L’immobilisation de la

biomolécule sur le transducteur

Les Biorécepteurs et les transducteurs
 Introduction
 La conception d'un biocapteur nécessite l'immobilisation du
biorécepteur sur le transducteur.
 L’objectif de toute méthode d’immobilisation est de retenir l’activité
maximale du ligand biologique sur la surface du transducteur ⇨
permet une détection immédiate et très sensible du processus de
reconnaissance moléculaire et une réutilisation éventuelle du
biocapteur.
 Les techniques d'immobilisation ont été développées pour
l'immobilisation d'enzyme, mais elles sont applicables à d'autres
protéines.
Définition de L’immobilisation

‘’ la technique utilisée pour la fixation physique ou chimique de

cellules, organites, enzymes ou autres protéines (par exemple des
anticorps monoclonaux) sur un support solide, dans une matrice solide
ou retenue par une membrane, afin d'augmenter leur stabilité et de
rendre leur répétition possible ou utilisation continue ’’. ( IUPAC )
 L’immobilisation

 Le choix de la technique d'immobilisation dépend:

• Des conditions d'utilisation du capteur
• La nature du ligand biologique
• Le type de transducteur utilisé
• Les propriétés physico-chimiquue de l’analyte

 Plusieurs modes d’immobilisation de l’élément biologique

peuvent être envisagés.
Les différentes méthodes d’immobilisation

Plusieurs modes d’immobilisation de

l’élément biologique peuvent être envisagés
notamment:
• L’adsorption (Adsorption)
• Le greffage/ couplage covalent (Covalent
bond)
• La réticulation (Crosslinking)
• L'inclusion ou piégeage (Entrapment)
• L’encapsulation (Encapsulation)
Et autres:
• La méthode Langmuir-Blodgett
 Adsorption
• L'adsorption est due à des interactions de type ionique, hydrophobe ou encore aux
liaisons hydrogène entre l'enzyme et la surface du transducteur.
• Cette technique permet une immobilisation simple.
• Toutefois les enzymes ainsi immobilisés peuvent facilement se désorber sous l'action
du pH ou de la force ionique.
• La stabilité et la durée d'utilisation des biocapteurs ainsi obtenus se trouvent
diminuées.
• Malgré la simplicité de mise en œuvre de cette technique d'immobilisation, elle
demeure peu utilisée pour la conception des biocapteurs.
Couplage Covalent
• Le couplage covalent d'enzyme sur un transducteur nécessite la présence d'un
groupement fonctionnel sur la surface de celui-ci.
Ces groupements sont en général -COOH, -NH2, -OH ou -SH; ils sont peu réactifs
chimiquement et il convient de les activer pour qu'ils réagissent dans des
conditions douces avec des groupements fonctionnels de l'enzyme,
n'intervenant pas dans le processus de reconnaissance moléculaire.
• Le principe de cette méthode
d’immobilisation est de faire réagir le
groupement fonctionnel libre de l’enzyme
avec un groupement fonctionnel du réactif
Exemple

Le terme acide carboxylique désigne une molécule comprenant un groupe carboxyle (–C(O)OH).
un carbodimide est un groupe fonctionnel de formule RN = C = NR.
La réticulation
La liaison par réticulation : type d’immobilisation au cours duquel les protéines
(enzymes, protéines membranaires dans le cas de cellules entières…) sont liées
entre elles par des liaisons covalentes au moyen d’agents de réticulation (ex.
glutaraldéhyde).

Les biorécepteurs immobilisés par réticulation peuvent être préparés par 2

moyens différents:
1. La réticulation des molécules d’enzyme sur le glutaraldéhyde (formation
d’agrégats insolubles).
2. L’adsorption des enzymes sur la surface est accompagnée par une réticulation.
 La réticulation
• Il existe deux méthodes de réticulation, soit les enzymes sont reliées entre elles par
des agents réticulant de façon directe, soit en plus de l’agent réticulant une protéine
inerte peut être utilisée afin de faciliter ou améliorer la réticulation, on parle alors de
co-réticulation.
• Les enzymes, après avoir été adsorbées sur un support, sont mises en contact avec un
agent réticulant afin de donner un réseau enzymatique tridimensionnel et qui
contrairement à l’enzyme seule est insoluble
Exemple: la réticulation au glutaraldéhyde:

Glutaraldéhyde : c’est un substance utilisé pour la fixation des protéines et la stérilisation

Exemple: la co-réticulation au glutaraldéhyde:

Les albumines sont des protéines solubles dans l'eau pure, moins dans l'eau salée
Micro-encapsulation
La micro-encapsulation consiste au confinement du bio-récepteur à
l'intérieur d'une sphère creuse semi-perméable de diamètre d'une
dizaine de microns dont la paroi est faite d'un polymère.

piégeage du bio-récepteur sur le transducteur à l’aide d’une membrane

inerte
 Inclusion dans un gel

• Un gel polymérique est préparé dans une solution contenant la matière biologique.
• Le bio-récepteur (souvent enzyme) est ainsi emprisonné dans la matrice du gel
(polyacrylamide …).
• Toutefois cette technique est parfois limitée par la taille des pores du gel qui
favorise le relargage des enzymes de faible poids moléculaire.
• Dans cette méthode, l'activité de l'enzyme est dépendante de microenvironnement
local de l'enzyme immobilisée (pH, force ionique, diffusion moléculaire, etc.
 Comparaison entre les méthodes d’immobilisations
Simple Méthodes Avantage
Adsorption sur des matrices insolubles Simple,
(par exemple, les liaisons ioniques ou les
forces hydrophobes)
piégeage dans un gel une universel pour toute
enzyme, produit chimique
doux
réticulation par un réactif procédure simple, forte liaison
chimique des biomolécules;
multifonctionnel (tel que les dérivés largement utilisé pour stabiliser des
de glutaraldéhyde ) enzymes ou des protéines
physiquement absorbées qui sont
liées par covalence sur un support
liaison covalente sur membrane, complexe enzymatique stable, la fuite
des biomolécules est très peu
supports insolubles probable, idéale pour la production
complexe
de masse et la commercialisation
Inconvénient
les liaisons enzymatiques Moins stable
dépendent fortement du pH, de la
température du solvant,
grandes barrières de diffusion, perte
d'activité enzymatique par fuite,
dénaturation possible des molécules
enzymatiques à cause des radicaux
libres
difficile à contrôler la réaction,
nécessite une grande quantité
d'enzyme, la couche de protéines a un
caractère gélatineux (manque de
rigidité), une activité enzymatique
relativement faible
possibilité de perte d'activité
compliquée et longue en raison de
la réaction impliquant des groupes Plus stable
essentiels à l'activité
L’immobilisation en pratique

l’immobilisation
d’enzyme sur un
surface d’électrode
Caractéristique d’un biocapteur

• La sélectivité
• Précision
• Répétabilité
• Limite de détection
• La sensibilité
• Le temps de réponse
Les avantages
• Un dispositif électronique
• Dimension (compact /petit )
• Il peuvent être intégrés implémenté
• Mesure rapide
• Temps de réponse rapide
• Mesurer l’analyte d’un mélange complexe
• Aucune préparation préalable