec du KOH puisque le perchlorate de potassium est pratiquement
insoluble à 0-4°C. C'est une approche beaucoup plus simple que les lavages à l'éther pour débarrasser les
protéines de l'excédent de PCA. D'un autre côté, un inconvénient majeur du PCA rendant son emploi très rare
est le danger de ce produit. En effet, en plus de sa corrosivité, le PCA est explosif, obligeant donc manipuler ce
produit avec la plus grande prudence dans des installations prévues à cette fin.
Précipitation au sulfate de zinc ou au tungstate de sodium: Le sulfate de zinc (ou le sulfate de cadmium) en
présence d'une base forte (NaOH ou Ba(OH)2 est un précipitant efficace. C'est une technique cependant un peu
complexe, particulièrement si on utilise le Ba(OH) 2 qui doit être conservé à l'abri de l'air. Une autre méthode du
même type utilise du tungstate de sodium en présence d'un acide fort (H2SO4).
Précipitation différentielle
La précipitation différentielle, ou précipitation fractionnée, est beaucoup plus douce que la précipitation totale
et préserve généralement l'intégrité fonctionnelle des protéines. C'est donc une approche très fréquemment
utilisée comment étape dans l'isolement des protéines. Elle est basée sur le fait que les conditions ioniques ou
de pH qui rendent les protéines insolubles varient pour chaque espèce de protéine. On peut donc ajuster les
concentrations de l'électrolyte ou le pH pour isoler la protéine désirée.
La stratégie généralement est très simple. Dans un premier temps on amène la concentration de l'électrolyte ou
le pH à un niveau un peu inférieur à celui de la protéine d'intérêt. Les protéines insolubles dans ces conditions
peuvent donc être éliminées, par exemple par centrifugation. La solution contenant les protéines non
précipitées, incluant la protéine d'intérêt, est récupérée. On y ajoute une quantité d'électrolyte ou on ajuste le pH
de façon à ce que cette protéine devienne insoluble. On peut alors récupérer la protéine d'intérêt qui a précipité.
Cette protéine est alors débarrassée de beaucoup de protéines contaminantes. Celles qui sont moins solubles que
les protéines ont été éliminées dans le premier précipité, celles qui le sont plus, sont restées dans le deuxième
surnageant.
Cette approche est cependant assez grossière et ne permet pas une purification très poussée. En effet, pour
s'assurer un bon rendement en protéine, on ajuste les concentrations, d'électrolytes ou le pH à des niveaux où
d'autres protéines de solubilité similaire coprécipiteront. De plus plusieurs protéines peuvent avoir des
solubilités relativement similaires. La précipitation différentielle est donc une des premières étapes de
purification. La principale méthode de précipitation différentielle est celle qui utilise le sulfate d'ammonium.
D'autres méthodes sont beaucoup moins fréquente (thermique, pI, etc.).
Précipitation au sulfate d'ammonium: L'électrolyte le plus employé pour la précipitation différentielle est le
sulfate d'ammonium. Ce sel est très soluble en solution aqueuse et permet d'atteindre des forces ioniques très
élevées. Il est très hydrophile et compétitionne efficacement avec les protéines pour l'eau causant leur
déshydratation. Les ions sulfates et ammonium sont relativement petits et peuvent facilement s'approcher des
résidus chargés des protéines pour les neutraliser. Ce sel a aussi l'avantage de peu dénaturer les protéines et
permet de maximiser l'obtention de protéines biologiquement actives.
Précipitation thermique et au pI: Ce sont des approches beaucoup plus rarement utiilisées. Leur inconvénient
est qu'elles sont plus susceptibles de dénaturer irréversiblement les protéines. La précipitation thermique peut
s'appliquer aux rares protéines qui restent solubles au dessus de 40°C. La précipitation au pI est souvent faite
dans un sac à dialyse. La solution de protéines est dialysée extensivement dans un tampon ajusté au pH
correspondant au pI de la protéine d'intérêt. Cette dernière précipite alors dans le sac et peut être récupérée.
Cette dialyse doit se faire contre de grands volumes de tampon, généralement 20 fois celui de la solution de
protéines, avec de nombreux renouvellements durant deux jours.

Récupération des protéines précipitées

La façon la plus courante de récupérer les protéines précipitées est la centrifugation. Une autre approche est la
filtration.
APPLICATIONS À LA BIOCHIMIE
Séparation des protéines d'autres molécules contaminantes
Une application très fréquente de la précipitation totale des protéines est la séparation des protéines marquées
des acides aminés radioactifs qui ont servi de précurseurs pour leur marquage métabolique.
Purification des protéines
Une des étapes initiales des procédures de purification est souvent la précipitation différentielle au sulfate
d'ammonium. Cette méthode relativement peu spécifique s'applique bien aux grands volumes qu'on obtient
souvent en début de processus de purification. Elle permet d'enlever une bonne partie protéines dont on veut se
débarasser. Il faut toutefois faire suivre cette étape d'une dialyse ou d'une ultrafiltration pour éliminer le sulfate
d'ammonium résiduel.
ASPECTS TECHNIQUES
Précipitation différentielle au sulfate d'ammonium
Cette procédure est employée pour séparer une protéine d'intérêt d'autres protéines contaminantes dans une
solution contenant un mélange complexe de protéines.
Cette méthode consiste simplement à solubiliser une quantité de sulfate d'ammonium (SA) dans la solution dont
on veut précipiter les protéines. Cette quantité est celle nécessaire pour arriver a une concentration équivalente
à un certain pourcentage de la quantité de SA suffisante pour saturer cette solution à la température et au pH où
on travaille. C'est pourquoi il s'agit bien du % de saturation (non pas du % de concentration en tant que tel). A
cette concentration les protéines contaminantes, en fait une partie d'entre elles précipiteront sans entrainer la
protéine désirée. Pour déterminer la quantité de SA à ajouter on utilise un tableau de saturation ou, plus
rarement un nomogramme.
 Concentration initiale de sulfate d'ammonium Concentration finale de sulfate d'ammonium
(% de la saturation à 0°C et pH 7.0) (% de la saturation à 0°C et pH 7.0)
0% 25% 50% 75% 100%
g de sulfate d'ammonium à ajouter par 100 mL de
solution
0% 0 13.6 29.5 48.3 70.7
25% 0 14.8 32.1 52.9
50% 0 16.1 35.3
75% 0 17.6
100% 0
Les valeurs sont données en termes de % de saturation, c'est-à-dire en proportion de la quantité de sulfate d'ammonium nécessaire
pour saturer complètement une solution d'eau à pH 7.0 à 0°C (3.90 mol/L). Ce tableau est évidemment très simplifié pour des fins
explicatives, les vrais tableaux donnent des valeurs à tous les 5% de saturation.
Par exemple, on désire aller chercher une protéine soluble dans du SA 50% mais insoluble à 75%; cette
protéine étant contenue dans une solution de 260 mL. En se servant dut tableau ci-dessous, il faudrait donc tout
d'abord ajouter 29.5 g de SA par 100 mL. Cela amènerait le % de saturation de 0 à 50%. Si notre solution est
de 260 mL il faudra donc ajouter 76.7 g de SA pour amener la saturation à 50%.
Tableau très simplifié de saturation du sulfate d'ammonium (0°C, pH 7
Les protéines insolubles (et non voulues) ayant précipitées par centrifugation, le sédiment contiendra les
protéines indésirables et insolubles dans 50 % de SA. Le surnageant lui contiendra , entre autres, la protéine
d'intérêt et des protéines contaminantes solubles dans 50% de S.A.. On reprend alors ce surnageant résultant
pour en faire précipiter la protéine d'intérêt. On doit amener la concentration de SA de 50% (dans le surnageant)
à 75%, le point d'insolubilité de la protéine recherchée. Pour cela, d'après le tableau des olubilités, il faudra
ajouter 16.1 g de SA par 100 mL. Cela représente 41.86 g dans 260 mL. Cette addition causera la précipitation
des protéines insolubles à entre 50 et 75% de saturation, incluant la protéine désirée plus d'autres protéines
contaminantes insolubles dans ces conditions. en centrifugeant, le sédiment contiendra ces dernières: la protéine
désirée et les contaminntes. Ce sédiment pourra être resolubilisé, puis souvent dialysé pour éliminer le SA.
Ensuite on pourra procéder à d'autres procédures de purification pour éliminer les protéines contaminantes et
non désirées.