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AT N° 3 : Suivi d’une fermentation éthanolique

Le domaine des biotechnologies utilise les capacités de synthèse des micro-organismes à produire
industriellement de nombreuses substances. Les applications sont diverses : production de
médicaments, de vaccins, d’additifs alimentaires, d’insecticides biologiques, de levures de
boulangerie, de boisson alcoolisées.Une application plus répandue ces dernières années, concerne la
valorisation des déchets des bio-industries.

Notre objectif est de suivre la croissance de la biomasse microbienne (levures telles que
Saccharomyces cerevisiae) et de s’assurer du bon déroulement du processus de fermentation
alcoolique par la disparition de substrats et l’apparition de produits.

Tâches Données
- Suivre la croissance d’une souche par turbidimètrie - Notice dosage du glucose par méthode enzymatique
- Déterminer les paramètres de croissance de la - Notice dosage de l’éthanol par méthode
souche enzymatique
- Vérifier les concentrations de produits formés

Matériel et réactifs spécifiques  :

 Souche en préculture de Saccharomyces cerevisiae en bouillon Sabouraud +
chloramphénicol ( étuve 30°C)
 360 mL de bouillon Sabouraud + chloramphénicol en spinner ou erlenmeyer
 Plaques chauffantes agitatrices
 PSM ou hottes à flux laminaire
 Spectrophotomètre et cuves
 Réactifs pour les dosages

Préparation du suivi de croissance en milieu non renouvelé  :

Pour avoir une phase de latence la plus courte possible et une quantité de microorganismes
suffisante, une préculture de la souche est réalisée la veille avec le même milieu de culture et placée
à 30°C.

-Pour ensemencer le bioréacteur de croissance (spinner ou erlen contenant du milieu stérile), vous
devez l’inoculer avec un volume donné de préculture.
-Pour cela, ensemencer le milieu de culture avec 10% de la préculture convenablement
homogénéisée.
Conserver l’inoculum de préculture dans la glace.

Suivi de croissance et mesure disparition de Substrats / apparition de produits :

La croissance est suivie par mesure de l’atténuante notée A de la culture à 620 nm.
Les concentrations en glucose et éthanol sont à réaliser en fin de séance grâce aux kits respectifs.

Mesure à t=0 minutes

o Dès l’ajout de l’inoculum, homogénéiser et prélever immédiatement 5 mL en tube hémolyse.
o Transvaser en cuve puis recouvrir de parafilm.
o Homogénéiser et lire de suite A à 620 nm contre un blanc adapté (= à conserver le pour toute
la séance)
o Conserver votre échantillon dans la glace pour analyse ultérieure.

Suivi de croissance 
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o Les mesures d’A sont à réaliser toutes les 15 minutes jusqu’à atteindre la phase stationnaire.
Pour vous aider, tracer la courbe en direct de manière à prévoir les dilutions éventuelles de
votre échantillon.
Pour rappel  : si l’atténuance dépasse 0,600, il est recommandé de diluer le prélèvement de façon à
rester dans la zone de linéarité ( de 0,1 à 0,6).

Attention, conservez tous vos prélèvements dans la glace.

Dosage Glucose et éthanol (cf notices) :

 Centrifuger 5 minutes à 200 rpm puis récupérer le surnageant.

 Doser le glucose et l’ethanol grâce aux notices (attention à la limite des tests).
Vous pouvez conserver au frais vos échantillons pour analyse prochaine.

Présentation orale des résultats avec support

Courbe de croissance à tracer ,résultats bruts dans tableau ( atténuance brute ou corrigée avec
dilution éventuelle, concentration en glucose).
Paramètres cinétiques de croissance à calculer : µx et G.
Consommation/ apparition des substrat/ produit sur le même graphique.
Calculer la vitesse de consommation du substrat ( en g/L/h).

Sitologie
-Notice Glucose RTU
http://biotech.spip.ac-rouen.fr/IMG/pdf/RTU_Glucose.pdf
-Notice éthanol cf fiche sur dossier teams