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Chapitre 6 : Génétique moléculaire

1-Génétique moléculaire
La génétique moléculaire fait appel à des manipulations de molécules organiques, qui sont à
l'origine synthétisées, digérées, liées, détruites in vivo.

C’est une branche de la biologie et de la génétique, qui consiste en l'analyse de la structure et

de la fonction des gènes, normaux ou mutants, au niveau moléculaire.

Les techniques de base de la biologie moléculaire consistent le plus souvent à tirer parti des
caractéristiques propres du matériel biologique sur lequel on travaille (comme les propriétés
physico-chimiques de l’ADN).

Figure : Différence entre le terme in vivo, in vitro et in silico.

2-Les techniques de base de la génétique moléculaire

L’ADN est présent dans tous les tissus des animaux, et les manipulations sur cette molécule
nécessitent au préalable son extraction

Les techniques d’extraction sont nombreuses (choisies en fonction de la quantité de matériel

de départ, de la source d’ADN, de la qualité requise...).

Les méthodes d’extraction/purification des acides nucléiques issus d’extraits cellulaires sont
généralement des combinaisons de deux ou plusieurs des techniques et avec plusieurs étapes.

2-1La lyse cellulaire

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La procédure de lyse idéale est souvent un compromis de techniques et doit être suffisamment
rigoureuse pour briser le matériau de départ complexe (par exemple, le tissu), mais
suffisamment douce pour préserver l’acide nucléique cible. Les procédures de lyse courantes
sont les suivantes :

-Le rupture mécanique (exemple : broyage ou lyse hypotonique)

-Le traitement chimique (exemple : lyse détergente, agents chaotropiques, réduction des thiols)

-La digestion enzymatique (exemple : protéinase K)

Une solution simple peut contenir des détergents pour solubiliser les membranes cellulaires et
des sels chaotropiques puissants pour inactiver les enzymes intracellulaires.

2-2Extraction des acides nucléiques

Utilisée pour débarrasser les acides nucléiques des protéines ; le phénol étant un déprotéinisant
puissant. Puis une extraction au chloroforme ou éther : complète toujours l’extraction
précédente pour éliminer toutes traces de phénol. Et en fin l’extraction à l’isobutanol : permet
d’extraire les molécules organiques.

Une centrifugation de 10 min sous 10000 g à la température de 4°C. A la sortie, on distingue

une phase aqueuse surnageante contenant les acides nucléiques en solution, une phase
organique au fond du tube : phénol + lipides

2-3Précipitation des protéines

Comme son nom l'indique les méthodes de précipitation totale des protéines visent à éliminer
l'ensemble des protéines d'une solution. Ce résultat s'obtient par des conditions plutôt
draconiennes qui, le plus souvent, dénaturent irréversiblement les protéines.

La précipitation totale est utilisée quand on veut séparer les protéines des autres petites
molécules contaminantes, acides aminés, sucres, etc.., ou, quelquefois, des autres
macromolécules. Cette approche est donc incompatible à des procédures ou on veut récupérer
une protéine intacte et fonctionnelle.

Récupération des protéines précipitées

La façon la plus courante de récupérer les protéines précipitées est la centrifugation. Une autre
approche est la filtration.

Solution Surnagean
t

Molécules Précipité
libres
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Figure : Principe de la précipitation des molécules.

2-4Vérification de l’efficacité de cette technique

Electrophorèse sur gel d’agarose, PCR (La réaction en chaîne par polymérase)

2-4-1Electrophorèse

La dilution et la densification de l’ADN par une solution colorée de bleu de bromophénol (BBP)
va permettre de suivre l’avancement de. Chaque fragment de restriction est déposé dans le gel
et la cuve mise sous tension (250 V) pendant une heure environ. Quand le front de migration
atteint l’extrémité du gel, on arrête la manipulation.

Le gel est introduit dans une cage connectée à un écran d’ordinateur. La projection de la lumière
UV permet d’observer les migrations de différentes bandes.

Figure : Principe de la technique électrophorèse.

2-4-2PCR (polymérase chaine réaction).

La PCR est une technique basée sur une répétition de cycles de transition de température. Sauf
pour certaines méthodologies (par exemple l’utilisation de sondes d’hydrolyse), chaque cycle
contient trois étapes.
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Elle se décompose en trois phases : une phase de dénaturation, une phase d'hybridation avec
des amorces et une phase d'élongation.

Dénaturation : C'est la séparation des deux brins d'ADN, obtenue par élévation de la
température (généralement 10 à 15 minutes à 95 °C).

Hybridation : en abaissant la température, les amorces spécifiques s'hybrident sur les

molécules simple brin d'ADN. Les amorces sont constituées de courtes séquences d'ADN
complémentaires de la séquence de l'ADN à amplifier. Il s'agit toujours d'un couple d'amorces,
complémentaire encadrant le fragment d'ADN à amplifier

Elongation C'est la synthèse du brin complémentaire. Une enzyme polymérase, la Taq

polymérase, ajoute à l'extrémité de l'amorce des oligonucléotides présents dans le milieu de
réaction.

Figure : Principe de la technique PCR (Polymérase Chaine Réaction).

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Chapitre 7 : Aberration chromosomique

L’altération du chromosome peut être globale ou partielle et porter sur son nombre, sa structure
interne.

Des anomalies plus importantes peuvent être visibles au microscope lors d’un test appelé
analyse chromosomique ou détermination du caryotype, et peuvent toucher n’importe quel
chromosome, y compris les chromosomes sexuels. Les anomalies chromosomiques affectent :

-Nombre de chromosomes

-Structure des chromosomes

1-Les anomalies de structures (touchant un seul chromosome)

-Les anomalies équilibrées ne modifient pas le contenu génétique des cellules et ne se traduit
pas par une anomalie du phénotype.

-Les anomalies déséquilibrées se définissent par le gain ou la perte de matériel génétique et se

traduisent par une anomalie du phénotype.

1-1Délétion : délétion chromosomique résultent de la perte de portions de chromosomes. Ils

peuvent provoquer de graves anomalies congénitales et un handicap intellectuel ou physique
important.

Cette anomalie est soit c’est une délétion intercalaire ou bien une délétion terminale provoque
une monosomie.

1-2Duplication : gain d’un segment chromosomique qui a pour conséquence une trisomie
partielle avec présence de 3 copies des gènes localisés au niveau du segment dupliqué.

Figure : Anomalie chromosomique de structure délétion (délétion intercalaire) et

duplication.
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Délétions/Duplications : ce sont des anomalies déséquilibrées les délétions/duplications sont

générés au moment du processus de réparation de cassures chromosomiques et peuvent se
produire au moment de la méiose ou de la mitose.

1-3Une inversion est une anomalie de structure intrachromosomique équilibrée inversion,

résulte de deux cassures sur un même chromosome suivies de réparation après inversion du
segment intermédiaire.

Figure : Anomalie chromosomique de structure inversion.

L’inversion est péricentrique si les points de cassure sont localisés de part et d’autre du
centromère.

L’inversion est paracentrique si les points de cassure sont localisés sur un même bras
chromosomique

1-4Chromosome en anneau : un chromosome en anneau résulte d’une cassure à chaque

extrémité d’un chromosome suivie par un recollement avec perte des segments distaux. Un
anneau est une structure instable en mitose et lors de la gamétogenèse.

Figure : Anomalie chromosomique de structure (chromosome en anneau).

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2-Les anomalies chromosomique du nombre

Affectent le nombre des chromosomes et non leur structure qui demeure normale. Les plus
fréquentes sont les aneuploïdies c’est à dire la perte ou le gain d’un ou quelques chromosomes.
Les polyploïdies désignent un nombre anormal de lots haploïdes entiers.

Trisomies :

Une trisomie correspond à la présence d’un chromosome supplémentaire. Le nombre de

chromosomes est donc de 47 et non plus de 46.

Figure : Trisomie 13(syndrome de Patau) et Trisomie 21 (syndrome de Down)

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Chapitre 8 : Conseil génétique

Conseil génétique
Est défini comme un processus de communication qui s’occupe des problèmes humains
associés à la présence ou au risque d’une maladie génétique dans une famille. Il permet d’aider
les patients à comprendre les données médicales, l’hérédité, les risques de récurrence et les
options disponibles, à choisir le plan d’action qui leur convient le plus et à gérer du mieux
possible la présence de la maladie et/ou le risque de récurrence.

1-Processus du conseil génétique

La génétique clinique nécessite une préparation de la consultation ; et un suivi en plus du contact
direct avec le patient. Classiquement, plus de la moitié du temps consacré à une famille
nécessitant un conseil génétique se passe avant et après la visite clinique.

Les étapes définies au sont quelque peu arbitraires ; certaines familles atteintes de maladies
génétiques sont vues de façon répétée sur une période allant de plusieurs années à plusieurs
générations, pour réévaluation, tandis que d’autres ne sont vue qu’une seule fois.

1-1Interrogatoire :

Il doit contenir :

-Âge, sexe.

-Cas de décès dans la famille (avec les causes).

-Décès dans la période périnatale.

-Parents atteints ou informatifs (hétérozygotes).

-Notion de consanguinité.

-Ethnie, race.

Ces informations doivent être objectives et mis à jour.

Un arbre généalogique est établi avec la famille.

1-2Recours au laboratoire :

-Examens cytogénétiques : caryotype.

-Dosages enzymatiques.

-Biologie moléculaire.

-Examens radiologiques (échographie, IRM).

-Si grossesse en cours : diagnostic prénatal

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2-Le calcul du risque génétique :

2-1Le risque Mendélien : Le risque mendélien est le plus facile à calculer. Il repose sur la
détermination exacte du diagnostic ou à défaut sur des arguments généalogiques (récessivité
probable en cas de consanguinité, hérédité clairement dominante ou liée au chromosome X).

2-2Le risque empirique : lorsque l'estimation repose sur l'observation de données et non sur
un modèle théorique. On utilise ce type d'estimation pour les anomalies chromosomiques et les
affections non mendéliennes dites multifactorielles (malformations communes : cardiopathie,
fentes labiales, dysraphies du système nerveux central).

2-3Le risque conditionnel : en y intégrant des données généalogiques ou biologiques : par

exemple, une femme qui a déjà eu trois garçons normaux a moins de risque qu'une femme qui
n'a pas eu d'enfant d'être conductrice pour une maladie liée au chromosome X même si leurs
risques a priori sont les mêmes.

3-Notion de confidentialité
L’information médical lui appartient et le médecin n’a pas le droit de divulguer cette
information sans son accord.

L’information génétique appartient à patient qui consulté, mais peut avoir des implications pour
ses apparentés.

Dans ce contexte se pose la question de confidentialité par rapport à la communication de

l’information aux membres de la famille à risque qui doivent être identifiés.