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La centrifugation pour l'extraction du liquide
apoplastique des feuilles à l'aide de Phaseolus
vulgaris "les haricots"
Présenter par :
Chabane Linda
Chettibi Marwa
Khalfouni Rayane Fatma Zohra
Touzene Abderrahmane Ramzi
Sommaire..................................................................................................................................1
Liste des figures........................................................................................................................1
Liste des tableaux.....................................................................................................................1
Liste des abréviations...............................................................................................................1
Introduction générale.............................................................................................................10
Chapitre 1 : Définition des haricots commun :....................................................................12
La cellule..................................................................................................................................13
Centrifugation :.......................................................................................................................15
Materail de centrifugation :...................................................................................................15
L’infiltration-centrifugation :................................................................................................17
Chapitre 2:Introduction.........................................................................................................18
Protocole :................................................................................................................................18
Preparation de la solution de nettoyage apoplastique:........................................................18
Test de contamination cytoplasmique :.................................................................................21
Calcul du facteur de dilution des apoplaste..........................................................................21
Concentrez FAE a la force maximale par lyophilisation :..................................................22
Analyse des métabolites : .......................................................................................................22
Chapitre 3 :Les résultats........................................................................................................24
Discussion.................................................................................................................................26
Chapitre 6 Conclusion générale............................................................................................30
Chapitre 7 Références bibliographiques..............................................................................32
Chapitre 8 Titre de l'annexe..................................................................................................34
i
3.3. Conclusion..................................................................................................................11
Conclusion générale................................................................................................................12
Bibliographie...........................................................................................................................14
A. Titre de l'annexe...........................................................................................................15
ii
B. Titre de l'annexe...........................................................................................................16
iv
Chapitre 4 Liste des abréviations
- Glucose-6-phosphate G-6-PG
- Glucose-6-phosphate déshydrogénase G6PDH
- Apoplaste fluide de lavage FAE
- Résonance Magnétique Nucléaire RMN
- High performance liquid chromatography HPLC
- Gas chromatography-mass spectrometry GC-MS
- La malate déshydrogénase MDH
- MSTFA N-méthyl-N-(triméthylsilyl) trifluoroacétamide
- Phaseolus vulgaris P.vulgaris
Chapitre 5 Introduction générale
Introduction générale :
1
2
Chapitre 1
B
Définition des haricots commun :
Le haricot commun Phaseolus vulgaris L. est une plante annuelle appartenant à l'ordre des
Fabales et à la famille des Fabacées [1](figure 1), est une plante originaire d'Amérique
centrale et d'Amérique du SudCette plante a été domestiqué séparément en Amérique centrale
(Mexique et Guatemala) et dans les Andes d'Amérique du Sud (principalement le Pérou)
pendant plus de 5000 ans, ensuite elle est transportée vers d'autres continents depuis le 16ème
siècle.[2] Le haricot commun joue un rôle important dans l'alimentation humaine comme
source de vitamines, de protéines, de fibres, de sels minéraux et dans la fixation biologique de
l'azote . Au delà de ses propriétés nutritives interessantes, le haricot possède des vertus
diurétiques, anti-inflammatoires, hypoglycémiantes, régulatrices du transit et cicatrisantes. Il
est un vrai atout pour les troubles rénaux, les douleurs articulaires, le transit, les diabétiques,
la perte de poids ainsi que pour les lésions cutanées [1].
3
La cellule:
Taille : Les cellules sont les plus petites unités de vie, dont la taille varie de quelques
microns à plusieurs millimètres.[5]
Structure : Les cellules sont des structures complexes contenant des organites
spécialisés qui assurent leur fonction.[6]
Fonction autonome : chaque cellule fonctionne de manière autonome mais en
coordination avec toutes les autres cellules du corps.[5]
Rôle : Les cellules maintiennent la vie d'un organisme en assurant son fonctionnement
normal[6]
Division cellulaire : les cellules se reproduisent par le processus de mitose, permettant
la croissance et la réparation des tissus. [5]
La cellule
Animal Végétale
3
3
Les cellules végétales :
Cellules végétales sont les unités élémentaires, très nombreuses, constituant les organismes
végétaux. Les cellules végétales des Angiospermes ont en générale une forme géométrique
car elles sont entourées par une paroi squelettique rigide. L’intérieur de la cellule est occupé
en grande partie par une vacuole. Elle renferme aussi des organites appelés chloroplastes qui
lui sont spécifique.[7](figure 2) .
La paroi cellulaire assure la rigidité de la plante et joue un rôle de soutien [8] Elle est
composée de trois couches : couche intermédiaire (ou couche intermédiaire), paroi primaire et
membrane plasmique. Les couches elles-mêmes contiennent de la pectine, de l'hémicellulose
et de la cellulose liées par des microfibrilles de cellulose, ainsi que des protéines solubles. [9]
(figure 3).
La centrifugation est un processus qui implique l'utilisation de la force centrifuge [10] pour la
sédimentation de mélanges à l'aide d'une centrifugeuse. Ce processus est utilisé pour séparer
deux liquides non miscibles, les composants plus denses du mélange migrant loin de l'axe de
la centrifugeuse, tandis que les composants moins denses du mélange migrent vers l'axe. La
centrifugation modifie la force gravitationnelle effective sur le tube/la bouteille de manière à
provoquer plus rapidement et plus complètement l'accumulation du précipité (« pastille ») au
fond du tube. La solution restante est proprement « surnageant». Le liquide surnageant est
rapidement décanté du tube/flacon sans perturber le précipité [11].
La force centrifuge est créée par un mouvement de rotation très rapide dans une centrifugeuse
L'appareil utilisé est une machine tournante à grande vitesse appelée centrifugeuse [12].
Matériels de centrifugation :
En fonction des exigences expérimentales, notamment en ce qui concerne les accélérations
nécessaires, les volumes de matériel à centrifuger, la température de travail, etc., on a créé une variété
d'appareils.
Centrifugeuses de table :
11
Centrifugeuses au sol :
Ultracentrifugeuses :
Ce sont des appareils complexes et coûteux qui permettent d'atteindre des accélérations très
élevées (jusqu'à 300 000 xg) en faisant tourner des rotors très rapidement (50-85 000 RPM).
Micro-centrifugeuses :
On a aussi développé des centrifugeuses spécialement conçues pour les micro-volumes très
souvent employés en biochimie moderne.
Les microtubes à centrifuger sont des petits tubes coniques généralement de 1.5 mL fait de
polypropylène et assez peu dispendieux. Les centrifugeuses de
ce type peuvent être réfrigérées et atteindre des accélérations de
l'ordre de 12-15 000 x g. Les modèles les moins couteux n'ont
pas de contrôle de vitesse et ne sont pas réfrigérés.
Figure 7: Micro-centrifugeuses
11
Ultracentrifugeuses analytiques :
Ce sont des appareils de moins en moins utilisés. Ces centrifugeuses servent surtout à
analyser la taille et la masse des particules et des protéines. D'autres techniques beaucoup
moins coûteuses sont utilisées de nos jours : électrophorèse, filtration sur gel...
Centrifugation différentielle :
L’infiltration-centrifugation :
Chapitre 2
B
11
Deuxième chapitre
Introduction
Protocole :
La technique d'infiltration-centrifugation est une méthode en deux étapes qui consiste à
remplacer l'espace d'air apoplastique par un liquide d'infiltration aqueux, qui se mélange au
liquide apoplastique natif, puis à récupérer le mélange liquide d'infiltration/fluide
apoplastique par centrifugation des feuilles. Cette installation permet de soumettre
l'échantillon à un large éventail de techniques biochimiques et analytiques en aval, telles que
l'électrophorèse des protéines, la mesure de l'activité enzymatique, la RMN, de nombreux
types de chromatographie et la spectrométrie de masse.
Dans les protocoles suivants, nous décrivons comment réaliser la technique d'infiltration-
centrifugation en utilisant des feuilles de Phaseolus vulgaris
NOTE : Un relâchement rapide du vide peut entraîner une lyse cellulaire et une
contamination cytoplasmique.
6. Répéter l'étape (1, 3,5) jusqu'à ce que la feuille soit complètement infiltrée, comme le
montre la couleur foncée des zones infiltrées.
7. Retirer la feuille de la fiole. Sécher avec du papier absorbant, avec précaution, la
feuille afin d'éliminer le liquide de surface.
11
8. Mesurer le poids de la feuille infiltrée. Calculer la différence de poids avant et après
l'infiltration, qui correspond approximativement au volume d'infiltration.
D. Récupération de la FTA par centrifugation :
1. Placer la feuille sur un morceau de Parafilm de 10 cm de large. À l'aide d'une pointe
de pipette de 5 ml (ou d'un objet de taille similaire), roulez la feuille à l'intérieur.
2. Insérer la feuille enroulée avec de pointes de pipette dans une seringue de 20 ml.
Placez les bords coupés de la feuille vers le haut. Insérer la seringue dans un tube
propre de 50 ml en polyéthylène ou en polycarbonate.
3. Centrifuger la seringue dans le tube pendant 10 minutes à 1 000 x g dans un rotor à
godets oscillants à 4 °C.
NOTE : L'examen visuel des feuilles après centrifugation doit révéler que la majorité du
liquide d'infiltration a été expulsée. Des taches vertes plus foncées indiquent qu'une durée de
centrifugation supplémentaire est nécessaire.
11
4 Pour la quantification des métabolites cytoplasmiques tels que le glucose-6-phosphate
(G-6-P), en utilisant la GC-MS comme décrit à l'étape 5.
11
6. Transférer les tubes congelés dans un ou plusieurs récipients de lyophilisation
réfrigérés. Pendant le transfert des tubes, remplacer le couvercle par un autre qui a été
percé avec un objet pointu pour permettre l'échange de gaz.
7. Fixer les récipients au lyophilisateur et lyophiliser complètement les échantillons.
8. Retirer les échantillons de la machine et reconstituer la FAE en ajoutant la quantité
calculée d'eau distillée.
9. Remettre le joint non ouvert en place et conserver les échantillons à -80 °C.
11
Chapitre 3
B Resultats et discussion
Les résultats:
11
Typiques des extractions de FAE effectuées sur des feuilles saines de P. vulgaris
Tendergreen leaves âgées de 3 semaines, en utilisant de l'eau distillée comme liquide
d'infiltration, sont présentés dans le tableau 2. Les jeunes feuilles de P. vulgaris se prêtent à
l'infiltration et, à la vitesse de centrifugation utilisée ici (1 000 x g), l'élimination de la
majorité du liquide d'infiltration par centrifugation peut être observée directement lorsque les
feuilles reprennent leur couleur verte d'origine. Le poids frais des feuilles de P. vulgaris était
en moyenne de 1,1 x g avant l'infiltration et a produit 0,5 ml de FAE par gramme de poids
frais. La concentration en protéines de la FAE a été déterminée à 0,18 ± 0,08 mg/ml à l'aide
d'un test standard de Bradford sur les protéines. Le facteur de dilution pour ces feuilles,
calculé en mesurant la dilution de l'indigo carmin, était de 2,3 ± 0,3 fois. Les valeurs ci-dessus
peuvent varier considérablement d'une espèce à l'autre et des expériences pilotes sont
nécessaires pour déterminer le rendement de la FAE par gramme de poids frais de feuille,
ainsi que la concentration en protéines de la FAE et le facteur de dilution que l'on peut
attendre pour un type de feuille donné.
L'intégrité des cellules peut être atteinte à la fois lors de l'étape d'infiltration, si les
changements de pression sont trop rapides, et lors de l'étape de centrifugation, si la force
centrifuge est trop élevée. Il est donc nécessaire d'analyser les échantillons d'EAF pour
détecter des signes de contamination cytoplasmique ; idéalement, plusieurs analyses
indépendantes sont effectuées. Les résultats de trois tests possibles sont présentés dans le
tableau" 2".
Phaseolus vulgaris
11
Tableau 1.1 :Les résultats typiques pour les extractions de la FAE P. vulgaris cv.
Tendergreen feuilles
Dans les extractions bien réalisées des FAE de P. vulgaris, la G6PDH était indétectable par un
test enzymatique standard. Ceci est conforme avec d'autres rapports où l'activité de la G6PDH
n'est détectable qu'au-dessus d'un seuil de force centrifuge [12]. En revanche, un niveau de
base d'activité malate déshydrogénase (2,5 U/ml) était détectable dans tous les échantillons de
P. vulgaris FAE à l'aide d'un test métabolique standard. L'augmentation de la force centrifuge
au-delà d'un seuil de 1 000 x g a entraîné une augmentation de l'activité MDH (résultats non
présentés). Étant donné que l'apoplaste d'autres espèces est connu pour contenir une activité
MDH endogène [18], la quantité détectée ici est considérée comme une activité apoplastique
identique, et des augmentations significatives au-dessus de ce niveau de base indiquent une
contamination. Les métabolites que l'on pense être principalement cytoplasmiques, tels que
les hexose-6-phosphates, peuvent également être utilisés pour évaluer la contamination par les
FAE dans ce cas, l'analyse GC-MS a permis de détecter des niveaux de G-6-P nuls ou à l'état
de traces dans les extractions d’FAE.
L'analyse des métabolites par GC-MS des feuilles de P. vulgaris FAE donne généralement 40
à 60 métabolites identifiables et un nombre à peu près égal de composés non identifiables
(figure 2). Les acides organiques, les sucres simples et les acides aminés représentent la
majeure partie des métabolites identifiables ; toutefois, des métabolites secondaires de plantes
11
ont également été détectés et quantifiés à partir de la FAE. Plusieurs exemples de pics
provenant de ces différentes classes de molécules sont indiqués sur la figure 2. D'autres
techniques d'analyse en aval sont applicables à ces échantillons d'AWF pour quantifier
diverses molécules, par exemple : ICP-MS, RMN, HPLC, spectroscopie d'absorption
atomique, spectrométrie de masse des protéines.
11
la FAE devrait être exempt de toute contamination par des protéines cytoplasmiques telles
que la Rubisco ; cependant, dans la pratique, il est difficile d'y parvenir. La présence d'une
bande de protéine Rubisco à ~53 kDa après SDS-PAGE fournit un test qualitatif
supplémentaire pour l'intégrité des échantillons de FAE. Par exemple, Par exemple,
l'échantillon chargé sur la trace 2 de la figure 9 contient une plus grande quantité de
contamination par la Rubisco qu'un échantillon de voie.
Discussion:
11
Les conditions de croissance des plantes doivent également être normalisées autant que
possible dans le cadre de l'expérience. L'utilisation d'armoires de croissance est préférable car
elles permettent de maintenir des régimes d'humidité, de température et d'intensité lumineuse
cohérents. La récolte des feuilles doit toujours avoir lieu au même moment de la journée car
les concentrations de métabolites, d'enzymes, etc. varient au cours du cycle diurne[14]. Enfin,
pour s'assurer que les feuilles de la plante ont toutes la même pression de turgescence, les
plantes doivent être arrosées peu de temps avant environs 1 heure la récolte.
Par conséquent, la procédure pour un type de feuille donné doit être un mélange optimisé
entre la maximisation du rendement et la minimisation de la contamination cytoplasmique de
la FAE. Dans tous les cas, il convient d'utiliser la vitesse de centrifugation la plus basse à
laquelle la FAE peut être récupérée afin d'éviter une éventuelle perturbation mécanique des
cellules de la feuille. L'optimisation de la vitesse de centrifugation doit être déterminée de
manière expérimentale pour chaque type de feuille en contrôlant le volume récupéré et la
contamination de l'apoplaste pour une gamme de vitesses de centrifugation. Il a été observé
que les activités des enzymes identifiées, telles que la MDH, la G6PDH et la glucose-
phosphate isomérase, restent faibles jusqu'à ce qu'un seuil de force centrifuge soit dépassé, au-
delà duquel ces activités augmentent rapidement, probablement en raison d'une fuite du
[9,12,14]
cytoplasme . L'utilisation de Parafilm comme support pendant l'étape de centrifugation,
peut améliorer l'efficacité de l'extraction de la FAE et peut minimiser les dommages
mécaniques. En outre, l'utilisation de Parafilm améliore la visualisation de la feuille après la
centrifugation, lorsqu'il convient d'examiner la feuille pour vérifier qu'elle n'est pas
endommagée et que l'extraction de la FAE est complète.
Manipulation et le stockage du fluide apoplastique extrait est important. FAE a été montré
pour contenir une multitude de proteases et d'autres enzymes [13,20], ainsi que des composés
organiques volatils. Par conséquent, pour réduire les changements à la composition de la FAE
après la récupération il est recommandé de conserver des échantillons sur la glace ou
autrement stockées à -80 ° C. En outre, dosages enzymatiques de la FAE doivent être
effectuées dès que possible après l'extraction de limiter l'inactivation enzymatique.
Limites de la technique
Un deuxième inconvénient potentiel est que l'élution de la FAE par centrifugation ne tient pas
compte de toutes les molécules présentes dans l'apoplaste pour plusieurs raisons. Certains
composés, en particulier les cations et les protéines peuvent être étroitement associés à la
13.
paroi cellulaire chargée négativement et ne se éluent avec le FAE D'autres molécules telles
que les protéines peuvent être trop grandes pour éluer de manière efficace hors de l'apoplaste
aux vitesses de centrifugation 14 utilisés..
Plusieurs tests existent pour déterminer la contamination cytoplasmique, mais aucune ne est
universellement acceptée. Les dosages d'enzymes cytoplasmiques principalement (par
exemple, G6PDH, phosphate isomérase hexose, MDH) ont l'avantage d'être facile à réaliser,
mais peut ne pas corréler bien avec fuites cytoplasmique (14,18). L'évaluation des métabolites
cytoplasmiques (par exemple, les phosphates de hexose, chlorophylle) est peut-être plus
indicatif, mais est moins bien établie 11. Néanmoins, les deux types de test peut être utile pour
la quantification relative de la contamination entre les échantillons apoplastique. Idéalement,
plusieurs mesures indépendantes devraient être utilisés pour valider l'intégrité de l'échantillon
de la FAE.
11
Chapitre 6
Conclusion générale:
30
Chapitre 7 Références bibliographiques
Voici un autre lien vers les nomes APA
13: laura mckinney 6 avril 2021 différence entre la centrifugation par gradient et par gradient de
densité
14
(Juin 2014)
[2] : Metouchi Imene et Yahia Lamia. Evaluation de l'effet d'engrais organique sur
l'expression végétative du Haricot cas de la biomasse du romarin et pin pignon
(2019/2020) .70.
Sec. Agroecology
[8] : Bailey, R. (2020, January 24). Cell theory: A core principle of biology.
ThoughtCo.
31
14 : Rico, A., Preston, G. M. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and
apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in
the tomato apoplast. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).
17 Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. Gas chromatography mass
spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).
12 Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves
by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).
18 Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for
peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley
(Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plan
Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of
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(2012).
Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes:
identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
19 Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast
proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005)
12 Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice
leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668
(2012).
18 Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for
peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley
(Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plan
11 Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of
apoplastic metabolites in tomato leaves. Physiological and Molecular Plant
Pathology. 78, 31-37 (2012).
12 Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes:
identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
19 Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast
proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005)
32
Annexe A
B
Chapitre 8 Titre de l'annexe
33
Figure 11: Pour une glucose-6-phosphate déshydrogénase norme (G6PDH)
34
35
Abstract
The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the
plasma membrane and comprises the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves
is the site of several important biological processes, including cell wall formation, nutrient
and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses against
pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique
for analysing the soluble composition of the apoplast of various plants. The liquid obtained
by this method is commonly referred to as apoplast washing fluid (AWF). The following
protocol describes an optimised vacuum infiltration and centrifugation method for the
extraction of apoplast wash fluid from the leaves of Phaseolus vulgaris (bean) cv.
Tendergreen. The limitations of this method and optimisation of the protocol for other plant
species are discussed. The recovered MEF can be used in a wide range of downstream
experiments that seek to characterise apoplast composition and how it varies in response to
plant species, plant development and environmental conditions, or to determine how micro-
organisms grow in the apoplast fluid and respond to changes in its composition.
36