Analyse PRODUIT LAITIER Tp 01 de Microbiologie alimentaire (Mme MESSAD)

Tp 01 : Analyse microbiologique du lait cru de vache et de

lait pasteurisé

I/ Introduction

"Le mot lait, sans indication de l’espèce, désigne en France le lait de vache ; il est le produit intégral
de la traite totale et ininterrompue d’une femelle laitière bien portante, bien nourrie et non surmené.
Le lait est un aliment complet, ce qui signifie qu'il sera également un bon milieu pour les
microorganismes, c'est ce qui fait qu'il ne se conserve pas. Un des moyens découverts par l'homme
pour augmenter sa conservation est de le faire transformer de façon plus ou moins contrôlée par
certains microorganismes de façon à éviter toute autre altération. En gros, cette conservation repose
sur l'élimination d'une grande partie de l'eau et sur l'acidification. Ce qui défavorise le
développement des microorganismes".
Les analyses microbiologiques ont pour but d’assurer au lait cru et à lait pasteurisé une qualité
hygiénique mettant en cause la santé du consommateur.

II/ Échantillonnage

1. Lait de vache cru

Afin d’obtenir un lait de bonne qualité microbienne, les règles à respecter sont les suivantes :
✓ Nettoyer l’extérieur de la mamelle avant la traite à l’aide d’un linge préalablement
trempé dans une solution désinfectante, la mamelle doit ensuite être séchée.
✓ Jeter les premiers jets de lait provenant de chaque quartier de la mamelle car, ils sont
fortement chargé en germes.
✓ Le lait est récupéré dans des flacons stériles placés tout près des mamelons.
✓ Assurer une réfrigération rapide du lait (0-4°C)
✓ Le contrôle microbiologique doit se faire dans un délai de 24h après le prélèvement.

2. Caractères physiques du lait cru et autres lait (pasteurisés et stérilisés)

On procède souvent à une observation du lait avant tout examen afin de détecter les anomalies
possibles. Le tableau suivant présente quelques tests à réaliser :

Caractères examiné Caractère normal Caractères anormal

Couleur Blanc mat : lait normal Gris jaunâtre : lait de mammite

Blanc jaunâtre : lait Bleu ou jaune : lait coloré par substances
riche en crème chimique ou de pigments bactériens
Odeur Odeur faible Odeur de putréfaction
Saveur Saveur agréable Saveur salée : lait de mammite
Gout amer : lait très pollué par des
bactéries
Consistance Aspect homogène Aspect grumeleux : lait de mammite
Aspect visqueux ou coagulé : lait très
pollué par des bactéries

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▪ Préparation des échantillons

On prélève 1ml du lait du flacon remplit de lait de vache cru devant une flamme, on l’introduit dans
un tube à essai contenant 9ml d’eau physiologique. Après agitation, on obtient la dilution 10-1.

▪ Préparation des dilutions

Après homogénéisation du produit à analyser, on prélève, à l’aide d’une pipette stérile, 1ml qu’on
introduit aseptiquement dans un tube à essai contenant 9ml d’eau physiologique stérile (la dilution
10-1). On effectue ensuite les dilutions 10-2 et 10-3.

III/ Recherche et dénombrement des différents germes

III.1/ Recherche et dénombrement des coliformes

Rappel
• Coliformes totaux: fermentent le lactose avec production de gaz à 30°C
• Coliformes thermo-tolérants ou fécaux: possèdent les mêmes propriétés à 44°C
(Escherichia coli : flore indiquant une contamination exclusivement fécale).

a) Test de présomption

Préparer des tubes contenant le milieu VBL a raison de 3tubes par dilution. Ce bouillon est lactosé,
billé au vert brillant. On introduit aseptiquement 1ml de chaque dilution (10-1,10-2,10-3) dans les
tubes correspondant de VBL. Les tubes de VBL sont munis d’une cloche de durham. L’incubation
se fait à 37°C pendant 24h.

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b) Test de confirmation

Ce test est réalisé dans le but de la recherche des coliformes fécaux thermo-tolérants, fermentant le
lactose et produisant de l’indole a 44°C tels que E. coli.
A partir des tubes positifs du précèdent test, on ensemence 1ml de chaque tube dans un autre tube
de VBL contenant une cloche de durham et un tube contenant de l’eau peptonnée exempte d’indole.
L’incubation se fait à 44°C pendant 24h.

Les résultats positifs se traduisent par un trouble et un dégagement de gaz dans la cloche de durham,
ainsi que l’apparition d’un anneau rouge à la surface du tube contenant l’eau peptonnéeaprès
addition du réactif de Kovacs.

III.2/ Recherche et dénombrement des Streptococcus fécaux

a)Test de présomption
Leur recherche se fait sur le milieu Roth D/C (azide de sodium comme agent sélectif).
Répartie dans des tubes à essai a raison de 10ml. 1ml de chaque dilution décimale est
ensemencé dans le milieu Roth (3 tubes par dilution). L’incubation se fait à 37C pendant 48h. Le
test est noté positif quand il y a apparition d’un trouble microbien dans le milieu Roth.

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c) Test de confirmation
Si le test de présomption est positif, un repiquage sur le milieu de Litsky, qui contient
l’azide de sodium et le cristal violet comme agents sélectifs, est effectué. L’incubation des tubes est
réaliséeà 37C pendant 24h. Le test positif se traduit par l’apparition d’une pastille violette au fond
du tube.

III.3/ Recherche et dénombrement de la flore aérobie mésophile totale

C’est l’ensemble des microorganismes présents dans l’air libre et dont la croissance
optimale est située entre 20 et 37°C. Cette flore est un indicateur de la qualité générale du produit à
analyser. Le milieu utilisé est une gélose nutritive de type PCA (Plate Count Agar) exempte
d’inhibiteurs et d’indicateurs colorés. 0.1ml de chaque dilution est ensemencée dans des boites de
pétrie contenant la PCA.

Apres incubation à 30C pendant 72h, la flore apparait sous forme de colonies compris entre
30 et 300.

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Les résultats sont exprimés en nombre de germes par ml, et donnes par la formule suivante :
X= N.1/D.1/V
X : ombre de germes par ml de produit
N : nombre de colonies.
V : volume de dilution
D : facteur de dilution ou la dilution considérée.

II.4/ Recherche et dénombrement des Levures et Moisissure

Les champignons inferieur sont incapables de se développer en milieu acide et froid. Ils
provoquent des défauts de fabrication qui se traduisent par des altérations nutritionnelles et
organoleptiques du produit.
Le milieu utilisé doit inhiber la croissance de toutes les bactéries, il doit, donc renfermer une
substance inhibitrice à leur développement (antibiotique). La substance choisie est l’oxytétracycline
pour OGA le chloramphénicol pour le milieu sabouraud et l’acide pour le PDA.
A partir de chaque dilution décimale, ensemencer aseptiquement 0,1ml dans une boite de
pétri contenant de la gélose OGA, étaler cette suspension à l’aide d’un râteau stérile, puis incuber a
25°C pendant a 5 jours.
Les levures forment des colonies rondes semblables aux colonies bactériennes, elles sont brillantes
et bombes. Les moisissures ont un aspect velouté et sont plus grandes.

III.5/ Recherche et dénombrement des genres sulfito-reducteurs (Clostridium

perfringens)

Le milieu utilisé est la gélose viande-foie, additionnée de sulfite de sodium et d’alun de fer.
L’action des germes sulfito-reducteurs conduit à la réduction de sulfite de sodium en présence
d’alun de fer en sulfure, donnant la couleur noire aux colonies.

Introduire respectivement 5ml de la dilution 10-1dans 2 tubes stériles. Les 2 tubes sont portés
dans un bain marie a 80°C pendant 10 min, puis refroidis sous un courant d’eau, on verse ensuite

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stérilement la gélose viande-foie additionnée de sulfite de sodium et d’alun de fer. Apres incubation
des tubes à 37°C pendant 72h, les colonies apparaissent noires ? Les résultats sont exprimés par
nombre de spores par ml de produit.

III.6/ Recherche des Staphylococcus aureus

La recherche de S. aureus se fait sur milieu solide sélectif Baird Parker qui contient du
chlorure de lithium, du tellurite, le glycocolle et le pyruvate qui agissent comme accélérateur de
croissance et en fin, le jaune d’œuf qui joue un rôle nutritif et révélateur enzymatique.

A l’aide d’une pipette stérile, mettre 1ml de chaque dilution est introduit dans un tube
contenant le milieu précité. Apres homogénéisation, les tubes sont incubés à 37°C pendant 48h. La
présence de S. aureus est révèle par deux caractéristiques :
• Réduction de tellurite en tellure donnant des colonies noires.
• Hydrolyse des lipoprotéines du jaune d’œuf signalé par l’halo clair entourant leurs
colonies noires.
L’isolement de cette espèce pathogène est réalisé à partir des tubes notés positifs.
1ml est ensemencé en strie sur la gélose Chapman puis incubé à 37°C pendant 24h.
Les colonies de S.aureus apparaissent noires brillantes entourées d’un halo jaune brillant.

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