Extraction et purification de

l’enzyme Fromase

Réalisé par
BENAMER Hanane Sous la supervision de
BERKANE Saida Mme AISSOU
MATMAT Raid
 Introduction

Définitions

Protocole d’extraction
Plan de travail
Protocole de purification

Applications industrielles

Conclusion
Introduction:

Une enzyme est une protéine qui transforme des substrats en des
produits dans un temps déterminé.

Les enzymes interviennent dans les bioconversions qui font partie des
biotechnologies blanches (white biotechnology) visant les productions
industrielles.
Parmis ces enzymes impliqués dans l’industrie on cite:
Les enzymes alimentaires :

Produits contenant une ou plusieurs enzymes capables de catalyser

une réaction biochimique spécifique.

Obtenus à partir de plantes, d’animaux, de micro-organismes.

Ajoutées à des denrées alimentaires à des fins technologiques à

toute étape de leur fabrication.

Parmis ces enzymes on retrouve : la fromase

 C’est quoi la fromase?
La fromase est une enzyme qui coagule le lait.

c'est à dire séparation du lait en sorte de solide mou (cailles), et cela en agissant
sur les caséines(protéines essentiels du lait) qui sont regroupées en micelles, elle
agit de facon à les faire rapprocher entre elles et les regrouper en amas de micelles
qui a leur tour se regroupe en un réseau bien organisé.

T° optimale = 55C°

Ph optimal = 3,5
Structure de micelle de caséine
Utilisée dans l’industrie
laitière, surtout pour la
production du fromage.
Une alternative très fiable
à la présure animal.

fabrication du fromage
Chymosine
 Où peut-on la trouver ?

Elle provient essentiellement d’une

source microbienne, obtenu par
culture de souche de la moisissure
Rhizomucore meihei.

Rhizomucore meihei sous microscope

Protocole d’extraction
 Qu’est-ce-que l’extraction d’une enzyme?

Une libération des enzymes des cellules par éclatement de la paroie

cellulaire , par des procédés mecanique , physique , chimique .

Le choix de cette techniques d’extraction ce fait en fonction de :

Type de cellule utilisée.

La localisation de l’enzyme.
Les conditions de purification de notre enzyme.
L’équipement disponible
Avant l’extraction, on effectue une culture d’une souche de
Rhizomucore meihei dans un milieu malt gélosé.
Les étapes d’extraction
1- Préparation de l’inoculum:

Solution 0,1% de tween

Ensemencement Incubation à 37°C,pendant
80.pour libérer les spores.
5jrs

Filtration de la suspension des spores sur la laine de verre

stérile.
2- Ensemencement du milieu:

10 ml du filtart Erlen de 500 ml

Incubation à 37°C pendant
4jours .
3- Extraction de l’enzyme:
Après incubation :

200ml de tampon Filtration et

Agitation mécanique de centrifugation
phosphate(0,02M; ph 6)
l’ordre de 300 trs/min pendant 30min à
pendant 1h. 4°C
3- Extraction de l’enzyme:

Après centrifugation :

Le surnageant obtenu est appelé :

Extrait enzymatique brut
Protocole de purification
 Qu’est-ce-que la purification d’une
enzyme?

Isolement d’une ou plusieurs protéines à

partir d’un mélange complexe.
Les étapes de purification
1- Précipitation au sulfate d’ammonium :

Sulfate
d’ammonium à 80%
de saturation. Extrait
enzymatique brut Centrifugation
Décanter à 4°C pendant
une nuit pendant 30 min
à 4°C
Le culot est mis en suspension avec une
solution tampon phosphate (0,02M;ph6)
2- Déssalage de l’extrait enzymatique :

Chromatographie gel de
filtration sur colonne pharmacia
(20×1cm), contenant du gel
Sephadex G25

Les fractions actives sont

rassemblées et concentrées
3- Concentration avec le saccharose :

Cette technique repose sur le principe

d'osmose.

Consiste à saupoudrer du
saccharose sur le boudin de dialyse
placé dans un récipient à 4°C .

provoque l'élimination de l'eau

présente dans échantillon.
 4- Chromatographie échangeuse d’anion:

Le gel gonflé
dans le tampon
phosphate et
dégazé, est
coulé dans une
colonne
équilibrée avec
le même Protéines éluées à 4°C
tampon Lecture de la DO à 280nm

Les fractions à activité coagulante sont

rassemblées et dialysées contre le tampon
phosphate durant 16h à 4°C.
5- lyophilisation:

Les fractions actives sont concentrées et conservées par procédés de

lyophylisation, en suivant 2 étapes

Gongélation Sublimation
passage sous vide directement de
l’état solide vers vapeur
Ainsi l’enzyme peut enfin être
utilisé dans la production
industrielle
 Applications industrielles
Actuellement, les fromases dominent le marché mondial des enzymes.
Ces biocatalyseurs sont d'une grande importance économique, en considérant les
applications industrielles multiples dans lesquelles elles sont impliquées tel que :

L'industrie fromagère L'industrie agro-alimentaire

(laitières)

Outil idéal pour les technologies à pâtes à molles . L'outil synthétique indispensable pour tous
Coagulation du lait pour la fabrication de fromages. les acteurs des filières agro-alimentaire
 Une bonne stratégie d'obtention d'une
enzyme dans les meilleurs conditions
possibles comportera donc le bon
Conclusion choix du matériel biologique du
départ, le choix des techniques
d'extractions les plus adaptées à ce
dernier et les technologies de
séparation et de purification
adéquates aux propriétés physico-
chimiques de l'enzyme.
 Références bibliographiques

BELHAMICH Nabila(2005).Extraction,purification et caractérisationd’une coagulase de Mucor

pusilus. Thèse en vue de l’obtention du diplômé de magister en sciences agronomiques. Spécialité,
sciences alimentaires. EL-HARRACH. Institut national agronomique.
Sébastien GIVRY(2006).Optimisation de procédés de fermentation lactique sur sirop de son de blé.
Thèse de doctorat pour l’obtention du grade de Docteur de l’Université de Reims Champagne-
Ardenne. Microbiologie Industrielle. Université de Reims Champagne-Ardenne.

A. Reps, S. Poznanski, A. Babuchowski, L. Jedrychowski(1979)Propriétés des

substituts de présure fabriqués à partirde Mucor miehei. N° 59, p 1-12

Lehninger, Nelson, D.L., Cox, M.M.(2017). Principles of biochemistry: 7e Edition

international edition

Voet, D., Voet J.G (2016). Biochemistry: 4e Edition. JOHN WILEY &SONS, INC.
Merci pour
votre
attention