Caractérisation D'un Probiotique Autochtone

REPUBLIQUE TUNISIENNE
MINISTERE DE L’AGRICULTURE, MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT

DES RESSOURCES HYDRAULIQUES ET SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE
DE LA PECHE SCIENTIFIQUE
INSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE DE TUNISIE
Ecole Doctorale Sciences et Techniques de L’Agronomie et de l’Environnement
THESE DE DOCTORAT EN SCIENCES AGRONOMIQUES
Spécialité Sciences animales
Caractérisation d’un probiotique autochtone et étude de son effet
sur le microbiote caecal et les performances zootechniques
des lapereaux en croissance
Soutenue publiquement par
Sana LENGLIZ BEN RAYANA

Le 21 Avril 2022 à l’INAT
Devant le jury composé de
M. Faycel BEN JEDDI, Professeur, INAT Président

M. Taha NAJAR, Professeur, INAT Directeur de thèse
Mme Lilia MESSADI, Professeur, ENMV Rapporteur
M. Brahim HADDAD, Professeur, INAT Rapporteur
M. Salah HAMMAMI, Professeur, ENMV Examinateur
M. Mohamed Salah ABBASSI, Maitre-assistant, IRVT Membre invité
Dédicaces
Je dédie ce travail :
À mes très chers parents Abdelmajid et Bahija ; Ceux qui m’ont tout donné sans compter
qu’ils trouvent ici tout mon amour et ma gratitude.
Merci d’avoir été toujours là pour moi. Que Dieu vous préserve !
À mon très cher époux Aniss, pour son encouragement, son aide, ses conseils et sa
compréhension. Qu’il trouve ici l’expression de mon amour et mes remerciements.
À mes enfants, mes amours, les prunelles de mes yeux, Zeineb et Youssef ; Merci d’égayer ma
vie ! Je vous souhaite la santé, le bonheur et la réussite.
À mes très chers frères Walid et Brahim, pour leurs encouragements et pour tout ce que nous
avons partagé ensemble. Je vous aime !
À Imen, Maila et Inès.
À l’âme de ma très chère tante Fahima.
À toute ma famille.
À ma belle-famille.
À mes amis et mes collègues.
À tous ceux qui me sont chers.

Remerciements
Ce travail a été réalisé entre le laboratoire de recherche de bactériologie de l’Institut

de la Recherche Vétérinaire de Tunisie et le laboratoire de zootechnie de l’Institut National
Agronomique de Tunisie. Il fait partie des travaux de recherche du Laboratoire Matériaux
Molécules et Applications, LR11ES22 sous la direction du Professeur Manef Abderrabba.
Je tiens à exprimer mon respect et ma profonde reconnaissance à mon directeur de thèse

Monsieur Taha Najar, Professeur en Production Animale à l’Institut National Agronomique
de Tunisie. Sa confiance, sa disponibilité et ses conseils m’ont beaucoup aidé à mener ce travail.
Tous mes remerciements et ma profonde gratitude à mon collègue et co-encadrant

de thèse, Monsieur Mohamed Salah Abbassi, Maitre-assistant de l’enseignement supérieur
agricole à l’Institut de la Recherche Vétérinaire de Tunisie. Merci pour ton aide tout au long de
ce travail. Nous avons partagé les réussites et les galères ensemble.
Je tiens à remercier les membres du jury qui m’ont fait l’honneur d’accepter de juger ce travail :
Au président du jury Monsieur Faycel Ben Jeddi, Professeur et Directeur Général de

l’Institut National Agronomique de Tunisie, vous me faites l’honneur de présider ce jury de
thèse, ma sincère reconnaissance et mon profond respect.
Aux rapporteurs,
Madame Lilia Messadi, Professeur Hospitalo-universitaire en Microbiologie à l’Ecole

Nationale de Médecine Vétérinaire et Monsieur Brahim Haddad, Professeur en Production
Animale à l’Institut National Agronomique de Tunisie pour avoir consacré de leurs temps
et accepté de rapporter ce travail. Je vous présente ma profonde gratitude et tout mon respect.
A l’examinateur, Monsieur Salah Hammami, Professeur à l’Ecole Nationale

de Médecine Vétérinaire je vous remercie à l’attention que vous avez porté à ce travail. Mon
profond respect et ma vive reconnaissance.
Je tiens à remercier le Directeur général de l’Institut de la Recherche Vétérinaire de Tunisie,

Monsieur Noureddine Ben Chehida qui m’a encouragé à réaliser ce travail et a facilité son
déroulement.
Un merci particulier à Monsieur Hédfi Belgacem, Technicien au Laboratoire de Zootechnie
de l’INAT. Je ne vous remercierai jamais assez pour votre aide et votre disponibilité.
Je tiens à remercier le personnel de la Direction Générale des forêts pour leur aide et facilitation
pour la collecte des échantillons.
Je remercie M. Taha Sassi de m’avoir fourni la souche probiotique commerciale, M. Anis

Raddaoui pour son aide et Mme Fadia Zeribi pour son aide et sa disponibilité.
Mes remerciements s’adressent aussi à tous mes collègues de l’IRVT et les membres
du laboratoire de recherche de bactériologie ainsi qu’à l’équipe de recherche du laboratoire de
zootechnie de l’INAT.
Ce travail est le fruit de plusieurs collaborations, merci à tous ceux qui y ont contribué de près
ou de loin.
Table des matières
Introduction générale ……………………………………………………………... 1
Synthèse bibliographique
I. Particularités anatomiques et physiologiques digestives du lapin………………... 4
1.Anatomie……………………………………………………………………….. 4
2.Physiologie de l’appareil digestif et digestibilité……………………………….. 5
3.Caractérisation de la microflore du caecum…………………………………… 7
4. Pathologie digestive chez le lapin……………………………………………… 8
4.1. Les conditions d’élevage pour les lapins…………………………………. 9
4.2. L’alimentation…………………………………………………………….. 9
4.3. Les agents infectieux………………………………………………………. 10
II. Les probiotiques………………………………………………………………….. 12
1. Historique……………………………………………………………………… 12
2. Utilisation des probiotiques……………………………………………………. 13
2.1. Utilisation des probiotiques en alimentation et médecine humaine………… 13
2.2. Utilisation des probiotiques chez les animaux d’élevage…………………… 16
3. Mécanismes d’action des probiotiques………………………………………. 21
III. Les bactéries lactiques et Enterococcus spp…………………………………….. 23
1. Généralités sur les bactéries lactiques………………………………………….. 23
2. Enterococcus spp. ……………………………………………………………... 24
2.1. Taxonomie………………………………………………………………….. 24
2.2. Caractères bactériologiques………………………………………………… 24
2.3. Habitat……………………………………………………………………… 27
2.4. Pathogénicité et facteurs de virulence des entérocoques……………………. 28
3. Résistance des entérocoques aux antibiotiques ……………………………… 32
3.1. Résistance aux bêta-lactamines……………………………………………... 32
3.2. Résistance aux aminoglycosides……………………………………………. 33
3.3. Résistance aux glycopeptides………………………………………………. 35
3.4. Résistance aux oxazolidinones……………………………………………… 36
3.5. Résistance aux tétracyclines et glycylcylines………………………………. 38
3.6. Résistance aux Macrolides- Lincosamides-Streptogramines (MLS)……….. 39
4. Bactériocines des entérocoques : les entérocines………………………………. 41
5. Application des entérocoques comme probiotiques……………………………. 46
5.1. Utilisation des entérocoques comme probiotiques chez l’Homme………….. 46
5.1.1. Traitement de la diarrhée………………………………………………… 46
5.1.2. Traitement du syndrome du côlon irritable (SCI)………………………. 46
5.1.3. Administration pour abaisser le cholestérol sérique…………………….. 47
5.2. Utilisation des entérocoques comme probiotiques chez les animaux
d’élevage……………………………………………………………………………. 47
5.2.1. Administration chez les volailles………………………………………... 47
5.2.2. Administration chez les bovins………………………………………….. 49
5.2.3. Administration chez les lapins………………………………………….. 50
IV. Escherichia coli : pathogénicité et indicateur de résistance aux antibiotiques….. 51
1. Caractéristiques bactériologiques……………………………………………… 51
2. Habitat…………………………………………………………………………. 51
3. Pouvoir pathogène d’Escherichia coli…………………………………………. 53
4. Tendance de la résistance aux antimicrobiens chez E. coli……………………….. 55
4.1. Les β-lactamases à spectre étendu (BLSE) …………………………………. 55
4.2. Les carbapénémases………………………………………………………… 57
4.3. Les céphalosporinases……………………………………………………… 59
4.4. Résistance aux non-bêta-lactamines………………………………………... 59
Matériel et méthodes
I. Souches bactériennes……………………………………………………………… 63
1. Souches bactériennes indicatrices de référence……………………………….. 63
2.Isolement de souches d’entérocoques bactériocinogènes……………………. 63
3. Isolement de souches d’entérocoques et de souches d’E. coli pour l’étude de la
résistance aux antibiotiques………………………………………………………… 64
II. Caractérisation des souches bactériocinogènes…………………………………... 65
1. Détection de l’activité bactériocinogène des isolats d’Enterococcus…………… 65
2. Détermination de la nature protéique de la substance inhibitrice………………. 65
3. Identification des isolats d’entérocoques bactériocinogènes ………………….. 66
3.1. Identification par galerie API……………………………………………….. 66
3.2. Extraction de l’ADN génomique…………………………………………… 66
3.3. Identification des espèces d’entérocoques par PCR………………………… 66
4. Détection des gènes codant les bactériocines………..………………………… 67
5. Evaluation de l’innocuité des isolats d’Enterococcus bactériocinogènes………. 68
5.1. Détection des gènes de virulence…………………………………………… 68
5.2. Etude de la sensibilité aux antibiotiques……………………………………. 69
5.3. Production de gélatinase……………………………………………………. 69
5.4. Production de DNase……………………………………………………….. 70
5.5. Activité hémolytique……………………………………………………….. 70
6. Activité protéolytique………………………………………………………….. 70
7. Croissance à différentes valeurs de pH…………………………………………. 70
8. Tolérance gastrique et biliaire…………………………………………………. 70
9. Coexistence des isolats ………………………………………………………… 71
III. Application de la souche d’Enterococcus bactériocinogène comme candidat
probiotique sur les performances zootechniques des lapereaux en croissance………. 71
1. Protocole expérimental………………………………………………………… 71
2. Mesure des performances zootechniques……………………………………… 74
2.1. Suivi de la croissance (Gain Moyen Quotidien ; GMQ)…………………… 74
2.2. Mesure de l’ingestion alimentaire et calcul de l’indice de consommation… 74
2.3. Mesure de la consommation d’eau…………….…………………………. 74
2.4. Calcul du rapport eau/aliment………………………………………………. 74
3. Composition corporelle et paramètres de la carcasse………………………….. 74
4. Analyses statistiques…………………………………………………………… 75
5. Etude de la microflore caecale…………………………………………………. 75
IV. Etude de la résistance aux antibiotiques de la deuxième collection
d’entérocoques et d’E. coli .……………………………………………………….. 76
1. Résistance aux antibiotiques des entérocoques……..………………………. 76
1.1. Identification des souches d’entérocoques…………………………………. 76
1.2. Test de sensibilité aux antibiotiques………………………………………… 76
1.3. Détection des gènes de résistance aux antibiotiques et des gènes de virulence 76
2. Résistance aux antibiotiques d’E. coli………………………………………. 78
2.1 Antibiogramme……………………………………………………………… 78
2.2. Détection phénotypique de la production des bêta-lactamase………………. 79
2.3. Détection phénotypique de carbapénémases……………………………… 79
2.3.1. Test de Hodge modifié………………………………………………… 79
2.3.2. Détection de carbapénémases de classe B……………………………… 79
2.3.3. Détection des carbapénémases de classe D……………………………. 80
2.4. Caractérisation moléculaire des gènes de résistance aux antibiotiques chez
E. coli ……………………………………………………………………………….. 80
2.4.1. Extraction de l’ADN génomique ……………………………………….. 80
2.4.2. Détection des gènes codant la résistance aux antibiotiques…………….. 80
2.4.2.1. Recherche des gènes codant les carbapénémases et les BLSE ……. 80
2.4.2.2. Recherche des gènes codant la résistance aux sulfamides, à la
tétracycline et aux quinolones à médiation plasmidque…………………………….. 80
2.4.2.3. Recherche d’intégrons et caractérisation de la région conservée
3’(qacΔE-sul1) ……………………………………………………………………… 83
Résultats et discussion
Chapitre I : Sélection et caractérisation des souches d’Enterococcus
bactériocinogènes à partir de fèces de lapins
I. Caractérisation des entérocoques bactériocinogènes……………………………… 84
1. Isolement et caractérisation morphologique et biochimique des isolats………. 84
1.1. Détection de l’activité inhibitrice des entérocoques par la methode des stries. 84
1.2. Détermination de la nature protéique de la substance inhibitrice ………….. 88
2. Identification des isolats bactériocinogènes…………………………………… 89
3. Détection des gènes codant pour les bactériocines……………………………. 89
4. Caractérisation de l’innocuité des souches bactériocinogènes…………………. 90
4.1. Sensibilité aux antibiotiques 90
4.2. Facteurs de virulence : Détection des activités gélatinase, DNase
et hémolyse…………………………………………………………………………. 90
4.3. Caractérisation moléculaire des gènes de virulence ……………………….. 91
5. Sélection des souches probiotiques à partir des souches bactériocinogènes…… 92
5.1. Détection de l’activité protéase……………………………………………... 92
5.2. Croissance à différentes valeurs de pH……………………………………… 92
5.3. Tolérance au suc gastrique et aux sels biliaires 92
5.4. Coexistence ………………………………………………………………… 93
6. Discussion …………………………………………………………………….. 93
Chapitre II : Evaluation de l’antibiorésistance des entérocoques et Escherichia
coli isolés de lapins
1. Résistance aux antibiotiques chez les entérocoques……………………………. 100
1.1. Nombre total des souches et identification ………………………………… 100
1.2. Etude de la sensibilité aux antibiotiques …………………………………… 100
1.3. Gènes codant pour la résistance aux antibiotiques chez les entérocoques…. 103
1.4. Gènes de virulence …………………………………………………………. 108
1.5. Discussion ………………………………………………………………….. 109
1.6. Conclusion …………………………………………………………………. 112
2. Résistance aux antibiotiques chez Escherichia coli …………………………… 114
2.1. Nombre total de souches et identification………………………………… 114
2.2. Etude de la sensibilité aux antibiotiques ……………………………………. 114
2.2.1. Test de Hodge modifié………………………………………………….. 114
2.2.2. Test EDTA ……………………………………………………………… 115
2.2.3. Test témocilline …………………………………………………………. 115
2.3. Caractérisation moléculaire ………………………………………………… 116
2.3.1. Caractérisation des gènes codant les carbapénémases et les BLSE ……. 116
2.3.2. Caractérisation des gènes codant la résistance à la tétracycline, aux
sulfamides et aux fluoroquinolones ……….……………………………………….. 117
2.3.3. Détection des intégrons ………………………………………………… 117
2.4. Discussion………………………………………………………………….. 119
2.5. Conclusion ………………………………………………………………… 122
Chapitre III : Application expérimentale de la souche d’Enterococcus
bactériocinogène comme candidat probiotique sur les performances
zootechniques des lapereaux en croissance
1. Performances zootechniques…………………………………………………... 123
2. Caractéristiques de la carcasse………………………………………………… 125
3. Mesure du pH…………………………………………………………………... 125
4. Etude de la microflore caecale ………………………………………………… 126
5. Discussion …………………………………………………………………….. 129
6. Conclusion ……………………………………………………………………. 132
Conclusion générale et Perspectives……………………………………………… 133
Références bibliographiques ……………………………………………………… 136
Résumé :
Notre étude a été réalisée dans le but de sélectionner et de valoriser des souches d'Enterococcus
probiotiques autochtones du lapin. A partir de 108 isolats d’entérocoques prélevés à partir de
lapins sains, 43 isolats d'entérocoques bactériocinogènes produisant diverses bactériocines
(codées par les gènes entP, entB et entA dans 22, 17 et 14 isolats, respectivement) ont été
identifiées. Après caractérisation phénotypique et génotypique pour déterminer l'innocuité de
ces souches nous avons sélectionné E. durans EntA32 comme souche probiotique candidate. E.
durans EntA32 a été testée (mélangée à l’aliment ou dans l'eau de boisson) sur des lapereaux
en croissance en comparaison à une souche probiotique commerciale. Son utilisation dans
l’aliment a amélioré le GMQ et a conduit à des poids plus importants avec une efficacité
alimentaire nettement meilleure et une augmentation du nombre de bactéries lactiques dans les
cæca de lapin et la prolifération modérée d'E. coli ce qui conduit à conclure que la nature
probiotique de notre souche E. durans EntA32 est assez prometteuse. Pour l'évaluation de la
résistance aux antibiotiques chez E. coli, nous avons prélevé 35 échantillons de matières fécales
de lapins sains. Nous avons isolé 39 E. coli résistants à plusieurs familles d'antibiotiques. Les
souches productrices de carbapénèmases ont été caractérisées avec l'identification pour la
première fois en Tunisie des gènes blaVIM (2 isolats) et blaIMI (un isolat) dans des isolats
d'origine animale. Ces résultats sont également similaires à ceux observés dans 97 isolats
d'Enterococcus spp. (44 E. faecium, 37 E. faecalis, 7 E. gallinarum, 5 E. durans et 4 E. avium)
isolés de lapins de trois niches écologiques (sauvage, laboratoire, ferme). En effet, des taux de
résistance ont été observés contre la tétracycline, l'érythromycine, l'ampicilline, la
streptomycine et la vancomycine.
Abstract :
Our study was carried out aiming to select and evaluete rabbit autochthonous probiotic
Enterococcus strain. From 108 enterococcus isolates from healthy rabbits, 43 isolates of
bacteriocinogenic enterococci producing various bacteriocins (encoded by the entP, entB and
entA genes in 22, 17 and 14 isolates, respectively) were identified. After phenotypic and
genotypic characterization to determine the safety of these strains, we selected E. durans
EntA32 that can be used as a probiotic strain. The E. durans EntA32 was tested (mixed in feed
or in drinking water) on growing rabbits in comparison with a commercial probiotic strain. Its
use in the feed improved the ADG and led to greater weights with significantly better feed
efficiency and an increase in the number of lactic acid bacteria in the caecum of the rabbit
associated with a moderate proliferation of E. coli which leads to the conclusion that the
probiotic nature of our strain E. durans EntA32 is quite promising.
For the evaluation of antibiotic resistance in E. coli, we collected 35 feacal samples from healthy
rabbits. We isolated 39 E. coli resistant to several families of antibiotics. The carbapenemase-
producing strains were characterized with the identification for the first time in Tunisia of the
blaVIM (2 isolates) and blaIMI (one isolate) genes in isolates of animal origin. These results are
also similar to those observed in 97 isolates of Enterococcus spp. (44 E. faecium, 37 E. faecalis,
7 E. gallinarum, 5 E. durans and 4 E. avium) isolated from rabbits of three ecological niches
(wild, laboratory, farm). Indeed, resistance rates have been observed against tetracycline,
erythromycin, ampicillin, streptomycin and vancomycin.
Liste des abréviations
AGV : Acide gras volatil

ATCC : American Type Culture Collection
BCC : Bouillon cœur cervelle
BEA : Bile Aesculin Azide
BET : Bromure d’éthidium
BGN : Bacilles à Gram négatif
BLSE : bêta-lactamase à spectre étendu
CLSI : « Clinical and Laboratory Standards Institute »
CMI : Concentration Minimale d'inhibition
CNGMO : Centre National de Greffe de Moelle Osseuse
DHFR : Dihydrofolate réductase
DHPS : Dihydroptéroate synthétase
EDTA : Acide Éthylène Diamine Tétra-acétique
GMQ : Gain moyen quotidien
IC : Indice de consommation
LAB : Acid Lactic Bacteria
MDR : « Multi Drug Resistance »
MH : Mueller Hinton
MRS : Man-Rogosa-Sharpe
PBS : phosphate buffered saline
SB : Slanetz-Bartley
SCI : syndrome du côlon irritable
TBX : Tryptone Bile X-Glucuronide
TGI : Tractus gastrointestinal
UFC : Unité formant colonie
VRBLG : Gélose biliée au cristal violet et au roue neutre
Liste des tableaux
Tableau 1 : Principaux micro-organismes utilisés comme probiotiques…………….. 16
Tableau 2 : Groupe phylogénétique des espèces du genre Enterococcus selon les
analyses génétiques de l’ARNr-16S et de l’espace intergénique 16S-23S…………… 24
Tableau 3 : Caractères d’identification des principales espèces du genre
Enterococcus………………………………………………………………………….. 26
Tableau 4 : Facteurs de virulence des entérocoques…………………………………. 31
Tableau 5 : Profils de sensibilité aux aminosides chez les entérocoques ayant des
gènes codant les enzymes de modification des aminosides………………………….. 35
Tableau 6 : Phénotypes de résistance aux glycopeptides……………………………. 36
Tableau 7 : Principaux caractères biochimique d’E. coli et des espèces
d’entérobactéries responsables de pathologies humaines…………………………….. 52
Tableau 8 : Souches bactériennes indicatrices………………………………………. 63
Tableau 9 : Amorces utilisées pour l’identification des espèces d’entérocoques……. 66
Tableau 10 : Amorces spécifiques et conditions d’amplification pour la détection des
gènes codant pour les bactériocines…………………………………………………… 67
Tableau 11 : Amorces spécifiques et conditions d’amplification pour la détection des
gènes de virulence …………………………………………………………………. 68
Tableau 12 : Charge des disques d’antibiotiques testés et diamètres critiques des zones
d’inhibition, selon les recommandations de CLSI (2017) …………………………. 69
Tableau 13 : Spécificités des lots de lapereaux en fonction du probiotique et son mode
d’administration……………………………………………………………….............. 73
Tableau 14 : Description des amorces utilisées pour la détection des gènes codant la
résistance aux antibiotiques et leurs conditions d’amplification chez les
entérocoques…………………………………………………………………………… 77
d’inhibition (CLSI, 2017) …………………………………………………………… 78
Tableau 16 : Description des amorces utilisées pour la détection des gènes codant les
carbapénèmases et leurs conditions d’amplification …………………………………. 81
Tableau 17 : Description des amorces utilisées pour la détection des gènes codant la
résistance aux antibiotiques et leurs conditions d’amplification………………………. 82
Tableau 18 : Séquences nucléotidiques des amorces de PCR et conditions
d’amplification des gènes codant pour les intégrons et de la région conservée(qacΔE-
sul1)……………………………………………………………………………………. 83
Table 19: Origine, identification et caractéristiques phénotypiques et génotypiques
des 43 isolats d'entérocoques bactériocinogènes………………………………………. 85
Tableau 20 : Distribution des espèces d’Enterococcus isolés de fèces de lapins de trois
origines et les taux de résistance aux antibiotiques 102
Tableau 21 : Caractéristiques phénotypiques et génotypiques des 97 isolats
d’Enterococcus à partir de fèces de lapins…………………………………………… 105
Tableau 22 : Les gènes codant l’antibiorésistance (AR) détectés chez les 97 isolats
d’Enterococcus ……………………………………………………………………….. 108
Tableau 23 : Caractéristiques phénotypiques et génotypiques de 39 isolats d’E. coli
obtenus de lapins sains………..……………………………………………………... 118
Tableau 24 : Analyse de la variance des paramètres zootechniques…………………. 123
Tableau 25 : Paramètres zootechniques des différents lots ; moyennes et écart type... 124
Tableau 26 : Rendements en carcasses, rendement du tube digestif par rapport au
poids vif et rendement du poids du caecum par rapport au tube digestif à la fin de
l’essai (abattage à 77 jours)..………………..…………………………………………. 125
Tableau 27 : Evolution du pH post-mortem de la carcasse chaude et du pH-ultime de
la carcasse froide des différents lots (lapins âgés de 77 jours, n =3)………………….. 125
Tableau 28 : Analyse statistique des quantités de bactéries lactiques dans les ceaca
des 4 lots………………………………………………………………………………. 127
Tableau 29 : Analyse statistique des quantités de bactéries E. coli dans les ceaca des
4 lots. …………………………………………………………………………………. 128
Tableau 30 : Analyse statistiques des quantités de bactéries anaérobies dans les ceaca
des 4 lots………………………………………………………………………………. 129
Liste des figures
Figure 1 : Schéma du tube digestif du lapin…………………………………………... 4
Figure 2 : Fonctionnement de la digestion du lapin…………………………………. 7
Figure 3 : Mécanismes d'action des probiotiques……………………………………. 22
Figure 4 : Conditions d’élevage et répartition des lapereaux en groupes……………... 72
Figure 5 : Inhibition de Listeria monocytogenes et Staphylococcus aureus par les
isolats d’entérocoques………………………………………………………………… 88
Figure 6 : Inhibition de L. monocytogenes par les surnageants de la souche
d’entérocoque EntSB49………………………………………………………………. 88
Figure 7 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification des
gènes entA et entB des souches d’Enterococcus…………………………………………… 89
Figure 8 : Les activités gélatinase et α-hémolyse des souches d’Enterococcus………. 90
Figure 9 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification du gène
gelE………………………………………………………………………………………………. 91
Figure 10 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification du
gène efaAfs………………………………………………………………………………... 91
Figure 11 : Photo montrant l’activité protéolytique d’une souche d’Enterococcus
(S5)……………………………………………………………………………………. 92
gène VanA. ………………………………………………………………………….. 103
gène tetM……………………………………………………………………………... 104
gène ermB…………………………………………………………………………….. 104
gène Int-Tn916/1545…………………………………………………………………... 104
Figure 16 : Photo montrant le test de Hodge modifié positif pour la souche IM15…... 115
Figure 17 : Photo montrant le test EDTA 0.5M positif pour la souche IM22………… 115
Figure 18 : Photo montrant la résistance à la témocilline de la souche IM20……….. 116
Figure 19 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% du produit d’amplification du gène
blaVIM de la souche IM2…………………………………………………………….. 116
Figure 20 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% du produit d’amplification du gène
blaIMI chez la souche IM2…………………………………………………………….. 117
Figure 21 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification des
gènes Int1 et Int2 des souches TBX……………….………………………………… 117
Figure 22 : Quantité de bactéries lactiques dans le contenu cæcal des 4 lots en fonction
du temps………………………………………………………………………………. 126
Figure 23 : Quantité d’Escherichia coli dans le contenu cæcal des 4 lots en fonction
du temps………………………………………………………………………………. 127
Figure 24 : Nombre de bactéries anaérobies dans le contenu cæcal des 4 lots en
fonction du temps……………………………………………………………………... 128
Introduction Générale
Introduction générale
L'élevage de lapins possède un grand potentiel en raison de la petite taille du corps de cet
animal, de l'intervalle entre générations court, du taux de croissance rapide, de la capacité de
production élevée et de la viande saine, pauvre en lipides et facilement digestible (Cullere et
Dalle Zotte ; 2018).
En Tunisie, le secteur cunicole a été longtemps dominé par les systèmes traditionnels.
Cependant, durant ces dernières années il a connu un fort développement devenant de plus en
plus industriel (Ouertani et al., 2016). Néanmoins et malgré ce grand regain d’intérêt, ce secteur
est confronté à plusieurs contraintes, principalement techniques, telles que la faible maîtrise
des facteurs de production (conduite alimentaire, bâtiments d'élevage) et les problèmes
sanitaires (Daboussi, 2017). En effet, les troubles digestifs sont très fréquents chez les lapereaux
en croissance ce qui conduit à une faible productivité et des pertes économiques importantes.
Ces troubles digestifs sont principalement d’ordre alimentaire puisqu’ils se manifestent chez
les lapereaux en période de post-sevrage (de 28 à 35 jours d’âge), période pendant laquelle
le lapereau passe d’un régime alimentaire basé sur le lait maternel riche à un régime alimentaire
basé sur des granulés peu digestibles et moins équilibrés. A cet âge les différentes structures
du tractus digestif se développent, la microflore digestive s’installe (Gallois, 2006) et l’animal
accroit son ingestion (Gidenne et Lebas 2005). De plus, la séparation du lapereau de sa mère
et son transfert brutal dans une autre cage en regroupement avec d’autres congénères soumet
l’animal à un stress, ce qui affaiblit son système immunitaire par l’absence d’immunoglobulines
protectrices et le rend de plus en plus sensible aux problèmes pathologiques. Ceci accentue
les affections gastro-intestinales se traduisant par des diarrhées et des mortalités.
Chez le lapin, les effets positifs des additifs sur la flore microbienne et par conséquent sur
la santé digestive peuvent s’accompagner d’une amélioration des performances zootechniques.
Pendant plusieurs années, l’utilisation préventive des antibiotiques était la seule barrière de lutte
contre les microorganismes pathogènes. Toutefois, devant l'émergence de microbes résistants
aux antibiotiques et depuis 2006, il est interdit d’utiliser les antibiotiques dans l’alimentation
animale. D’autres alternatives telles que les probiotiques, les prébiotiques, les symbiotiques,
les enzymes, les bactériocines, les acides organiques et les herbes et leurs extraits, qui sont
1
des outils éprouvés pour la prévention et le traitement des maladies chez diverses espèces
animales, y compris les lapins sont de plus en plus utilisés (Falcão-e-Cunha et al., 2007).
Les bactéries probiotiques représentent une nouvelle approche pour maintenir l’équilibre et
le contrôle du microbiote digestif chez divers animaux d’élevage, assurant ainsi et
indirectement un renforcement du système immunitaire et une protection de l’hôte contre toute
infection digestive. Selon l'Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture
(FAO) et l'Organisation mondiale de la santé, les probiotiques sont des micro-organismes
vivants qui, lorsqu'ils sont administrés en quantité appropriée, ont un effet bénéfique sur la santé
de l'hôte (Gibson et al., 2017).
Les entérocoques sont un groupe diversifié et riche en espèces appartenant au groupe

des bactéries lactiques. La capacité des bactéries lactiques à produire des substances
antimicrobiennes naturelles (acides organiques, diacétyle, peroxyde d'hydrogène
et bactériocines) est bien connue. Certaines espèces d'entérocoques sont commensales et sont
également productrices de bactériocines, peuvent stimuler le système immunitaire et ont une
influence significative sur le maintien de l'homéostasie intestinale (Saillant et al., 2021).
L'application de souches d’entérocoques bactériocinogènes est un moyen possible de remplacer
les antibiotiques et de réduire la survenue de maladies. Pour cette raison, ainsi qu'en terme
de recherche fondamentale et appliquée, il serait utile de détecter la capacité des entérocoques
isolés de lapins à produire des substances antimicrobiennes et de tester leurs propriétés.
Ainsi, notre travail a pour objectif d’étudier l’effet d’une souche d’entérocoque autochtone du
tractus intestinal du lapin en tant que probiotique sur les performances zootechniques et l’état
sanitaire des lapereaux en croissance.
Pour cela notre étude consiste à :
- Réaliser l’isolement d’une collection de souches d’entérocoques bactériocinogènes

à partir de fèces de lapin de différents écosystèmes ; étudier leur activité
antimicrobienne et détecter les gènes qui codent à la production de bactériocines.
- Evaluer l’innocuité des souches d’entérocoques bactériocinogènes ainsi que
les propriétés probiotiques.
- Evaluer l’effet d’une souche d’entérocoque sélectionnée potentiellement probiotique
sur un nombre de lapereaux en période de post-sevrage et étudier les paramètres
zootechniques et la microflore caecale de ces lapereaux.
2
- Etudier phénotypiquement et génotypiquement la résistance aux antibiotiques d’une

large collection d’entérocoques et d’entérobactéries sélectionnées des fèces de lapins
de différents écosystèmes afin de comparer et mieux comprendre le microbiote digestif
des lapins.
Nous allons présenter en premier lieu une synthèse bibliographique portant sur l’anatomie
et la physiologie de l’appareil du tube digestif du lapin, la prévalence des troubles digestifs
du lapereau en post-sevrage, des généralités sur les probiotiques et leurs utilisations,
les entérocoques : production de bactériocines et résistance aux antibiotiques et leur utilisation
entant que probiotiques. Ainsi que l’antibiorésistance chez Escherichia coli, commensal du
tractus intestinal du lapin.
3
I. Particularités anatomiques et physiologiques digestives du lapin

1. Anatomie
Le lapin est un herbivore monogastrique. Son appareil digestif est composé de plusieurs
compartiments allant de la bouche, l’œsophage, l’estomac, l’intestin grêle jusqu’au gros
intestin. Ce dernier est composé du cæcum et du côlon (Figure 1).
Figure 1 : Schéma du tube digestif du lapin (Garreau et al., 2015)
La bouche présente des dents profondément insérées dans la mâchoire et qui sont en croissance
continue. Les glandes salivaires sont bien développées et sécrètent diverses enzymes.
4
L’estomac fait suite à l’œsophage, il est constitué de trois parties (fundus, cardia et antrum).
Le milieu stomacal est fortement acide avec des variations de pH entre 1,5 et 3,5 ; ceci est dû
à la sécrétion de l’acide chlorhydrique. L’estomac se termine par le pylore.
L’intestin grêle rattaché au pylore est la plus longue partie du tube digestif. Plusieurs organes
de sécrétion communiquent avec l’intestin grêle tels que le foie, le pancréas, .. Le pH intestinal
est légèrement alcalin (pH 7,2 à 7,5).
Le cæcum présente un volume assez important contenant 100 à 120g d’une pâte homogène avec
un pH légèrement acide proche de 6. Il renferme une multitude de micro-organismes jouant
un rôle majeur pour la digestion du tube digestif.
Le côlon est formé de trois parties : le côlon proximal, siège d’une grande production de mucus ;
le fusus et le côlon distal où la paroi du tissu devient lisse. Le côlon se termine par le rectum
dont l’orifice extérieur est l’anus. Le fonctionnement du côlon permet la production
de cæcotrophes, phénomène caractéristique des Lagomorphes.
2. Physiologie de l’appareil digestif et digestibilité
En élevage, l’aliment est distribué sous forme de granulés dès l’âge de 18 jours, en même temps
que le lait maternel. La consommation des aliments augmente en fonction de l’âge ; l’animal
passe d’une seule prise par jour à plusieurs prises par jour allant jusqu’à 25 à 30 prises alternées
(Fortun-Lamothe et Gidenne, 2003). Les granulés présentent une forte teneur en matière sèche
et sont formés essentiellement de protéines végétales, de glucides (amidon) et un minimum
de fibres pour le transit intestinal.
Un aliment composé pour les lapereaux en croissance doit être équilibré afin de satisfaire leurs
besoins alimentaires. Il doit répondre aux recommandations de Lebas en 2004 notamment en
énergie digestible (2400 à 2600 Kcal/kg), cellulose (110à 130g/kg), protéines (110 à 130g/kg
d’aliment), lipides (20 à 40g/kg), vitamines et en minéraux.
Chez le lapin, l’ingestion des aliments et leur digestion ne diffèrent pas de celles des
monogastriques. De l’estomac jusqu’à l’intestin grêle, la digestion est réalisée essentiellement
grâce à la sécrétion enzymatique. Au cours de son séjour dans l’estomac (2 à 4 heures),
l’aliment subit une série de transformations par l’acidité gastrique, le mucus et les enzymes
(lipases et pepsines). L’estomac mène aussi, grâce à sa paroi musculeuse, différentes
contractions assurant le brassage des aliments avec le suc gastrique.
5
Les particules alimentaires passent ensuite vers l’intestin grêle où elles y séjournent une à deux
heures. A ce niveau, la digestion des protéines se poursuit par les protéases pancréatiques et les
peptidases des entérocytes. Ces protéines digérées sont d’origine alimentaire et/ou celles
des enzymes et les bactéries qui envahissent les entérocytes. La digestion des lipides se fait par
l’action combinée des sels biliaires secrétés par le foie et les lipases pancréatiques. La digestion
des glucides (amidon) est assurée par l’amylase pancréatique.
Cette digestion enzymatique est poursuivie par une digestion microbienne au niveau du caecum.
A ce stade, les particules alimentaires y restent environ 6 à 12 heures et subissent l’action
des microorganismes qui dégradent les particules protéiques digérés ainsi que la cellulose en
acides gras volatils (AGV). Le contenu du caecum, constitué ainsi de particules non dégradées,
de sécrétions intestinales et de bactéries, est ensuite évacué dans le côlon proximal puis distal
(Gidenne et Lebas, 2005).
Dans le côlon deux types distincts de pelotes fécales sont formés à différents moment
de la journée : Des crottes dures, rondes et riches en fibres évacuées durant la nuit, moment où
l’ingestion est très importante, et des crottes molles dites caecotrophes produites surtout
pendant la matinée quand l’ingestion alimentaire est faible. Ces crottes molles sont directement
capturées par l’animal dès leur émission. Ce phénomène, caractéristique des lagomorphes, est
appelé caecotrophie et apparait dès l’âge de 3 semaines quand le lapereau commence à ingérer
les aliments solides (Figure 2).
Les crottes molles riches en protéines et vitamines et pauvres en fibres passent dans l’estomac
où elles subissent une digestion identique à celle de tous les aliments ingérés. La caecotrophie
présente un intérêt nutritionnel important et ce par son apport en protéines de haute valeur
biologique (dont le un-tier d’origine microbienne) et des vitamines hydrosolubles (Gidenne et
Lebas, 2006). C’est un mode d’adaptation évolutive vers le régime herbivore favorisant ainsi
le maintien de la stabilité de l’état sanitaire de l’animal. Par contre l’absence de caecotrophie
entraine des carences en quelques acides aminés et en vitamines B et C (Gidenne, 2015).
Le profil fermentaire du lapin est donc dépendant du microbiote caecal.
6
Figure 2 : Fonctionnement de la digestion du lapin (d’après Lebas, 2002).
3. Caractérisation de la microflore du caecum
Chez le lapin, le caecum reste stérile jusqu’à trois jours après la naissance (Gouet et Fonty,
1979). C’est alors après une semaine qu’une flore bactérienne vient s’installer et peut atteindre
jusqu’à 107 bactéries/g caecal. Cet organe représente un milieu relativement stable (matière
sèche de 21 à 23%, et un pH entre 5,5 et 6) pour le développement d’une microflore (Gidenne
et Lebas, 1984). Selon Bennegadi et al., 2003, l’étude de l’ARNr 16S a révélé la présence
majoritaire de bactéries (80 à 90%) dans la composition de la microflore caecale. Ceci a été
confirmé par Combes et al. (2011) qui, en utilisant aussi les techniques de biologie moléculaire
ont essayé de décrire le développement de la microflore caecale de la période postnatale jusqu’à
l’âge adulte et qui a montré que le microbiote caecal se développe progressivement d'une
communauté simple et instable après la naissance à une communauté complexe et culminante
chez les lapins subadultes. Ceci a été décrit bien avant. D’après Gidenne et al., 2008,
la composition structurale du caecum varie en fonction du temps. En effet, à l’âge
de 2 semaines, elle passe d’une composition majoritairement de bactéries anaérobies
facultatives vers une composition en bactéries anaérobies strictes jusqu’à l’âge de 28 jours (âge
7
du sevrage). Lebas (2008) a montré que cette population de bactéries anaérobies strictes est
essentiellement composée de bacilles bactéroïdes alors que les bactéries anaérobies facultatives
comportent Escherichia coli, des Staphylocoques et des entérocoques. Outre les bactéries, on y
trouve aussi des levures et des protozoaires mais pas de champignons (Bennegadi et al., 2003).
Plus tard Velasco-Galilea et al., 2018 ont caractérisé la microflore caecale et fécale des lapins.
En effet, l’attribution taxonomique a révélé que la diversité microbienne était dominée par
les embranchements Firmicutes (76,42%), Tenericutes (7,83%) et Bacteroidetes (7,42%) ;
le royaume Archaea est présent à un faible taux (0,61%). Cependant, l'analyse de la variance
au niveau du genre a révélé une présence plus élevée des genres Clostridium, Anaerofustis,
Blautia, Akkermansia, rc4-4 et Bactéroïdes dans les échantillons de caecum. En revanche,
les genres Oscillospira et Coprococcus se sont avérés surreprésentés dans les fèces, ce qui
suggère que les espèces bactériennes de ces genres agiraient comme fermenteurs à la fin
du processus de digestion des aliments.
De plus, l’étude de Mi et al., en 2018 suggère fortement la présence de nouvelles bactéries

fibrolytiques dans le caecum du lapin, ce qui peut expliquer les activités fibrolytiques très fortes
qui s'y trouvent.
Par ailleurs, cette microflore participe non seulement à la dégradation des aliments mais aussi
entre en compétition avec les micro-organismes potentiellement pathogènes et stimule
l’immunité de l’hôte.
4. Pathologie digestive chez le lapin
Le comportement alimentaire dominé par la caecotrophie rend le lapin particulièrement sensible

aux pathologies digestives qui sont une des causes majeures de mortalités entrainant des pertes
économiques dans les élevages cunicoles.
Les symptômes de troubles digestifs ou d’entérite sont simples et presque toujours constants.
Les premiers signes passent généralement inaperçus par l’éleveur et durent trois jours.
Des signes de constipation apparaissent, en plus d’une diminution de la consommation
alimentaire et de la croissance. A partir du cinquième jour, le lapin se déshydrate et apparait
une diarrhée discrète qui se traduit par un arrêt total de l’excrétion fécale ou bien d’une
élaboration d’excréments mous qui ne sont plus consommés par l’animal, pour se terminer par
l’excrétion de fèces liquides qui souillent ses parties postérieures. Durant cette phase,
des mortalités peuvent survenir. Après deux jours, la diarrhée devient de plus en plus importante
et aiguë, le lapin refuse de se nourrir et de boire, souffrant de coliques très douloureuses.
8
La mort survient généralement après plusieurs heures dans le coma. Néanmoins, si l’animal
survit une journée au coma, sa guérison sera rapide et complète en quelques jours. L’examen
par autopsie révèle des lésions atypiques. En effet pendant la phase aigüe de la maladie,
le contenu caecal se liquéfie et se décolore. Le caecum se remplit de gaz et contient peu
de nourriture. Les parois de l’intestin montrent des lésions striées de rouge avec un aspect
congestionné (Gidenne, 2015).
Les troubles dans l’appareil digestif peuvent être causés par de multiple facteurs. En effet ces
affections peuvent être d’ordre non biologique (conditions d’élevage, alimentation, stress...) ou
bien d’ordre biologique (bactéries, virus, parasites) (Marlier et al., 2003).
4.1. Les conditions d’élevage pour les lapins
Le lapin est un animal craintif qui a du mal à ajuster sa décharge d’adrénaline. D’une manière
générale tous les facteurs de stress favorisent chez lui des pathologies digestives (Marlier et al.,
2003). Les conditions d’élevage comme la densité des animaux dans les cages, la variation
des températures, le bruit ou les visiteurs sont tous des facteurs de stress qui ont été reliés à
des décharges répétées d’adrénaline. Les lapins réagissent très mal lors du transport post-
sevrage ou bien au moment du changement de cage en cage au cours de l’élevage. Une étude
récente réalisée par Trocino et al. (2018) a montré l’impact des conditions de logement, à savoir
le type de sol et la densité de peuplement, sur le comportement, la réactivité et le niveau
de stress chez les lapins.
Les lapins sont très sensibles aux stress thermiques, toute perturbation de température peut
entrainer un ralentissement du transit digestif associé à des entérites. La température idéale pour
l’élevage de lapin doit se situer aux alentours de 20°C car le lapin, dépourvu de glandes
sudoripares, est incapable de réguler sa température au-delà de 25°C (Marai et al., 2002).
Le stress dû à la chaleur a des effets négatifs sur les taux de croissance et sur plusieurs traits
de production, en particulier les mortalités en post-sevrage. Habeeb et al. (1997) ont montré
que pendant l’été le taux de mortalité est de 18% contre une absence totale en hiver. Les lapins
sont aussi sensibles à une hygrométrie très basse ou assez élevée. L'hygrométrie idéale est
de 65% pour 20°C.
4.2. L’alimentation
L’alimentation occupe une place très importante parmi les causes favorisant les troubles
digestifs des lapins. En effet, l’abreuvement inadéquat est très fréquent en élevage et peut causer
9
des diarrhées mucoïdes, ainsi il doit être correct au niveau quantitatif et qualitatif. L’animal doit
avoir de l’eau propre à sa disposition et en quantité suffisante, environ 200 ml par jour.
Les eaux à pH basiques favorisent les pathologies digestives.
Un changement brutal du régime alimentaire peut également causer des troubles digestifs. Ceci
est observé essentiellement au moment du sevrage quand le lapereau passe d’une alimentation
lactée à une alimentation solide ou à une ration inadaptée quantitativement. En général, ce n’est
pas la nourriture elle-même qui est responsable, mais plutôt sa composition. D’après Gidenne
(2015) un défaut de cellulose et un excès de protéines sont des éléments majeurs pour
déclencher des troubles intestinaux.
Les fibres, mise à part leur importance nutritionnelle, jouent un rôle très important dans
la régulation de l’ingestion et du transit intestinal puisqu’elles représentent une source
de fermentation à la microflore caecale. Ainsi le taux et la nature de ces fibres peuvent
influencer le dérèglement digestif. Licois et Gidenne (1999) ont démontré l’effet des fibres
alimentaires sur la résistance aux pathologies digestives. Le respect des besoins des lapereaux
en fibre est d’une haute importance pendant la période qui suit le sevrage, soit un taux
de cellulose de 14 à 15%. Quant aux protéines, elles sont indispensables pour la croissance
de l’animal ainsi que le développement et le renouvellement de la muqueuse intestinale.
Le niveau des protéines recommandé pour des lapereaux en croissance est de 16% (Lebas,
1989).
Durant la période qui suit directement le sevrage, il est recommandé d’appliquer une stratégie
de limitation de l’ingestion. L’intérêt de cette limitation pour réduire la prévalence de certaines
maladies digestives a été démontré depuis 2002. L’efficacité de la restriction alimentaire
s’explique par le lien avec un transit des aliments plus lent.
4.3. Les agents infectieux
Plusieurs agents sont impliqués dans les pathologies digestives. Ce sont essentiellement
des parasites, des virus et des bactéries.
Les parasites : Parmi les causes de pathologies digestives en élevage cunicole, on identifie
les coccidies. Ce sont des protozoaires qui appartiennent au genre Eimeria. La coccidiose
intestinale est marquée par des lésions macroscopiques intestinales et une congestion associée
à un œdème de la paroi intestinale. D’après Marlier et al. (2003), E. intestinalis et E. flavescens
10
sont les plus pathogènes et causent de fortes diarrhées qui s’accompagnent de mortalités dans
50% des cas.
Les virus : Il n’y a pas beaucoup de travaux sur les virus entéropathogènes du lapin. Une étude
réalisée par Lavazza et Capucci (2008), sur une période qui s’étend de 2002 à 2007 dans
des élevages cunicoles italiens, a montré que chez des lapins présentant des diarrhées 45,3%
des animaux hébergent des particules virales. Ces virus pourraient permettre l’apparition
d’entérites plus graves en favorisant ou en aggravant des infections bactériennes secondaires.
Les bactéries : La majorité des études portant sur les pathologies digestives d’origine
bactérienne chez les lapins ont rapporté que Escherichia coli, Clostridium piliforme
et Clostridium spiroforme sont la cause majeure de ces pathologies (Marlier et al. 2003).
Les clostridies sont des bactéries anaérobies strictes, à Gram positif, hôtes normaux du tube
digestif, en faible quantité. C. piliforme et C. spiroforme sont les deux agents pathogènes les
plus rencontrés chez le lapin. Leur virulence est liée à la capacité de produire des toxines.
C. piliforme est l’agent responsable de la maladie de Tyzzer. La forme chronique de cette
maladie se traduit par une perte de poids associée à des diarrhées aqueuses. Dans sa forme
aiguë, des entérites hémorragiques nécrosantes de la partie distale du tube digestif sont
observées chez les lapereaux lors du sevrage (Marlier et al., 2003). C. spiriforme produit
une toxine induisant une entérotoxémie qui provoque une paralysie intestinale avec
accumulation de gaz dans l’estomac et l’intestin. Cette même toxine provoque une entérite avec
diarrhée faisant suite à une constipation (Licois et Marlier, 2008).
Les colibacilles sont des bactéries commensales courantes du tractus gastro-intestinal
des lapins. Chez les animaux sains, la population des colibacilles est limitée à 102 à 103 UFC
d’E. coli/g de contenu caecal. Cependant tout dérèglement (suppression du lait maternel,
changement d’aliment dans l’élevage, transport, stress, rotavirus...) peut déclencher
une élévation de la flore colibacillaire jusqu’à 108 et 109 UFC d’E. coli/g. Cette élévation est
étroitement liée à l’alcalinisation du contenu du caecum. L’augmentation du pH influence
l’environnement intestinal et ralentit le transit ce qui modifie la flore bactérienne intestinale.
De ce fait, les colibacilles qui sont de faible nombre deviennent dominantes. Cet envahissement
par les colibacilles se traduit par des entérites. Les souches impliquées dans les troubles
digestifs sont appelées entéropathogènes. Elles ont la capacité d’adhérer à la muqueuse
intestinale et provoquent des lésions au niveau des entérocytes (Licois et Marlier, 2008).
L’animal souffre d’une diarrhée aiguë, diminue en poids et se déshydrate. C’est chez surtout
les jeunes lapins après le sevrage que ces entérites revêtent une importance économique grave.
11
II. Les probiotiques

1. Historique
Il existe une longue histoire d'allégations de santé concernant les micro-organismes vivants
dans les aliments, en particulier les bactéries lactiques. Dans une version persane de l'Ancien
Testament (Genèse 18 :8), il est indiqué qu'« Abraham devait sa longévité à la consommation
de lait aigre ». En 76 avant JC, l'historien romain Plinius a recommandé l'administration
de produits laitiers fermentés pour traiter la gastroentérite (Bottazzi V, 1983). Depuis
l'avènement de l'ère de la microbiologie, certains chercheurs (par exemple, Carre, Tissier,
et Metchnikoff) ont attribué de tels effets sur la santé à des changements de l'équilibre microbien
intestinal. Le concept de probiotiques est d'abord issu de la théorie proposée par Elie
Metchnikoff (Metchnikoff, 1907), lauréat du prix Nobel d'origine russe, selon laquelle
l'ingestion de certaines bactéries sélectionnées peut avoir une influence bénéfique sur le tractus
gastro-intestinal (TGI) de l'Homme. Il a lancé la théorie après avoir observé que de nombreux
paysans bulgares vivent longtemps et en bonne santé parce qu'ils consomment de grandes
quantités de produits laitiers fermentés. Il a noté que les personnes qui consommaient
des produits laitiers fermentés, y compris des micro-organismes bénéfiques, avaient une
résistance plus élevée aux agents pathogènes. Il a suggéré qu'en raison de la dépendance des
microbes intestinaux vis-à-vis des aliments, il est possible de manipuler la microflore de notre
corps pour remplacer les microbes nocifs par des microbes utiles. Ce concept a été développé
au fil des décennies. Le mot « probiotique » est dérivé du grec et signifie « pour la vie ». D'autres
sources ont décomposé le mot plus largement, indiquant que la racine pro est d'origine latine,
ce qui signifie ‘en faveur de’. La portion « bios », qui signifie la vie, est également dérivée
du Grec (Morelli et Capurso, 2012). En 1965, Lilly et Stillwell ont été les premiers à proposer
une définition des probiotiques comme des substances sécrétées par un micro-organisme
qui stimulent la croissance d'un autre. Parker (1974) a défini les probiotiques comme
« des organismes et des substances qui contribuent à l'équilibre microbien intestinal ». Plus tard,
Fuller (1989) a redéfini le probiotique comme « un complément alimentaire microbien vivant
qui affecte avantageusement l'animal hôte en améliorant son équilibre microbien intestinal ».
Havenaar et Huis in’t Veld (1992) ont élargi la définition à « une monoculture ou une culture
mixte de micro-organismes vivants qui profite à l'homme ou aux animaux en améliorant
les propriétés de la microflore indigène ». Après, Guarner et Schaafsma (1998) ont suggéré
la définition comme « des micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont consommés
en quantités adéquates, confèrent un effet sur la santé de l'hôte ». En 2001, Schrezenmeir
12
et De Vrese ont proposé une définition du probiotique comme : « une préparation ou un produit
contenant des microorganismes viables définis en nombre suffisant, qui altèrent la microflore
par implantation ou colonisation, dans un compartiment de l'hôte et par là, exercent des effets
bénéfiques sur la santé de l'hôte ». Ensuite, en 2002, l'Organisation des Nations Unies pour
l'alimentation et l'agriculture/Organisation mondiale de la santé (FAO/OMS) (2002) ont défini
les probiotiques comme des « micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont administrés
en quantités adéquates, confèrent un avantage pour la santé de l'hôte ». En 2014, des experts
de l'ISAPP (International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics) ont confirmé
le rapport précédent de la FAO/OMS (2002). Un consensus a été annoncé qui a permis
des corrections grammaticales mineures à la définition, en conservant son sens et sa
signification. Le terme « probiotique » peut être utilisé pour désigner de nombreux types
de micro-organismes qui présentent des avantages pour la santé de l'hôte, tout en restant en vie.
Dans le document présenté, cette caractéristique a été particulièrement soulignée, et
les métabolites ainsi que les cellules mortes de micro-organismes ont été exclus de la définition
d'un « probiotique ». De plus, il a été convenu que les « probiotiques » ne sont pas
des consortiums non définis de micro-organismes (tels que les greffes de microbiote fécal) ou
des aliments fermentés contenant des micro-organismes non définis (Hill et al., 2014). Ainsi,
cette définition comprend les trois principaux termes clés des probiotiques : microbiens, viables
et bénéfiques pour la santé.
2. Utilisation des probiotiques

2.1. Utilisation des probiotiques en alimentation et médecine humaine
Les probiotiques ont été utilisés pour la prévention et le traitement de diverses conditions
médicales et pour favoriser le bien-être général. Certains de leurs effets bénéfiques sur la santé
ont été validés, tandis que d'autres utilisations sont étayées par des preuves limitées. Non
seulement les effets probiotiques sont spécifiques à la souche, mais leurs actions peuvent varier
d’un hôte à un autre, et des avantages plus importants peuvent être observés avec un lot
de probiotiques par rapport à un autre en raison de la complexité du contrôle qualité avec
des micro-organismes vivants. De plus, les agents combinés peuvent compliquer
la quantification des avantages cliniques particuliers (Senok et al., 2005 ; Wald et Rakel, 2008 ;
Surawicz CM 2008). Les maladies associées au tractus gastro-intestinal ont été une cible
commune des probiotiques, principalement en raison de leur capacité à restaurer la flore
intestinale. La preuve la plus solide de l'utilisation des probiotiques réside dans le traitement
de certaines maladies diarrhéiques, en particulier la diarrhée à rotavirus chez les enfants.
13
Des études cliniques ont également soutenu le rôle des probiotiques dans le traitement
de la pochite (Pouchitis) (Senok et al., 2005 ; Pham et al., 2008 ; Vanderhoof et Young, 2008).
Les données sont incohérentes en ce qui concerne l'efficacité des probiotiques contre la diarrhée
associée aux antibiotiques et la diarrhée du voyageur (Senok et al., 2005 ; Pham et al., 2008).
Bien que les résultats des essais cliniques soient contradictoires, la thérapie probiotique peut
également être bénéfique dans le traitement de la maladie de Crohn, de la rectocolite
hémorragique (CU), du syndrome du côlon irritable (SCI) et des infections à Helicobacter
pylori (Senok et al., 2005 ; Pham et al., 2008 ; MacIntyre et Cymet TC, 2005 ; Scarpellini
et al., 2008). Les probiotiques ont montré leur capacité à diminuer les symptômes
de l'intolérance au lactose (Goldin BR. 1998 ; Scarpellini et al., 2008 ; Farnworth ER, 2008 ;
Goldin et Gorbach, 2008). D'autres maladies non associées au tractus gastro-intestinal ou au
microbiote intestinal, y compris divers problèmes urogénitaux (par exemple, vaginose
bactérienne, vaginite à candidose, infections des voies urinaires), peuvent également répondre
aux probiotiques. Les probiotiques ont également été étudiés pour : leur rôle dans le traitement
des infections des voies respiratoires supérieures (par exemple, l'otite moyenne aiguë) ;
la réduction du risque de cancer du côlon et de la vessie, de maladies allergiques et d'atopie ;
la stimulation de la réponse immunitaire ; et prévenir les caries dentaires (Senok et al., 2005 ;
MacIntyre et Cymet, 2014 ; Scarpellini et al., 2008 ; Goldin et Gorbach, 2008 ; Reid et al.,
2003).
D’une manière générale les effets bénéfiques des probiotiques comprennent ce qui
suit (Shokryazdan et al., 2017 ; George Kerry et al., 2018) :
▪ Interférence, exclusion et antagonisme des agents pathogènes ;
▪ Stimulation immunitaire et immunomodulation ;
▪ Activités anticancérigènes et antimutagènes ;
▪ Activité antioxydante ;
▪ Activité de fixation des toxines et de détoxification ;
▪ Maintien de l'intégrité de la muqueuse ;
▪ Diminution de l'incidence et de la durée de la diarrhée ;
▪ Régulation de la motilité intestinale pour contrôler la constipation ou syndrome du côlon
irritable ;
▪ Soulagement des symptômes allergiques ;
▪ Réduction du cholestérol sérique ;
▪ Diminution de la pression artérielle ;
14
▪ Réduction du risque de diabète gestationnel ;

▪ Amélioration de l'absorption des nutriments ;
▪ Amélioration de la croissance de l'enfant ;
▪ Soulagement des symptômes de l'intolérance au lactose ;
▪ Production de composés bénéfiques, tels que les vitamines, acides gras à chaîne courte
(AGCC) et linoléiques conjugués acide.
La plupart des probiotiques sont des bactéries, principalement des bactéries lactiques (Oyetayo
et Oyetayo, 2005). Les genres couramment utilisés comme probiotiques comprennent
les espèces bactériennes Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus, Carnobacterium,
Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Propionibacterium, Leuconostoc et Bacillus,
les levures Saccharomyces et les moisissures Aspergillus (Oyetayo et Oyetayo, 2005 ; Amara
et Shibl, 2015).
Un bon candidat probiotique doit remplir les critères suivants (Fuller, 1989) :
▪ Il doit être un organisme capable d'exercer un effet bénéfique sur l’ hôte, une croissance
accrue ou une résistance aux maladies ;
▪ Il doit être non pathogène et non toxique ;
▪ Il doit être capable de survivre et de se métaboliser dans l'environnement intestinal en
résistant au faible pH de l'estomac, aux acides organiques, aux acides biliaires et aux
enzymes présents dans les intestins ;
▪ Et il devrait être stable dans des conditions de stockage et de terrain.
Une liste sélective de différentes espèces bactériennes qui sont activement utilisées comme
probiotiques est répertoriée dans le tableau 1 (George Kerry et al., 2018).
Bien que les probiotiques soient toujours en cours de développement et nécessitent des études
et un développement supplémentaire pour surmonter les obstacles liés à la réussite de leur
administration et à des effets secondaires minimes, plusieurs formes de probiotiques sont
disponibles dans le commerce et sont utilisées en grande quantité (George Kerry et al., 2018).
15
Tableau 1 : Principaux micro-organismes utilisés comme probiotiques (George Kerry et al., 2018).
N° Genre bactériens probiotique Espèces impliquées

1 Lactobacillus L.plantarum, L. paracasei, L. acidophilus, L., casei, L.
rhamnosus, L. crispatus, L. gasseri, L. reuteri, L. bulgaricus
2 Propionibacterium P. jensenii, P. freudenreichii
3 Peptostreptococcus P. productus
4 Bacillus B. coagulans, B. subtilis, B. laterosporus
5 Lactococcus L. lactis, L. reuteri, L.rhamnosus, L. casei, L. acidophilus, L.
curvatus, L. plantarum
6 Enterococcus E. faecium
7 Pediococcus P. acidilactici, P. pentosaceus
8 Streptococcus S. sanguis, S. oralis, S. mitis, S.thermophilus, S. salivarus
9 Bifidobacterium B. longum, B. catenulatum, B. breve, B.animalis, B. bifidum
10 Bacteroides B. uniformis
11 Akkermansia A. muciniphila
Levure Saccharomyces S. boulardi
2.2. Utilisation des probiotiques chez les animaux d’élevage
Chez les animaux de ferme, les stress environnementaux tels que le régime alimentaire,
les méthodes de gestion d’élevage, etc., peuvent perturber les conditions microbiennes
intestinales, créant des facteurs de risque d'infection par des agents pathogènes. Les bactéries
zoonotiques peuvent causer la mortalité, la morbidité et les maladies chez les animaux,
entraînant d'énormes pertes économiques dans les secteurs de l'élevage. Il est bien connu que
des agents pathogènes tels que Campylobacter spp. et Salmonella spp. peuvent être transmis
à la chaîne alimentaire et devenir une source de maladie humaine (Scallan et al., 2011).
L'Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (EFSA, 2004) a affirmé que la contamination
des aliments et les intoxications alimentaires humaines peuvent être réduites le plus
efficacement possible par la réduction des agents pathogènes chez les animaux vivants.
L'objectif le plus important de l'utilisation de probiotiques pour l'alimentation animale est
de maintenir et d'améliorer la croissance et la productivité des animaux, ainsi que de prévenir
et de contrôler les agents pathogènes entériques et ce par une écologie microbienne saine dans
le tractus gastro-intestinal (TGI) en augmentant la population de microbes bénéfiques qui
empêchent la colonisation d'agents pathogènes entériques nocifs dans le tractus gastro-intestinal
et en produisant des composés antimicrobiens (Hung et al., 2012 ; Shim et al., 2012). Par
conséquent, les probiotiques peuvent être une alternative efficace aux additifs alimentaires
16
antibiotiques tout en réduisant la propagation des zoonoses et autres agents pathogènes

entériques courants.
▪ Probiotiques pour ruminants

Les ruminants sont capables de convertir des sous-produits agricoles non valorisés par
l’Homme en aliments de haute qualité. Le rumen abrite une communauté microbienne
complexe composée de bactéries, de protozoaires, de champignons, d'archaea et de virus.
Ce complexe affecte directement la santé et l'efficacité alimentaire des animaux, car chaque
souche de microbe pourrait avoir son activité fonctionnelle particulière. A cet égard,
la caractérisation de l'écosystème digestif du rumen en termes de composition microbienne
et de diversité fonctionnelle des microbes est nécessaire pour moduler le TGI des animaux
domestiques. Les probiotiques agissent comme un facteur clé qui peut fortement affecter
la structure et les activités des communautés microbiennes intestinales, favorisant la santé
et améliorant les performances des ruminants (Rigobelo et Avila, 2012). Par exemple, il a été
rapporté que les probiotiques ont un impact bénéfique sur la population de micro-organismes
cellulolytiques dans le rumen, entraînant une digestion plus élevée des fibres, ce qui maintient
le pH du rumen stable et diminue le risque d'acidose. De plus, les probiotiques peuvent affecter
positivement la prise alimentaire des animaux, améliorant ainsi leurs performances et leur
productivité. La colonisation de bactéries probiotiques dans le rumen des jeunes ruminants peut
inhiber l'établissement d'agents pathogènes dans leur TGI, conduisant à la prévention
des diarrhées et à la réduction du temps de sevrage et à l'amélioration de l'utilisation
des aliments fibreux (Hussain et al., 2012). Les avantages de la supplémentation en probiotiques
chez les ruminants ne se limitent pas à la production animale : elle peut également être utile
pour résoudre les problèmes environnementaux. Par exemple, il a été démontré qu'une
supplémentation en probiotiques dans l'alimentation des ruminants peut réduire la production
de méthane, qui est considéré comme un important gaz à effet de serre provoquant
le réchauffement climatique (Takahashi, 2013).
Plusieurs essais sur le terrain ont montré que la supplémentation en probiotiques peut contrôler
et réduire efficacement la charge pathogène dans l'intestin du bétail. Une étude de terrain
de 2 ans a montré que l'application quotidienne de supplément alimentaire de la souche
Lactobacillus acidophilus NP51 chez les bovins de boucherie entraînait une diminution
significative de 35% de l'excrétion fécale d'Escherichia coli O157:H7 (Peterson et al., (2007).
Ceci est conforme aux résultats de Sargeant et al., (2007), qui ont montré qu'une combinaison
17
probiotique de Propionibacterium freudenreichii et de Lactobacillus acidophilus NP51

(NPC747) était efficace chez les bovins pour réduire l'excrétion fécale d'E. coli O157. :H7.
Wisener et al., (2015) ont également confirmé que la combinaison de Propionibacterium
freudenreichii et de Lactobacillus acidophilus NP51 (NPC 747) réduisait efficacement
l'excrétion fécale d'E. coli O157:H7 chez les bovins. Ces auteurs ont également suggéré qu'un
débit de dose de 109 UFC/animal/jour était plus efficace que des débits de doses inférieurs.
▪ Probiotiques pour les lapins
Un système intensif d'élevage de lapins, notamment en période de sevrage, peut engendrer

de nombreux stress physiologiques et environnementaux. Ces problèmes entraînent
la concentration et la propagation d'agents entéropathogènes tels que Escherichia coli,
les coccidies et l'entéropathie épizootique du lapin qui ont des effets négatifs sur
les performances de croissance, l'efficacité alimentaire et l'état de santé du lapin. L'utilisation
d'antibiotiques comme activateurs de croissance dans les élevages a été interdite relativement à
la résistance bactérienne. Cependant les probiotiques comme alternatives possibles améliorent
la capacité des animaux à assimiler la valeur nutritionnelle des aliments et à les convertir
positivement en masse corporelle.
Une étude menée par Guo et al. (2017) a montré que des lapins ayant reçu un régime
comprenant un mélange de 5 souches probiotiques de Bacillus subtilis (106 UFC/g) présentaient
des performances de croissance meilleures que celles des témoins ainsi qu’une augmentation
des immunoglobulines (IgG et IgA) sériques indiquant une amélioration de la réponse
immunitaire par rapport aux lapins témoins. De plus, ils ont montré qu’une alimentation
supplémentée de B. subtilis durant 7 semaines améliore l’homéostasie intestinale, la réponse
immunitaire innée ainsi que la résistance aux maladies.
De même, d’après Wang et al., (2020), un mélange de trois bactéries probiotiques de Bacillus
isolées de lapins, a été administré à des jeunes lapereaux en post-sevrage avec trois
concentrations différentes 105 UFC/g, 106 UFC/g et 107 UFC/g pendant 5 semaines.
Les résultats ont montré que les souches de Bacillus à une dose de 106 UFC/g améliorent
les performances de croissance, renforcent le système immunitaire et améliorent nettement
le microbiote intestinal en augmentant Lactobacillus spp. et Bacillus spp., avec une diminution
du nombre d'Escherichia coli. De plus, le mélange de Bacillus a augmenté les concentrations
d'acide acétique, d'acide propionique et d'acide butyrique ainsi que les activités de protéase,
d'amylase et de cellulase des lapins jeunes et sevrés. L’administration de ces souches
18
de Bacillus probiotiques a également augmenté l'abondance des bactéries cellulolytiques et a

amélioré la morphologie intestinale. Par conséquent, ces souches ont facilité la croissance
des lapereaux sevrés en améliorant la fonction digestive. Une souche de Lactobacillus casei
a été aussi testée récemment comme probiotique chez les lapereaux et il a été montré que,
par voie orale, elle pourrait augmenter l'abondance des lactobacilles intestinaux, diminuer
l'abondance relative des Escherichia-Shigella intestinaux et favoriser la croissance
de l'appendice vermiforme (Shen et al., 2019).
Liu et al. (2019) ont montré que l’utilisation de Clostridium butyricum en tant que probiotique
a donné des effets bénéfiques sur l'amélioration de la microflore intestinale du lapin au sevrage.
Les auteurs ont rapporté que, par rapport au témoin, les lapins ayant reçu une dose élevée
(105 UFC/g) de Clostridium butyricum possédaient des villosités des tissus de l’intestin grêle
de taille plus grande tandis que ceux ayant une dose de 104 UFC/g présentaient des villosités
plus longues dans le duodénum et l’iléon. D’autre part ce traitement a diminué la profondeur
des cryptes intestinales des lapins. Ainsi les probiotiques peuvent augmenter la longueur des
villosités et diminuer la profondeur des cryptes dans l’intestin grêle ce qui est bénéfique pour
la digestion et l’absorption des nutriments, affectant ainsi directement la morphologie de la
muqueuse, l’activité des enzymes digestives et par conséquent, les performances de croissance.
Certains auteurs ont rapporté que les probiotiques améliorent les caractéristiques de la carcasse
et augmentent même les parties comestibles. Fathi et al. (2017) ont montré que les lapins nourris
avec une supplémentation de Bacillus subtilis augmentaient le poids de la carcasse, le
pourcentage d’habillage et les coupes de la partie médiane et postérieure en pourcentage du
poids vif. De même, Mohamed et al. (2017) ont rapporté que la plupart des composantes de la
carcasse étudiées étaient affectées positivement chez des lapins nourris avec des probiotiques
(deux suspensions fraiches de Bifidobactérium bifidum et de Lactobacillus acidophilus) par
rapport au groupe témoin.
▪ Probiotiques pour les volailles
L'inquiétude du public concernant la résistance microbienne aux antibiotiques a conduit à une

interdiction de leur utilisation en tant que stimulateur de croissance pour la volaille et d'autres
animaux d'élevage dans plusieurs pays. Les probiotiques sont l'une des nombreuses approches
qui ont été considérées comme des alternatives aux promoteurs de croissance antibiotiques dans
la production avicole (Patterson et Burkholder, 2003 ; Kabir., 2009).
19
Comme chez les humains, le tractus intestinal des poulets peut être colonisé par des bactéries
probiotiques qui peuvent apporter des bienfaits nutritionnels et pour la santé du côlon via leurs
activités métaboliques (Shokryazdan et al., 2014). Les bactéries probiotiques peuvent
également contribuer à la protection de l'hôte contre les agents pathogènes intestinaux par
la colonisation de l'intestin (Guarner et Malagelada, 2003 ; Isolauri et al., 2002) et la stimulation
des réponses immunitaires (Panda et al., 2000) en favorisant les mécanismes de défense
endogènes de l'hôte et en modulant le système immunitaire muqueux (Dalloul et al., 2003).
De plus, avec la multiplication des recherches dans le domaine des probiotiques, leurs effets
bénéfiques sur les volailles se découvrent les uns après les autres. Par exemple, la capacité
des probiotiques à réduire les effets néfastes du stress thermique chez les poulets (Jahromi et
al., 2015) et leurs effets sur la réduction des métaux lourds, en particulier la contamination
environnementale par le plomb des élevages avicoles (Jahromi et al., 2014), sont de nouvelles
approches dans ce champ.
L'activité antimicrobienne potentielle des souches probiotiques contre les Campylobacter

pathogènes dans des élevages de volailles a été évaluée. Plusieurs probiotiques potentiels anti-
Campylobacter ont été identifiés (Tableau 1). Comme exemple, il a été démontré in vitro que
Pediococcus parvulus, Lactobacillus salivarius et Enterococcus faecalis MB 5259 inhibent
potentiellement Campylobacter jejuni et réduisent sa croissance (Menconi et al., 2014 ; Robyn,
et al., 2012).
Quelques études ont rapporté un rôle efficace des probiotiques dans la réduction de la charge
excrétée de C. jejuni dans les essais in vivo tels que Bifidobacterium longum PCB 133 (Santini
et al., 2010) ou bien Lactobacillus gasseri SBT2055 qui a pu bloquer l'adhérence et l'incursion
de C. jejuni et réduire sa charge (Nishiyama et al., 2014).
De même, plusieurs résultats expérimentaux indiquent que l'application de cultures

probiotiques peut contrôler et réduire efficacement la colonisation par des agents pathogènes
chez les volailles. Par exemple, l'administration de 108 UFC de Lactobacillus à des poulets
a réduit la colonisation caecale de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis
et Clostridium perfringens pendant au moins 14 jours (Kizerwetter-Świda et Binek, 2009 ;
Higgins et al., 2008), De même, l'application du probiotique Bacillus subtilis comme
supplément alimentaire a réduit les populations de Salmonella spp. dans l'intestin des poulets
de chair (Park et kim, 2014 ; Upadhaya et Kim, 2016). Une diminution significative du nombre
d'Escherichia coli K88 a été observée avec l'ajout de la souche probiotique Enterococcus
faecium à raison de 109 UFC/kg dans l'alimentation des poulets de chair (Cao et al., 2013).
20
3. Mécanismes d’action des probiotiques
Il existe de nombreux mécanismes par lesquels les probiotiques peuvent prévenir l'infection,
notamment en augmentant la valeur nutritionnelle des aliments, en améliorant la santé
intestinale et en conférant des avantages pour la santé, tels que la production de substances
antimicrobiennes, l'inhibition de l'adhérence épithéliale et muqueuse des agents pathogènes,
la compétition pour des nutriments limités, l’inhibition de l'invasion épithéliale par des agents
pathogènes, la modulation du système immunitaire et instruction de la composition et
de l'activité du microbiote intestinal (Wan et al., 2016 ; Hossain et al., 2017) (Figure 3). Chaque
mécanisme d'action probiotique est dépendant de la souche, ce qui rend essentiel de sélectionner
et de comparer scientifiquement les probiotiques individuels pour l'usage auquel ils sont
destinés. Cependant, les mécanismes sont fondés soit sur la production de nombreux types de
molécules, soit sur un contact direct de cellule à cellule (Jonkers, 2016).
L'antagonisme bactérien des probiotiques joue un rôle majeur dans l'équilibre entre les micro-
organismes concurrents bénéfiques et potentiellement pathogènes. Les micro-organismes
probiotiques appliquent ce mécanisme en sécrétant une variété de composés antimicrobiens,
notamment des acides organiques, du péroxyde d'hydrogène, des bactériocines et
des biosurfactants, qui peuvent inhiber la croissance de bactéries pathogènes ; cependant,
les bactériocines ont une activité antimicrobienne plus forte contre les agents pathogènes dans
des conditions acides (Kanmani et al., 2013). En libérant des composés antimicrobiens,
les probiotiques peuvent supprimer la croissance des agents pathogènes d'origine alimentaire
et peuvent également réduire le développement de biofilms par les agents pathogènes et se
défendre contre les infections. En général, les bactéries lactiques probiotiques libèrent
des acides organiques (principalement des acides lactique et acétique) qui réduisent le pH
intestinal, diminuent le risque de colonisation par des agents pathogènes, créent des conditions
plus appropriées pour le microbiote résident et créent un environnement acide inhibiteur
des agents pathogènes (Servin, 2004).
Les probiotiques peuvent également utiliser des mécanismes enzymatiques, sécrétant
des enzymes capables d'hydrolyser les toxines bactériennes, de modifier les récepteurs
de toxines et d'inhiber les maladies à médiation par les toxines (Alvarez-Olmos et Oberhelman,
2001). La sécrétion d'enzymes polyamines permettait à Saccharomyces boulardii de dégrader
les récepteurs de la toxine Clostridium difficile dans l'iléon du lapin et de bloquer la sécrétion
induite par le choléra dans le jéjunum du rat (Alvarez-Olmos et Oberhelman, 2001).
21
Les souches probiotiques peuvent également montrer des mécanismes métaboliques, dans
lesquels elles créent un écosystème anaérobie favorable dans l'intestin pour le microbiote
résident en détoxifiant les molécules inhibitrices et les composés piégeurs d'oxygène tels que
les amines ou les nitrates. Ces activités métaboliques et cette capacité de survie dans l'intestin
dépendent principalement des souches probiotiques utilisées (Chaucheyras-Durand et Walker
2008). Les souches probiotiques peuvent également sécréter des exopolysaccharides qui
peuvent inhiber la formation de biofilms par des agents pathogènes (Kim et al., 2009).
Certains probiotiques peuvent également appliquer des mécanismes de prévention
de la colonisation, dans lesquels ils inhibent de manière compétitive l'adhésion de micro-
organismes pathogènes aux surfaces des cellules hôtes (La Ragione et al., 2004). Pour ce
mécanisme, les protéines présentes à la surface des agents probiotiques sont importantes, telles
que les protéines de la couche S (couche de surface) à la surface de Lactobacillus helveticus
et Lactobacillus crispatus qui peuvent obstruer l'adhésion d'Escherichia coli O157:H7 à HeLa,
HEp-2 et Cellules T84 (Johnson-Henry et al., 2007).
L'impact des probiotiques ainsi que des bactéries colonisant les aliments ne réside pas
seulement dans leur capacité à se greffer dans le microbiote mais plutôt dans le partage de gènes
et de métabolites, soutenant le microbiote en difficulté et influençant directement les cellules
épithéliales et immunitaires (Wieërs et al., 2020).
Figure 3 : Mécanismes d'action des probiotiques. a) Exclusion compétitive des micro-

organismes pathogènes. b) Production de substances antimicrobiennes. c) Compétition pour les
nutriments et les facteurs de croissance. d) Augmenter l'adhérence à la muqueuse intestinale. e)
Fonction de barrière épithéliale améliorée. f) Augmentation de la sécrétion d'IgA (stimulation
immunitaire) (Hossain et al., 2017).
22
III. Les bactéries lactiques et Enterococcus spp.

1. Généralités sur les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques (Lactic Acid Bacteria, LAB) sont un groupe d'organismes à Gram
positif, cocci ou bâtonnets, catalase négative, et non sporulés. Ils sont aérotolérants et protégés
contre les sous-produits de l'oxygène tels que le peroxyde d'hydrogène par les péroxydases.
Ils sont généralement immobiles et la division cellulaire se produit généralement dans un seul
plan (Corona-Hernandez et al., 2013). L'optimum de croissance est à un pH de 5,5 à 5,8, et ces
micro-organismes ont des besoins nutritionnels complexes en acides aminés, peptides, bases
nucléotidiques, vitamines, minéraux, acides gras et glucides. Ils fermentent les glucides pour
obtenir de l'énergie, en utilisant des sources de carbone endogènes comme accepteur final
d'électrons à la place de l'oxygène. Les LAB sont classés en micro-organismes
homofermentaires et hétérofermentaires, sur la base des produits des glucides fermentés.
Les LAB homofermentaires produisent principalement de l'acide lactique à partir de sucres,
tandis que les LAB hétérofermentaires produisent de l'acide lactique, de l'acide acétique ou
de l'alcool et du dioxyde de carbone (Mokoena et al., 2016).
Plusieurs études ont rapporté la capacité de divers LAB à inhiber la croissance de micro-
organismes pathogènes, leur capacité à dégrader les mycotoxines, leurs capacités probiotiques,
ainsi que les activités antimicrobiennes par production des peptides antimicrobiens appelés
bactériocines ou peroxyde d'hydrogène, diacyles (Naidu et al., 1999). Les LAB sont parmi
les microbes les plus importants utilisés dans les fermentations alimentaires, ainsi que pour
améliorer le goût et la texture des produits alimentaires fermentés (Hati et al., 2013). Ils se
trouvent dans les matières végétales et les fruits en décomposition, dans les produits laitiers,
la viande et le poisson fermentés, les céréales, les betteraves, les légumes marinés, les pommes
de terre, le levain, les ensilages, les boissons fermentées, les jus, les eaux usées et dans
les cavités humaines et animales (König et Fröhlich, 2009 ; Liu et al., 2014). Chez l'homme,
ils habitent particulièrement la cavité buccale, l'iléon, et le côlon (Djadouni et Kihal, 2012)
Les LAB sont actuellement classés dans le phylum Firmicutes, classe Bacilli et ordre
Latobacillales. Les genres LAB comprennent Lactobacillus (180 espèces), Lactococcus (7
espèces et 6 sous-espèces), Leuconostoc (13 espèces et 3 sous-espèces), Pediococcus (9
espèces), Streptococcus, Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Dolosigranulum,
Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Khalid, 2011 ; Walter,
2008).
23
2. Enterococcus spp.
2.1. Taxonomie
Les entérocoques (Enterococcus spp.) appartiennent au phylum des Firmicutes de la famille
des Enterococcaceae comprenant les genres Bavariicoccus, Catellicoccus, Melissococcus,
Pilibacter, Tetragenococcus et Vagococcus (Schlegel et al., 2000).
Au début, le genre Enterococcus comprenait uniquement deux espèces (E. faecalis et
E. faecium), mais le nombre d’espèces a augmenté à partir de 1984, date de séparation du genre
Enterococcus du genre Streptococcus. En 2002, Facklam et al., ont reporté 23 espèces
d’Enterococcus. Actuellement on compte plus de 50 espèces d’Enterococcus spp (Köhler W,
2007 ; Lebreton et al., 2014 ; Franz et al., 2011 ; Van Tyne et Gilmore, 2014 ;
www.bacterio.net/enterococcus.html) (Tableau2).
Tableau 2 : Groupe phylogénétique des espèces du genre Enterococcus selon les analyses
génétiques de l’ARNr-16S et de l’espace intergénique 16S-23S (Franz et al., 2011 ; Lebreton
et al., 2014).
Groupes
E.
E. faecalis E. avium E. faecium E. cecorum E. gallinarum E. dispar
saccharolyticus
Espèces de chaque groupe
E. faecalis E. avium E. faecium E. cecorum E. gallinarum E. dispar E. saccharolyticus
E. caccae E. devriesei E. canis E. columbae E. casseliflavus E. asini E. acquimarinus,
E. haemoperoxidus E. malodoratus E. durans E. canintestini E. camelliae,
E. moraviensis E. pseudoavium E. hirae E. E. italicus,
hermanniensis
E. silesiacus E. raffinosus E. mundtii E. pallens E. sulfureus,
E. termitis E. viikkiensis E. ratti E. E. lemanii
diestrammenae
E. plantarum E. xiangfangensis E. villorum E. eurekensis
E. ureasiticus E. lactis E. alcedinis,
E. quebecensis E. olivae
E. ureilyticus E. bulliens
E. rotaii
E. rivorum
2.2. Caractères bactériologiques

Les entérocoques sont des bactéries à Gram positif de forme ovoïde (cocci) d’une dimension
de 0,6 à 2 µm par 0,6 à 2,5 µm, non sporulées et non capsulées (Holt et al., 1994). Après culture
en milieu liquide, ils forment des paires ou de courtes chaînettes. La mobilité des entérocoques
diffère selon les espèces, elle se fait à l’aide de flagelles rudimentaires. Ces organismes n’ont
pas le cytochrome C à la fin de la chaîne respiratoire et donc sont catalase négative.
Les entérocoques sont aéro-anaérobie tolérants, se développent facilement sur milieux usuels
à base de peptone en l’absence de facteurs supplémentaires. Les colonies sont bombées avec
24
une surface lisse à bord régulier, opaque et blanchâtre et le diamètre varie de 0,5 à 2mm
(Facklam et al., 2002). La pigmentation jaune n'est présente que chez un nombre limité
d'espèces, dont Enterococcus casseliflavus, E. sulfureus et E. mundtii (Lebreton et al., 2014).
Sur gélose au sang, les entérocoques sont non-hémolytiques ou β-hémolytiques, mais la β-
hémolyse reste un caractère particulier chez certaines souches de E. feacalis et de E. gallinarum.
Ils sont capables de croître en milieu contenant 6,5% de NaCl et à pH 9,6, sur des milieux
contenant des sels biliaires en hydrolysant l’esculine, à des températures de 10 à 45 °C et
de survivre à 60 °C pendant 30 minutes ; cependant quelques exceptions existent. La teneur
moléculaire en G/C varie de 37 à 45% avec un génome dont la taille varie de 2,7 à 3,6 Mb
(Facklam et al., 1999 ; Lebreton et al., 2014). Les entérocoques catabolisent un grand nombre
de sucres par voie fermentative, homo-fermentative, avec formation d’acide lactique (Facklam
et al., 1999). Ils hydrolysent l'esculine et produisent une pyrrolidonyl-arylamidase (PYR) (par
hydrolyse du pyrrolidonyl- β naphthylamide), qui est l'un des caractères le plus discriminatif
pour distinguer les entérocoques des streptocoques D, de Pediococcus et Leuconoctoc, mais
cette enzyme est absente chez E. cecorum et E. columbae (Schlegel et al., 2000).
L’identification est réalisée par des galeries d’identification du commerce de type ApiSystème
(Api-20-Strep, Rapid-ID-Strep). Le tableau 3 montre les caractères complémentaires
discriminants d’identification.
25
Tableau 3 : Caractères d’identification des principales espèces du genre Enterococcus (Schlegel et al., 2000).
+ : >85% de souches positives, - : <15% de souches positives, V : 16 à 94% de souches positives, PYRase : pyrrolidonyl-arylamidase, Nd
E. saccharolyticus
Tests
E. pseudoavium
E. casseliflavus
E. malodoratus
E. gallinarum
E. raffinosus
E. flavescens
E. columbae
E. sulfureus
E. cecorum
E. faecium
E. mundtii
E. faecalis
E. durans
E. dispar
E. avium
E. hirae
Mobilité - - + + - + - - - - - - - - - - -
Pigmentation jaune - - - + + + + - - - - - - - - - -
Antigène de groupe D V + + + + V V V V V V V - + - - -
Production de PYRase + + + + + + + + + + + + + + - - -
Résistance au tellurite de potassium - + - - - - V - - - - - - - Nd Nd Nd
Production d’acétoïne + + V V + V V + + V V V - Nd Nd Nd
Hydrolyse de l’arginine + + + + + + - + + + - - - - - - -
Fermentation de
L-Arabinose + - + + + + - - - - + + - - Nd - +
Saccharose + + + + + + + - + Nd V + - V Nd Nd Nd
Lactose + + + + + + + + + + + + + V - + V
Mannitol + + + + + + - - - - + + + + + - +
D-Raffinose - - + + + + + - V - + + - - Nd - +
Ribose + + + + + - Nd Nd Nd + + + + + + + +
Sorbitol - + - V V - - - - - - + + + + + -
L-Sorbose - - - - - - - - - - - + + + + - -
Méthyl-α-D-glucopyranoside - - + + - + Nd - - + + + + - + - -
26
2.3. Habitat
Les entérocoques sont un composant naturel du microbiote humain. Ils colonisent le tractus
gastro-intestinal inférieur, la cavité buccale et le tractus génital (Murray, 1990). Il y a environ
106 à 107 Enterococcus dans l'intestin humain (Qin et al., 2010), dont la plupart sont E. faecalis
(105-107 UFC/g de fèces) ou E. faecium (104-105 UFC/g de fèces). Chez certains individus
et dans certains pays, E. faecium peut prédominer dans cet écosystème (Devriese et Pot, 1995).
En plus d'E. faecalis et d’E. faecium, E. cecorum et E. durans sont également fréquemment
isolés (Chenoweth et Schaberg, 1990) tandis que E. caseliflavus, E. hirae, E. gallinaroum et
E. avium sont occasionnellement détectés (Gilmore et al., 1990).
Les entérocoques sont aussi un important colonisateur de l’intestin de plusieurs animaux,

y compris des porcs, des ânes, des poulets, des chiens. Cependant, les intestins des animaux
à sang froid constituent d'autres habitats importants (Devriese et al., 1990). En raison de leur
association avec le tractus gastro-intestinal, les entérocoques sont souvent présents dans
les aliments d'origine animale tels que les viandes, les viandes fermentées et cuites, ainsi que
le fromage (Franz et al., 1999). E. faecalis, E. faecium, E. durans, E. hirae et E. cecorum sont
présents dans le tractus gastro-intestinal des animaux de ferme tels que la volaille, les moutons,
les porcs et les vaches (Elghaieb et al., 2019 ; Leclercq et al., 1996). La présence d'entérocoques
dans le tractus gastro-intestinal des animaux d'élevage entraîne un risque élevé
de contamination du lait de vache et de brebis ou de la viande au moment de l'abattage. Ainsi,
des entérocoques ont été isolés de viande fraîche (Fluckey et al., 2009) ou de lait (Giannino
et al., 2009). Les entérocoques peuvent également être associés aux produits carnés transformés
tels que les saucisses crues fermentées ou les produits carnés cuits (Barbosa et al., 2009).
Ils sont également présents dans les fromages artisanaux, où ils prédominent souvent en fin
d'affinage (Fuka et al., 2010 ; Martin-Platero et al., 2009). Les souches d'E. faecium, E. faecalis
et E. durans prédominent dans le fromage et peuvent jouer un rôle dans l'affinage et
la production d'arômes (Bouton et al., 2009 ; Randazzo et al., 2008). Les entérocoques sont
également présents dans une variété de produits végétaux traditionnellement fermentés.
De plus, les souches d'E. faecalis et d'E. faecium sont également fréquemment isolées
de produits végétaux fermentés asiatiques et africains (Yousif et al., 2005).
Les entérocoques ont été isolés aussi à partir d'un certain nombre de sources environnementales,
notamment le sol (Graham et al., 2017), la végétation, le sable de plage, l’eau douce, les eaux
de surface, les eaux usées urbaines et les terres agricoles (Byappanahalli et al., 2012). Cela est
dû à leur nature robuste, leur permettant de s'adapter et de survivre dans des conditions sous-
27
optimales telles que des températures et des pH extrêmes, ainsi que dans des zones à haute
salinité telles que les eaux marines. Les entérocoques ne sporulent pas ; par conséquent, leur
persistance dans ces environnements hostiles découle, en partie, de leur capacité à entrer dans
un état viable et non cultivable, leur résistance à la carence de nutriments et leur capacité
à résister à la dessiccation (Lebreton et al., 2017).
2.4. Pathogénicité et facteurs de virulence des entérocoques

L'émergence des entérocoques en tant qu'agents pathogènes problématiques et opportunistes ne
se produira qu'à la fin des années 1970 (García-Solache et Rice, 2019). Malgré leur importance
croissante en tant qu'opportunistes nosocomiaux, les entérocoques ne sont pas considérés
comme hautement virulents, car ils nécessitent un hôte immunodéprimé pour que la maladie
se produise (García-Solache et Rice, 2019). Chez ce type d'hôtes, ils provoquent principalement
des infections des voies urinaires, mais aussi des bactériémies nosocomiales et des infections
intra-abdominales, pelviennes, des plaies et des tissus. Les méningites et les infections
respiratoires causées par les entérocoques sont très rares (Kayser FH, 2003). Les entérocoques
sont actuellement le troisième agent pathogène nosocomial le plus courant, causant 14%
des infections nosocomiales aux États-Unis entre 2011 et 2014, contre 11% en 2007. En plus
des infections nosocomiales, les entérocoques sont responsables de 5 à 20% des endocardites
d'origine communautaire (Fiore et al., 2019). Le succès des entérocoques en tant que
pathogènes nosocomiaux peut s'expliquer par leur histoire évolutive. Tout en co-évoluant avec
leurs hôtes pour s'adapter à la vie terrestre, les entérocoques sont devenus un genre rustique.
Ils ont acquis une propension à échanger des informations génétiques avec d'autres bactéries
qui occupent les mêmes habitats, ils ont donc développé des génomes rationalisés et malléables
qui leur ont permis de prospérer même face à des facteurs de stress environnementaux tels que
l'exposition aux antibiotiques qui caractérisent les établissements de santé modernes (Lebreton
et al., 2017).
Douze espèces d'entérocoques sont impliquées dans les infections humaines : E. avium,
E. casseliflavus, E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus,
E. mundtii, E. pseudoavium, E. raffinosus et E. solitarius (Mundy et al., 2000). Parmi ceux-ci,
E. faecalis et E. faecium sont les plus répandus ; ils représentent environ 75% des isolats
cliniques. E. faecium est l'un des agents pathogènes du groupe ESKAPE (E. faecium, S. aureus,
Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Enterobacter
spp.), un groupe de micro-organismes virulents et multirésistants qui représentent la plupart
des infections nosocomiales humaines et dont la résistance aux antibiotiques doit être surveillée
28
(De Oliveira et al., 2020). Cependant, des infections par d'autres entérocoques sont de plus
en plus rapportées (García-Solache et Rice 2019).
Chez les animaux les infections à entérocoques sont rarement rapportées. Ils sont
principalement responsables de mammite bovine et de spondylarthrite entérococcique chez
les volailles. E. cecorum a été initialement décrit en 1983 comme constituant du microbiote
intestinal des volailles adultes, en particulier des poulets (Gallus gallus domesticus).
Cependant, au cours des 15 dernières années, des souches pathogènes d'E. cecorum sont
apparues comme une cause importante de maladies squelettiques chez les poulets de chair
et les poulets reproducteurs de chair. Des épidémies à E. cecorum pathogène chez des poulets
commerciaux ont été initialement décrits en 2002 en Écosse et aux Pays-Bas. Plusieurs rapports
ont suivi décrivant des épidémies d'E. cecorum pathogènes en Belgique, au Canada,
en Allemagne, en Hongrie, en Iran, en Pologne, en Afrique du Sud, en Suisse, et aux États-
Unis. Actuellement, des E. cecorum pathogènes semble maintenant être endémiques dans
le monde entier (Jung et al., 2018). La caractéristique la plus frappante de l'infection par
E. cecorum pathogène est la paralysie due à une masse inflammatoire qui se développe dans
la colonne vertébrale au niveau de la vertèbre thoracique libre. La reconnaissance de cette lésion
vertébrale a donné lieu à plusieurs noms de maladies pour l'infection pathogène à E. cecorum,
notamment l'ostéomyélite vertébrale, l'ostéomyélite et l'arthrite entérococciques vertébrales,
et la spondylarthrite entérococcique.
Parmi les bactéries à Gram positif, les streptocoques et les entérocoques sont des agents
importants d'infection intramammaire dans les troupeaux laitiers, étant les principaux agents
pathogènes responsables du nombre élevé de cellules somatiques en réservoir dans
les troupeaux gérés de manière appropriée (Carrillo-Casas et Miranda-Morales, 2012).
La principale source d'agents de mammite environnementale est l'environnement de la vache,
car les infections ont généralement lieu pendant la pratique de la traite. La haute tolérance
des entérocoques aux conditions défavorables permet leur longue survie dans l'environnement.
Pour cette raison, les infections potentielles de la glande mammaire sont faciles et simples.
E. faecium et E. faecalis ont été souvent impliqués dans les mammites bovines (Carrillo-Casas
et Miranda-Morales 2012 ; Różańska et al., 2019).
La pathogenèse de la plupart des infections implique une séquence d'événements qui incluent
la colonisation, l'adhésion aux cellules de l'hôte, l'envahissement des tissus et la résistance aux
mécanismes de l’immunité innée (Giridhara Upadhyaya et al., 2009). Des études ont montré
que les souches d'entérocoques qui ont des facteurs de virulence causent plus d’infections
29
graves que ceux qui sont dépourvus. Des progrès considérables ont été réalisés ces dernières
années dans la détection des facteurs de virulence chez les entérocoques d'origine clinique.
Deux facteurs de virulence ont été isolés et caractérisés : i) les facteurs de surface qui affectent
la colonisation des cellules hôtes, et ii) les agents sécrétés par les entérocoques, qui
endommagent les tissus (Sava et al., 2010). Le tableau 4 résume les principaux facteurs
de virulence, les gènes codant ces facteurs et leurs fonctions/effets biologiques (Chajęcka-
Wierzchowska et al., 2017).
30
Tableau 4 : Facteurs de virulence des entérocoques (Chajęcka-Wierzchowska et al., 2017)

Facteurs de virulence gènes Caractéristiques et fonctions/effets biologiques
Facteurs de colonisation
• Substance agg Poids moléculaire : 137 kDa
d’agrégation (aggregation Structure en épingle à cheveux. Le motif moteur fortement
substance) : AS conservateur de LPXTG est une partie importante de sa
molécule et sa séquence distinctive est considérée comme le
site de reconnaissance et de clivage par les sortases qui les
lient par une liaison covalente à la paroi cellulaire
La substance d'agrégation comprend une gamme d'adhésines
hautement homologues
Se liant aux cellules hôtes, permet un contact de cellule à
cellule entre les souches donneuses et receveuses pour la
conjugaison
• Protéine de liaison au ace Poids moléculaire : 74 kDa
collagène (Accessory Une protéine dont la structure est similaire à Ace de E.
colonisation factor) : Ace faecalis a été trouvée chez E. faecium : Acm
Ace joue un rôle important dans la colonisation en se liant aux
protéines de la matrice extracellulaire (ECM) ; il participe
également à la liaison du collagène de type I et IV
• Antigène spécifique efAfs chez E. Poids moléculaire : 34 kDa
de l'endocardite (adhésine de faecalis (des EfaA est homologue aux adhésines présentes dans les parois
paroi cellulaire/ endocardis homologues de ce cellulaires des streptocoques (protéine FimA, produite par
antigen) : Efa A gene chez E. Streptococcus parasanguis, ScaA chez S. gorgonii, PsaA
avium, E. chez S. pneumoniae et SsaB chez S. sanguis).
asini, E. durans et Facteur de virulence associé à l'endocardite infectieuse
E. solitarius)
efAfm chez E.
faecium
• Protéine de surface esp Poids moléculaire : 200 kDa
entérococcique Le gène esp est transférable par conjugaision et transposition
(Entercococcal surface La protéine Esp participe à la formation de biofilm qui peut
protein) : Esp jouer un rôle important dans l'échange de matériel génétique
entre les cellules et augmenter leur résistance aux
antibiotiques.
Facteurs sécrétés qui endommagent les tissus
• Cytolysine : Cyl cylLl/cylLs C'est une exotoxine de type bactériocine, qui présente des
propriétés bactéricides vis-à-vis des bactéries à Gram négatif
et des propriétés toxiques (Bêta-hémolyse) vis-à-vis des
érythrocytes, des leucocytes et des macrophages.
▪ La production de cytolysine est codée par un opéron
contenant huit gènes : cylR1, cylR2, cylLl, cylLs, cylM, cylB,
cylA et cylI.
• Gelatinase : GelE gelE Poids moléculaire : 30 kDa
La gélatinase est une métalloendopeptidase extracellulaire,
dépendante du zinc.
▪ hydrolyse la gélatine, l'élastine, le collagène,
l'hémoglobine, ainsi que d'autres peptides bioactifs, par
ex. protéines liées aux phéromones.
• Hyaluronidase : Hyl hyl Poids moléculaire : 45 kDa
Localisation plasmidique
Joue un rôle dans la destruction des mucopolysaccharides du
tissu conjonctif et du cartilage
• Phéromones cpd, cob, ccf, cad Les phéromones sont de petits peptides de 7 à 8 acides
aminés, qui facilitent le transfert de plasmides entre les
cellules.
Ils peuvent être chimiquement attractifs pour les neutrophiles
humains et induire la production de superoxydes (substances
mutagènes) et initier des conditions inflammatoires
31
3. Résistance des entérocoques aux antibiotiques

3.1. Résistance aux bêta-lactamines
La famille des β-lactamines regroupe plusieurs molécules appartenant à plusieurs classes telles
que : pénicilline G, amoxicilline, ampicilline, oxacilline, céphalosporines de 1er/2ème/3ème/4ème
génération, et carbapénèmes (imipenème, méropénème, ertapénème) (Cavallo et al., 2004).
Les β-lactamines inhibent la synthèse du peptidoglycane, constituant de la paroi bactérienne.
En effet, la synthèse de la paroi est réalisée par plusieurs réactions de transglycosylation,
transpeptidation et carboxypeptidation. Ces réactions sont déclenchées respectivement par
des transglycosylases, des transpeptidases et des carboxypeptidases connues sous le nom
de protéines de liaison à la pénicilline (PLP/Penicillin Binfing Protein PBP). Les bêta-
lactamines se fixent sur les PLP et jouent ainsi le rôle de substrats suicides. Cette fixation est
responsable de l’inactivation de ces enzymes et donc de l’arrêt de la croissance bactérienne
(Cavallo et al., 2004). Tous les entérocoques produisent au moins cinq PLP (PLP1 à PLP5),
qui peuvent être différenciés par la migration sur l'électrophorèse sur gel et sont initialement
nommées par convention selon l'ordre de migration (Nikolaidis et al., 2014).
Les entérocoques expriment une PLP5 de faible affinité (PLP5 chez E. faecium, et chez
E. faecalis parfois dénommée PLP4) qui se lient faiblement aux bêta-lactamines. En raison
de son affinité relativement faible pour les bêta-lactamines, PLP5 est capable d'effectuer
la synthèse du peptidoglycane à concentration de bêta-lactamines qui saturent le domaine
transpeptidase des autres PLP. Le niveau de résistance intrinsèque diffère parmi les bêta-
lactamines. En règle générale, les pénicillines (par exemple, l'ampicilline) ont l'activité la plus
élevée, les carbapénèmes légèrement inférieurs et les céphalosporines ont la plus faible activité.
La résistance acquise de haut niveau aux bêta-lactamines (CMI 128 mg/l pour l’ampicilline) est
apparue dans les hôpitaux aux États-Unis dans les années 1970 et 1980. La résistance
à l'ampicilline est rare chez E. faecalis, mais se produit dans ∼90% des souches d’E. faecium
nosocomiales modernes (Arias et Murray 2012). En général, il existe six PLP chez E. faecium,
dont les PLP1 (PM=140 KDa), PLP2 (PM=90 KDa), et PLP3 (PM=140 KDa) qui ont une forte
affinité aux β-lactamines et ont un rôle important dans la division cellulaire et la croissance
de la paroi bactérienne. En revanche, les PLP4 (80KDa) et PLP6 (43 KDa) ont une plus faible
affinité aux β-lactamines. Cependant, la PLP5 (75 KDa) a la plus faible affinité (Gutmann
et al., 1994). La résistance élevée à l'ampicilline chez E. faecium a été initialement expliquée
soit par la production accrue (hyperproduction) de PLP5, et/ou par des polymorphismes dans
la sous-unité bêta de cette protéine (PLP5’). En effet, l’hyperproduction de PLP5 est
32
le mécanisme principal de la résistance des E. faecium aux bêta-lactamines. La présence

du PLP5 en grande quantité compensera l’activité des autres PLPs inactivées par la pénicilline
(lors du traitement), et elle assure à elle seule la formation du peptidoglycane. Sur le plan
génétique, l’hyperproduction de PLP5 est due à une délétion de la région psr (pour ‘PBP
synthesis repressor’), localisée en amont du gène pbp5 codant la PLP5, et qui code pour
une protéine « régulatrice » de l’expression de ce gène (Ligozzi et al., 1996). Le deuxième
mécanisme de résistance lié au PLP5 est la modification structurale (polymorphisme) de PLP5
en PLP5’ (Rice et al., 2001). En effet, des mutations ponctuelles dans la région C-terminale
de PLP5 ont été significativement liées à un niveau de résistance élevé aux béta-lactamines,
tel que 485M/T, 496N/K, 499A/T, 525 E/D, 586V/L et 629E/V (Klibi et al., 2008 ; Gagetti
et al., 2019 ; Sifaoui et al., 2001).
Un autre mécanisme de résistance aux bêta-lactamines n'impliquant pas les PLP a été rarement
rapporté chez les entérocoques. Les premiers isolats d'E. faecalis produisant une bêta-lactamase
identique à l'enzyme staphylococcique blaZ ont été identifiés au Texas en 1981, puis ont été
décrits au Liban, au Canada et en Argentine (Gagetti et al., 2019). Actuellement, ce mécanisme
de résistance est plus fréquent chez E. faecalis que chez E. faecium. Ces souches sont
caractérisées par leur résistance à la pénicilline, aux aminopénicillines (ampicilline) et aux
uréido-pénicillines (pipéracilline), mais sensibles à l'imipenème et aux combinaisons de bêta-
lactamines avec des inhibiteurs de béta-lactamases.
3.2. Résistance aux aminoglycosides

Les aminoglycosides ou aminosides sont des agents antimicrobiens bactéricides à action rapide
inhibant la biosynthèse des protéines par la liaison au site A conservé de l'ARNr 16S sur
la petite sous-unité 30S du ribosome bactérien (Becker et Cooper, 2013). Les plus anciens
(streptomycine, kanamycine, néomycine, paromomycine, lividomycine…) sont des substances
naturelles élaborées surtout par Streptomyces, Micromonospora (gentamicine et sisomicine)
et des Bacillus (butirosine). Les produits les plus récents sont semi synthétiques (dibékacine,
amikacine, netilmicine) (Piepersberg, 1995).
Tous les entérocoques ont une résistance intrinsèque de bas niveau aux aminoglycosides (CMI
allant de 4 mg/mL jusqu'à 256 mg/mL). Le métabolisme anaérobie des entérocoques est censé
favoriser leur résistance de bas niveau à tous les aminoglycosides en limitant l'absorption
de ces antibiotiques, qui est associée aux protéines impliquées dans le transport d'électrons.
L'ajout d'un agent interférant avec la synthèse de la paroi cellulaire tel que l'ampicilline ou
la vancomycine, augmente nettement l'absorption de l'aminoglycoside et la destruction
33
des entérocoques. Chez E. faecium, deux gènes chromosomiques : le 6'-N-aminoglycoside

acétyltransférase (aac (6 ') -Ii) et une ARNr méthyltransférase (efmM) (Galimand et al., 2011 ;
Hollenbeck et Rice, 2012), ont été associés à une résistance intrinsèque à la tobramycine et à la
kanamycine.
En plus de la résistance intrinsèque aux aminoglycosides, les entérocoques ont acquis

des mécanismes de résistance entraînant une très forte résistance (résistance de haut niveau)
(les CMI en général ≥ 2000 mg /L). Cette résistance est liée à des modifications de la cible
ribosomale par mutations ou niveau des protéines ribosomales ou par, principalement,
des enzymes modificatrices des aminosides codées par des gènes à localisation plasmidique
ou transposables (Abbassi et al., 2007, 2009). Les enzymes de modification des aminosides
sont classés en trois groupes d'enzymes : les aminosides-phosphotransférases (APH)
(phosphorylation des groupements hydroxyles (OH)), les aminosides-nucléotidyl transférases
(ANT) (nucléotidylation des groupements hydroxyles), et les aminosides-acétyl transférases
(AAC) (acétylation des groupements aminés (NH2)). Dans chaque groupe, les enzymes sont
désignés par leur type d'activité (AAC, ANT, APH), le numéro du carbone portant
le groupement (chiffre arabe) modifié (1 à 6), et le cycle concerné par la modification (prime,
seconde). L'éventuel chiffre romain qui suit indique le spectre de l'enzyme, c'est-à-dire sa
spécificité pour les différents aminosides (Chow, 2000 ; Quincampoix et Mainardi, 2001).
La résistance de haut niveau à la streptomycine se produit le plus souvent par mutations

ponctuelles de la protéine ribosomique S12 ou par l'acquisition de gènes codant pour les
enzymes ANT(3´´)-Ia ou ANT(6´)-Ia (Hollenbeck et Rice , 2012 ; Miller et al., 2014). Alors
que la résistance causée par les enzymes modifiant les aminosides (AME) aura généralement
des CMI comprises entre 4 000 et 16 000 mg/ml, les mutations ribosomiques entraînent des
CMI de 128 000 mg/ml.
La résistance élevée à la gentamicine est généralement due à l'acquisition d'un transposon
hébergeant l'enzyme bifonctionnelle AAC(6´)-Ie-APH(2´´)-Ia, responsable de la résistance
croisée à tous les aminosides cliniquement disponibles, à l'exception de la streptomycine
(Hollenbeck et Rice , 2012). De plus, plusieurs autres déterminants ont été occasionnellement
décrits dans la résistance de haut niveau à la gentamicine, comme APH(2´´)-Ib, APH(2´´)-Ic ou
APH(2´´)-Id (Abbassi et al., 2007a ; Hollenbeck et Rice , 2012).
Enfin, deux autres enzymes, APH(3’)-IIIa et ANT(4´´)-Ia, ont été identifiés chez
les entérocoques, responsables respectivement à la résistance à la kanamycine et à
la tobramycine/kanamycine/amikacine/néomycine (Tableau 5).
34
Tableau 5 : Profils de sensibilité aux aminosides chez les entérocoques ayant des gènes codant
les enzymes de modification des aminosides (Chow, 2000).
Profil de résistance aux aminosides Gène

G T Am K N Di St Ar
R R R R R R S S aac(6’)-Ie-aph(2’’)-Ia
R R S R R R S S aph(2’’)-Ib
R R S R S S S S aph(2’’)-Ic
R R S R R R S S aph(2’’)-Id
S S R R S S S S aph(2’’)-IIIa
S R S R R nt S nt aac(6’)-Ii
S S S S S S R S ant(3’’)-Ia
S R R R S nt S S ant(4’)-Ia
S S S S S S R S ant(6’)-Ia
G : gentamicine, T : tobramycine, Am : amikacine, K : kanamycine, N : nétilmicine, Di :
dibekacine, St : streptomycine, Ar : arbekacine ; nt : non testé, R : résistant, S : sensible.
3.3. Résistance aux glycopeptides

Les glycopeptides (vancomycine et teicoplanine) inhibent la synthèse du peptidoglycane (paroi
bactérienne) (Cattoir et Leclercq, 2013). La majorité des entérocoques est naturellement
sensible aux glycopeptides avec une CMI modale de 1 mg/L pour la vancomycine et 0,5 mg/L
pour la teicoplanine. Les espèces E. gallinarum et E. casseliflavus/ E. flavescens ont une
résistance naturelle chromosomique constitutive de bas niveau aux glycopeptides. Trois
phénotypes appelés VanC1 (E. cassliflavus), VanC2 (E. flavescens) et VanC3 (E. gallinarum)
présentent un bas niveau de résistance à la vancomycine et restent sensibles à la teicoplanine
(Cattoir et Leclercq, 2013).
L'acquisition de la résistance aux glycopeptides a été décrite pour la première fois en 1988,
et depuis les entérocoques résistants aux glycopeptides (GRE) sont apparu comme une cause
majeure d'infections nosocomiales partout dans le monde. La majorité des infections causées
par les GRE sont attribuées à E. faecium, bien que la résistance aux glycopeptides a été observée
chez E. faecalis et d'autres espèces d'entérocoques. Jusqu'à présent, 8 types de mécanismes
de résistances enzymatiques acquis aux glycopeptides ont été décrits. Les phénotypes VanA
(le plus fréquent), VanB (fréquent), VanD, VanE, et VanG, VanL, VanM et VanN (Cattoir
et Leclercq, 2013 ; Ahmed et Baptiste, 2018) possèdent globalement des structures génétiques
et des modes d'action similaires (Tableau 6). L'opéron vanA comporte plusieurs gènes dont
les actions sont synergiques. Ces gènes codent pour des protéines permettant l'induction
de la résistance en présence de glycopeptides, la synthèse d'un précurseur anormal
des peptidoglycanes qui comporte dans sa partie C-terminale un dipeptide D-Alanine-D-Lactate
35
à la place du dipeptide D-Alanine-D-Alanine habituel, et l'hydrolyse du précurseur normal.

Les niveaux de résistance conférés par l'opéron vanA à la vancomycine et à la téicoplanine sont
élevés. L’opéron vanB confère un niveau de résistance variable à la vancomycine alors que
la sensibilité à la teicoplanine n’est pas altérée. L’opéron vanD accorde une résistance de niveau
modéré à la vancomycine et à la teicoplanine, tandis que les opérons vanG et vanE confèrent
un bas niveau de résistance à la vancomycine (la sensibilité de la teicoplanine n’est
pas modifiée) (Tableau 6).
Tableau 6 : Phénotypes de résistance aux glycopeptides (Cattoir et Leclercq, 2013 ; Ahmed et

Baptiste, 2018).
Résistance acquise Résistance

naturelle
Haut niveau Variable Modéré Bas niveau Bas niveau
VanA VanM VanB VanD VanE VanG VanL VanN VanC1/C2/C3
Vancomycine R R r-R R r r r r r
Teicoplanine R R S r-R S S S S S
Transférabilité + + + - - + - + -
Espèces A/B* A A/B A/B B B B A G/D
Expression I ? I C I/C I I C C/I
Localisation P(Chr) P(Chr) Chr (P) Chr (P) Chr Chr ? Chr Chr
génétique
précurseurs final D-Ala-D- D-Ala- D-Ala-D- D-Ala-D- D-Ala- D-Ala- D-Ala- D-Ala-D- D-Ala-D-Ser
Lac D-Lac Lac Lac D-Ser D-Ser D-Ser Ser
R : haut niveau de résistance (CMI : 0,16 mg/L) ; r : le faible niveau de résistance (CMI : 8-16
mg/L) ; S : sensible, A : E. faecium, B : E. faecalis ; G : E. gallinarum, D : E. casseliflavus ; I :
inductible ; C : constitutive ; Chr : chromosome, * : autres espèces d'entérocoques.
3.4. Résistance aux oxazolidinones

Les oxazolidinones (Linézolide et tétizolide) représentent une classe d’antibiotique avec grande
activité contre les bactéries à Gram positif. Ils sont des inhibiteurs de la synthèse des protéines
par fixation sur la sous unité ribosomale 50S en se liant à l'ARNr 23S. Ceci aboutit au blocage
de l’initiation et de la translocation de l’ARNm (Roger et al., 2018). Le linézolide, première
oxazolidinone lancée depuis avril 2000, est indiqué dans le traitement des infections causées
par les bactéries à Gram positif, y compris les entérocoques résistants aux glycopéptides.
Les mutations dans les gènes codant pour l'ARNr 23S, qui est une partie importante du site
de liaison de l’antibiotique au ribosome, sont les mécanismes les plus courants de résistance
au linézolide. Plusieurs mutations dans le gène codant l'ARNr 23S (la boucle centrale
36
du domaine V de l’ARNr 23S) ont été décrites, telles que G2576T, G2505A, U2500A, G2447U,
C2534U, G2603U. Cependant la substitution G2576T est la plus fréquente (Bourgeois-
Nicolaos et al., 2007). La plupart des bactéries, y compris les entérocoques, possède
de multiples copies des gènes codant pour l'ARNr 23S. E. faecalis possède quatre copies
du gène et E. faecium six copies. En théorie, la présence de plusieurs copies de gènes rend
la résistance aux mutations sporadiques moins probable, car les copies de gènes non affectées
masqueraient l'effet du gène muté. Cependant, la recombinaison entre les copies sensibles
et résistantes (conversion génique) produira des souches avec plusieurs copies mutées sous
une pression sélective persistante du linézolide. Dans les isolats cliniques, une mutation dans
un gène d'ARNr 23S d'E. faecium a conféré une CMI de 8 à 16 mg/ml. La même mutation dans
plus que 3 gènes d'ADNr 23S ont conféré une CMI comprise entre 64 et 128 mg/ml (Marshall
et al., 2002). Encore, un autre mécanisme basé sur des mutations nucléotidiques a été décrit
pour des gènes codant pour des protéines ribosomales rplC (L3), rplD (L4), rplV (L22),
qui bordent le centre peptidyl-transférase où le linézolide se lie, sont associées à une
augmentation des CMIs (Bi et al., 2018 ; Pfaller et al., 2017 ; Mendes et al., 2018).
En 2000, la modification enzymatique de l'ARNr 23S par la méthylation d'une adénine

en position 2503 a été rapportée chez un isolat de Staphylococcus sciuri isolé à partir
d’un écouvillon nasal d'un veau (Schwarz et al., 2000), en 2005 chez des isolats cliniques
de S. aureus résistants à la méthicilline (Kehrenberg et al., 2005 ; Long et al., 2006), et en 2011
ce mécanisme a été aussi observé chez un isolat bovin de E. faecalis en Chine (Liu et al., 2012).
Ce mécanisme confère non seulement une résistance aux phénicolés, mais aussi aux
oxazolidinones, lincosamides, pleuromutilines, et au streptogramine A (connue sous le terme
PhLOPSA, pour : Phénicoles, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilines et
Streptogramine A). Le CFR-rRNA methyltransférase est codé par le gène plasmidique cfr
(chloramphenicol-florfenicol resistance). Le transfert des plasmides hébergeant le cfr a été
démontré et le cfr de type sauvage (homologue des staphylocoques) et ses dérivés, nommés
cfr(B) et cfr(C) ont émergé chez Enterococcus spp. à partir d'échantillons animaux et humains
(Bender et al., 2016).
Récemment, un autre mécanisme codé par le gène plasmidique optrA codant pour un ABC
transporteur et responsable d’une résistance croisée aux phénicolés et aux oxazolidinones,
y inclus le tedizolide (Wang et al., 2015). Le gène optrA code pour une protéine de la famille
des ABC-F (ATP binding cassette (ABC)-F proteine) et assure la résistance grâce à la protection
de la cible ribosomale (Sharkey and O’Neill, 2018). Bien que la dissémination de ce gène reste
37
limitée géographiquement, il a été détecté chez des isolats de E. faecalis et de E. faecium

et fréquemment chez les isolats d’origine animale (porcs et volailles) que ceux d'origine
humaine (Bender et al., 2018 ; Liu et al., 2020). En Tunisie, ce mécanisme de résistance a été
rapporté chez des isolats E. faecalis isolés d’eaux usées (Freitas et al., 2017), de volaille
(Elghaieb et al., 2019) et de patients neutropéniques (Raddaoui et al., 2020).
En 2018, un nouveau déterminant de résistance, appartenant à la famille des protéines ARE

ABC-F, appelé poxtA, a été détecté en Italie chez une souche clinique de S. aureus résistants à
la méthicilline (Antonelli et al., 2018). La protéine PoxtA diminue la sensibilité aux phénicols,
aux oxazolidinones et aux cyclines. Comme OptrA, PoxtA a été initialement considérée comme
faisant partie d'un système d'efflux de l’antibiotiques, il a été démontré plus tard que cette classe
de protéines confère une résistance via un mécanisme de protection ribosomique.
Ce mécanisme de résistance au linézolide a été détecté chez des isolats de S. aureus, E. faecalis,
E. faecium et Pediococcus acidilactici principalement d’origine animale (Antonelli et al.,
2018 ; Hao et al., 2019). En Tunisie, le gène poxtA a été identifié par Elghaieb et al., (2019)
chez des isolats d’E. faecium isolés de lait cru bovine.
3.5. Résistance aux tétracyclines et glycylcyclines

Les tétracyclines (tétracycline, minocycline, oxytétracycline, chlortétracycline….) exercent
leur effet antibactérien en se liant au ribosome et en interférant avec la fixation de l'aminoacyl-
ARNt. Cela se produit via l'association avec plusieurs boucles de l'ARNr 16S et de la protéine
ribosomique S7 (Schnappinger et Hillen, 1996 ; Chopra et Roberts, 2001). La résistance aux
tétracyclines est courante chez les entérocoques et est principalement codée par l'un des deux
mécanismes suivants : i- l'efflux de l’antibiotique via des pompes d'efflux codées par les gènes
tet(K) et tet(L), et ii- la protection de la cible ribosomale et codées par les gènes tet(M), tet(O),
et tet(S) généralement portés par des éléments mobiles tels que Tn916. Les pompes à efflux
codées par tet(K) et tet(L), généralement portés sur des plasmides, codent pour des protéines
avec 14 α-hélices qui constituent les domaines transmembranaires et confèrent une résistance
à la tétracycline mais pas à la minocycline (Chopra et Roberts, 2001). Les gènes tet(M), tet(O)
et tet(S) sont des déterminants souvent à localisation chromosomique, qui confèrent une co-
résistance à la doxycycline, le minocycline, et la tétracycline et peuvent être transférés via
le transposon Tn916.
Les glycylcyclines : tigécycline, l'aminométhylcycline omadacycline et l'eravacycline

synthétique, ont été conçus pour conserver leur activité dans le cadre des déterminants courants
38
de la résistance à la tétracycline et offrent des options potentielles pour le traitement

des infections dues aux entérocoques résistants aux glycopeptides. La résistance à la tigécycline
est apparue avec l'utilisation clinique. Le principal mécanisme de résistance semble impliquer
des mutations de la protéine S10 de la sous-unité ribosomique 30S (Cattoir et al., 2015). Ces
mutations se regroupent dans une boucle étendue de la protéine, qui fait saillie près du site
de liaison de la tigécycline sur l'ARNr 16S, conduisant potentiellement à une diminution
de l'accès ou de la liaison au ribosome (Beabout et al., 2015). Le tigécycline est un faible
substrat pour les pompes d'efflux et les protéines de protection ribosomique ; cependant
la présence des gènes codant à la fois la pompe d'efflux tet(L) et le facteur de protection tet(M)
a été associée à une résistance chez des isolats cliniques de E. faecium (Fiedler et al., 2016).
3.6. Résistance aux Macrolides-Lincosamides-Streptogramines (MLS)

Ces trois groupes d’antibiotiques sont de structures chimiques différentes mais ils sont
apparentés par leur spectre d’activité, leur mécanisme d’action et leurs mécanismes
de résistance.
Les MLS inhibent la synthèse protéique en se fixant tous au niveau de la sous-unité 50S du
ribosome en particulier au niveau d’une région de l’ARN ribosomal 23S (Roberts MC, 2008).
E. faecium est caractérisée par un gène spécifique d’espèce msrC, à l’origine d’une
augmentation de la CMI des macrolides (érythromycine) de 2 à 8 fois. Ce gène msrC est
intrinsèque et non lié à la pression de sélection d’antibiotique et constituerait un avantage pour
E. faecium par rapport aux autres espèces.
La résistance aux MLS est codée par plusieurs mécanismes dont les principaux sont : 1-
modification de la cible ribosomale, 2- inactivation enzymatique, 3- efflux actif.
• Modification de la cible ribosomale :

La modification de la cible est due à une altération du ribosome suite à une diméthylation
de l’ARN ribosomal par une méthylase codée par des gènes erm (erythromycine ribosome
methylation). Le site précis de méthylation est une adénine en position 2058 dans l'ARNr 23S
de la grande sous-unité ribosomique 50S. Le résidu est situé dans une région conservée
du domaine V de l'ARNr 23S et joue un rôle clé dans la liaison des MLSB. En conséquence
de la méthylation de l'ARNr 23S, la liaison de l'érythromycine à sa cible est altérée. Il existe
une résistance croisée entre tous les macrolides, lincosamides et streptogramines B
(pristinamycine I, virginiamycine S et quinupristine) en raison du chevauchement des sites
de liaison de ces antibiotiques dans l'ARNr 23S, ce qui a donné lieu au phénotype dite MLS B.
39
En revanche, le composé A des streptogramines et l’association A+B demeurent actifs.

Les méthylases de résistance aux macrolides constituent une famille de protéines hautement
apparentées codées par les gènes erm (Erythromycin Resistance Methylase). Chez les
entérocoques, la résistance est principalement codée par le gène erm(B) et peu par les gènes
erm(A), erm(C) ou erm(F) (Luna et al., 2002 ; Portillo et al., 2000). L’expression
de la résistance peut être constitutive ou inductible sous le contrôle d'un atténuateur situé en
amont du gène erm(B) (64, 119). La résistance inductible est exprimée comme une résistance
croisée entre la plupart des membres du groupe MLSB, y compris la clindamycine et
les membres de macrolides à 14 chaînons, qui sont des inducteurs à divers degrés de production
du méthylase ErmB. Qu'elle soit inductible ou constitutive, la résistance à l'érythromycine
s'exprime généralement à un niveau élevé (CMI 128 mg/litre) (Leclercq et Courvalin, 2005).
• Inactivation enzymatique :
L’inactivation des MLS est réalisable par différentes enzymes. Par ce mécanisme, la résistance
n’est pas croisée entre les MLS mais elle confère seulement une résistance aux antibiotiques
ayant une relation structurale. Le gène lnuB code un lincosamide O-nucléotidyltransférase
inactivant les lincosamides confèrant ainsi une résistance franche à la lincomycine mais
la clindamycine reste active (Roberts MC, 2008). La modification enzymatique des deux
facteurs des streptogramines est attribuée à deux types d’enzymes d’acétyltransférases
inactivant le facteur A (codés par les gènes vatA, vatD, vatE (satG), vatH) et le facteur
B (le gène vgbA) (Hollenbeck et Rice, 2012 ; Roberts MC, 2008).
• Efflux actif :
Chez les entérocoques ainsi que les bactéries à Gram positif, l’acquisition de la résistance aux
macrolides par efflux actif est causée par deux classes de pompes : 1- la superfamille des ABC
transporteurs (ATP-Binding-Cassette) (Singh et al., 2001), 2- la superfamille des MFS (Major
Facilitor Superfamily) (Roberts MC, 2008). Ces protéines de transport actif pompent
l’antibiotique en dehors de la cellule favorisant une faible concentration intracellulaire. Chez
les entérocoques plusieurs gènes codants ces pompes à efflux ont été identifiés tels que : lsa(A)
(phenotype LSA), lsa(E) (phenotype LSA), mef(A) (phénotype M), msr(A) (phénotype MSB),
msr(B), vga(B), vga(D) (phénotype SA) (Leclercq et Courvalin, 1991 , ; Hollenbeck et Rice,
2012).
40
4. Bactériocines des entérocoques : les entérocines

La production de substances antagonistes par les organismes vivants est une caractéristique
conservée tout au long de l'évolution, constituant un mécanisme de défense ancestral efficace.
Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens sécrétés par synthèse ribosomique,
d'une longueur de 20 à 60 acides aminés, cationiques et hydrophobes (Kumariya et al., 2019).
Les bactériocines ont suscité beaucoup d'intérêt en tant qu'agents antimicrobiens potentiels
contre différentes espèces bactériennes, fongiques et virales (Akerey et al., 2009 ; Hassan et
al., 2012a ; Torres et al., 2013), et même contre des structures résistantes naturelles telles que
les biofilms bactériens (Park et al., 2011). Ces peptides naturels synthétisés par les ribosomes
sont produits par des bactéries vivant dans un environnement polymicrobien compétitif et sont
utilisés pour éliminer d'autres espèces bactériennes, en particulier celles qui sont étroitement
apparentées. Ils sont libérés extra-cellulairement et peuvent avoir des effets bactéricides ou
bactériostatiques sur les microorganismes cibles.
Alors que certaines bactériocines ne présentent une activité antimicrobienne que contre
des bactéries de la même espèce ou contre des groupes phylogénétiques proches, désignées sous
le nom de bactériocines à spectre étroit, d'autres sont actives contre une variété de genres et,
ainsi, présentent une large activité antimicrobienne.
Les bactériocines ont une structure extrêmement diverse, étant codées par des opérons de gènes
complexes et variables, localisés sur le chromosome, des plasmides ou d’autres éléments
génétiques mobiles (Heilbronner et al., 2021). Ces groupes de gènes de bactériocine codent
généralement pour la bactériocine elle-même, mais aussi pour des enzymes biosynthétiques,
des mécanismes d'exportation et d'immunité, et même des régulateurs de production
de bactériocine à détection de quorum. Les producteurs de bactériocines se protègent
généralement par des protéines d'auto-immunité et/ou par des transporteurs d'efflux
(Heilbronner et al., 2021).
Bien que les bactériocines soient produites à la fois par bactéries Gram positif et Gram négatif
(Bali et al., 2016), la grande majorité des bactériocines rapportées sont produites par bactéries
Gram positif, et en particulier par les bactéries lactiques (LAB) (Klaenhammer TR, 1988). Ces
composés sont répandus parmi les espèces de bactéries, et certaines études suggèrent que
pratiquement toutes les bactéries sont capables de produire des bactériocines (Majeed
et al, 2013). En raison de cette grande diversité de bactéries productrices, une grande variété
41
de bactériocines a été identifiée, et certaines bactéries peuvent produire plusieurs types

de bactériocines (Cintas et al., 2001).
Les entérocines sont des bactériocines produites par les espèces d’entérocoques, telles que
E. faecalis, E. faecium, E. durans et E. munditi. À ce jour, de nombreuses souches productrices
d’entérocines (souches bactériocinogènes) ont été caractérisées à partir de plusieurs niches
écologiques (intestins des humains et des animaux, produits laitiers, saucisses, légumes
et poissons, etc..). Beaucoup de ces entérocines présentent une forte activité bactéricide contre
plusieurs bactéries pathogène et responsables de la détérioration des aliments, tels que Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium spp., Escherichia coli, Vibrio cholera
et Bacillus cereus (Jaouani et al., 2014, Poeta et al., 2007a, Todorov et al., 2017).
Classification des entérocines :
En raison de leur diversité et de leur complexité, il y a eu différents systèmes de classification

des bactériocines au fil des années, principalement pour celles produites par les bactéries
lactiques. Klaenhammer (1993), a été le premier à proposer un schéma de classification des
bactériocines LAB basé sur quatre classes, alors que d'autres n'ont opté que pour deux classes
(Cotter et al., 2005). Bien que la classification des bactériocines soit encore un sujet
controversé, il existe deux grandes classes bien définies pour les entérocines. La classe I
comprend les lantibiotiques et la classe II comprend les non-lantibiotiques non modifiés (Ness
et al., 2014 ; Perez et al., 2014). Chaque classe est divisée en diverses sous-classes, mais
l'incohérence entre les classifications est particulièrement remarquée pour celles-ci. La classe
III comprend soit des bactériolysines (Perez et al., 2014) soit des peptides cycliques (Franz et
al., 2007) selon différentes études. Les entérocines des classes I et II sont capables de provoquer
la mort cellulaire principalement par la formation de pores dans la membrane cellulaire
des bactéries cibles après liaison à des récepteurs spécifiques, tandis que les bactériolysines
de classe III provoquent la mort cellulaire en clivant les liaisons croisées peptidoglycanes
de la paroi cellulaire cible.
Les différentes classes et sous-classe d’entérocines produites par les entérocoques sont :
❖ Class I : Lantibiotiques
Les lantibiotiques sont de petits peptides (<5 kDa), 19 à 50 acides aminés, qui sont modifiés
post-traductionnellement en leurs formes biologiquement actives, résultant en des acides
aminés inhabituels, tels que des résidus de lanthionine (Franz et al., 2007). Ces modifications
peptidiques sont avantageuses en rendant les bactériocines plus stables à l'activité des protéases
42
ou aux températures et pH élevés (Pircalabioru et al., 2021). De plus, les bactériocines de cette
classe sont généralement très efficaces contre les pathogènes à Gram positif (Cotter et al.,
2013). La cytolysine et l'entérocine W, toutes deux produites par des souches d'E. faecalis, sont
les deux seules entérocines de type lantibiotique actuellement connues (Ness et al., 2014). La
cytolysine peut être codée par des gènes situés sur le chromosome ou dans un plasmide sensible
aux phéromones (pAD1) et implique deux peptides (CylL et CylS), tous deux nécessaires à
l'activité antimicrobienne (Chow et al., 1993). L'entérocine W est active contre différentes
espèces à Gram positif, telles que Bacillus coagulans, B. circulans, Listeria innocua et E.
faecalis (Sawa et al., 2012).
❖ Classe II-Non lantibiotiques
Les bactériocines de classe II comprennent la majorité des entérocines décrites (Ness et al.,
2014). Ils sont petits (<10 kDa), thermorésistants et ne subissent pas de modifications post-
traductionnelles importantes. Cependant, il existe quelques exceptions, telles que la présence
de ponts disulfure dans certaines molécules (essentiels pour l'activité antimicrobienne) et
lorsque le peptide leader subit un clivage lors du transport hors de la cellule (Ness et al., 2014 ;
Franz et al., 2007 ; Lohans et Vederas, 2012). Ils sont divisés en plusieurs sous-classes :
la classe IIa (les bactériocines de type pédiocine), la classe IIb (Bactériocines bi-peptidiques),
la classe IIc (les bactériocines circulaires) et la classe IId (les bactériocines non modifiées,
linéaires, bactériocines de type non pédiocine).
▪ Classe IIa- Les bactériocines de type pédiocine
Les bactériocines de type pédiocine sont particulièrement puissantes contre les espèces
de Listeria, et en particulier contre L. monocytogenes (Lohans et Vederas, 2012 ; Rodriguez et
al., 2002).
Les entérocines appartenant à cette classe ont été identifiés chez six espèces d'entérocoques :
E. faecium, E. faecalis, E. mundtii, E. avium, E. durans et E. hirae. Les entérocines A (EntA)
et P (EntP) et les bactériocines Ent43, Ent31 et EntRC714 sont parmi les entérocines les mieux
rapportées produites par des isolats cliniques. Le gène entP a été identifié soit sur le
chromosome soit sur les plasmides de différentes souches d'E. faecium (Cintas et al., 1997,
2001). Il possède un large spectre antimicrobien qui comprend des agents pathogènes d'origine
alimentaire, tels que L. monocytogenes, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus carnosus, Clostridium sporogenes, et E. faecalis.
De même, la bactériocine 43 (Bac43), la bacteriocine RC714 et la bacteriocine 31 (Bac31) ont
43
une activité inhibitrice contre E. faecalis, E. faecium et L. monocytogenes (Todokoro et al.,

2006 Almeida-Santos et al., 2021 ; Svetoch et al., 2008).
▪ Classe IIb : Bactériocines bi-peptidiques
La première bactériocine à deux peptides, la lactococcine G, a été isolée de Lactococcus lactis,

tandis que la première entérocine à deux peptides était l'entérocine 1071, qui provient
d'E. faecium (Ness et al., 2014). Une bactériocine à deux peptides a besoin des deux peptides,
qui sont génétiquement co- localisées, afin d'exercer une activité antimicrobienne. Dans
quelques cas, les peptides individuels présentent une certaine activité antimicrobienne, mais
cette activité est bien moindre par rapport à l'activité combinée des deux peptides
à concentration molaire égale (Ness et al., 2014). Les entérocines incluses dans ce groupe sont
l'entérocine C (EntC), l'entérocine 1071 et l'entérocine X des espèces E. faecalis et E. faecium.
L'Ent 1071, qui est composée du peptide entérocine 1071A, et l'entérocine 1071B ont été
caractérisées pour la première fois chez E. faecalis BFE1071 qui a été isolé à partir
d'échantillons fécaux d'un mini porc (Balla et al., 2000). Son spectre inhibiteur comprend
diverses bactéries Gram-positives, telles que E. faecium RC3, plusieurs souches d'E. faecalis
et L. innocua. L’Ent X est composé de deux peptides, EntXα et EntXβ, et est produit par
la souche E. faecium KU-B5 (Hu et al., 2010) (Maldonado-Barragán et al., 2009). L’entérocine
Ent C à un large éventail de cibles, y compris Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,
Bacillus et Listeria. Le peptide Ent C1 est identique au peptide Ent 1071A, tandis que le peptide
Ent C2 diverge du peptide Ent 1071 par un seul résidu d'acide aminé en position 17, où l'alanine
est remplacée par la thréonine.
▪ Classe IIc : Bactériocines circulaires
Ces bactériocines diffèrent de la plupart des bactériocines de classe II parce que le résidu
N-terminal résultant est lié de manière covalente au résidu C-terminal, formant une forme
circularisée. Les entérocines circulaires connues, qui ne sont pas couramment trouvées, sont
BacAS-48, Bac21 et Ent4 (Almeida-Santos et al., 2021). La bactériocine AS-48 (BacAS-48)
est l'une des entérocines les plus étudiées. Elle a été isolée à partir d'E. faecalis S-48 clinique
(Martinez-Bueno et al., 1990). L'AS-48 est une bactériocine à large spectre, capable d'inhiber
à la fois les bactéries Gram-négatives (Pseudomonas spp.) et Gram-positives (Bacillus et
Enterococcus). Bac21 a été identifié dans un isolat clinique d'E. faecalis et est actif contre
S. agalactiae, S. sanguis, S. aureus, E. faecalis, E. faecium et E. hirae (Tomita et al., 1997).
Ces deux bactériocines ont été identifiées uniquement chez des isolats d’E. faecalis car les
44
gènes codant ces bactériocines sont localisés sur des plasmides répondant aux phéromones
produites généralement que par E. faecalis.
▪ Classe IId : Bactériocines sans tête (leader)
La plupart des bactériocines de classe II contiennent un peptide leader N-terminal, qui dirige
la sécrétion de la bactériocine et est clivé pendant le processus de sécrétion. Les bactériocines
de ce groupe sont isolées d'entérocoques de denrées alimentaires (Enterocins L50 (EntL50), Q,
RJ-11, and 7A/7B), mais peuvent également être trouvées dans des isolats provenant d'humains
(Enterocins 62-6, DD14, FH 99), d'animaux (MR10A/B) et d'eaux usées (EJ97). Il n'y a eu
aucune description d'entérocines sans leader parmi les souches cliniques d'entérocoques
(Almeida-Santos et al., 2021 ; Ness et al., 2014).
▪ Autres bactériocines de classe II
Certaines bactériocines ne relèvent pas du schéma de classification ci-avant décrit, car elles ne
partagent pas les caractéristiques de classification de base des bactériocines d'aucune
des classes/sous-classes mentionnées ci-dessus (Ennahar et al., 2001). Ces bactériocines ont été
identifiées dans différentes espèces d'entérocoques récupérées à partir d'échantillons humains
et alimentaires. Parmi eux, la bactériocine 32 (Bac32), 51 (Bac51), EF478 et l'entérocine B
(EntB) ont été détectées dans des isolats cliniques d'E. faecium et E. faecalis (Ness et al., 2014).
Parmi ces entérocines, Ent B est le plus répandu chez les entérocoques et il est souvent identifié
dans des souches coproducteurs d'EntA. Il est actif contre un large spectre de bactéries Gram-
positives, en particulier contre S. aureus et L. monocytogenes, Clostridium tyrobutyricum,
C. sporogenes (Casaus et al., 1997 ; Jaouani et al., 2014). D’autres entérocines ont été identifiés
comme : entérocines 96, EntF4-9, durancine 61 A, EntIT et EntESL5.
❖ Classe III : Bactériolysines
Les bactériolysines sont des enzymes lytiques de grand poids moléculaire (> 10 kDa) qui
dégradent les parois cellulaires des bactéries cibles (Ness et al., 2014). À ce jour, il existe deux
bactériolysines entérococciques connues, l'entérolysine A (Hickey et al., 2003) et la
bactériocine 41 (Bac41) (Zheng et al., 2009), toutes deux décrites chez E. faecalis.
L'entérolysine A à un large spectre d'activité antimicrobienne contre les bactéries Gram-
positives, à savoir les souches E. faecalis, L. innocua, L. lactis, Lactobacillus spp, Lactococcus
spp, et Pediococcu spp.
45
5. Application des entérocoques comme probiotiques

5.1. Utilisation des entérocoques comme probiotiques chez l’Homme
5.1.1. Traitement de la diarrhée :
L’emploi des entérocoques comme probiotiques est potentiellement possible puisqu’ils

appartiennent aux bactéries lactiques et font partie intégrante de la flore commensale
de l’homme et des animaux. En Suisse, l’efficacité clinique d’E. faecium SF68 a été démontrée
dans la prévention de diarrhées associées aux antibiotiques chez l’adulte et dans le traitement
de diarrhées chez l’enfant (Bellomo et al., 1980). Cette souche a également été testée pour
traiter des diarrhées aiguës, et lors d’essais cliniques en Belgique, un raccourcissement de ces
diarrhées de 1 à 3 jours a été observé (Buydens et Debeuckelaere, 1996). Son efficacité dans
le traitement des maladies intestinales repose probablement sur le fait que la souche elle-même
est un commensal du tractus gastro-intestinal et qu'elle a une phase de latence et un temps
de génération très courts (environ 20 min dans des conditions optimales). Cette souche s'est
également avérée capable d'inhiber la croissance d'E. coli, de sérotypes de Salmonella,
de Shigella spp. et Enterobacter spp. in vitro, et il s'est avéré résistant aux faibles valeurs
de pH, ainsi qu'à la bile (Canganella et al., 1996). Une préparation probiotique différente,
le mélange probiotique « Biothree » contenant des souches de Bacillus mesentericus, E. faecalis
et Clostridium butyricum, s'est également avérée efficace pour réduire la gravité de la diarrhée
et la durée du séjour à l'hôpital chez les enfants atteints de diarrhée aiguë (Chen et al., 2010).
5.1.2. Traitement du syndrome du côlon irritable (SCI)
Une préparation probiotique contenant une souche d'E. faecium a été utilisée dans une étude
clinique sur 85 patients atteints d'une maladie du côlon irritable et le probiotique a réussi
à réduire les symptômes associés à la maladie. Cela a été considéré comme pouvant être dû
à un changement dans les micropopulations gastro-intestinales à la suite de l'administration
du probiotique (Fan et al., 2006). ProSymbioflor®, est un autolysat de cellules et fragments
cellulaires de E. faecalis DSM 16440 et E. coli DSM17252 qui a été utilisé dans un essai
clinique avec 297 patients pendant une durée de 8 semaines. Le traitement du SCI avec le lysat
probiotique s'est avérée efficace pour réduire les symptômes typiques des patients atteints
du SCI (Enck et al., 2008).
46
5.1.3. Administration pour abaisser le cholestérol sérique
L'effet hypocholestérolémiant des probiotiques repose principalement sur leur activité

hydrolase des sels biliaires (BSH). L'enzyme BSH conjuguée (E.C. 3.5.1.24) déconjugue
les sels biliaires et libère la glycine et/ou la taurine d'une chaîne latérale du noyau stéroïde.
Lorsque le sel biliaire est hydrolysé en acide biliaire déconjugué et en acide aminé en raison de
l'activité bactérienne de la BSH, puis sécrété par le tractus gastro-intestinal, la demande en
cholestérol est augmentée, ce qui peut à son tour abaisser les taux de cholestérol (De Rodas et
al., 1996). Franz et al., (2001) ont montré que l'activité hydrolase des sels biliaires est assez
courante chez les souches de E. faecium et de E. faecalis. Une souche probiotique d'E. faecium
a été utilisée avec deux souches de Streptococcus thermophilus dans une préparation
probiotique nommée Causido® qui a été utilisée pour fermenter le produit à base de yaourt
appelé Gaio (Agerholm-Larsen et al., 2000). Il s'agit d'un exemple où un probiotique E. faecium
a été en fait inclus dans un produit alimentaire et le yaourt a servi de véhicule de livraison pour
le probiotique E. faecium. Dans une étude contrôlée par placebo, en double aveugle,
l'application à long terme d'un probiotique E. faecium M-74 a montré un effet
hypocholestérolémiant clair, en particulier du LDL-cholestérol, après 50 semaines
d’administration (Hlivak et al., 2005). Les probiotiques entérocoques peuvent donc être
considérés comme des hypocholestérolémiants potentiels, cet effet étant probablement basé sur
leur activité hydrolase des sels biliaires.
5.2. Utilisation des entérocoques comme probiotiques chez les animaux d’élevage
5.2.1. Administration chez les volailles
L’administration des probiotiques chez les volailles vise généralement à augmenter

les performances de croissance et la santé en influençant positivement les populations
microbiennes intestinales, en améliorant les paramètres immunitaires ou d’autres facteurs liés
à la santé. De nombreuses études montrent une influence positive des probiotiques
entérocoques, ou des préparations probiotiques contenant entre autres également des souches
d’entérocoques, sur la santé des volailles. Vahjen et al., (2002) ont montré que l’administration
d’E. faecium SF68 aux dindonneaux entrainait une augmentation de la concentration d’acide
lactique dans le tractus intestinal des dindes, ce qui stimulait la croissance d’autres bactéries
lactiques, en particulier les lactobacilles, dans l’intestin grêle. Cela a démontré que
les entérocoques étaient viables et métaboliquement actifs dans le tractus gastro-intestinal
de la dinde, et que leur effet stimulateur sur les lactobacilles intestinaux pourrait éventuellement
47
permettre de contrecarrer l’infection gastro-intestinale par des bactéries pathogènes. Une étude
sur l’effet d’E. faecium NCIMB 10415 sur les performances de croissance des dindonneaux a
montré que le traitement avec des probiotiques améliorait considérablement les performances
des dindonneaux en ce qui concerne le gain de poids et le taux de conversion alimentaire.
L’alimentation probiotique a également entraîné une augmentation de la colonisation des LAB
dans le contenu iléal et une excrétion significativement accrue des LAB (Samli et al., 2007).
Une autre étude sur les poulets de chair a utilisé une préparation probiotique qui contenait deux
souches de Lactobacillus et une des deux souches Bifidobacterium, Pediococcus et
Enterococcus (Montzouris et al., 2007). Dans l’ensemble, l’application du probiotique dans
les aliments et l’eau pour animaux a eu un effet favorisant la croissance, égal à celui
de l’alimentation à 2,5mg/kg d’avilamycine (antibiotique), et a également entraîné une
modification de la composition du microbiote caecal avec des augmentations significatives
du nombre de bifidobactéries, lactobacilles et les cocci à Gram positif, tous considérés comme
représentant un effet probiotique significatif (Montzouris et al., 2007). Une souche d’E. faecium
M74 a été utilisée par Capcarova et al., (2010a). La teneur en bilirubine était en outre
significativement augmentée chez le poulet de chair contenant le probiotique. Capcarova et al.,
(2010b) ont utilisé la souche probiotique E. faecium M74 pour étudier les paramètres sanguins
et de production des poules pondeuses, et ont montré que l’application de la souche a entraîné
une réduction du cholestérol, des lipides, du calcium, du nombre de leucocytes et des valeurs
d’hématocrite dans le plasma sanguin au cours d’au moins deux périodes d’échantillonnage ;
tandis que le nombre d’érythrocytes a augmenté. Cependant, aucun effet significatif n’a été noté
pour la concentration sérique de triglycérides et les paramètres de production d’œufs.
Un effet favorisant la croissance a également été démontré lors de l’application d’un mélange
de probiotiques à des poulets de chair dans une étude de Capcorova et al., (2011). Le mélange
probiotique contenait L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. helveticus, L.
delbrueckii subsp. lactis, S. thermophilus et E. faecium, et la supplémentation de l’eau
d’alimentation avec les probiotiques pendant 40 semaines a amélioré le poids corporel lorsqu’ils
sont administrés en concentrations élevées et chez les animaux les plus âgés plutôt que chez les
plus jeunes. De plus le probiotique a eu un effet bénéfique sur le métabolisme minéral, la teneur
en triglycérides sériques et le statut antioxydant des poulets de chair de type hybride Hybro
(Capcorova et al., 2011). L’augmentation du calcium sérique est particulièrement importante
pour l’animal car elle entraîne une densité et une résistance osseuse plus élevées et aide l’animal
à faire face à l’augmentation rapide du poids.
48
5.2.2. Administration chez les bovins
Les probiotiques sont utilisés chez les bovins dans le but d'améliorer la digestion et
les performances de croissance, ainsi que de prévenir l'acidose et les épidémies d'agents
pathogènes d'origine alimentaire. E. faecium EF212, a rapporté être capable de réduire le risque
d'acidose lorsqu'elle est administrée aux vaches laitières (Emmanuel et al., 2007). Ghorbani et
al., (2002) ont montré que bien que l'alimentation du probiotique E. faecium EF212 aux bovins
en parc d'engraissement n'ait pas affecté le pH sanguin ou la glycémie, les bouvillons nourris
avec des probiotiques présentaient une concentration de CO2 dans le sang numériquement plus
faible, ce qui est cohérent avec un risque réduit d'acidose.
E. faecium produit des quantités modérées d'acide lactique dans le rumen, cela pourrait stimuler
la croissance des utilisateurs d'acide lactique et stabiliser le pH des ruminants. Nocek et
al., (2003) ont nourri des vaches en transition (3 semaines avant le vêlage à 3 semaines après
le vêlage) par une combinaison de deux souches d'E. faecium et de S. cerevisiae. Dans leur
étude, la préparation probiotique a considérablement réduit la baisse du pH ruminal en début
de lactation et a augmenté le nombre de jours de lactation et le pourcentage de protéines du lait
au début de la lactation. Les concentrations sanguines de glucose et d'insuline étaient
significativement augmentées. Dans une autre étude par Nocek et Kautz (2006), la préparation
probiotique a considérablement amélioré la digestibilité ruminale du fourrage, augmenté
la production de lait et la glycémie et diminué le β-hydroxybutyrate sanguin.
D'autres souches probiotiques ont été utilisées pour réduire l'excrétion fécale
d'entéropathogènes importants comme E. coli O157:H7, Shigella, Salmonella, et Clostridium
(Emmanuel et al., 2007 ; Ohya et al., 2000). Une nouvelle réduction de ces agents pathogènes
serait bénéfique du point de vue de la sécurité alimentaire. E. coli O157:H7, un commensal du
tractus gastro-intestinal les bovins, est un pathogène zoonotique important principalement
associé au bœuf et au lait cru de vache. Les tentatives pour contrôler l'apparition de cet agent
pathogène à la source à l'aide de probiotiques seraient extrêmement bénéfiques, d'autant plus
que les infections par cet agent pathogène entraînent non seulement une maladie, mais peuvent
également être fatales, en particulier chez les jeunes enfants. L'alimentation de la souche vivante
d'E. faecium EF212 à des bouvillons en parc d'engraissement sous un régime riche en céréales
pendant 11 jours n'avait aucun effet sur les protéines de la phase aiguë associées à une réponse
inflammatoire (Emmanuel et al., 2007). Cependant, l'effet combiné de l'alimentation par
S. cerevisiae et d'E. faecium a conduit à une réponse inflammatoire chez les bovins en parc
49
d'engraissement nourris avec des proportions élevées de céréales, mais on ne savait pas sur quoi
cet effet était basé, c'est-à-dire s'il était basé sur les activités des levures ou des entérocoques.
Il a été émis l'hypothèse que la levure soutenait la croissance des bactéries Gram-positives,
ce qui à son tour aurait pu conduire à la destruction des bactéries Gram-négatives par ex. activité
bactériocine, qui a alors peut-être entraîné une libération d'endotoxine qui a augmenté les
concentrations des protéines de réponse inflammatoire en phase aiguë (Emmanuel et al., 2007).
5.2.3. Administration chez les lapins
Au cours de ces dernières décennies, plusieurs études de recherche ont été publiées sur les effets
des probiotiques sur l’élevage cunicole. La majorité des résultats et des preuves suggèrent que
ces probiotiques peuvent jouer plusieurs rôles dans l’élevage via le contrôle biologique contre
les micro-organismes pathogènes, l’augmentation de la croissance ou bien par le biais
de composés actifs qui augmentent la quantité et la qualité du produit final.
Certaines études de recherche ont également été menées sur des souches probiotiques isolées
du lapin lui-même. Cunha et al., (2017) ont testé, chez des lapins New-Zealandais âgés de 38
jours, l'administration d'entérocoques et de trois souches d'E. coli isolées de fèces de lapin. Fait
intéressant, les administrations d'E. coli ont été interrompues car les animaux ont montré, entre
le deuxième et le cinquième jour de l'essai, des selles diarrhéiques et des signes gastro-
intestinaux avec une diminution de la prise alimentaire et une augmentation de la consommation
d'eau. D'autre part, Enterococcus spp. ont montré une interaction positive avec les hôtes même
si les auteurs ont souligné que les souches bactériennes probiotiques ne restaient pas dans
le tractus gastro-intestinal plus d'une semaine après la fin de l'administration.
L'utilisation d'Enterococcus spp. a également été prise en compte par Pogány Simonová et
al., (2020) en utilisant une souche productrice de bactériocine (Enterococcus faecium EF9a)
aux propriétés probiotiques isolée des fèces de la race hongroise le lapin blanc Pannon.
La souche probiotique Enterococcus faecium EF9a a été ajoutée à l'eau de boisson et a induit
une diminution significative des coliformes, des staphylocoques à coagulase positive,
des pseudomonas et des staphylocoques à coagulase négative dans les fèces de lapin, ainsi que
des effets antimicrobiens dans le caecum contre les coliformes, les staphylocoques à coagulase
négative, les pseudomonas. De plus, Lauková et al., (2016) ont testé une souche d'Enterococcus
faecium. La souche utilisée, isolée de l’environnement, était également productrice d'entérocine
M (souche AL41, enregistrée dans la Czech Culture Collection, Brno, République tchèque—
CCM8558), qui a été testée seule et en association avec Eleutherococcus senticosus (ginseng
50
sibérien), une plante à propriétés adaptogènes, anti-stress et immunomodulatrices. Les auteurs

ont rapporté qu'E. faecium AL41 colonisait mieux le tractus gastro-intestinal des lapins lorsqu'il
était utilisé seul qu'en association avec l'herbe, et il restait présent chez les animaux après
3 semaines après l’arrêt de son administration. Des réductions significatives des staphylocoques
à coagulase négative, des staphylocoques à coagulase positive, des Clostridia, des coliformes
et/ou des pseudomonas ont également été mises en évidence en relation avec l'administration
d'E. faecium AL41. Les modifications du microbiote étaient associées à la fois à l'effet
antibactérien de l'entérocine M produite ainsi qu'à la production d'acide lactique à partir
de la souche probiotique.
IV. Escherichia coli : pathogénicité et indicateur de résistance aux antibiotiques

1. Caractéristiques bactériologiques
Escherichia coli appartient au règne des Procaryotae, phylum des Proteobacteria, classe des
Gammaproteobacteria, ordre des Enterobacteriales, famille des Enterobacteriaceae, et au
genre Escherichia (Baraduc et al., 2000). C’est un colibacille à extrémités hémisphériques à
Gram négative, d’environ 2,5 µm de longueur et 0,8 de diamètre, non sporulée, généralement
mobile grâce à une ciliature péritriche (Baraduc et al., 2000). E. coli est aérobie-anaérobie
facultatif, non exigeante qui se multiplie et se développe facilement dans les milieux ordinaires.
Ayant une multiplication rapide, après 18 à 24 H d’incubation à 37°C. Les colonies se
présentent sous un aspect caractéristique mais non spécifique : rondes, plates et bords réguliers
d’environ 2 mm de diamètre (Baraduc et al., 2000). Comme tous les entérobactéries, E. coli
est oxydase négative. Les principaux caractères biochimiques utilisés pour la différenciation
d’E. coli des autres espèces d’entérobactéries les plus communes en pathologies humaines sont
résumés dans le Tableau 7.
2. Habitat
E. coli est un habitant des intestins et des matières fécales des humains, des animaux et
des reptiles à sang chaud. E. coli se trouve dans le microbiote intestinal, qui se compose de plus
de 500 espèces de bactéries totalisant 1010 à 1011 cellules par gramme de contenu du gros
intestin. Bien que les bactéries anaérobies dans l'intestin soient plus nombreuses que E. coli
de 100/1 à 10 000/1 (Berg, 1996), E. coli est l'organisme aérobie prédominant dans le tractus
gastro-intestinal. Comme E. coli peut transiter dans l'eau et les sédiments, il est souvent utilisé
comme indicateur de la pollution fécale de l'eau ; on a estimé que la moitié de la population
d'E. coli réside dans ces habitats secondaires. Les différents hôtes d’E. coli ont des tailles
51
corporelles, des morphologies intestinales, des régimes alimentaires, des temps de rétention
du digesta et un microbiote distinct. Ces caractéristiques peuvent avoir une influence
substantielle sur la prévalence et la densité d'E. coli, qui varient respectivement de 0% à 100%
et sur 6 ordres de grandeur parmi les espèces hôtes. La concentration par gramme de fèces varie
chez l'homme de 107 à 109 unités formant colonies (UFC) et est beaucoup plus faible chez
les animaux domestiques, en moyenne entre 104 et 106 UFC (Tenaillon et al., 2010).
Tableau 7 : Principaux caractères biochimique d’E. coli et des espèces d’entérobactéries

responsables de pathologies humaines (Joly et Reynaud., 2003).
Enterobacter agglomerans
Citrobacter amalonaticus
Enterobacter Aerogenes
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter cloacea
Citrobacter diversus
Shigella dysenteriae
Citrobacter freundii
Klebsiella oxytoca
Salmonella Typhi
Proteus mirabilis
Escherichia coli
Shigella flexneri
Shigella sonnei
Caractères
Shigella boydii
Salmonella I
Hafnia alvei
Production d’indole + + + - - [-] - - + - - - - [-] D D -
Rouge de Méthyle + + + + - D - D d D + + + + + + +
Voge-Proskauer (VP) - - - - + D + D + + [-] - - - - - -
Citrate de Simmons - [+] + + + D + - + + d + - - - - -
Hydrogène sulfuré - - - [+] - - - - - - + + + - - - -
Uréase - [+] [+] D - [-] D - + + + - - - - - -
Phénylalanine
- - - - - [-] - - - - + - - - - - -
désaminase
Lysine décarboxylase [+] - - - + - - + + + - + + - - - -
Arginine dihydrolase [-] [+] d d - - + - - - - D - [-] - - -
Ornithine
D + + [-] + - + + - - + + - - - - +
décarboxylase
Liquéfaction de la
- - - - - - - - - - + - - - - - -
gélatine
Utilistion du malonate - [-] + [-] + D [+] D + + - - - - - - -
Glucose (acidification) + + + + + + + + + + + + + + + + +
Glucose (Production de
+ + + + + [-] + + + + + + - - - - -
gaz)
Lactose + D d d + D + - + + - - - - - - -
Saccharose D [-] [-] d + [+] + - + + [-] - - - - - -
D- Mannitol + + + + + + + + + + - + + + - + +
D-Adonitol - - + - + - [-] - + + - - - - - - -
D-Sorbitol + + + + + D + - + + - + + D D D -
L- Arabinose + + + + + + + + + + - + - + D D +
Raffinose D - - d + D + - + + - - - - - + -
L-Rhamnose [+] + + + + [+] + + + + - + - - D - [+]
Maltose + + + + + [+] + + + + - + + [-] [-] D +
D-Xylose + + + + + + + + + + + + [+] [-] - - -
Thréalose + + + + + + + + + + + + + [+] [+] D +
Cellobiose - + + d + D + [-] + + - - - - - - -
Esculine (Hydrolyse) D - - - + D D - + + - - - - - - -
Melibiose [+] [-] - d + D + - + + - + + [-] - D [-]
L et D –Arabitol - - + - + D [-] - + + - - - - - - -
Lipase - - - - - - - - - - + - - - - - -
ONPG(β-galactosidase) + + + + + + + + + + - - - - d - [+]
D-Mannose + + + + + + + + + + - + + + + + +
Légende : +, 90 à 100% des souches positives ; [+], 76 à 89% des souches positives ; d, 26
à 75% des souches positives ; -, 0 à 10% des souches positives ; [-], 76 à 89% négatives.
52
3. Pouvoir pathogène d’Escherichia coli
E. coli est un membre commensal du microbiote intestinal des vertébrés ainsi qu'un agent
pathogène opportuniste des mammifères et des oiseaux (Kaper et al., 2004 ; Croxen et Finlay,
2010). Des souches d'E. coli peuvent provoquer à la fois des pathologies extra-intestinales
(infections des voies urinaires, diverses infections intra-abdominales, pulmonaires, de la peau
et des tissus mous, méningite néonatale et bactériémie) et des pathologies intestinales (diverses
formes de diarrhée, dont le syndrome hémolytique et urémique (SHU)). Ces infections peuvent
être très fréquentes (IU), associées à une forte morbidité (insuffisance rénale dans le SHU chez
l'enfant, séquelles neurologiques dans la méningite néonatale) et une mortalité élevée (~15%
dans la bactériémie).
Les pathologies intestinales consistent le plus souvent en des diarrhées plus ou moins sévères
causées par différents pathotypes ou pathovars d'E. coli, appelés IPEC (Intestinal pathogenic
E. coli) : E. coli enterotoxinogènes (enterotoxinogenic E. coli, ETEC), E. coli
entéropathogéniques (Enteropathogenic E. coli, EPEC), E. coli entéroaggrégatifs
(Enteroaggregative E. coli, EAEC), E. coli à adhésion diffuse (Diffuse-Adhering E. coli,
DAEC), E. coli entérohémorragiques (Enterohaemorragic E. coli, EHEC), et E. coli
verotoxinogène (Vero cytotoxin-producing E. coli, VTEC) ou E. coli producteurs
de shigatoxines (Shiga toxin-producing E. coli, STEC) (Kaper et al., 2004). Parmi ces
pathotypes, les souches EHEC de sérotype O157:H7 sont un pathogène zoonotique bien connu.
Il est bien établi que les animaux d'élevage, notamment les bovins, constituent un réservoir
d'EHEC (O157:H7) (Chekabab et al., 2013 ; Kaper et al., 2004).
Les E. coli pathogènes extra-intestinaux (ExPEC) constituent un autre groupe important

d'E. coli pathogènes provoquant une diversité d'infections chez les humains et les animaux,
notamment les infections des voies urinaires, la méningite et la septicémie. Les E. coli
uropathogènes (Uropathogenic E. coli, UPEC) sont capables de coloniser les voies urinaires et
de provoquer des cystites et des pyélonéphrites, pouvant entraîner une urosepsie (Kaper et al.,
2004). On estime que 130 à 175 millions d'infections urinaires humaines surviennent chaque
année dans le monde, dont environ 80% sont causées par des souches UPEC (Russo et Johnson,
2003). Les ExPEC sont également le principal agent pathogène bactérien à Gram négatif associé
à la méningite néonatale et la deuxième cause globale après les streptocoques du groupe B
(Bonacorsi et Bingen, 2005). Les E. coli associés à la méningite (MNEC) peuvent provoquer
de graves lésions neurologiques et entraîner la mort de 20 à 40% des nouveau-nés infectés
53
(Bonacorsi et Bingen, 2005). Les ExPEC constituent également l'une des principales causes
d'infections sanguines nosocomiales. Contrairement aux infections intestinales à E. coli, pour
lesquelles des épidémies sont souvent rapportées, les infections ExPEC sont communément
considérées comme des infections opportunistes individuelles ou isolées, même si des
infections potentiellement apparentées ont été rapportées pendant de courtes périodes dans des
zones géographiques restreintes. Contrairement aux E. coli pathogènes intestinaux, les ExPEC
affectent principalement un sous-ensemble spécifique de la population (nouveau-nés, personnes
âgées et patients immunodéprimés) ou provoquent des infections urinaires chez des femmes en
bonne santé suite à une contamination fécale du tractus urogénital (Yamamoto, 2007).
E. coli pathogène aviaire (Avian Pathogenic E. coli, APEC) est un pathogène extra-intestinal
qui provoque diverses infections locales et systémiques chez la volaille, y compris les poulets,
les dindes, les canards et de nombreuses autres espèces aviaires (Dho-Moulin et Fairbrother
,1999). Les infections les plus courantes causées par l'APEC chez les poulets sont
la périhépatite, l'aérosacculite, la péricardite, la péritonite à l'œuf, la salphingite,
le coligranulome, l'omphalite, la cellulite et l'ostéomyélite/arthrite ; ceux-ci sont communément
appelés colibacilloses aviaires. L'APEC provoque également le syndrome de la tête enflée chez
les poulets et le complexe d'ostéomyélite chez les dindes (Dziva et Stevens, 2008).
La colibacillose est l'une des principales causes de mortalité (jusqu'à 20%) et de morbidité chez
les volailles et entraîne également une diminution de la viande (diminution de 2% du poids vif,
détérioration de 2,7% de l'indice de conversion alimentaire) et de la production d'œufs (jusqu'à
20 %), une diminution des taux d'éclosion et une augmentation de la condamnation
des carcasses (jusqu'à 43 %) à l'abattage (Mellata, 2013). De plus, l'APEC est responsable d'une
mortalité élevée (jusqu'à 53,5%) chez les jeunes poulets (Mellata, 2013). De multiples sérotypes
APEC ont été associés à des cas de colibacillose lors d'épidémies sur le terrain; cependant, trois
sérotypes (O78, O2 et O1) représentent la majorité (plus de 80%) des cas (Ghunaim et al.,
2014). Des études récentes suggèrent que l'APEC (en particulier les isolats appartenant aux
lignées génétiques ST95 et ST131 ou aux sérogroupes O1, O2 et O18) est un pathogène
zoonotique potentiel d'origine alimentaire ainsi qu'une source ou un réservoir d'infections extra-
intestinales chez l'homme (Bélanger et al., 2011 ; Liu et al., 2018). En particulier, l'APEC
partage une similitude génétique avec les ExPEC humains, les E. coli uropathogènes (UPEC)
et la méningite néonatale E. coli (NMEC) et possède des gènes de virulence définissant l'UPEC
et le NMEC avec la capacité de provoquer des infections des voies urinaires (UTI) et une
méningite dans des modèles de souris et de rats (Tivendale et al., 2010). De plus, la détection
54
de plasmides ColV (colicine V) spécifiques à l'APEC dans les isolats ExPEC humains suggère
une possible transmission zoonotique de l'APEC de la volaille à l'Homme (Liu et al., 2018).
Par conséquent, l'APEC est un agent pathogène d'importance pour l'industrie avicole et la santé
publique.
4. Tendances de la résistance aux antimicrobiens chez E. coli
A l’échelle mondiale, la résistance aux antibiotiques (antimicrobiens) est un problème majeur

de santé publique. Des taux élevés de résistance aux antibiotiques ont été rapportés chez E. coli
de diverses origines (Paitan, 2018 ; Hassen et al., 2019, 2020a,b ). En médecine humaine,
le traitement des infections à E. coli repose principalement sur l'antibiothérapie à l'aide
d'antibiotiques appartenant aux bêta-lactamines, aux aminoglycosides, et aux fluoroquinolones.
Cependant, les isolats d'E. coli collectés à partir d'échantillons humains cliniques ont montré
des taux de résistance aux antibiotiques accrus envers les familles susmentionnées ainsi qu'à
d'autres telles que la fosfomycine, le triméthoprime/sulfaméthoxazole, les tétracyclines et
la colistine (Poirel et al., 2018 ; Paitan Y, 2018) réduisant ainsi les options de traitement (Pitout
JD, 2012).
Chez E. coli, ainsi que chez d'autres membres des Enterobacterales, la résistance acquise aux
bêta-lactamines est principalement codée par des enzymes appelées bêta-lactamases
appartenant aux bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE), aux céphalosporinases plasmidiques
(pAmpC), aux oxacillinases (OXA) et aux carbapénémases (CARBA) (Bush, 2018).
4.1. Les β-lactamases à spectre étendu (BLSE)
Les BLSE sont capables de conférer une résistance aux pénicillines, aux céphalosporines
de 1ère, 2ème, 3ème et 4ème génération, à l’aztréonam, mais non aux céphamycines et carbapénèmes
(Bush, 2018, Castanheira et al., 2021). Les BLSE sont généralement inhibées par les inhibiteurs
de bêta-lactamase comme l’acide clavulanique et le tazobactam (Bush, 2018). Actuellement,
la majorité des BLSE détectées chez les Enterobacteriaceae appartiennent à 4 familles
nommées : TEM (Temoneira), SHV (Sulfhydryl variable), CTX (Céfotaximase) et OXA
(Oxacillinase) (Bush, 2018, Castanheira et al., 2021).
Les BLSEs de type TEM sont des variantes de la β-lactamase à médiation plasmidique
originale, TEM-1, qui a été décrite au début des années 1960. Cette enzyme a été ainsi nommée
parce qu'elle a été trouvée à l'origine dans un isolat d'E. coli provenant d'une hémoculture d’un
55
patient grec nommé Temoneira. Le premier dérivé de TEM, TEM-2, a une seule substitution
d'acide aminé de Gln39Lys à partir de la β-lactamase TEM-1 originale. Ce changement n'a pas
modifié le profil de substrat de TEM-1, cependant TEM-2 a servi de progéniteur à
de nombreuses BLSE de type TEM. En 1989, le premier variant de type TEM qui a montré un
phénotype BLSE était TEM-3 (Bush, 2018, Castanheira et al., 2021). Actuellement, environ
243 variantes TEM ont été décrites, bien que toutes ne soient pas des BLSE
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/refgene/#TEM).
Les β-lactamases de type SHV sont à l'origine des enzymes chromosomiques chez
K. pneumoniae. La première BLSE décrite en 1985 était SHV-2 et a été trouvée chez une seule
souche de Klebsiella ozaenae isolée en Allemagne qui différait du SHV-1 par une seule
substitution d'acide aminé de Gly à Ser en position 238. La majorité des BLSE de type SHV
sont des mutations aux positions Ambler 238 (Gly à Ser) et 240 (Lys à Glu). La substitution de
la sérine en position 238 semble être critique pour l'hydrolyse efficace de la ceftazidime, tandis
que la substitution de Lys au résidu 240 est critique pour l'hydrolyse efficace du céfotaxime.
À ce jour, 228 variants de séquence du SHV ont été détectés, bien que tous n'aient pas été
caractérisés fonctionnellement pour déterminer s'ils possèdent le phénotype BLSE
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/isolates#/refgene/SHV). Dans le monde, SHV-5
et SHV-12 ont été les variantes BLSE les plus courantes trouvées chez les entérobactéries.
Les β-lactamases de type CTX-M ont été initialement signalées à la fin des années 1980,
apparaissant simultanément à plusieurs endroits. La nomenclature CTX-M (céfotaximase
de Munich) a été initialement utilisée dans un rapport allemand (Bauernfeind et al., 1990).
Cependant, les enzymes de type CTX-M identifiées dans d'autres régions ont reçu des noms
différents, y compris FEC-1 (Japon), Toho-1 (Japon) et MEN-1 (France) (Bonnet, 2004).
Ces premiers rapports ont été suivis de flambées dans plusieurs pays. L'expansion mondiale
des isolats porteurs de ces BLSE sera appelée plus tard la « pandémie de CTX-M » (Cantón
et Coque, 2006). Depuis le début des années 2000, les enzymes de type CTX-M sont reconnues
comme le groupe BLSE le plus courant, remplaçant TEM et SHV comme type BLSE dominant.
Des isolats porteurs de gènes codant pour le CTX-M ont été détectés dans des contextes
nosocomiaux et communautaires ainsi que chez des animaux de compagnie, l'environnement,
des produits alimentaires et du bétail (Liu et al., 2018). La plupart des enzymes CTX-M peuvent
être regroupées en cinq groupes basés sur des homologies de séquence : CTX-M-1, CTX-M-2,
CTX-M-8, CTX-M-9 et CTX-M-25 (Bonnet, 2004). Dans le groupe CTX-M-1, l’enzyme CTX-
M-15 est de loin le plus courant, suivi par CTX-M-3 et CTX-M-1. Dans le groupe CTX-M-9,
56
les CTX-M-9 et CTX-M-14 étaient les enzymes les plus courantes, mais plus récemment,
le CTX-M-27 a souvent été rapporté (Ghosh et al., 2017). CTX-M-2, CTX-M-8 et CTX-M-25
sont les variants les plus fréquents au sein de leurs propres groupes. Les premières variantes
de CTX-M hydrolysaient efficacement le céfotaxime et la ceftriaxone, d'où le nom
de céfotaximase (Bonnet, 2004). Contrairement aux BLSE de type TEM et SHV, les premières
enzymes CTX-M avaient une activité limitée contre la ceftazidime, cependant les variantes de
CTX-M avec une activité hydrolytique accrue de la ceftazidime ont été décrites plus tard. Des
exemples importants d'enzymes CTX-M présentant une hydrolyse de la ceftazidime sont CTX-
M-15 et CTX-M-27, qui appartiennent respectivement aux groupes CTX-M-1 et CTX-M-9.
Les β-lactamases de type OXA hydrolysent l'oxacilline. En général, les enzymes de type OXA
constituent un large groupe qui présente une variabilité dans les profils de substrat et
les séquences d'acides aminés. Cependant, plusieurs variants de type OXA hydrolysent les
céphalosporines, les céphèmes et/ou les monobactames (phénotype BLSE). Selon une revue
de Yoon et Jeong, (2020), il existe 27 enzymes oxacillinases décrites comme un spectre étendu.
Les substrats de ces enzymes comprennent les céphalosporines de troisième et/ou de quatrième
génération en plus des pénicillines et les premières céphalosporines. La plupart
des oxacillinases dérivent de OXA-10 (également appelée PSE-2) et OXA-2. Les dérivés
d'OXA-10 comprennent OXA-11, OXA-13, OXA-14, OXA-16, OXA-17, OXA-19 et OXA-
28. De plus, Parmi les dérivés OXA-2, les OXA-15, OXA-32, OXA-34, OXA-36 (séquence
partielle), OXA-53, OXA-141, OXA-161, OXA-210 et OXA-226 ont été décrits.
4.2. Les carbapénémases :
Les carbapénémases hydrolysent les carbapénèmes et toutes les autres β-lactamines en

hydrolysant la structure en anneau β-lactame des antibiotiques β-lactamines, perturbant ainsi
leur fonction. Il existe trois classes de carbapénémases : classe A, B et D. Les carbapénémases
de classe A, dont la première carbapénémase de classe A à être décrite était localisée sur le
chromosome et ont été rapportée chez les bacilles à Gram négatif (BGN) cliniques et
environnementaux. Ce n'est que dans les années 1990 que les carbapénémases de classe A
à médiation plasmidique ont été couramment décrites chez les BGN cliniques, y compris les
Enterobacteriaceae, P. aeruginosa et les espèces Acinetobacter. Les carbapénémases
à médiation chromosomique et plasmidique sont capables d'hydrolyser presque tous les
β-lactames, y compris les carbapénèmes, et sont inhibées par des inhibiteurs de β-lactamase,
tels que l'acide clavulanique et le tazobactam. Les carbapénémases de classe A à médiation
plasmidique les plus couramment décrites sont la carbapénémase de Klebsiella pneumoniae
57
(KPC) et la β-lactamase à spectre étendu de Guyane (GES) (Cuzon, et al., 2010 ; Nordmann et
al., 2011). La famille GES compte plus de 20 variantes, GES-1 montrant une activité vis-à-vis
d’autres β-lactamines mais pas des carbapénèmes. La plupart des variants de GES ont une
activité vis-à-vis des céphalosporines à large spectre, mais la substitution d'acides aminés dans
d'autres variants étend leur activité vis-à-vis des carbapénèmes. Ces variants à activité
carbapénèmase comprennent GES-2, GES-4, GES-5, GES-6, GES-14, GES-16 et GES-18. Les
KPC ont une activité à large spectre contre presque tous les β-lactamines, y compris les
carbapénèmes, et elles sont principalement rapportées chez des isolats cliniques de K.
pneumoniae. Cependant, au cours de la dernière décennie, le KPC a également été signalé chez
d'autres espèces d'entérobactéries, notamment E. coli, Enterobacter spp., Klebsiella oxytoca,
Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Morganella morganii et Citrobacter freundii.
Les carbapénémases de classe B, ou métallo carbapénémases (MBL), sont des β-lactamases à
large spectre capables d'hydrolyser tous les β-lactamines disponibles en clinique à l'exception
des monobactames et ne sont pas inhibées par les inhibiteurs de β-lactamase (l'acide
clavulanique, le tazobactam ou le sulbactam). Cependant, les MBL sont inhibées par les
chélateurs d'ions métalliques, tels que l'acide éthylène diaminetétraacétique (EDTA) et l'acide
dipicolinique, car leur activité hydrolytique dépend de l'interaction entre l'ion zinc du site actif
(Zn2+) et le β-lactame. Les MBL les plus courantes chez les entérobactéries comprennent la
métallo-β-lactamase (VIM) codée par l'intégron de Verona, l'imipénèmase (IMP) et la métallo-
β-lactamase de New Delhi (NDM). Les plus rares sont GIM, SIM, SPM.
Les carbapénèmases de classe D sont appelées enzymes hydrolysant l'oxacilline et comprennent

plus de 200 enzymes, dont quelques-unes ont une activité carbapénémase. Les variantes les plus
répandues sont OXA-48 et OXA-181, qui hydrolysent faiblement les carbapénèmes. La plupart
des variantes d'OXA sont couramment signalées chez A. baumannii et rarement chez les
Enterobacteriaceae. Cette classe de β-lactamases n'est pas inhibée par les inhibiteurs de β-
lactamases et/ou l'EDTA. Depuis l'émergence d'OXA-48, il est de plus en plus signalé chez les
espèces d'entérobactéries, notamment E. coli, Enterobacter spp., C. freundii, K. oxytoca,
Providencia rettgeri et Serratia marcescens. Bien que l'OXA-48 hydrolyse les carbapénèmes
dans une moindre mesure, leur co-occurrence avec d'autres mécanismes de résistance, tels que
l'imperméabilité de la membrane, peut entraîner une résistance de haut niveau (Kopotsa et al.,
2019).
58
4.3. Les céphalosporinases
E. coli porte un gène chromosomique, ampC, codant une β-lactamase de type AmpC. Le gène
ampC est normalement exprimé à bas niveau, car son promoteur est faible, en plus il contient
un atténuateur transcriptionnel. Cependant, des mutations au niveau du promoteur (box-35 et -
10) ont été rapportées. Ces mutations jouent un rôle important dans la résistance d’E. coli aux
β-lactamines par augmentation de la transcription d’ampC (Jorgensen et al., 2010 ; Caroff et
al., 2000). Ces gènes responsables d’une hyperproduction d’AmpC sont désignés cAmpC, car
ces céphalosporinases sont produites d’une manière constitutive. En plus, des AmpC
β-lactamases à spectre large (ESAC) avec une activité hydrolytique élevée contre la ceftazidime
et le céfepimine ont été décrits chez E. coli. Cette augmentation de spectre d’activité est due à
des modifications structurales dans le site actif de l’enzyme lui-même et non dans le promoteur.
Autre que l’ApmC chromosomique, la présence de plasmides codant le gène ampC (pAmpC)
est de plus en plus fréquemment identifiée chez E. coli. Ces gènes pourraient avoir comme
origine une mobilisation vers des plasmides des gènes ampC chromosomiques d’organismes
comme Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Hafnia alvei, Morganella morgani et
Aeromonas spp. Le CMY-2, est l’un de ces pAmpC, et il est le plus fréquent chez les isolats
d’E. coli résistants aux céphalosporines isolées de sources animales (Jorgensen et al., 2010).
4.4. Résistance aux non-bêta-lactamines :
Les principales résistances décrites chez les entérobactéries y compris E. coli sont les
résistances aux quinolones, aux aminosides, au triméthorprime, aux sulfamides et aux
tétracyclines. La résistance aux quinolones est essentiellement codée par deux mécanismes
moléculaires : (i) mutations chromosomiques dans les gènes gyrA et parC, (ii) et plus
récemment, par des gènes plasmidiques transférables (Lee et al., 2005). Chez E. coli,
la résistance aux quinolones est généralement attribuée à des mutations dans le gène gyrA
codant la sous-unité A de l’ADN gyrase. La résistance par des mutations du gyrA se fait au
niveau de la protéine GyrA entre les acides aminés en position 67 et 106, nommée région
déterminant la résistance aux quinolones (QRDR). Les changements d’acides aminés Ser-83 L
ou de l’Asp-87 N sont les plus fréquemment observés chez les souches résistantes à l’acide
nalidixique (Karczmarczyk et al., 2011). Le premier déterminant de la résistance d’origine
plasmidique, qnrA, fut découvert en 1998, suivi en 2004 par deux autres déterminants qnr B et
qnr S chez plusieurs espèces d’entérobactéries. Les gènes qnr codent pour une protéine,
quinolone réductase QNR, de 218 acides aminés. À ce jour cinq types de qnr ont été mis en
évidence, les variants qnrA, qnrB, qnrS, qnrD et qnrC (Strhilevitz et al., 2009). Un deuxième
59
gène de résistance plasmidique a été mis en évidence en 2006 (Robicsek et al., 2006). Il code
une aminoaside 6’-N-acétyltransférase mutée, l’aac (6’)-Ib-cr. Le gène aac (6’)-Ib code
la résistance à la tobramycine, à l’amikacine et à la kanamycine par inactivation
de l’antibiotique. Deux mutations Trp102Arg et Asp179Tyr, retrouvées sur le variant Ib-cr lui
permettent de N-acétyler le cycle piperazinyl au niveau du groupement amine secondaire de la
ciprofloxacine et du norfloxacine. En 2003, le gène d’oqxAB a été détecté chez des souches
d’E. coli humaines. Ce gène code pour la synthèse d’une pompe à efflux actif (Zhao et al.,
2010) qui confère une résistance de bas niveau aux fluoroquinolones, vis-à-vis de l’acide
nalidixique, la fluméquine, la norfloxacine et la ciprofloxacine chez E. coli. Puis en 2007, le
gène qepA a été décrit chez une souche d’E. coli isolée en Belgique et code une pompe à efflux
(QEP : quinolone efflux pump). La résistance acquise au triméthorprime et aux sulfamides peut
être due à des mutations chromosomiques ou à l’acquisition de gènes plasmidiques (sul, dfr),
codant des enzymes DHPS (dihydroptéroate synthétase) et DHFR (dihydrofolate réductase)
résistantes respectivement aux sulfamides et au triméthoprime. Des mutations chromosomiques
de certains gènes peuvent provoquer la surproduction d’enzyme cible, tel qu’une
hyperproduction d’acide para-amino-benzoïque, ou encore une DHPS et /ou une DHFR
de faible affinité aux antibiotiques. La résistance plasmidique est liée à l’acquisition
de nouvelles enzymes résistantes. Des DHPS insensibles aux sulfamides codés par les gènes
sul1, sul2 et sul3 ont été décrites chez des bactéries à Gram négative. Pour la résistance au
triméthoprime, plus de 30 gènes différents ont été identifiés codant un DHFR (Šeputiené et
al., 2010). À ce jour, 19 gènes transférables qui codent pour l’enzyme DHFR ont été détectés.
Ces gènes ont été classés en deux groupes, le type A qui constitue les gènes dfrA et le type B
qui est formé par les gènes dfrB (Šeputiené et al., 2010). La résistance aux aminosides peut se
traduire par l’altération de la cible d’un acide aminé dans une protéine ribosomale entrainant
une diminution de l’affinité du ribosome pour un antibiotique. Des substitutions d’acides
aminés dans la protéine S12 de la sous-unité 30 S du ribosome provoquent une résistance à
la streptomycine. Cependant, le principal mécanisme de résistance aux aminosides est
la modification (inactivation) enzymatique de l’antibiotique. Cette modification structurale
consiste en l’ajout d’un groupement sur les positions aminées ou hydroxylées
des aminoglycosides ce qui empêche leur fixation sur le site A du ribosome. Ce groupement
peut être un groupement nucléotidyl pour les aminoglycosides O-nucléotidyltransférases
(ANT), un groupement phosphoryle pour les aminoglycosides O-phosphotransférases (APH)
ou/et un groupement acétyle pour les aminoglycosides N-acétyltransférases (AAC) (Thompson
et al., 1999).
60
La résistance à la tétracycline peut être due à plusieurs mécanismes tels que l’expulsion de
tétracyclines par des pompes actives et les protéines de protection du ribosome. Ces pompes
actives sont codées par des gènes différents, principalement tet (A-E) et tet (G-I). Le gène tet
(B) semble plus répandu et a été trouvé chez différents genres de bactéries à Gram négatif, y
compris les Enterobacteriaceae, des bactéries non fermentatrices et d’autres pathogènes
respiratoires (Thaker et al., 2010). L’autre mécanisme de résistance est constitué par les
protéines de protection du ribosome, codé par les gènes tet (M) et tet (O), qui sont plus fréquents
chez les Gram positifs. Ces protéines de protection du ribosome se lient à la sous-unité 50S, sur
un site différent de celui de tétracycline, mais le changement de conformation du ribosome qui
se produit après la liaison est suffisant pour empêcher la fixation de la tétracycline (Thaker et
al., 2010).
61
I. Souches bactériennes
1. Souches bactériennes indicatrices de référence
Des souches bactériennes indicatrices ont été utilisées pour différents tests au cours de ce travail
(Tableau 8).
Tableau 8 : Souches bactériennes indicatrices
Souches indicatrices Test

Listeria monocytogenes ATCC 43256 Activité bactériocinogène
Staphylococcus aureus (Khemiri et al., 2018) Activité bactériocinogène
Escherichia coli ATCC 25922 Activité bactériocinogène /

Contrôle antibiogramme
Enterococcus faecalis JH 2-2 Activité bactériocinogène
Salmonella Typhimurium Activité bactériocinogène
Bacillus cereus (Collection IRVT) Activité bactériocinogène
Bacillus subtilis (Collection IRVT) Activité bactériocinogène
Paenibacillus larvae (Collection IRVT) Activité bactériocinogène
Pseudomonas aeroginosa (Collection du Test de Hodge

CNGMO)
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Contrôle antibiogramme
2. Isolement de souches d’entérocoques bactériocinogènes
Une première collection d’échantillons de matières fécales fraîches de deux groupes de 50

lapins. Le premier groupe (1 à 31) sont des lapins adultes sains issus de croisement New-
zélandais x californienne maintenus dans des cages métalliques séparées et nourris avec des
aliments granulés sans ajout de médicaments (ni anticoccidiens, ni antibiotiques). Ils font partie
de l’élevage cunicole du laboratoire de zootechnie de l'Institut National Agronomique de
Tunisie (INAT). Les lapins du groupe 2 (32-50) provenaient de trois zones sauvages de la région
de Mahdia, en Tunisie (zone touristique Mahdia, zone forêt Minette et zone Essâad). La collecte
a été faite au mois d’Avril 2019 aux alentours des terriers de lapins. Cinq grammes de chaque
63
échantillon ont été dilués dans 5 ml de bouillon cœur cervelle (BCC) (Bio-Rad), homogénéisés
et incubés pendant une heure à 37°C. Ensuite, 100 µl de chaque échantillon ont été utilisés pour
inoculer des milieux sélectifs. La gélose Slanetz-Bartley (SB) (BioKar diagnostics, Allonne,
France) et la gélose Bile Aesculin Azide (BEA) (Biolife) ont été utilisées pour l'isolement
des entérocoques et la gélose Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (Oxoid, Basingstoke, UK) pour
l'isolement des LAB (Poeta et al., 2006, 2007). Les boites ont été incubées pendant une nuit à
37°C à l'exception des boites MRS qui ont été incubées pendant 48 h. Une ou deux colonies
présentant un aspect typique d'Enterococcus (cultivées sur SB / BEA) ont été réisolées sur
gélose cœur cervelle et incubées pendant une nuit à 37°C afin d’obtenir des cultures pures.
De même pour les colonies cultivées sur gélose MRS. La coloration de Gram, le test de la
catalase et de l’oxydase ont été réalisés pour la confirmation de l’appartenance au genre
Enterococcus. Les isolats sont par la suite conservés à -20°C dans un milieu de conservation
(BCC + 20% de glycérol) pour une ultérieure utilisation.
3. Isolement de souches d’entérocoques et de souches d’E. coli pour l’étude de la résistance

aux antibiotiques
Une deuxième collection d’échantillons de matières fécales fraîches de 35 lapins a été collectée
d’un élevage industriel en Tunisie (gouvernorat de Nabeul). De la même manière 5g de chaque
échantillon ont été dilués dans 5 ml de bouillon cœur cervelle (BCC) (Bio-Rad), homogénéisés
et incubés pendant une heure à 37°C et les milieux sélectifs pour les entérocoques utilisés sont
la gélose Bile Aesculin Azide (BEA) avec ou sans ajout de 32 mg/litre de Vancomycine.
Les isolats collectés ont été initialement définis par les tests phénotypiques à savoir :
la coloration de Gram, la réaction à la catalase et à l’oxydase puis ils sont conservés à -20°C.
Les mêmes échantillons de matières fécales fraîches de 35 lapins provenant de l’élevage

industriel ont servi pour l’isolement des isolats d’Escherichia coli. Après incubation de 5g
de chaque échantillon dans 5ml de BCC pendant 1 h à 37°C, 100 µl ont été étalés sur trois boites
de gélose : i) gélose TBX non supplémentée (pour isoler les souches d’E. coli), ii) gélose TBX
supplémentée avec 2 mg / L de céfotaxime (pour isoler les souches d’E. coli résistantes
au céfotaxime et qui seraient productrices de BLSE ou de pAmpC (Kilani et al., 2015)), iii)
gélose TBX avec 1 mg / L d'imipénème, et incubée pendant une nuit à 37°C (Ilyas et al., 2021).
Une colonie d’aspect typique bleu-vert a été sélectionnée et isolée de chaque boite. Les isolats
ont été confirmés et identifiés par des tests classiques (coloration de Gram, test à l'oxydase,
production d'uréase et d'indole) et par identification biochimique à l'aide du système API 20E
64
(bio-Mérieux). Puis, ils sont conservés à -20°C afin d’être utilisés pour les différents tests à
venir.
II. Caractérisation des souches bactériocinogènes
1. Détection de l’activité bacteriocinogène des isolats d’Enterococcus
Pour la détermination de l'activité antibactérienne, nous avons utilisé la procédure décrite par
De Vuyst et al. (1996). Cent µl d'une culture préalablement incubée dans du BCC pendant une
nuit de la souche indicatrice (tableau 8) ont été ajoutés à 20 ml de gélose molle (bouillon BCC
(Bio-Rad) supplémenté de 0,7% d'agar), mélangés et versés dans une boîte de Pétri. Après
solidification, une colonie d’entérocoque à tester pour l'activité antimicrobienne a été placée
sous forme de strie avec une anse stérile sur la gélose molle ensemencée avec les bactéries
indicatrices (5 souches par boite). Les boites ont été incubées pendant 24 h à 37°C dans des
conditions aérobies. L'activité antimicrobienne a été détectée visuellement par des zones
d'inhibition claires autour de la souche testée. Les valeurs ont été attribuées en fonction du
diamètre du halo d’inhibition : ++++ = zone claire> 15 mm, +++ = zone claire 10–15 mm, ++
= 5–9 · 9 mm, + = zone claire 1– 4 · 99 mm, - = aucune zone (Jaouani et al., 2014).
2. Détermination de la nature protéique de la substance inhibitrice
Les isolats présentant une activité antibactérienne par la méthode des stries ont été cultivés
pendant une nuit à 37°C dans 10 ml de bouillon MRS (Oxoid, Basingstoke, UK). Les
surnageants ont été recueillis par centrifugation (10 min à 10 000 g) à 4°C, puis stérilisés par
filtration en utilisant des filtres de 0,22 µm. Leur activité antibactérienne a été testée par le test
de diffusion de puits comme suit : un aliquot de 150 µl d'une culture d’une nuit des bactéries
indicatrices a été mélangé avec 15 ml de gélose molle (milieu BCC complété avec 0,8% d'agar)
et versé dans des boites de Petri. Des puits ont été perforés dans la gélose afin d’être remplis
avec 100 µl des extraits de surnageant des isolats à tester. Simultanément, pour tester la nature
protéique de l'activité inhibitrice, les surnageants stérilisés ont été ajustés à pH 7 avec 1 mol l-1
de NaOH pour éliminer l'effet dû aux acides organiques et 100 µl ont été traités avec 5 µl
de protéinase K (25 mg ml- 1, Sigma), les trois types de surnageants (pur, neutralisé par NaOH
et traité par la protéinase K) ont été placés dans les puits et la boite a été incubée pendant une
nuit à la température appropriée des souches indicatrices. La production de bactériocines ou de
composés de type bactériocine par les souches testées a été confirmée par la présence de zones
d'inhibition autour du puits contenant le bouillon de culture pur et neutralisé et l'absence du
halo autour du puits contenant la protéinase K (Dal Bello et al., 2010).
65
3. Identification des isolats d’entérocoques bactériocinogènes
Les souches sélectionnées potentiellement bactériocinogènes ont été identifiées par les deux
méthodes biochimique et moléculaire.
3.1. Identification par galerie API
Les souches d’entérocoques bactériocinogènes ont été identifiées en utilisant les galeries API
20 strep kit (Biomérieux, Marcy l’Etoile, France). Les tests ont été réalisés selon les
recommandations du fournisseur et les résultats obtenus sont interprétés à l’aide d’une base de
données API 20 strep.
3.2. Extraction de l’ADN génomique
L'ADN total a été extrait des isolats cultivés pendant une nuit dans un bouillon BCC à 37°C.
Les échantillons ont été centrifugés à 13 000 g pendant 10 min. Le surnageant a été éliminé et
le culot a été remis en suspension dans 1 ml de PBS et centrifugé à 13 000 g pendant 10 min.
Le surnageant a été éliminé et le culot a été remis en suspension dans 400 µl de TE [Tris-Hcl
10 mM, EDTA 2 mM ; pH8], puis soumis à une ébullition à 100°C dans un bain-marie pendant
10 min, ensuite refroidi sur de la glace pendant 10 min et centrifugé à 13 000 g pendant 10 min.
Les surnageants contenant de l'ADN ont été conservés à -20°C jusqu'à utilisation.
3.3. Identification des espèces d’entérocoques par PCR
Les souches d’Enterococcus sont identifiées par une PCR (Polymerase Chain Reaction) ciblant
les espèces E. faecalis et E. faecium selon la méthode décrite par Dutka-Malen et al., (1995) en
utilisant les amorces ddlE. faecalis et ddlE. faecium (Tableau 9). Les produits de PCR sont
ensuite analysés par électrophorèse sur gel d’agarose à 2% contenant le bromure d’éthidium
(BET : 0,5µg. ml-1).
Tableau 9 : Amorces utilisées pour l’identification des espèces d’entérocoques
Gène Amorces (5’ - 3’) Conditions d’amplification Taille du Réferences

fragment
(pb)
ddlE. ATCAAGTACAGTTAGTCT 941
faecalis ACGATTCAAAGCTAACTG 94°C/2mn; 30 cycles: Dutka-
ddlE. TAGAGACATTGAATATGCC (94°C/1mn,54°C/1mn,72°C/1mn); 550 Malen et
faecium TCGAATGTGCTACAATC 72°C/10min al., 1995
66
4. Détection des gènes codant les bactériocines
Les gènes codant pour les entérocines (entA, B, P, Q, L50A / B, AS-48, 31, X, 1071A / B) ont
été détectés par PCR en utilisant les amorces et les conditions rapportées par Edalatian et al.,
(2012). La PCR a été réalisée dans un volume de 25 µl contenant du tampon PCR 1X, 1,5 mmol
l-1 MgCl2, 0,2 mmol l-1 dNTP, 0,2 mmol l-1 de chaque amorce bactériocine et 3U de Taq
polymérase. Les amorces et les conditions d’amplification sont présentées dans le Tableau 10.
Les produits PCR ont été séparés par électrophorèse dans des gels d'agarose à 2% contenant du
bromure d'éthidium (0,5 µg ml-1), en utilisant un marqueur de taille de 100 pb (Sigma) comme
marqueur de poids moléculaire.
Tableau 10 : Amorces spécifiques et conditions d’amplification pour la détection des gènes

codant pour les bactériocines (Edalatian et al., 2012).
Taille du
Gène Séquence (5’ to 3’) Condition d’Amplification fragment Références
(pb)
entA AAATATTATGGAAATGGAGTGTAT 95°C/5mn; 35 cycles : 475
GCACTTCCCTGGAATTGCTC 94°C/30s,50°C/30s,72°C/10s
; 72°C/7min
entB GAAAATGATCACAGAATGCCTA 95°C/5mn; 35 cycles : 159
GTTGCATTTAGAGTATACATTTG 94°C/30s,50°C/30s,72°C/10s
; 72°C/7mn
entP CGTAATGGTGTTTATTGTAAT 95°C/5mn; 35 cycles : 117
ATGTCCCATACCTGCCAAAC 94°C/30s,48°C/30s,72°C/10s
; 72°C/7mn Du Toit et
entL50A,B GGAGCAATCGCAAAATTAG 95°C/5mn; 35 cycles : 150 al., 2000
ATTGCCCATCCTTCTCCAAT 94°C/30s,55°C/30s,72°C/10s
; 72°C/7mn
ent31 TATTACGGAAATGGTTTATATTG 95°C/5mn; 35 cycles : 122
TCTAGGAGCCCAAGGGCC 94°C/30s,50°C/30s,72°C/10s
; 72°C/7mn
entAS48 GAGGAGTTTCATGATTTAAAG 95°C/5mn; 35 cycles : 185
CATATTGTTAAATTACCAAGC 94°C/30s,50°C/30s,72°C/10s
; 72°C/7mn
ent1071A,B GGGGAGAGTCGGTTTTTAG 95°C/5mn; 35 cycles : 273 Martin et
ATCATATGCGGGTTGTAGCC 94°C/30s,50°C/30s,72°C/10s al., 2006
; 72°C/7mn
entQ CAAGAAATTTTTTCCCATGGC 95°C/5mn; 35 cycles : 95
CTTCTTAAAAATGGTATCGCA 94°C/30s,55°C/30s,72°C/10s
; 72°C/7mn Edalatian et
entX GTTTCTGTAAAAGAGATGAAAC 95°C/5mn; 35 cycles : 500 al., 2012
CCTCTTAATCATTAACCATAC 94°C/30s,50°C/30s,72°C/10s
; 72°C/7mn
67
5. Evaluation de l’innocuité des isolats d’Enterococcus bactériocinogènes

5.1. Détection des gènes de virulence
Les isolats d’Enterococcus bactériocinogènes ont été testés pour dix gènes de virulence : hyl
(hyaluronidase), esp (protéine de surface), geIE (gélatinase), agg (substance d'agrégation), ace
(adhésion du collagène), efa (adhésion de la paroi cellulaire), cylLL/s (cytolysine), cob
(phéromone sexuelle), cpd (phéromone sexuelle) et ccf (phéromone sexuelle). La liste des
amorces spécifiques utilisées, leurs conditions d'amplification et les tailles des fragments
d’ADN est présentée dans le Tableau 11. Les produits PCR ont été analysés comme mentionné
ci-dessous.
Tableau11 : Amorces spécifiques et conditions d’amplification pour la détection des gènes

de virulence
Taille du
Gène Séquence (5’ to 3’) Conditions d’Amplification fragment Références
(pb)
hyl ACAGAAGAGCTGCAGGAAATG 94°C/5mn ; 30 cycles : 276
GACTGACGTCCAAGTTTCCAA 94°C/1mn,54°C/1mn,72°C/1mn ;
72°C/1mn Vankerckhoven
esp AGATTTCATCTTTGATTCTTGG 94°C/5mn ; 30 cycles : 510 et al., 2004
AATTGATTCTTTAGCATCTGG 94°C/1mn,54°C/1mn,72°C/1mn ;
72°C/1mn
agg AAGAAAAAGAAGTAGACCAAC 94°C/5mn ;30 cycles : 1553 Aristimuño et
AAACGGCAAGACAAGTAAATA 94°C/1mn,53°C/1mn,72°C/1.30mn al., 2018
; 72°C/5mn
gelE ACCCCGTATCATTGGTTT 95°C/5mn; 30 cycles : 419 Eaton and
ACGCATTGCTTTTCCATC 95°C/1mn,56°C/30s,72°C/30s ; Gasson 2001
72°C/10mn
ace AAAGTAGAATTAGATCCACAC 94°C/5mn ; 30 cycles : 320 Hassan et al.,
TCTATCACATTCGGTTGCG 94°C/1mn,58°C/1mn,72°C/1mn ; 2012b
72°C/10mn
cylLL/s GTGTTGAGGAAATGGAAGCG 95°C/5mn; 35 cycles : 324 Brandao et al.,
TCTCAGCCTGAACATCTCCAC 95°C/30s,60°C/30,72°C/1mn ; 2010
72°C/10mn
ccf GGGAATTGAGTAGTGAAGAAG 95°C/5mn; 35cycles : 543
AGCCGCTAAAATCGGTAAAAT 95°C/30s,54°C/30s,72°C/1mn ;
72°C/10mn
cpd TGGTGGGTTATTTTTCAATTC 95°C/5mn; 35cycles : 482
TACGGCTCTGGCTTACTA 95°C/30s,54°C/30s,72°C/1mn ;
72°C/10mn Reviriego et
cob AACATTCAGCAAACAAAGC 95°C/5mn;35cycles : 1405 al., 2005
TTGTCATAAAGAGTGGTCA 95°C/30s,54°C/30s,72°C/1mn ;
72°C/10mn
EfaAfs GACAGACCCTCACGAATA 95°C/5mn; 35cycles : 705
AGTTCATCATGCTGTAGTA 95°C/30s,54°C/30s,72°C/1mn ;
72°C/10mn
68
5.2. Etude de la sensibilité aux antibiotiques
Huit antibiotiques de différentes classes (tableau12) ont été utilisés dans cette étude (charge
de disque) : ampicilline (10µg), érythromycine (15µg), gentamicine (500µg), streptomycine
(300µg), linézolide (30µg), vancomycine (30µg), tétracycline (30µg), teicoplanine (30 µg).
La sensibilité aux antibiotiques des isolats bactéricinogènes a été réalisée par la méthode
de diffusion sur des boites de gélose MH (Mueller-Hinton, Bio-Rad) selon les recommandations
du Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2017). Les boites ont été incubées à
37°C pendant 24h puis les diamètres de la zone d'inhibition ont été mesurés et la sensibilité des
souches a été interprétée selon les recommandations du CLSI (CLSI, 2017). La multirésistance
a été définie comme une résistance aux antibiotiques appartenant à trois familles d'antibiotiques
ou plus (Magiorakos et al., 2012).
d’inhibition, selon les recommandations de CLSI (2017)
Charge de Diamètres critiques (mm)

Antibiotiques
disque (µg)
R I S
Vancomycine 30 <12 - ≥12

Teicoplanine 30 <16 - ≥16
Ampicilline 10 <8 8-10 ≥10
Tétracycline 30 ≤14 15-18 ≥19
Érythromycine 15 ≤13 14-22 ≥23
Linézolide 30 <19 19-22 ≥23
Streptomycine 300 <14 - ≥14
Gentamicine 500 <8 - ≥8
5.3. Production de gélatinase
La production de gélatinase a été évaluée selon la méthode de Cariolato et al., (2008). Des
plaques contenant de la gélose cœur cervelle additionnée de 30 g l-1 de gélatine et 10 g l-1 de
peptone, ont été striées par les souches bactériocinogènes et incubées à 37°C pendant 24h.
Ensuite, les plaques ont été incubées à 4°C pendant 5h. L'apparition d'un halo clair autour des
stries des colonies indique l’hydrolyse de la gélatine et ainsi la production de gélatinase.
69
5.4. Production de DNase
Pour la détection de la DNase, les isolats de colonies ont été cultivés en stries sur milieu gélose
DNase (Bio-Rad). Après incubation pendant 24 h à 37°C, les plaques ont été inondées de HCl
(1N). L'apparition de zones claires autour des colonies a été considérée comme une indication
positive de la production de DNase (Gupta et Malik, 2007).
5.5. Activité hémolytique
L'activité hémolytique a été déterminée en étalant une seule colonie sur des plaques de gélose
préparées avec de la gélose Columbia (Bio-Rad) contenant 5% de sang de mouton (Asteri et
al., 2009) puis incubées 24 h à 37°C. Les boites ont été examinées par observation de la zone
d'hémolyse autour des colonies. S’il y a présence de zone claire autour des colonies, les souches
sont considérées β-hémolytiques, si présence de zone verte autour des colonies, elles sont α-
hémolytiques et si pas de halo autour des colonies, les souches sont γ-hémolytiques.
6. Activité protéolytique
L'activité protéolytique a été déterminée en étalant la suspension bactérienne à étudier sur la

gélose au lait écrémé, préparée en supplémentant la gélose Mueller-Hinton (MH) avec 3% (p/v)
de poudre de lait écrémé (skim milk, Bio-Rad). Les boites ont été incubées à 37°C pendant 24h
et l'activité protéolytique a été confirmée par la présence d'un halo clair autour des colonies
(Cariolato et al., 2008).
7. Croissance à différentes valeurs de pH
Cinq souches ont été sélectionnées en fonction de leur spectre d'inhibition élevé, de leur
sensibilité aux antibiotiques et de l'absence de gènes de virulence pertinents. Les isolats ont été
cultivés dans du bouillon MRS ajusté à pH 4,5,6,7 et 8. Les souches cultivées dans du bouillon
MRS ont servi de contrôle (pH 6,5) (Jaouani et al., 2015). Le test a été réalisé dans des
microplaques. Chaque puits a été rempli de 180 µl du milieu MRS et inoculé avec 20 µl de
préculture (DO620 = 0,02), puis incubé à 37°C. La lecture de la densité optique a été enregistrée
toutes les heures pendant 28 h à l'aide d'un spectrophotomètre (Labsystems multiscan RC). Ce
test a été réalisé en triple exemplaires.
8. Tolérance gastrique et biliaire
L'évaluation de la résistance à l'acidité gastrique a été réalisée selon la méthode décrite par
Argyri et al., (2013). Les isolats ont été récoltés par centrifugation (10.000 g, 5 min, 4°C), lavés
70
deux fois avec une solution de PBS stérile (pH 7,3), puis remis en suspension dans 1 ml de PBS,
et dilués (1 : 100) dans une solution de PBS ajustée au pH 2.5. La résistance a été évaluée en
termes de nombre de colonies viables et répertoriée en double sur gélose Bile esculine azide
(BEA) (Bio-Rad) après incubation à 37°C pendant 0 ; 0,5 ; 1 ; 2 et 3 h, ce qui représente le
temps du passage des aliments dans l'estomac.
La tolérance aux sels biliaires a été déterminée en étalant une seule colonie de chaque souche
d’entérocoques testées sur des boites de gélose TH contenant de la bile de galle de bœuf (0,1 et
4% (p/v)). Les plaques ont été incubées à 37°C pendant 24 h et examinées visuellement pour la
croissance.
9. Coexistence des isolats
La coexistence entre les cinq isolats a été examinée par une méthode de séquences croisées
(Guo et al., 2010). Chaque souche d'entérocoque a été cultivée dans une boite de gélose MRS
avec une seule strie de l'inoculum au centre de la plaque de Petri et incubée pendant une nuit à
37°C. Lorsque la croissance a été observée, les boites ont été ensemencées avec les autres
isolats, par une seule strie en formant à angle de 90° par rapport à la première strie.
L'antagonisme l'un contre l'autre a été visualisé par l'observation d'une zone d'inhibition.
III. Application de la souche d’Enterococcus bactériocinogène comme candidat

probiotique sur les performances zootechniques des lapereaux en croissance
Afin de tester, in vivo, les performances de la souche E. durans entA32 en tant que candidat
probiotique, un essai expérimental sur des lapereaux sevrés a été réalisé. La souche candidate a
été administrée selon deux modes, dans l’aliment ou bien dans l’eau de boisson et comparée à
une souche probiotique commercialisée sur le marché.
1. Protocole expérimental
L’essai expérimental s’est déroulé pendant la période Novembre-Décembre 2021 au clapier

expérimental de l’INAT. Pour cela, soixante lapereaux New-zélandais x Californiens âgés de
30 à 35 jours pesant entre 600g et 700g de poids vif ont été sevrés, marqués et répartis en quatre
groupes ayant des poids moyens comparables (Tableau 13). Chaque groupe est composé de 15
lapereaux répartis sur 3 cages (soient 5 lapereaux par cage). Les lots des quatre groupes sont
disposés de façon à éviter l’effet bâtiment. Selon le protocole expérimental les lapereaux sont
71
logés à raison de 5 par cage au début de l’essai, puis 3 à 4 lapins par cage jusqu’à la fin de
l’essai (Figure 4). Les dimensions des cages sont L(60cm) x l (30cm) x H(30cm).
Tout au long du déroulement de l’essai, la température et l'humidité relative quotidiennes

moyennes ont été enregistrées entre 13 °C et 24°C et entre 64% et 84%, respectivement.
Le régime alimentaire de base reçu par les 4 lots est un aliment commercial granulé pour
engraissement qui permet de subvenir aux besoins des lapins. Sa composition théorique est :
2500 Kcal d’ED/kg, 15,5% MAT et 16% de CB, 16% Soja, 15% Orge, Luzerne 33% , 0,5%
Huile, 31% son et 4% CMV. Ce régime ne contenait ni anticoccidiens ni antibiotiques.
Figure 4 : Conditions d’élevage et répartition des lapereaux en groupes.
La souche candidate E. durans EntA32 a été lyophilisée à partir d’une culture fraiche de 108
UFC afin d’être utilisée dans les mêmes conditions que celles des souches probiotiques
généralement vendues sur le marché. La lyophilisation a été faite dans des conditions
opératoires qui permettent d'obtenir la plus haute concentration en microorganismes et une
bonne stabilité du lyophilisat dans le temps. Le procédé consiste en une première étape de
congélation (refroidissement de l'échantillon de 25 °C à -20 °C durant 6 heures) puis une étape
de sublimation pendant laquelle la température étagère est maintenue à -56 °C et la pression est
maintenue à 10 Pa jusqu'à la fin de cette phase qui a duré 12h. (La sublimation consiste en une
diminution de la pression à une température négative), ensuite l’étape de la diffusion pendant
laquelle la température de l'échantillon augmente à 25 °C alors que la température de l'étagère
est maintenue à - 56 °C et une pression de 5 Pa pendant 24 h.
72
Tableau 13 : Spécificités des lots de lapereaux en fonction du probiotique et son mode

d’administration.
Lot Probiotique administré Mode d’administration

Témoin Pas de probiotique -
PC Probiotique commerciale lyophilisée Ajouté dans l’aliment à raison de 200g
Bacillus subtilis (dilué) dans 100Kg d’aliment.
PSA La souche E. durans EntA32 Ajouté dans l’aliment à raison de 15g
lyophilisée dans 100kg d’aliment.
PSE La souche E. durans EntA32, culture Ajouté dans l’eau de boisson à raison de
fraiche de 107 UFC. 500µl / lapin /jour.
- Pour le lot témoin, les lapereaux ont reçu l’aliment commercial tout au long de la
journée à volonté.
- Pour le lot PC, recevant la souche commerciale : les lapereaux reçoivent l’aliment
commercial auquel on ajoute la souche probiotique lyophilisée (les bouchons sont
broyés, mélangés avec la souche puis remis sous forme de granulés,), ad libitum.
- Le même protocole pour le lot (PSA) la souche candidate E. durans EntA32
lyophilisée mélangée avec l’aliment broyé puis aggloméré et administré à l’animal
ad libitum.
- Les lapereaux du 4ème lot (PSE), auxquels on a administré la souche E. durans
EntA32 dans l’eau reçoivent l’aliment commercial comme le lot témoin.
L’eau est distribuée pour tous les groupes dans des bidons de 5 litres avec des tétines. Elle est
renouvelée un jour sur deux.
Un contrôle de l'état de santé et des performances de croissance tout au long de la période d'essai
(7 semaines) a été réalisé, les lapins ont été contrôlés quotidiennement pour observer la
mortalité et les signes cliniques tels que diarrhée, constipation (absence d'excrétion fécale dans
les 24 h) ou autre maladie.
Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité d'Ethique en Expérimentation Animale
de l’Ecole Nationale de Médecine Vétérinaire de Sidi Thabet (numéro d'approbation éthique :
CEEA-ENMV 39/2021/INAT).
73
2. Mesure des performances zootechniques
2.1. Suivi de la croissance

Les poids vifs de tous les lapins ont été suivis par pesées individuelles et enregistrés une fois
par semaine le même jour à une heure fixe. La consommation alimentaire a été déterminée
chaque semaine. Les refus d'aliments ont été collectés chaque semaine et quantifiés juste avant
chaque distribution.
Le Gain moyen quotidien (GMQ) est calculé selon la formule :
GMQ= (Poids semaine (i) – Poids semaine (i-1)) / 7
2.2. Mesure de l’ingestion alimentaire et calcul de l’Indice de consommation
La consommation a été calculée selon la formule suivante :
Quantité consommée (g)= Quantité distribuée- quantité refusée

L’indice de consommation est calculé selon la formule :
Indice de consommation = Quantité consommée (g)/ Gain de poids vif (g)
2.3. Mesure de la consommation d’eau
Pour toutes les cages de l’essai un bidon de 5 litres en plastique muni d’une tétine et numéroté
a été placé sur chaque cage (Figure4). La consommation d’eau a été mesurée un jour sur deux
et à une heure fixe par le calcul de la différence de poids de chaque bidon entre deux pesées
successives.
2.4. Calcul du rapport eau/aliment

Grâce aux quantités d’eau et d’aliments consommées, le rapport eau/aliment a été déterminé.
3. Composition corporelle et paramètres de la carcasse
Les carcasses des lapereaux par traitement abattus à la fin de l’essai ont été pesées à chaud et
après refroidissement à 4 °C pendant 24h. Le tube digestif et le caecum ont été aussi pesés et le
calcul des rendements en carcasses chaude, froide ainsi que les proportions des organes digestifs
par rapport au poids vif et par rapport à la carcasse froide ont été déterminés.
La mesure du pH (pH post-mortem) a été faite sur la carcasse chaude 5 à 10 mn après abattage,
et ce au niveau du muscle de la cuisse à l’aide d’un pH-mètre (pH330i/SET, WTW, Germany).
74
Une mesure du pH 24h post-mortem a été réalisée au même endroit, ceci nous a permis
d’évaluer la qualité de la viande.
Le rendement en carcasse froide a été calculé comme suit :
Rendement en carcasse froide = (P. carcasse froide /P. vif) *100
4. Analyses statistiques
Toutes les données ont été traitées par le logiciel SAS version 9.1.3 procédure GLM III pour
l’analyse de la variance.
Le modèle suivant a été utilisé pour les performances zootechniques :
Yijk=µ + Ti + Mj(t) + eijk
(Yijk : observations, µ: moyenne générale, Ti : effet traitement, Mj(t) : effet interaction mode
d’administration du probiotique intra-traitement, eijk : erreur résiduelle).
5. Etude de la microflore caecale
La microflore caecale a été étudiée à temps 0 (temps du sevrage et le démarrage de l’essai), à

l’âge de 42 jours, 49 jours et à l’âge de 11 semaines (fin de l’essai). Pour cela 4 lapereaux
choisis de façon aléatoire ont été abattus par saignement artériel, le caecum est écarté
stérilement et transporté à 4°C au laboratoire de microbiologie.
Cinq grammes du contenu caecal de chaque lapereau ont servi pour réaliser des dilutions en eau
physiologique de 10-1 à 10-6. Ensuite, 100 µl de chaque dilution ont été utilisés pour inoculer
des milieux sélectifs et faire le dénombrement. La gélose Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (Oxoid,
Basingstoke, UK) a été utilisée pour le dénombrement des bactéries lactiques. La gélose
lactosée biliée au cristal violet et au rouge neutre (VRBL) est utilisée pour la recherche et le
dénombrement des bactéries coliformes (Escherichia coli et autres). La gélose Tryptone sulfite
néomycine (TSN) est utilisé pour la détection et l’énumération de Clostridium perfringens,
anaérobie stricte. Les boîtes de TSN sont placées dans une jarre hermétiquement fermée
contenant un réactif générateur d'une atmosphère anaérobie. Toutes les boites ont été incubées
pendant une nuit à 37°C.
75
IV. Etude de la résistance aux antibiotiques de la deuxième collection des entérocoques et

d’E. coli
1. Résistance aux antibiotiques des entérocoques

1.1. Identification des souches d’entérocoques
L’identification biochimique et génotypique des souches d’entérocoques utilisées pour l’étude

de la résistance aux antibiotiques a été réalisée de la même manière que précédemment.
1.2. Tests de sensibilité aux antibiotiques
La résistance aux antibiotiques pour les entérocoques isolés des échantillons de la matière fécale
des lapins de provenance de la ferme industrielle a été réalisée de la même manière que
précédemment et selon les recommandations du CLSI, 2017.
Les antibiotiques utilisés et les charges des disques sont indiqués dans le Tableau12. Tous les
isolats résistants à l'ampicilline ont été testés pour l'activité bêta-lactamase avec un test sur
disque de papier à la nitrocéfine (AB Biodisk, Dalvogen, Suède). La méthode de dilution en
gélose a été réalisée pour déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) de la
vancomycine selon le CLSI (2017). La souche de référence E. faecalis ATCC 29212 a été
utilisée comme témoin.
1.3. Détection des gènes de résistance aux antibiotiques et des gènes de virulence
L'extraction d'ADN génomique pour les expériences de PCR a été réalisée comme décrit
précédemment. Toutes les amorces et conditions d'amplification sont présentées dans
le Tableau 14. Les gènes codants pour la résistance à la gentamicine/kanamycine/tombramycine
(aac(6')-Ia-aph(2")-Ie), streptomycine (ant(6)-Ia), érythromycine (erm(B), erm(A), erm(C),
msr(A) et mef(A/E), tétracycline (tet(M), tet(L), tet(O), tet(K) et tet(S)), glycopeptides
(vancomycine/ teicoplanine) (vanA, vanB) et le linézolide (optrA) ont été analysés par PCR
(Tableau 14). Pour tous les isolats tet(M)-positifs, la présence de transposons conjugatifs de la
famille Tn916-Tn1545 (gène de l'intégrase Int-Tn) a été étudiée. Pour évaluer le pouvoir
de virulence des isolats d'entérocoques, les gènes hyl et esp cliniquement pertinents ont été
étudiés. Toutes les expériences de PCR ont inclus des contrôles positifs et négatifs. Les produits
de PCR ont été analysés par électrophorèse dans un gel d'agarose-Tris-Borate-EDTA à 1,5%
contenant 0,5 µg/µl de bromure d’éthidium.
76
Tableau 14 : Description des amorces utilisées pour la détection des gènes codants la résistance
aux antibiotiques et leurs conditions d’amplification chez les entérocoques.
Taille du
Gène Amorces (5’ - 3’) Conditions d’amplification fragment Références
(pb)
ermB GAAAAGGTACTCAACCAAATA 94°C/5min; 35 cycles : 142 Song et al.,
GTAACGGTACTTAAATTGTTTAC 94°C/30s,50°C/30s,72°C/1min ; 2004
72°C/5min
ermA TATCTTATCGTTGAGAAGGGATT 95°C/5min; 30 cycles : 139 Martineau
CTACACTTGGCTTAGGATGAAA 95°C/30s,55°C/30s,72°C/30s ; et al., 2000
72°C/5min
ermC CTTGTTGATCACGATAATTTCC 95°C/5min; 30 cycles : 190 Martineau
ATC TTTTAGCAAACCCGTATTC 95°C/30s,55°C/30s,72°C/30s ; et al., 2000
72°C/5min
mefA/E AGTATCATTAATCACTAGTGC 93°C/5min ; 35 cycles : 348 Sutcliffe et
TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG 93°C/1min,52°C/1min,72°C/1min al., 1996
; 72°C/5min
msrA GCAAATGGTGTAGGTAAGACAACT 95°C/3min; 35 cycles: 400 Portillo et
ATCATGTGATGTAAACAAAAT 94°C/30s,55°C/2min,72°C/90s; al., 2000
72°C/5min
int- GCTCAAAGACCAAAGGTTAGAA 94°C/5min ; 35 cycles : 742 Shiojima et
tn916/1545 TGTGTGGCAATTTATCCTCGTT 94°C/1min,54°C/1min,72°C/1min al., 2005
; 72°C/5min
tetL CATTTGGTCTTATTGGATCG 94°C/1min ; 30 cycles : 456 Aarestrup et
CAATATCACCAGAGCAGGCT 94°C/1min,50°C/1min,72°C/1min al., 2000
; 72°C/10min
tetO GATGGCATACAGGCACAGAC 94°C/1min ; 30 cycles : 615 Aarestrup et
CAATATCACCAGAGCAGGCT 94°C/1min,50°C/1min,72°C/1min al,. 2000
; 72°C/10min
tetK TTAGGTGAAGGGTTAGGTCC 94°C/1min ; 30 cycles : 697 Aarestrup et
GCAAACTCATTCCAGAAGCA 94°C/1min,55°C/2min,72°C/2min al.,
; 72°C/10min 2000
tetS TGGAACGCCAGAGAGGTATT 94°C/1min ; 30 cycles : 660 Choi JM,
ACATAGACAAGCCGTTGACC 94°C/1min,55°C/2min,72°C/2min and Woo
; 72°C/10min GJ.,2015
tetM GCTCATGTTGATGCAGGAAA 94°C/5min ; 39 cycles : 500 Abbassi et
TCCCATTGTTCAGATTCGGTA 94°C/30s,55°C/30s,72°C/1mn ; al., 2007a
72°C/5mn
vanA ATGGCAA GTCAGGTGAAGATGG 96°C/2min ; 35 cycles : 399 Woodford
TCCACCTCGCCAACAACTAACG 94°C/30s,50°C/30s,72°C/1mn ; et al.,1993
72°C/10mn
vanB ATGGGAAGCCGATAGTC 94°C/2min; 30 cycles: 635 Dutka-
GATTTCGTTCCTCGACC 94°C/1min,54°C/1min,72°C/1min; Malen et
72°C/10min al., 1995
ant(6)-Ia ACTGGCTTAATCAATTTGGG 95°C/10min ; 30 cycles : 577 Del campo
GCCTTTCCGCCACCTCACCG 94°C/30s,58°C/30s,72°C/30s ; et al., 2000
72°C/10mn
aac(6’)- CCAAGAGCAATAAGGGCATA 94°C/3mn ; 32 cycles : 220 Van de
aph(2’’) CACTATCATACCACTACCG 94°C/30s,60°C/1mn,72°C/2mn ; kludert and
72°C/6mn Vliegenthart
1993
optrA AGGTGGTCAGCGAACTAA 94°C/3mn ; 32 cycles : 1395 Wang, et
ATCA ACTGTTCCCATTCA 94°C/30s,55°C/1mn,72°C/2mn ; al., 2015
72°C/6mn
77
2. Résistance aux antibiotiques d’E. coli

2.1. Antibiogramme
Les tests de sensibilité aux antibiotiques ont été effectués par la méthode de diffusion sur gélose
Mueller Hinton selon les recommandations du CLSI (2017). Tous les isolats ont été testés pour
la sensibilité à l'amoxicilline, à l'amoxicilline-acide clavulanique, au céfotaxime, à la
ceftazidime, à la céfoxitine, au méropénème, à l'imipénème, à l'ertapénème, à la gentamicine,
à la tobramycine, à la kanamycine, à la tétracycline, au chloramphénicol, à l'acide nalidixique,
à la ciproflaxacine et le triméthoprime/sulfaméthoxazole.
d’inhibition (CLSI,2017)
Charge Diamètre critique (en mm)

Antibiotiques
(µg) R I S
Ampicilline ou amoxicilline 10 ≤13 14-16 ≥17
Amoxcilline/ac.clavulanique 20/10 ≤13 14-17 ≥18
Ceftazidime 30 ≤25 22-24 ≥21
Céfotaxime 30 ≤22 23-25 ≥26
Méropénème 10 ≤19 20-22 ≥23
Imipénème 10 ≤19 20-22 ≥23
Ertapénème 10 <19 20-22 ≥23
Céfoxitine 30 <14 15-17 ≥18
Tobramycine 10 ≤12 13-14 ≥15
Gentamicine 10 ≤12 13-14 ≥15
Acide nalidixique 30 ≤13 14-18 ≥19
Ciprofloxacine 5 ≤15 16-20 ≥21
Tétracycline 30 ≤11 12-14 ≥15
Kanamycine 30 UI ≤13 14-16 ≥17
Chloramphénicol 30 ≤12 13-17 ≥18
Triméthoprime + 1,25/23,75 <13 14-15 ≥16
sulfaméthoxazole
78
2.2. Détection phénotypique de la production des Bêta-lactamases
La production des BLSE a été mise en évidence par le test de la double synergie (Drieux et
al., 2008). Deux disques d’antibiotiques Céfotaxime (CTX 30µg), et ceftazidime (CAZ 30µg)
sont placés de part et d’autre et à 25mm d'un disque d'amoxicilline-acide clavulanique (AMC
30µg) sur une gélose MH préalablement ensemencée par la souche à tester. Les boites sont
ensuite incubées à 37°C pendant 24h. Le test est considéré positif s’il y a une augmentation
de la zone d’inhibition entre le disque d’AMC et les deux autres disques d’antibiotiques et ce
par apparition de synergie dite en « bouchon de champagne » en raison de l’effet inhibiteur
de l’acide clavulanique.
Pour les isolats résistants au céfotaxime présentant initialement un DDST négatif, une
hyperproduction simultanée d'une céphalosporinase a été détectée en réalisant le DDST sur une
gélose contenant de la cloxacilline (250 mg/L) (Drieux et al., 2008). E. coli ATCC 25922 a été
utilisé comme souche de contrôle.
2.3. Détection phénotypique de carbapénémases

2.3.1. Test de Hodge modifié
Pour les isolats présentant une sensibilité réduite à au moins une des trois molécules
de carbapénème testés (méropénème, imipénème, ertapénème), la production
de carbapénèmase a été étudiée par le test de Hodge modifié (MHT) (CLSI, 2017). Pour cela
une souche de référence sensible à l’ertapénème E. coli ATCC 25922 a été ensemencée par
écouvillonnage sur gélose MH, puis un disque d’ertapénème (10µg) a été placé au milieu. Les
souches à tester et une souche témoin positive Pseudomonas aeroginosa (productrice
de carbapénémase VIM) ont été ensemencées en stries depuis le disque vers le bord de la boite.
Après incubation de la boite à 37°C pendant 24 heures, la souche testée est considérée
productrice d’une carbapénèmase si elle présente une déformation de la zone d’inhibition le
long de la strie semblable à celle de la souche témoin positive.
2.3.2. Détection de carbapénémases de classe B
La détection des carbapénémases de classe B a été réalisée selon Yong et al., (2002) et CLSI
(2018). Brièvement, deux disques d'imipenème (10 µg) avec ou sans acide éthylène diamine
tétra acétique (EDTA, 10 µl de solution 0,5 M) ont été placés sur une plaque de gélose Mueller-
Hinton (Bio-Rad, France) inoculée avec l'isolat testé. Les zones d'inhibition des disques
imipenème et imipenème + EDTA ont été comparées après une nuit d'incubation à 37°C. Une
79
différence de diamètre de zone entre les disques imipenème et imipenème +EDTA ≥5 mm a été
interprétée comme un résultat positif pour la production de méthallocarbapénémase (MBL).
2.3.3. Détection des carbapénèmases de classe D

Pour la détection des carbapénémases de classe D, des isolats présentant des diamètres de zone
d'inhibition <25 mm pour l'ertapénème ont été testés avec un disque de 30µg de témocilline. La
résistance à la témocilline était définie par un diamètre de zone d'inhibition <12 mm (Potron et
al., 2013 ; Rodríguez -Lucas et al., 2020).
2.4. Caractérisation moléculaire des gènes de résistance aux antibiotiques chez E. coli
2.4.1. Extraction de l’ADN génomique
L'ADN génomique a été extrait de chaque isolat à l'aide de la méthode d'ébullition (Al-Gallas
et al., 2002) et utilisé comme matrice d'ADN dans toutes les réactions PCR.
2.4.2. Détection des gènes codant la résistance aux antibiotiques

2.4.2.1. Recherche des gènes codant les carbapénémases et les BLSE
Les gènes codant pour les carbapénémases les plus cliniquement répandues (KPC, OXA-48-
like, VIM, IMP, IMI, NDM), ESBL (TEM, SHV, CTX-M-groupe 1) et pAmpC (CMY) ont été
détectés par PCR en utilisant des amorces telles que décrites dans le tableau 16.
2.4.2.2. Recherche des gènes codant la résistance aux sulfamides, à la tétracycline et aux
quinolones à médiation plasmidique
Les gènes codant pour la résistance aux sulfamides (sul1, sul2, sul3) (Maynard et al., 2003 ;
Mazel et al., 2000 ; Perreten et boerlin, 2003), la résistance à la tétracycline (tetA, tetB, tetC)
(Guardabassi et al., 2000 ; Sáenz et al., 2004), et la résistance aux quinolones à médiation
plasmidique (PMQR) (qnrA, qnrB, qnrS, qepA, aac(6')-Ib-cr) ont été recherchés comme décrit
précédemment (Cattoir et al., 2007 ; Gay et al., 2006, Park et al., 2006, Yamane et al., 2008)
(Tableau 17). Des souches positives appropriées de notre collection ont été utilisées dans
chaque réaction PCR (Kilani et al., 2015 ; Soufi et al., 2009, 2011).
80
Tableau16 : Description des amorces utilisées pour la détection des gènes codant les
carbapénèmases et leurs conditions d’amplification
Taille du
Gène Amorces (5’ - 3’) Conditions d’amplification fragment Réferences
(pb)
blaCTX-M-gr1 GTTACAATGTGTGAGAAGCAG 94°C 7 min, 30 cycles (94°C 1041 Jouini et al.,
CCGTTTCCGCTATTACAAAC 50s, 50°C 50s, 72°C 1 min), 2007
72°C 5 min
blaCMY GATTCCTTGGACTCTTCAG 96°C 5 min, 30 cycles ( 1800 Stapleton et
TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC 96°C 30s , 55°C45s, 72°C 2 al., 1999
min), 72°C 5 min
blaSHV CACTCAAGGATGTATTGTG 96°C 5 min, 24 cycles ( 885 Jouini et al.,
TTAGCGTTGCCAGTGCTCG 96°C 15s , 60°C15s, 72°C 2 2007
min), 72°C 5 min
blaTEM ATTCTTGAAGACGAAAGGGC 94°C 5 min, 30 cycles (94°C 1150 Sáenz et al.,
ACGCTCAGTGGAACGAAAAC 1 min, 60°C 1 min, 72°C 1 2004
min), 72°C 7 min
blaVIM GATGGTGTTTGGTCGCATA 94°C 10 min, 30 cycles 390 Dallenne et
CGAATGCGCAGCACCAG (94°C 40s, 55°C 40s, 72°C 1 al., 2010
min), 72°C 7 min
blaNDM-1 GCTTTGGCGATCTGGTTTTC 94°C 10 min, 36 cycles 621 Poirel et al.,
CGGAATGGCTCATCACGATC (94°C 30s, 52°C 40s, 72°C 2011
50 s), 72°C 5 min
blaOXA-48 TTGGTGGCATCGATTATCGG 96°C 5 min, 35 cycles (96°C 743 Poirel et al.,
GAGCACTTCTTTTGTGATGGC 1 min, 61°C 1 min, 72°C 2 2004
min), 72°C 10 min
blaIMP GGAATAGAGTGGCTTAAYTCTC 94°C 5 min, 36 cycles (94°C 188 Ellington et
CCAAACYACTASGTTATCTa 30s, 52°C 40s, 72°C 50 s), al., 2007
72°C 5 min
blaKPC GTATCGCCGTCTAGTTCTGC 638
GGTCGTGTTTCCCTTTAGCC 94°C 5 min, 25 cycles (94°C Hong et al.,
30s, 50°C 30s, 72°C 1 min), 2012
blaIMI TGC GGTCGATTGGAGATAAA 72°C 7min 399
CGATTCTTGAAGCTTCTGCG
a
Y = C or T , S = G or C
81
Tableau 17 : Description des amorces utilisées pour la détection des gènes codant la résistance
aux antibiotiques et leurs conditions d’amplification
Taille du
Conditions
Gène Amorces (5’ - 3’) fragment Réferences
d’amplification
(bp)
tetA GTAATTCTGAGCACTGTCGC 95°C 5 min, 25 cycles 937
CTGCCTGGACAACATTGCTT (94°C 30s, 62°C 30s,
72°C 45s), 72°C 7min Guardabassi
tetB CTCAGTATTCCAGCCTTTG 95°C 5 min, 25 cycles 416 et al., 2000
CTAAGCACTTGTCTCCTGTT (95°C 30s, 57°C 30s,
72°C 20s), 72°C 7min
tetC TCTAACAATGCGCTCATCGT 95°C 5 min, 25 cycles 570 Sáenz et al.,
GGTTGAAGGCTCTCAAGGGC (94°C 30s, 62°C 30s, 2004
72°C 45s), 72°C 7min
sul1 TGGTGACGGTGTTCGGCATTC 94°C 5 min, 30 cycles 789 Mazel et al.,
GCGAGGGTTTCCGAGAAGGTG (94°C 30s, 63°C 30s, 2000
72°C 1 min), 72°C 8
min
sul2 CGGCATCGTCAACATAACC 94°C 5 min, 30 cycles 722 Maynard et
GTGTGCGGATGAAGTCAG (94°C 30s, 50°C 30s, al., 2003
72°C 90 s), 72°C 8 min
sul3 GAGCAAGATTTTTGGAATCG 94°C 5 min, 30 cycles 789 Perreten and
CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA (94°C 1 min, 51°C 1 boerlin, 2003
min, 72°C 1 min), 72°C
5 min
qnrA AGAGGATTTCTCACGCCAGG 95°C 10 min, 35 cycles 580 Cattoir et al.,
TGCCAGGCACAGATCTTGAC (95°C 1 min, 54°C 1 2007
min, 72°C 1 min), 72°C
10 min
qnrB GATCGTGAAAGCCAGAAAG 95°C 10 min, 32 cycles 469 Gay et al.,
ACGATGCCTGGTAGTTGTCC (94°C 45s, 54°C 45s, 2006
72°C 60s), 72°C 10 min
qnrS GCAAGTTCATTGAACAGGGT 95°C 10 min, 35 cycles 428 Cattoir et al.,
TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG (95°C 1 min, 54°C 1 2007
min, 72°C 1 min), 72°C
10 min
aac(6’)-Ib TTGCGATGCTCTATGAGTGGCA 95°C 5 min, 34 cycles 482 Park et al.,
CTCGAATGCCTGGCGTGTTT (94°C 45s, 55°C 45s, 2006
72°C 45s), 72°C 7 min
qepA GCACGTCCAGCAGCGGGTAG 96°C 5 min, 30 cycles 199 Yamane et al.,
CTTCCTGCCCGAGTATCGTG (96°C 1 min, 60°C 1 2008
min, 72°C 1 min), 72°C
5 min
82
2.4.2.3. Recherche d'intégrons et caractérisation de la région conservée 3’(qacΔE-sul1)

Les intégrons de classe 1 et 2 ont été étudiés pour tous les isolats d'E. coli par PCR comme
indiqué précédemment (Mazel et al., 2000). Pour les isolats int1 positifs, la région 3' classique
(qacΔE-sul1) de l'intégron de classe 1 a également été détectée par PCR (Sáenz et al., 2004).
Les amorces des gènes, les conditions d’amplification ainsi que la taille des fragments sont
représentées dans le Tableau18.
Tableau18 : Séquences nucléotidiques des amorces de PCR et conditions d’amplification des

gènes codant pour les intégrons et de la région conservée(qacΔE-sul1)
Taille des
Gène Amorces (5’ - 3’) Conditions d’amplification fragments Références
(pb)
int1 GGGTCAAGGATCTGGATTTCG 95°C 5 min, 30 cycles (94°C 483 Mazel et al.,
ACATGGGTGTAAATCATCGTC 30s, 62°C 30s, 72°C 1 min), 2000
int2 CACGGATATGCGACAAAAAGGT 72°C 5 min 788
GTAGCAAACGAGTGACGAAATG
qacΔE- GGCTGGCTTTTTCTTGTTATCG 94°C 5 min, 30 cycles (94°C 1125 Sáenz et al.,
sul1 GCGAGGGTTTCCGAGAAGGTG 30s, 63°C 30s, 72°C 1 min), 2004
72°C 8 min
83
Résultats et Discussion
Chapitre I :
Sélection et caractérisation des souches d’Enterococcus

bactériocinogènes à partir de fèces de lapins
Chapitre I : Sélection et caractérisation des souches
Ce chapitre a fait l’objet d’une publication au Journal of Applied Microbiology
Lengliz, S., Abbassi, M. S., Rehaiem, A., Ben Chehida, N., and Najar, T. (2021).
Characterization of bacteriocinogenic Enterococcus isolates from wild and laboratory rabbits
for the selection of autochthonous probiotic strains in Tunisia. Journal of applied
microbiology, 131(3), 1474–1486. https://doi.org/10.1111/jam.15047
I. Caractérisation des entérocoques bactériocinogènes

1. Isolement et caractérisation morphologique et biochimiques des isolats
Une collection de 108 isolats d’entérocoques a été sélectionnée à partir de matières fécales
de 50 lapins (52 isolats à partir de lapins de laboratoire et 56 isolats à partir de lapins sauvages).
Les isolats sélectionnés ont présenté des colonies typiques du genre Enterococcus de 2 à 3mm.
En observation microscopique, les souches se présentent sous forme de cocci à Gram positif.
Elles sont catalase négatives et oxydase positives.
1.1. Détection de l’activité inhibitrice des entérocoques par la méthode des stries
Tous les isolats ont été testés pour leurs activités antibactériennes. La détection de l’activité
inhibitrice a été réalisée par la méthode de la diffusion sur milieu gélosé ce qui permet de
sélectionner les isolats producteurs de substance antibactérienne, une capacité qui joue un rôle
important dans la compétitivité de certains isolats d’Enterococcus dans différentes niches
écologiques spécifiques. Le test d’antagonisme a été réalisé contre huit souches pathogènes.
Parmi les 108 isolats, 43 (39.8%) montrent une activité antimicrobienne contre au moins une
des souches indicatrices (Tableau 19). La majorité des isolats sont capables d’inhiber E.
faecalis. Parmi les 43 isolats, vingt d’entre eux sont capables d’inhiber L. monocytogenes
(Figure 6). P. larvae, B. subtilis et S. aureus sont respectivement inhibées par 15 (34,9%), 3
(6,9%) et 6 (17,64%) isolats. Il faut souligner que l'inhibition n'a été observée que vis-à-vis des
souches à Gram positif principalement L. monocytogenes, S. aureus, B. subtilis, E. faecalis et
l'agent causal de la loque américaine P. larvae et que nous n’avons enregistré aucune inhibition
contre E. coli et Salmonella.
Dans notre étude, P. larvae a été fortement inhibée par 15 isolats (34,9%), alors que S. aureus
l’a été par 6 isolats (2 E. faecium, 3 E. faecalis et un E. durans) (Figure 5).
84
Tableau 19: Origine, identification et caractéristiques phénotypiques et génotypiques des 43 isolats d'entérocoques bactériocinogènes.
Isolats / Spectre Gènes Gènes de Profil de Test Test Test Test
Identification
Origine* d’inhibition d’enterocine virulence résistance Gélatinase Protéase DNAse Hemolyse
Ent A37 / W E. faecium E. faecalis++ entP gelE,ace,cob, Ery - - - α
cpd,ccf
Ent A38 / W E. faecalis++ entB gelE, ace, cob, Ery - - - α
cpd, ccf
Ent A39 / W E. faecalis++ entA ccf Ery - - - ϒ
Ent A44 / W L. mono++, entA gelE, ace,cob, _ - - - α
E. faecalis++ cpd, ccf
Ent A46 / W E. faecalis+ entB gelE, ace, cob, _ ++ + - α
cpd, ccf
Ent L34 / W E. faecalis+, entA, entP gelE, cob, ccf Ery, Amp ++ + - α
B. larvae++
Ent L36 / W E. faecalis+ entA Esp, cpd, ccf Amp, Tet - - - α
Ent L37/ W E. faecalis+ entA Hyl, esp, cpd, ccf Amp, Tet - - - α
Ent SB32 / W L.mono+++, entA, entP cpd Tet - - - ϒ
E.faecalis+,
B. larvae+++
Ent SB33 / W L.mono++, entA, entP esp, gelE, ace, Tet - - - ϒ
E.faecalis++, cob, cpd, ccf
S.aureus++,
B. larvae+++
Ent SB38 / W E.faecalis++, B. entP gelE, ace, cob, Ery - - - α
larvae+++ cpd, ccf
Ent SB40 / W E.faecalis++, entA, entB esp, gelE, ace, Ery, Van - - - α
S.aureus+ cpd, ccf
Ent SB46 / W E.faecalis++ entA esp, gelE, ace, _ - - - α
cob, cpd
Ent S3/ L E. faecalis L.mono++, entB, entP efa, gelE, ace, Amp, Lin, Tet, - - - ϒ
cob, cpd, ccf van, Ery
Ent S4/ L L.mono++, entA, entB, efa, gelE, ace, Amp, Tet, Van, - - - ϒ
B. larvae+ entP cob, cpd, ccf Ery
Ent S9/ L L.mono+, entB Hyl, esp, gelE, Amp, Tet, Ery, - - - β
ace, cylLL/S, cpd, Lin (I)
ccf
Ent S17/ L L. mono+, ND gelE, ace, cob, Ery, Amp, Tet, + + - ϒ
B. subtlis+ cpd, ccf Str, Lin
85
Ent S20/ L L. mono+, ND gelE, ace, cylLL/S, Amp, Tet, Van, - - - β

E.faecalis+, cpd, ccf Ery
B. subtlis+
Ent S22/ L L. mono+, entB Hyl, esp, gelE, Amp, Tet, Van - - - β
ace, cylLL/S, cpd,
ccf
Ent S23/ L E. faecalis++, S. entA, entP gelE, ace, cylLL/S, Amp, Van + + + ϒ
aureus+++ cpd, ccf
Ent S25/ L L. mono+, entP Hyl, esp, gelE, Ery, Amp, Van - - + β
E. faecalis+, ace, cylLS, cpd,
ccf
Ent A40 / W L. mono+, EntP gelE, ace, cob, Ery - - - α
ccf
Ent A45 / W L.mono++, entA, entP gelE,cob,cpd,ccf Ery + + - α
E.faecalis++,
EntL13/ L L.mono+, entB cob, cpd, ccf Amp,Tet,Van, - - - α
Tec
EntL17/ L L. mono+, entB cob, cpd, ccf Amp,Gen,Tet, - - - α
E. faecalis+, Van, Tec
EntL42/ W E. faecalis+, EntA, entP gelE,cob, ccf Ery,Amp,Van ++ + - α
B. larvae+
EntL44 / W L. mono++, entP gelE, cob, cpd, Amp, Van, Tec + + - α
E. faecalis++, B. ccf
larvae+++
EntL46 / W E. faecalis+, entA, entP gelE, cob, cpd, Ery, Amp + + - α
B. larvae++ ccf
EntSB43 / W E. faecalis+, ND gelE, cob, cpd, Ery - + + α
B. larvae+++ ccf
EntSB44 / W E. faecalis++, S. entP gelE, cob, cpd Ery, Tet - + + α
aureus+,
B. larvae+++
EntSB49/ W L. mono++, entB efa, gelE, cpd, - - - - ϒ
ccf
EntS1/ L B. larvae++ entB, entP ND - - - - α
EntS13/ L S. aureus+ entA, entB hyl, gelE, agg, Amp, Van, Tec + + - α
ace, cob, cpd
86
EntS16/ L B. larvae++ entP gelE, agg, ace, Ery, Amp, Lin, - - - α

cob, cpd Tet, Van
EntA32 / W E. durans L.mono++++, entA, entB, ND - - - - ϒ
E.faecalis+++, entP
S.aureus++,
B. larvae++++
EntL32 / W L. mono+++, entA, entB, ND Amp - - - ϒ
E. faecalis++, B. entP
larvae+++
EntA48 / W E. gallinarum L. mono++, entB Cpd, ccf - - - - ϒ
E. faecalis+,
EntSB35 / W E. faecalis++ entB efa, gelE, ace, - - - + α
cob cpd, ccf
EntSB39 / W E. faecalis++ entB gelE, ace, cob, - - +/- + α
cpd, ccf
EntSB42 / W L. mono++, entB, entP efa, gelE, cob, Ery, Str + - - ϒ
E. faecalis+ cpd, ccf
EntSB47 / W L. mono+++, entB Efa, ccf Tet - - - ϒ
E. faecalis+++,
B. larvae+
EntS18/ L E. avium L. mono++, entP ND Amp, Van + + + α
B. subtlis+
EntL25/ L E. faecalis++ entP Cob Amp, Tet,Van, - - - α
Tec
*L : Lapin de laboratoire, W : Lapin sauvage. L. mono : Listeria monocitogenes. Van: Vancomycine, Amp: Ampicilline, Tet: Tétracycline, Tec:
Teicoplanine, Str: streptomycine, Ery: erythromycine, Lin: linézolide, Gen: Gentamicine.
Diamètre d’inhibition : ++++ = zone claire>15 mm, +++ = zone claire 10–15 mm, ++:5–9·9 mm, + = zone claire 1–4·99 mm
ND : Non détecté.
87
Figure 5 : Inhibition de L. monocytogenes et Staphylococcus aureus par les isolats

d’entérocoques.
1.2. Détermination de la nature protéique de la substance inhibitrice
La nature de la substance inhibitrice, secrétée par les bactéries montrant un pouvoir

antibactérien par le test d’antagonisme direct, a été déterminée par la méthode de diffusion en
puits. 93% des isolats qui ont montré une bonne activité inhibitrice surtout contre Listeria
monocytogenes manifestent cette activité par leur surnageant de culture. Après le traitement
de ces surnageants par la protéinase K l’activité antibactérienne a été perdue ce qui prouve
la nature protéique de la substance responsable de cette inhibition (Figure 6). Par contre elle
persiste dans les surnageants neutralisés par le NaOH, ce qui prouve que l’inhibition
des bactéries indicatrices est bien due à une substance protéique et non à l’acidité du surnageant
(Dal Bello et al., 2010).
Figure 6 : Inhibition de L. monocytogenes par les surnageants de la souche d’entérocoque

EntSB49
88
2. Identification des isolats bactériocinogènes
L’identification des isolats bactériocinogènes a été réalisée par la méthode biochimique en

utilisant les galeries Api strep. et confirmée par la méthode moléculaire.
Les 43 isolats bactériocinogènes ont été identifiés comme E. faecalis (21), E. faecium (13), E.
gallinarum (5), E. durans (2) et E. avium (2). Ces espèces sont les espèces d'entérocoques
communes identifiées dans le tractus gastro-intestinal des mammifères et ont été rapportées
comme productrices de bactériocines par plusieurs études. On remarque la dominance des deux
espèces E. faecalis et E. faecium dans le tractus intestinal des lapins.
3. Détection des gènes codant pour les bactériocines
Neuf gènes codant les entérocines (entA, B, P, Q, L50A/B, AS‐48, 31, X, 1071A/B) ont été
étudiés. Seuls entP, entB et entA ont été détectés dans 22 (51,2%), 17 (40%) et 14 (32,5%)
isolats, respectivement (Tableau 19, Figure7). Certains isolats d’entérocoques abritaient plus
d'un gène, les trois combinaisons suivantes ont été détectées : entA + entP (7 isolats.), entP+
entB (3 isolats), entA+ entB+ entP (3 isolats). Les gènes codant les six autres entérocines n’ont
été détectés chez aucun des isolats bactériocinogènes. Trois isolats identifiés E. faecalis ne
présentent aucun des gènes étudiés, deux isolats isolés des fèces de lapins de laboratoire et un
des lapins sauvages. Il est probable que l’acquisition par les entérocoques des gènes de
bactériocine diffère selon la complexité des gènes testés et la distribution des espèces
d’entérocoques testés. Ces trois E. faecalis ne possèdent pas un spectre d’inhibition large ni une
forte intensité d’activité inhibitrice sur milieu gélosé.
Figure 7 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification des gènes entA
et entB des souches d’Enterococcus. M-marqueur de taille 100pb, 1-E. faecium EntA37/W, 2-
E. faecium EntSB38/W, 3-E. faecium EntA39/W, 4-E. faecium EntSB33/W, 5-E. faecalis
EntS23/L, 6- E. faecalis EntS1/L, 7-E. faecium EntA38/W et 8- E. faecalis EntL13/L.
89
4. Caractérisation de l’innocuité des souches bactériocinogènes
La plupart des souches d’entérocoques font partie intégrale de la flore commensale chez
l’homme et les animaux et jouent un rôle important dans l’équilibre intestinal par leur action
contre les bactéries pathogènes. Cependant pour être utilisées comme probiotiques, les
entérocoques doivent être évalués pour leur potentiel d’innocuité. Pour cela une caractérisation
de la sensibilité aux antibiotiques, une caractérisation phénotypique et une caractérisation
génotypique des facteurs de virulence pour les 43 isolats bactériocinogènes ont été établies.
4.1. Sensibilité aux antibiotiques
Les 43 isolats bactériocinogènes ont été testés pour leur sensibilité à 11 antibiotiques par la
méthode de diffusion en milieu MH gélosé. Des taux élevés de résistance ont été détectés pour
l'érythromycine (20 isolats soit 46,5%), la tétracycline (15 isolats,35%) et l'ampicilline (20
isolats, 46,5%). La résistance à la vancomycine a été détectée dans 15 isolats, associée à la
teicoplanine dans six isolats. Une résistance au linézolide a été observée dans deux isolats
d'E. faecalis et un isolat d'E. faecalis était de sensibilité intermédiaire. Vingt-six isolats étaient
multirésistants, en particulier contre l'ampicilline, la tétracycline et l'érythromycine (Tableau
19). Selon les profils de résistance, dix isolats étaient résistants à deux familles d'antibiotiques.
Neuf isolats (21%) étaient sensibles à tous les antibiotiques testés.
4.2. Facteurs de virulence : Détection des activités gélatinase, DNase et hémolyse
La gélatinase, la DNase et la β-hémolyse ont été détectées respectivement dans 10,7 et 4 isolats.
Deux isolats étaient simultanément producteurs de β-hémolyse et de gélatinase. Un seul isolat
était producteur de gélatinase et de DNase (Figure 8). Et aucun isolat n'était simultanément
producteur de β-hémolyse, de gélatinase et de DNase.
Figure 8 : Les activités gélatinase et α-hémolyse chez les souches d’Enterococcus

(a : activité gélatinase, b : activité α-hémolytique)
90
4.3. Caractérisation moléculaire des gènes de virulence
Trente-sept isolats (86%) abritaient au moins un gène codant pour la virulence. Les gènes
suivants ont été détectés (nombre d'isolats) : hyl (5), esp (8), geIE (30), agg (2), ace (21), efa
(6), CylLL/s (5), cob (26), cpd (32) et ccf (33). Quatre isolats abritaient à la fois les gènes hyl et
esp (un E. faecium, trois E. faecalis) connus comme marqueurs spécifiques d'E. faecium
résistant à la vancomycine ; cependant, l'isolat d'E. faecium hyl/esp positif était sensible à la
vancomycine. Parmi les 30 isolats gelE positifs (Figure 9), seuls neuf présentaient une activité
de gélatinase et un isolat producteur de gélatinase était dépourvu de ce gène. Les trois gènes
codant pour les phéromones sexuelles cob, cpd et ccf ont été détectés chez 6 E. faecium, 9 isolats
d'E. faecalis et 3 isolats d'E. gallinarum. Le gène efa codant pour l'adhésion à la paroi cellulaire
spécifique d'E. faecalis n'a été trouvé que dans trois isolats d'E. faecalis et trois isolats d'E.
gallinarum (Figure10). Trois E. faecalis, deux E. durans et un E. avium ne portaient aucun gène
de virulence.
Figure 9 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification du gène gelE. M-
marqueur de taille 100pb, 1-E. faecium EntA37/W, 2-E. faecium EntA38/W, 3-E. faecium EntA44/W, 4-E. faecium
EntL34/W, 5-E. faecalis EntS3/L, 6- E. faecalis EntS4/L, 7-E. faecalis EntS17/L, 8- E. faecalis EntA40/L,9-E.
faecalis EntL42/W, 10-E. faecalis EntS13/L et 11-E. durans EntA32/W.
Figure 10 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification du gène efaAfs.
M-marqueur de taille 100pb, 1-E. faecalis EntS3/L, 2-E. faecium EntA38/W, 3-E. faecalis EntS4/L, 4-E. faecalis
EntSB49/W, 5-E. gallinarum EntSB35/W, 6- E. faecalis EntS3/L et 7-E. durans EntA32/W.
91
5. Sélection des souches probiotiques à partir des souches bactériocinogènes
5.1. Détection de l’activité protéase
L’une des caractéristiques pour évaluer une souche bactérienne en tant que probiotique est sa
capacité à dégrader la caséine. Cette activité est importante en industrie alimentaire mais aussi
révélatrice des souches entérocoques probiotiques. Dans notre étude, 13 souches sont
protéolytiques (Figure 11).
Figure 11 : Photo montrant l’activité protéolytique chez une souche d’Enterococcus

EntA45/W (nommée S5)
5.2. Croissance à différentes valeurs de pH
La capacité des souches à croitre et se développer à différentes valeurs de pH a été évaluée et a

montré que les souches d’Enterococcus ont pu survivre à pH 5 mais la croissance est bien
meilleure sur les milieux MRS (témoin, pH 6,5), à pH 7 et à pH 8. Aucune croissance n’a été
observée à pH 4.
La densité optique demeure stable pendant 28 heures.
5.3. Tolérance au suc gastrique et aux sels biliaires
L’aptitude des cinq isolats (E. durans EntA32, E. durans EntL32, E. faecium EntSB32, E.
gallinarum EntSB47 et E. faecalis EntSB49) à survivre en présence de MRS à pH 2,5 pendant
3 heures a montré que EntSB32, EntSB47, EntA32 et EntL32 ont survécu efficacement sans
perte importante de la viabilité cellulaire. Cependant, à partir de 30 min, la viabilité cellulaire
d'EntSB49 a été fortement diminuée et limitée jusqu'à une heure. De plus, tous les isolats ont
pu se développer dans 40% de bile.
92
5.4. Coexistence
Ce test a été réalisé pour évaluer la possibilité d'utiliser des souches comme probiotiques. Parmi
les cinq isolats, seuls E. gallinarum EntSB47 et E. durans EntA32 étaient compatibles dans ce
test de coexistence et peuvent par ailleurs survivre et coexister ensemble.
6. Discussion
Cette étude visait à caractériser et à sélectionner des isolats d'Enterococcus pouvant être utilisés
comme probiotiques chez le lapin. Plusieurs souches ont été montrées comme probiotiques pour
divers animaux tels que les volailles (Abd El-Hack et al., 2020). Il est préférable que les
bactéries probiotiques soient autochtones pour l'hôte auquel ils seront administrés (Cunha et
al., 2017 ; Pogány Simonová et al., 2020). Par conséquent, nous avons collecté 50 échantillons
de fèces de lapins de deux groupes : des lapins sauvages et des lapins de laboratoire qui sont
soumis à des conditions de vie, d'alimentation et d'environnement différentes. Nous avons
collecté 108 isolats qui ont été testés pour leur capacité à inhiber huit bactéries pathogènes. La
nature protéique de la substance inhibitrice a été confirmée par le test à la protéinase K.
Quarante-trois isolats ont pu inhiber au moins une des souches indicatrices. L'inhibition n'a été
observée que vis-à-vis des souches à Grampositif, principalement, L. monocytogenes, S. aureus,
B. subtilis, E. faecalis et l'agent causal de la loque américaine P. larvae. Le spectre d'inhibition
est commun aux entérocoques bactériocinogènes rapportés dans de nombreuses études (Klibi
et al., 2012 ; Jaouani et al., 2014). En effet, la bactériocine cible la paroi cellulaire du
peptidoglycane des bactéries en formant des pores conduisant à la lyse des cellules bactériennes.
Par conséquent, les bactéries à Gram positif sont plus sensibles à la bactériocine que les
bactéries à Gram négatif qui sont protégées par la membrane externe. Dans notre étude, P.
larvae a été fortement inhibée par 15 isolats (34,9%), ce résultat a été observé aussi par Jaouani
et al., (2014) et Yoshiyama et al., (2013). De plus, dernièrement, il a été prouvé par Gyurova
et al., (2021) que E. durans possède une forte activité inhibitrice probiotique contre P. larvae,
en raison de la production de bactériocines qui agissent directement sur la bactérie P. larvae en
induisant sa mort. Par ailleurs la souche a un potentiel probiotique prouvé pour une utilisation
comme alternative aux antibiotiques, qui sont le seul moyen jusqu'à présent de traiter les ruches
affectées. On a aussi observé une inhibition de S. aureus par 6 isolats (2 E. faecium, 3 E. faecalis
et une E. durans). En 2003, Heikkila¨ et Saris ont aussi montré le pouvoir d’E. faecalis isolé du
lait maternel à détruire S. aureus, connu comme agent causal des infections mammaires
maternelles et infections néonatales.
93
Cette propriété d'inhibition des bactéries pathogènes est aujourd'hui d'un grand intérêt
notamment pour lutter contre les pathogènes d'origine alimentaire et les bactéries résistantes
aux antibiotiques (Hashempour-Baltork et al., 2019). Les isolats bactériocinogènes ont été
identifiés comme E. faecalis (21), E. faecium (13), E. gallinarum (5), E. durans (2) et E. avium
(2). On remarque la dominance des deux espèces E. faecalis et E. faecium dans le tractus
intestinal des lapins. Ces résultats sont similaires à plusieurs études antérieures (Linaje et al.,
2004). Ces espèces sont les espèces d'entérocoques communes identifiées dans le tractus gastro-
intestinal des mammifères et ont été montrées comme productrices de bactériocines par
plusieurs études (Poeta et al., 2007b ; Klibi et al., 2012 ; Jaouani et al., 2014). D'autres souches
appartenant à différentes espèces d'entérocoques telles que E. durans et E. mundtii ont été
signalées comme productrices efficaces de bactériocines. Il semble que la production
de bactériocines soit une propriété importante pour que les entérocoques persistent et survivent
dans différentes niches écologiques (Ness et al., 2014).
Il est aussi intéressant de noter que les souches d’Enterococcus faecium, gallinarum et durans
ont été toutes isolées à partir de lapins sauvages alors que la majorité d’E. faecalis et E. avium
ont été isolées de lapins de laboratoire. Ceci pourrait être dû à la différence entre les régimes
alimentaires des deux groupes de lapins. La différence de prédominance des espèces
d’Enterococcus dans le tractus digestif intestinal a été rapportée chez différentes espèces
animales (Ben Said et al., 2019 ; Zaheer et al., 2020), cependant la différence entre lapins
sauvages et celles d’élevage n’a jamais été décrite à ce jour.
Au moins dix entérocines (entA, entB, entP, entQ, entL50A/B, entAS‐48, ent31, entX,
ent1071A /B) ont été rapportées chez les entérocoques. Cependant, entA, entB et entP sont
jusqu'à présent principalement signalés comme dominants (Poeta et al., 2007b ; Klibi et al.,
2012 ; Jaouani et al., 2014). Nos résultats sont en accord avec ces études antérieures. En effet,
entP, entB et entA ont été détectés respectivement, dans 22, 17 et 14 isolats. Les autres gènes
étudiés n'ont pas été détectés. Fait intéressant, cinq et trois isolats abritaient respectivement
deux et trois gènes codants pour les entérocines. Il est intéressant de noter que l'occurrence de
plusieurs gènes de production de bactériocines n'est pas corrélée au pouvoir d'inhibition des
isolats multi producteurs correspondants. Poeta et al., (2007b) et Brandão et al., (2010) ont
signalé des gènes de bactériocine silencieux et un pouvoir d'inhibition élevé d'isolats contenant
un seul gène plutôt que ceux hébergeant plusieurs gènes.
94
Afin d'évaluer la capacité de nos isolats bactériocinogènes, nous avons étudié plusieurs
caractères considérés comme des paramètres clés pour sélectionner des isolats candidats
probiotiques. Les entérocoques sont des colonisateurs habituels du tractus gastro-intestinal
de l'homme et des animaux ; cependant, ils sont apparus depuis 30 ans en tant qu'agents
pathogènes nosocomiaux importants et responsables d'infections communautaires (Arias et al.,
2012). Le gène gelE code pour la gélatinase qui peut diminuer la capacité de la défense du
système immunitaire, ce gène a été détecté dans 30 isolats. Cependant, seulement neuf ont
montré une activité phénotypique de la gélatinase lors de nos expériences. Cela pourrait
s'expliquer par la sensibilité du test expérimentale qui réduit notre capacité à observer l'activité
de la gélatinase ou bien que le gène gelE est silencieux ou exprimé à un faible niveau. Par
contre, un isolat producteur de gélatinase ne possédait pas le gène gelE, ce qui peut s'expliquer
par un autre mécanisme moléculaire d'hydrolyse de la gélatine (Kiruthiga et al., 2020).
Une activité de bêta-hémolyse a été observée dans quatre isolats d'E. faecalis qui contenaient
le gène cylLL/s. La cytolysine cylLL/s est associée à la virulence et le lien positif entre la
production de cytolysine et la mortalité a été confirmé dans un modèle de maladie animale (Day
et al., 2003). La cytolysine CylLL/s est une bactériocine unique car elle présente à la fois des
activités hémolytiques et bactéricides (Booth et al., 1996 ; De Vuyest et al., 2003 ; Nes et al.,
2007). Les isolats restants étaient soit α-hémolytiques, soit non hémolytiques. Sept isolats
étaient producteurs de DNase. L'activité DNase est également considérée comme un trait
pathogène qui contribue à la virulence de nombreuses bactéries ainsi que des entérocoques
(Dworniczek et al., 2014).
Le gène codant pour la protéine de surface des entérocoques (esp) a été détecté dans cinq isolats
d'E. faecium et trois isolats d'E. faecalis. L’Esp joue un rôle dans l'adhérence des cellules des
entérocoques aux tissus de l'hôte, favorise la colonisation et aide à échapper au système
immunitaire de l'hôte (Shankar et al., 1999 ; Toledo-Arana et al., 2001). La hyaluronidase (hyl)
est considérée comme une toxine qui joue un rôle dans la destruction des mucopolysaccharides
du tissu conjonctif et du cartilage conduisant à la propagation des entérocoques au sein des
tissus de l'hôte. Le gène hyl est principalement associé au génome des souches d'E. faecium,
mais il est rarement trouvé chez E. faecalis ; ceci s’oppose à notre découverte où le gène hyl est
trouvé dans un isolat d'E. faecium et trois E. faecalis. Les gènes hyl et esp étaient présents
simultanément dans trois isolats d'E. faecalis et un isolat d'E. faecium. En effet, les deux gènes
coexistent principalement dans les souches d'E. faecium résistantes à la vancomycine. Ceci est
signalé comme un trait spécifique d'E. faecium nosocomial résistant à la vancomycine dans le
95
monde (Freitas et al., 2010). Cette corrélation a également été trouvée chez deux isolats
d'E. faecalis résistants à la vancomycine de notre collection. Il est fort probable que les gènes
codant pour la résistance à la vancomycine soient localisés sur le même plasmide hébergeant
les gènes hyl et esp (Klare et al., 2005 ; Freitas et al., 2010).
Le gène ace codant pour la protéine de liaison au collagène joue un rôle important dans
la colonisation des cellules hôtes. De plus, les isolats d'entérocoques contenant le gène ace se
sont avérés positivement corrélés avec la formation de biofilm (Cui et al., 2020). En fait,
la capacité à former un biofilm sur les surfaces abiotiques est considérée comme une propriété
de virulence importante des entérocoques leur permettant d'échapper au système immunitaire
et à l'action des antibiotiques (Donelli et Guaglianone, 2004). Ce gène a été trouvé dans huit
isolats d'E. faecium, dix E. faecalis et deux E. gallinarum. Ceci est en corrélation avec d'autres
études rapportant une fréquence élevée de substance d’agrégation dans les isolats
d'entérocoques d'origines diverses (Iweriebor et al., 2015 ; Jung et al., 2017 ; Wei et al., 2017).
Certains entérocoques possèdent un mécanisme d'acquisition plasmidique basé sur la présence

de gènes codant des phéromones sexuelles. Ces mécanismes améliorent l'acquisition
de plasmides répondant aux phéromones sexuelles qui pourraient abriter des gènes de résistance
aux antibiotiques et/ou des déterminants de la virulence (Graham et al., 2020). Dans nos isolats,
la majorité abritait l'un de ces gènes. De plus, les trois gènes coexistaient chez sept E. faecalis,
six E. faecium et trois E. gallinarum. Les Phéromones ainsi que leurs plasmides sont d'abord
caractérisés chez E. faecalis ; cependant, il semble qu'ils puissent également se présenter chez
d'autres espèces d'Enterococcus (Chajecka-Wierzchowska et al., 2016).
L'antigène de l'endocardite (efa) chez les entérocoques, est une protéine codée par le gène efaAfs
chez les souches d'E. faecalis. Ce gène joue un rôle important dans l'adhérence des entérocoques
aux cellules hôtes et il a été suggéré qu'il joue un rôle dans l'adhérence pour l'endocardite et a
un effet sur la pathogénicité dans le modèle animal. Ce gène a été trouvé chez trois souches
d’E. faecalis et trois souches d’E. gallinarum. Bien que ce gène soit fortement présent chez
E. faecalis, il semble qu'il puisse être présent chez d'autres espèces d'Enterococcus (Eaton et
Gasson, 2001).
Le gène agg codant pour la substance d'agrégation (AS) qui joue un rôle dans l'adhérence des
entérocoques aux tissus des cellules hôtes et probablement dans l'invasion des cellules
humaines. La substance AS est codée par un plasmide sensible aux phéromones et induit par
conséquent l'agglutination des cellules d'E. faecalis, améliorant le transfert de plasmide entre
96
les cellules (Graham et al., 2020). Le gène agg n'a été détecté que dans deux isolats d'E. faecalis,
tous deux hébergeant le gène gelE. Une association qui pourrait favoriser la formation
de biofilm.
Les entérocoques se sont révélés être des agents pathogènes nosocomiaux importants, en
particulier E. faecalis et E. faecium, non seulement pour leur pouvoir pathogène, mais aussi
pour leur capacité à acquérir des gènes et des éléments génétiques mobiles codant pour la
résistance aux antibiotiques. E. faecium a été considéré par l'OMS (2017) comme un agent
pathogène nosocomial important avec une haute priorité pour évaluer sa sensibilité aux
antibiotiques, principalement à l'ampicilline et aux glycopeptides. La résistance aux
aminosides, aux glycopeptides, aux tétracyclines et au linézolide est principalement due à des
transposons ou des plasmides nés et facilement transférés entre les espèces d'entérocoques et
d'autres bactéries à Gram positif telles que les staphylocoques et les streptocoques. Dix isolats
étaient sensibles à tous les antibiotiques testés. Une résistance à l'ampicilline a été observée
chez 20 souches dont 15 E. faecalis, trois E. faecium et deux E. avium. Chez les entérocoques,
la résistance à l'ampicilline est principalement due à des mutations de PBP5 pour E. faecium et
PBP4 pour E. faecalis. La résistance à l'ampicilline est principalement rapportée dans
E. faecium d'origine clinique que dans les isolats cliniques d'E. faecalis (Klibi et al., 2008 ;
Montealegre et al., 2016). Une résistance à l'ampicilline a été signalée à des fréquences
modérées chez les entérocoques provenant d'animaux d’élevage, d'animaux de compagnie ou
d'animaux sauvages ainsi que chez ceux provenant de la viande (Torres et al., 2018). Silva et
al., (2010), ont signalé un faible taux de résistance à l'ampicilline dans les isolats d'Enterococcus
provenant de lapins sauvages en Europe, cependant, selon Ben Said, et al., (2019), la résistance
à l'ampicilline n'a pas été détectée chez E. faecalis et E. hirae isolés de lapins sauvages en
Tunisie. Des taux de résistance modérés sont également observés pour l'érythromycine et la
tétracycline. Les deux phénotypes sont associés aux entérocoques d'origines diverses, en
particulier chez les isolats cliniques. Les résistances à la tétracycline et à l'érythromycine sont
principalement localisées sur des transposons ou des plasmides qui favorisent leur
dissémination horizontale entre les isolats d'entérocoques (Abbassi et al., 2007a). Une
résistance élevée à la gentamicine et à la streptomycine a été observée respectivement chez un
isolat E. faecalis et un isolat E. gallinarum. Chez les isolats cliniques humains, des taux élevés
de résistance élevée aux aminosides sont fréquemment rapportés (Abbassi et al., 2007a).
Cependant, des taux modérés ont été signalés dans des isolats d'animaux et de produits
alimentaires d'origine animale (Torres et al., 2018).
97
La résistance aux glycopeptides (vancomycine et teicoplanine) est apparue depuis 1986 et est
maintenant de plus en plus signalée dans le monde, non seulement chez les entérocoques
cliniques mais aussi chez divers animaux d'élevage, animaux sauvages et environnements
aquatiques (eaux de surface, eaux usées, station d'épuration). A notre surprise, 15 isolats
de notre collection étaient résistants à la vancomycine (12 E. faecalis, deux E. avium et un
E. faecium). Chez les isolats cliniques d'entérocoques, la résistance aux glycopeptides est
principalement signalée chez E. faecium plutôt que chez E. faecalis et reste rare chez d'autres
espèces (Vehreschild et al., 2019). L'utilisation de l'avoparcine dans l'élevage a été incriminée
en tant qu'activateur sélectif de l'émergence de la résistance aux glycopeptides chez les animaux
destinés à l'alimentation en Europe ; cependant, depuis 1995, son utilisation chez les animaux
d’élevage a été progressivement interdite par de nombreux pays. Chez les isolats cliniques, la
résistance à la vancomycine est principalement associée à la résistance à l'ampicilline.
Conformément à nos résultats, tous les isolats résistants à la vancomycine étaient également
résistants à l'ampicilline. Il a été supposé que l'acquisition de la résistance à l'ampicilline par
mutation ponctuelle dans PLP5 (PLP5' pour E. faecium) et (PLP4 pour E. faecalis) est la
première étape de l'adaptation nosocomiale de tels isolats en milieu hospitalier suivie
de l'acquisition de gènes transférables codant à la résistance à la vancomycine. Les gènes de la
résistance à la vancomycine sont généralement associés à d'autres gènes résistants tels que ceux
codant la résistance à l'érythromycine et/ou la résistance à la tétracycline sur des éléments
génétiques mobiles. Une résistance à l'érythromycine et à la tétracycline a été observée dans
la majorité de nos isolats résistants à la vancomycine. La détermination des gènes codant pour
la résistance à la vancomycine a été réalisée, en effet les gènes VanA et VanB ont été étudiés
par PCR mais nous n'avons pas réussi à trouver les deux gènes. Nous avions prévu d'étudier
tous les gènes acquis codant pour la résistance à la vancomycine tels que les phénotypes
Van A, B, L, M, N, D, E, G (Ahmed and Baptiste 2018) dans le deuxième chapitre.
Une découverte inattendue a également été observée au niveau de cette étude, à savoir la
résistance au linézolide dans trois isolats d'E. faecalis non sensibles (deux totalement résistants
et un moyennement sensible) provenant de lapins de laboratoire. Le linézolide, appartenant à la
famille des oxazolidinones, est utilisé depuis 2000 pour traiter les entérocoques résistants à la
vancomycine et tout de suite après, des isolats résistants au linézolide sont apparus. Cette
résistance a d'abord été liée à des mutations chromosomiques des protéines ribosomiques
(Elghaieb et al., 2020) et récemment d'autres mécanismes acquis ont été rapportés [enzymes
méthyl transférase, protection ribosomique par les protéines OptrA et PoxtA]. Freitas et al.,
98
2017 et Elghaieb et al., 2019 ont récemment décrit les premiers isolats d'E. faecalis et
E. faecium résistants au linézolide en Tunisie et en Afrique. Cette résistance est codée par les
gènes optrA et poxtA (Elghaieb et al., 2019). De ce fait, ces résultats sont très importants
et inquiétants. Les lapins sauvages et de laboratoire ne sont pas traités avec des antibiotiques ;
par conséquent, les taux de résistance signalés n'ont pas pu être liés à l'utilisation d'antibiotiques.
D'autres hypothèses expliqueraient ce phénomène comme le contact de lapins avec des humains
à proximité ou des aliments consommés contenant des entérocoques résistants ou des éléments
génétiques mobiles codant pour la résistance aux antibiotiques.
Selon nos résultats, cinq isolats ont été sélectionnés pour évaluer certains caractères utilisés
pour la sélection des souches probiotiques candidates : EntSB32, EntA32, EntL32, EntSB49 et
EntSB47. Ces cinq souches ont survécu à pH 5 et leur croissance a été améliorée à pH 6,5 ; 7 et
8. Quatre d'entre eux ont survécu à pH 2,5 pendant 3 heures d'incubation et tolèrent les sels
biliaires (40%). Ceci indique que les quatre isolats (EntA32, EntL32, EntSB32, EntSB47) ont
une aptitude à survivre lors du passage du tube digestif supérieur vers l'intestin ; cela représente
une exigence cruciale de la sélection des probiotiques. Les souches probiotiques peuvent être
administrées seules ou en combinaison avec d'autres probiotiques pour obtenir un effet additif.
Dans nos isolats, seuls EntSB47 et EntA32 étaient compatibles dans le test de coexistence
(E. gallinarum EntSB47 et E. durans EntA32).
En conclusion et selon les caractéristiques étudiées, E. durans EntA32 semble être le meilleur
candidat pour être utilisé comme probiotique. Ceci pour les raisons suivantes : Cette souche
était exempte de tout facteur de virulence, présentait un bon pouvoir d'inhibition contre quatre
agents pathogènes et abritait trois gènes d'entérocine. De plus, E. durans EntA32 tolère l'acidité
du tractus gastro-intestinal.
99
Chapitre II :
Evaluation de l’antibiorésistance des entérocoques et
Escherichia coli isolés de lapins
Chapitre II : Evaluation de l’antibiorésistance
1. Résistance aux antibiotiques chez les entérocoques
Cette partie a fait l’objet d’une publication au Journal of Applied Microbology
Lengliz, S., Cheriet, S., Raddaoui, A., Klibi, N., Ben Chehida, N., Najar, T., & Abbassi,
M. S. (2022). Species distribution and genes encoding antimicrobial resistance in Enterococcus
spp. isolates from rabbits residing in diverse ecosystems: a new reservoir of linezolid and
vancomycin resistance. Journal of applied microbiology, 10.1111/jam.15461. Advance online
publication. https://doi.org/10.1111/jam.15461
1.1. Nombre total des souches et identification
Au total 126 échantillons fécaux ont été collectés pour l’étude de l’antibiorésistance chez les
entérocoques. Une collection de 97 isolats d’Enterococcus a été obtenue : 54 à partir de 60
lapins de ferme, 28 à partir de 35 lapins sauvages et 15 à partir de 31 lapins de laboratoire.
Après identification des isolats, les espèces les plus dominantes sont E. faecium (n = 44 ; 45%)
et E. faecalis (n = 37 ; 38,1%), suivies de E. gallinarum (n = 7 ;7,2%), E. durans (n = 5 ; 5,1%)
et E. avium (n = 4 ; 4,1%). E. faecalis est significativement associée aux lapins sauvages et ceux
de la ferme, mais non détectée chez les lapins de laboratoire où l’espèce prédominante est
E. faecium (13/15).
Parmi les 97 isolats d’entérocoques, des taux de résistance élevés ont été observés à la
tétracycline (n = 59 ; 60,8%), à l’érythromycine (n = 42 ; 43,3%), à l’ampicilline (n = 29 ;
29,9%), à la streptomycine (n = 26 ; 26,8%) et à la vancomycine (n = 21 ; 21,6%).
Des fréquences de résistance significativement plus faibles ont été observées pour la
teicoplanine (n = 9 ; 9,2%), le linézolide (n = 8 ; 8,2%), la ciprofloxacine (n = 7 ; 7,2 %) et la
gentamicine (résistance de haut niveau) (n = 1 ; 1%) (Tableau 20). La résistance à l'ampicilline
était prédominante parmi les isolats d'E. faecium, étant observée dans 18 (62%) des 29 isolats
résistants à l'ampicilline. Parmi eux, 13 étaient des lapins de laboratoire. Une résistance à la
vancomycine a été observée chez 15 E. faecium (4 lapins d'élevage, 2 lapins sauvages, 9 lapins
de laboratoire), quatre isolats d'E. faecalis (3 lapins d'élevage, 1 lapin sauvage) et deux isolats
d'E. avium (2 lapins de laboratoire). De plus, le phénotype VanA (co-résistance à la teicoplanine
et à la vancomycine) a été observé dans neuf isolats (2 E. faecalis, 6 E. faecium, 1 E. avium).
Sur les huit isolats résistants au linézolide, sept étaient E. faecium (3 lapins de ferme, 4 lapins
100
de laboratoire) et un était E. faecalis (1 lapin de ferme). Les analyses des profils de résistance
parmi les 97 isolats montrent que 31 (31,9%) étaient MDR, avec ce phénotype présenté
respectivement, par 11 (73,3%) et 19 (35,1%) lapins de laboratoire et de ferme, alors qu'un seul
(3,5%) E. faecium d'un lapin sauvage a été défini comme MDR. Des phénotypes MDR ont été
observés dans 20 (45,4%) isolats d'E. faecium, dix (27%) isolats d'E. faecalis et un isolat d'E.
avium (25%) (p < 0,05), respectivement (Tableau 20).
101
Tableau 20 : Distribution des espèces d’Enterococcus isolés de fèces de lapins de trois origines et taux de résistance aux antibiotiques
Antimicrobien* Nombre des Origines des lapins**
isolats Ferme (N=54; 55.6% ) Sauvages (N=28; 28.8%) Laboratoire (N=15;
résistants n (%**) n (%**) 15.4%)
(%*) n (%**)
E. faecalis E. faecium E. gallinarum E. durans E. avium E. faecalis E. faecium E. gallinarum E.durans E. faecium E. avium
24 (44.4%) 23 (42.6%) 2 (3.7%) 3 (5.5%) 2 (3.7%) 13 (46.4%) 8 (28.5%) 5 (17.8%) 2(7.1%) 13 (86.6%) 2 (13.3%)
Ampicilline# 29 (29.9) 5 (20.8) 2 (8.7) 0 0 1 (50) 3 (23) 3 (37.5) 0 1 (50) 13 (100) 1 (50)
Tétracycline ## 59 (60.8) 19 (79.1) 19 (42.6) 2 (100) 1 (33.3) 2 (100) 4 (30.5) 1 (12.5) 1 (20) 0 9 (69.2) 1 (50)
Erythromycine 42 (43.3) 9 (37.5) 11 (47.8) 1 (50) 0 0 7 (53.8) 6 (75) 1 (20) 0 7 (53.8) 0
Gentamicine 1 (1) 1 (4.1) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Streptomycine† 26 (26.8) 13 (54.1) 11 (47.8) 0 0 0 0 0 1 (20) 0 1 (7.7%) 0
Vancomycine†† 21 (21.6) 3 (12.5) 4 (17.4) 0 0 0 1 (7.7) 2 (25) 0 0 9 (69.2) 2 (100)
Teicoplanine 9 (9.2) 2 (8.3) 2 (8.7) 0 0 0 0 1 (12.5) 0 0 3 (23) 1 (50)
Linézolide 8 (8.2) 1 (4.1) 3 (13) 0 0 0 0 0 0 0 4 (30.7) 0
Ciprofloxacine 7 (7.2) 3 (12.5) 3 (13) 0 1 (33.3) 0 0 0 0 0 0 0
MDR 31 (31.9) 10 (41.6) 9 (39.1) 0 0 .0 0 1 (12.5) 0 0 10 (76.9) 1 (50)
*Pourcentages de la résistance parmi les 97 isolats d’entérocoques

**Pourcentages des isolats résistants entre chaque espèce appartenant à chaque origine de lapins
#
Résistance à l’ampicilline est significativement associée aux isolats de lapins de laboratoire (P < 0.05)
##
Résistance à la tétracycline est significativement associée aux isolats de lapins de ferme et de laboratoire (P < 0.05)
†
Résistance à la streptomycine est significativement associée aux isolats de lapins de ferme (P < 0.05)
††
Résistance à la vancomycine est significativement associée aux isolats de lapins de laboratoire (P < 0.05)
102
1.3. Gènes codant pour la résistance aux antibiotiques chez les entérocoques
Vingt et un isolats étaient résistants à la vancomycine ; cependant, seulement un isolat

d'E. faecalis (lapin de ferme) et un isolat d'E. faecium (lapin de laboratoire) portaient le gène
vanA, qui présentaient tous deux le phénotype VanA (Tableau 21) (Figure 12). Aucun des huit
isolats résistants au linézolide ne contenait le gène optrA.
Figure 12 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification du gène VanA.
M- marqueur de taille 100pb,1- E. faecium S25, 2- E. faecalis S66 3-E. faecalis S26, 4-E.
faecium S92
Parmi les 59 isolats résistants à la tétracycline, tetM, tetO et tetL étaient présents,
respectivement dans 48 (81,3%), sept (11,8%) et un isolat (1,7%) ; cependant, les gènes tetS et
tetK n'ont pas été détectés. Sept isolats ne contenaient aucun des gènes tet analysés. La
combinaison des gènes tetM+tetO et tetM+tetL a été détectée respectivement dans quatre et un
isolat (Tableau 21), (Figure 13). Parmi les 42 isolats résistants à l'érythromycine, les gènes
msr(A) et ermB ont été détectés, respectivement dans 14 et 13 isolats, dont deux contenaient
les deux gènes. Seize isolats ne contenaient aucun des gènes analysés codant pour la résistance
à l'érythromycine. Le gène Int-Tn a été détecté dans 27 (27,8%) isolats dont neuf (33,3%) co-
hébergeaient à la fois les gènes tetM et ermB, 16 (59,2%) étaient associés au gène tetM
uniquement, un co-hébergé tetO et ermB et un contenait uniquement le gène ermB (Figure 14).
Une résistance élevée à la streptomycine a été démontrée par 26 isolats, avec ant(6)-Ia présent
dans seulement trois isolats (2 E. faecium et 1 E. faecalis). Une résistance élevée à la
gentamicine, associée au gène aac(6')-Ie-aph(2")-Ia, a été détectée dans un isolat d'E. faecium
provenant d'un lapin de laboratoire (Tableau 21).
103
Figure 13 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification du gène tetM.
M- marqueur de taille 100pb,1- E. faecium S25, 2- E. faecalis S41, 3-E. faecalis S26, 4-E.
faecium S49, 5-E. faecalisS53, 6-E. faecalis S61,7- E. faecalis S62, 8-E. faecalis S63, 9- E.
faecalis S64, 10-E. faecium S74, 11-E. gallinarum S82, 12-E. faecium S83, 13-E. faecium S84.
Figure 14 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification du gène ermB.
M- marqueur de taille 100pb, 1- E. faecalis S54, 2-E. faecalis S55, 3-E. faecalis S56, 4-E.
faecalis S57, 5- E. faecalis S63, 6- E. faecalis S64, 7-E. faecium S70, 8-E. faecium S73, 9-E.
faecium S74, 10- E. faecium S86 et 11- E. faecium S87.
Figure 15 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification du gène Int-
Tn916/1545.
104
Tableau 21 : Caractéristiques phénotypiques et génotypiques des 97 isolats d’Enterococcus à

partir des fèces de lapins
Gènes de
Isolat Espèce Profile de résistance Gènes de résistance / Int-Tn
virulence
Lapins de ferme
S1 E. faecium - - -
S2 E. faecalis Amp,Str,Tet tetM/Int-Tn -
S3 E. faecium Ery,Str,Tet tetM/- -
S4 E. faecalis Ery,Str,Tet tetM/Int-Tn -
S5 E. faecium Str,Tet tetM/- -
S6 E. faecium - -/- -
S7 E. faecalis Ery, Str,Tet tetM/Int-Tn -
S8 E. faecium Ery,Str, Tet,Van tetM,ermB,ant(6)-Ia/Int-Tn -
S9 E. faecium Tet -/- -
S10 E. faecium Ery,Tet tetM,ermB/- -
S11 E. faecalis Str,Tet tetM/Int-Tn -
S12 E. faecalis - -/- -
S14 E. faecium Cip,Tet -/- -
S15 E. gallinarum Tet tetM/- -
S16 E. faecium Amp,Ery -/- -
S17 E. durans Cip -/- -
S18 E. durans - -/- -
S19 E. faecalis Str,Tet tetM/Int-Tn -
S20 E. faecalis Cip,Tet -/- -
S21 E. faecalis Cip -/- -
S22 E. faecalis Str -/- -
S23 E. faecium Tet /- -
S24 E. avium Amp,Tet -/- -
S25 E. faecium Str,Tet,Van,Tec,Lin tetM,ermB/- -
S26 E. faecalis Ery,Van,Tec,Lin msr(A),vanA/- -
S27 E. faecium Amp,Ery,Van,Tec,Lin -/- -
S28 E. faecalis Cip,Van,Tec -/ -
S29 E. faecium Tet tetM/Int-Tn -
S30 E. faecalis Amp,Ery,Str,Gen,Tet - -
S31 E. faecalis Amp,Ery,Tet tetM/Int-Tn -
S32 E. faecalis Amp,Str,Tet tetM/- -
S33 E. faecium Ery,Str,Tet tetM/Int-Tn -
S35 E. faecium Ery,Str,Tet tetM,ermB/Int-Tn -
S36 E. faecalis Tet tetM/Int-Tn -
S38 E. faecium Cip,Ery,Str,Tet tetM,ermB/Int-Tn -
S39 E. avium Tet tetM,tetO/- -
S40 E. faecium Ery,Str,Tet,Lin -/- -
S41 E. faecalis Ery,Tet tetM,ermB/Int-Tn -
S42 E. gallinarum Ery,Tet tetM,tetO,ermB/Int-Tn -
S43 E. faecium Cip,Str,Tet -/- -
105
S45 E. faecalis Amp,Tet tetM/- -

S46 E. faecalis Str,Tet tetM/- -
S47 E. durans Tet tetM/- -
S48 E. faecium Ery,Tet -/- -
S49 E. faecium Ery,Tet tetM,tetO,ermB/Int-Tn -
S50 E. faecalis Ery,Str,Tet,Van tetM/Int-Tn -
S51 E. faecalis Str,Tet tetM/- -
S52 E. faecium Tet tetO/- -
S53 E. faecalis Ery,Str,Tet tetM,ermB/Int-Tn -
S54 E. faecalis Ery,Str,Tet tetO,ermB,ant(6)-Ia/Int-Tn -
Lapins sauvages
S55 E. faecalis Ery -/- -
S56 E. faecalis Ery msr(A)/- -
S57 E. faecalis Ery msr(A)/- -
S60 E. faecalis Amp, Ery msr(A)/- -
S61 E. faecalis Amp,Tet tetM,tetO/- esp
S62 E. faecalis Amp,Tet tetM,tetO/- hyl,esp
S63 E. faecalis Tet tetM/- -
S64 E. faecalis Tet tetM/- esp
S65 E. faecalis Ery -/- -
S66 E. faecalis Ery,Van -/- esp
S67 E. faecalis Ery -/- esp
S68 E. faecium Ery msr(A)/- -
S69 E. faecium Ery -/- -
S70 E. faecium Amp,Ery,Van msr(A)/- -
S71 E. faecium Amp,Van,Tec -/- -
S72 E. faecium Amp,Ery msr(A)/- -
S73 E. faecium Ery ermB/Int-Tn -
S74 E. faecium Ery,Tet tetM,ermB,msr(A)/Int-Tn -
S76 E. durans - -/- -
S77 E. durans Amp -/- -
S78 E. gallinarum - -/- -
S81 E. gallinarum Ery,Str -/- -
S82 E. gallinarum Tet tetM/- -
Lapins de laboratoire
S83 E. faecium Amp,Ery,Tet,Van,Lin tetM,msr(A)/- -
S84 E. faecium Amp, Ery,Tet,Van tetM,msr(A)/ Int-Tn -
S85 E. faecium Amp,Ery,Tet,LinI tetM,msr(A)/Int-Tn hyl,esp
S86 E. faecium Amp,Ery,Tet,Str,Lin tetM,tetL,ermB,msr(A),ant(6)Ia/ -
Int-Tn
S87 E. faecium Amp,Ery,Tet,Van tetM,msr(A) /- -
S88 E. faecium Amp,Tet,Van tetM/- hyl,esp
S89 E. faecium Amp,Van -/- -
S90 E. faecium Amp, Ery,Van msr(A)/- hyl,esp
106
S91 E. faecium Amp,Tet,Van,Tec tetM/Int-Tn -

S92 E. faecium Amp,Ge,Tet,Van,Tec tetM,vanA,aac(6')-aph(2")/- -
S94 E. faecium Amp,Van,Tec -/- hyl
S95 E. faecium Amp,Ery,Tet,Van,Lin tetM/Int-Tn -
S96 E. avium Amp,Van -/- -
S97 E. avium Amp,Tet,Van,Tec tetM/- -
Amp: ampicilline, Str: streptomycine, Tet: tetracycline, Ery: erythromycine, Van:

vancomycine, Lin: linézolide, Ge: gentamicine, Cip: ciprofloxacine
107
Tableau 22 : Les gènes codant l’antibiorésistance (AR) détectés chez les 97 isolats
d’Enterococcus
Phénotype de l’AR
(n des isolats Gène d’AR Isolats positifs Espèces (nbre d’isolats)
résistants)
Tétracycline (59) : tetM 48 E. faecalis (20), E. faecium
E. faecalis (23), E. (22), E. gallinarum (3), E.
faecium (29), E. avium (2), E. durans (1)
gallinarum (3), E. tetO 7 E. faecalis (3), E. faecium (2),
avium (3), E. durans E. gallinarum (1), E. avium (1)
(1) tetL 1 E. faecium (1)
tetS 0 -
tetK 0 -
Erythromycine (42): ermB 13 E. faecalis (3), E. faecium (9),

E. faecalis (16), E. E. gallinarum (1)
faecium (24), E. ermA 0 -
gallinarum (2) ermC 0 -
msr(A) 14 E. faecalis (4), E. faecium (10)
mef(A/E) 0 -
Gentamicine (1): aac(6’)-Ia-aph(2")-Ie 1 E. faecium (1)

E. faecium (1)
Streptomycine (26): ant(6)-Ia 3 E. faecalis (1), E. faecium (2)

E. faecalis (13), E.
faecium (12), E.
gallinarum (1)
Vancomycine* (21): vanA 2 E. faecalis (1), E. faecium (1)

E. faecalis (4), E. vanB 0 -
faecium (15), E.
avium (2)
Linézolide (8): E. optrA 0 -
faecalis (1), E.
faecium (7
* En association avec la résistance à la teicoplanine (phénotype VanA) chez 9 isolats (2 E.

faecalis, 6 E. faecium, 1 E. avium).
1.4. Gènes de virulence
Les gènes de virulence hyl et esp ont été détectés dans cinq et huit isolats, respectivement, et
étaient présents simultanément dans trois isolats d'E. faecium et un isolat d'E. faecalis. Deux
isolats d'E. faecium résistants à l'ampicilline/vancomycine ont co-hébergé les gènes hyl et esp.
Ces gènes, seuls et concomitamment, n'ont été détectés que chez les lapins sauvages (n = 5) et
de laboratoire (n = 4) (Tableau 21).
108
1.5. Discussion
Le but de l'étude suivante est de mettre en évidence l'importance potentielle des lapins en tant
que réservoir d’entérocoques résistants aux antibiotiques. Plusieurs études ont déjà rapporté des
taux élevés de résistance aux antibiotiques chez les isolats d'entérobactéries, d'entérocoques et
de staphylocoques provenant de bétail et d'animaux sauvages (Gilbert et al., 2021). Cependant,
à ce jour, les systèmes de production de lapins et les lapins sauvages ont rarement été étudiés
en ce qui concerne l'épidémiologie de la résistance aux antibiotiques (Poeta et al., 2007 ; Ben
Said et al., 2019).
Sur 126 échantillons fécaux, 97 étaient associés à la présence d'espèces d'entérocoques, à savoir
E. faecium (45,3%), E. faecalis (38,1%), E. gallinarum (7,2%), E. durans (5,1%) et E. avium
(4,1%). La prédominance d'E. faecium et d'E. faecalis reflète les rapports précédents associés
aux entérocoques fécaux de lapins d'élevage et sauvages (Linaje et al., 2004 ; Silva et al., 2010),
en plus d'autres animaux d'élevage et sauvages (Grassoti et al., 2018, Elghaieb et al., 2019). À
l'inverse, une étude récente de Ben Said et al., (2019) rapporte la prédominance d'E. hirae
(19/36) et E. faecalis (17/36) parmi 36 entérocoques fécaux de lapins sauvages en Tunisie. De
même, Zaheer et al., (2020) ont trouvé une prédominance des espèces d'E. hirae dans les
systèmes de production bovine (parcs d'engraissement) (92% des échantillons de matières
fécales bovines) à divers endroits en Alberta, au Canada. Dans la présente étude, malgré le
faible nombre d'isolats prélevés sur des lapins de laboratoire, aucun isolat d'E. faecalis n'a été
récupéré, E. faecium est le prédominant dans ce groupe d’échantillons (13/15 isolats). Chez les
animaux et les humains, il a été démontré que la distribution des espèces d'entérocoques et leurs
proportions associées dans différentes niches écologiques varient en fonction du type d'hôte, de
l'âge, du régime alimentaire, des problèmes de santé accompagnants et du traitement
antimicrobien administré antérieurement (Lebreton et al., 2014). En conséquence, nous
émettons l'hypothèse que, sur la base de nos résultats, les conditions relatives à l'élevage en
laboratoire peuvent favoriser la prolifération d'E. faecium par rapport à E. faecalis. Dans
l'ensemble, la prédominance d'E. faecalis et d'E. faecium chez le lapin, qui représentent les
espèces les plus pertinentes sur le plan clinique humaine, fournit des preuves d'une transmission
potentielle à l'Homme, soulignant ainsi la pertinence de l'étude présentée, c'est-à-dire la
transmission de l’antibiorésistance à l'Homme, comme il peut être utilisé pour attribuer
l'étendue de la transmission microbienne le long du continuum agriculture-environnement-
publique.
109
Les résultats des analyses de la sensibilité aux antibiotiques ont montré des taux élevés de
résistance à la tétracycline, à l'érythromycine et à la streptomycine (résistance de haut niveau).
Des résultats similaires ont déjà été rapportés pour des isolats d'entérocoques, et en particulier
E. faecium, provenant d'humains, d'animaux, de produits alimentaires d'origine animale et de
l'environnement naturel (Abbassi et al., 2007a ; Poeta et al., 2007 ; Aslam et al., 2012 ; Ben
Said et al., 2016, 2019 ; Elghaieb et al., 2019 ; Dos Santos et al., 2021). Cependant, l'un des
résultats notables de la présente étude était les taux relativement élevés de la résistance à
l'ampicilline (29,9%), à la vancomycine (21,6%) et au linézolide (8,2%).
La résistance à l'ampicilline est principalement associée aux isolats d'E. faecium provenant des
milieux cliniques ; cependant, ceci a également été signalé à de faibles taux chez le bétail et les
animaux sauvages (Grassotti et al., 2018 ; Elghaieb et al., 2019). Cette résistance, bien
qu'observée dans les isolats d'entérocoques des trois groupes de lapins, était significativement
associée aux isolats d'entérocoques de lapins de laboratoire et également associés à la résistance
à la vancomycine. Ce résultat peut être attendu puisque la résistance à l'ampicilline représente
un trait commun parmi les isolats humains et animaux d'E. faecium résistants à la vancomycine
(Ahmed et Baptiste, 2018 ; Torres et al., 2018). En Tunisie, des entérocoques résistants à la
vancomycine avec des phénotypes acquis ont été détectés pour la première fois en 2003
(Abbassi et al., 2007b) parmi deux isolats cliniques d'E. faecium vanA-positifs étroitement liés.
La détection reste faible en milieu clinique (Dziri et al., 2019) ; cependant, des isolats
d'E. faecalis résistants à la vancomycine (vanA/vanB) ont été détectés chez des oiseaux
sauvages (Ben Yahia et al., 2018). Dans la présente étude, une résistance à la vancomycine a
été détectée chez 15 isolats d'E. faecium, quatre E. faecalis et deux isolats d'E. avium au niveau
des trois groupes de lapins. À notre connaissance, il s'agit de la première description de
résistance à la vancomycine chez des isolats d'E. faecium et E. avium provenant d'animaux en
Tunisie. Parmi nos isolats résistants à la vancomycine, un seul E. faecalis (lapin d'élevage) et
un E. faecium (lapin de laboratoire) contenaient le gène vanA. En effet, seuls les gènes vanA et
vanB ont été étudiés parmi les huit gènes van acquis rapportés (vanA, vanB, vanD, vanE, vanG,
vanL, vanM, vanN) (Ahmed et Baptiste, 2018) suggérant l'occurrence possible d'au moins un
des gènes non étudiés, comme indiqué précédemment (Dos Santos et al., 2021).
Cette étude est parmi les premières en Tunisie à rapporter la présence d'isolats d'entérocoques
résistants au linézolide chez le lapin. La résistance au linézolide a été signalée pour la première
fois en Tunisie (et en Afrique) parmi des isolats d'E. faecalis provenant d'eaux usées (Freitas et
al., 2017), suivi par les isolats d'E. faecalis et d'E. faecium provenant de bétail, de produits
110
alimentaires d'origine animale (Elghaieb et al., 2019, 2020), et de patients neutropéniques

(Raddaoui et al., 2020). Les gènes plasmidiques optrA et poxtA étaient les principaux
mécanismes de résistance au linézolide chez ces souches, en plus des mutations ponctuelles
dans les protéines ribosomiques. Le gène optrA n'a pas été détecté parmi les huit isolats
résistants au linézolide de la présente étude ; par conséquent, d'autres mécanismes de résistance
sont probablement impliqués. Il semble probable que diverses niches écologiques
d'entérocoques résistants au linézolide existent en Tunisie, y compris des lapins en contact étroit
de l'Homme (aucune résistance au linézolide n'a été détectée chez les lapins sauvages). Nous
considérons qu'il est important de noter que l'association de la résistance à l'ampicilline, à la
streptomycine et à la tétracycline avec les lapins de laboratoire est probablement liée, en partie,
à la prédominance des isolats d'E. faecium chez ces lapins, car les espèces d'E. faecium sont
bien connues pour présenter des niveaux de résistance aux antibiotiques plus élevés que les
autres espèces.
Le déterminant le plus fréquemment détecté pour les entérocoques résistants à la tétracycline

dans des contextes cliniques et non cliniques est tetM (protection ribosomique) (Molechan et
al., 2019), ceci corrobore les résultats de la présente étude. Dans l'ensemble, tetM, tetO
(protection ribosomique) et tetL (pompes à efflux) étaient présents, respectivement, dans
81,3%, 11,8% et 1,7% des isolats résistants à la tétracycline. Les gènes tetM et dans une
moindre mesure tetO semblent être relativement omniprésents parmi toutes les espèces
d'entérocoques collectées, reflétant probablement la dissémination généralisée de ces gènes au
sein des espèces d'entérocoques. Fait intéressant, comme rapporté par plusieurs études
(Chajęcka-Wierzchowska et al., 2020 ; Dos Santos et al., 2021), la présence de plus d'un gène
tet par souche a été détectée dans cinq isolats de cette étude, mettant ainsi en évidence la
propension d'Enterococcus spp. d'acquérir plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques. De
plus, la prédominance des gènes codant pour la protection ribosomique par opposition à ceux
codant pour les pompes à efflux pourrait être considérée comme un mécanisme représentatif de
la gymnastique moléculaire, c'est-à-dire la réduction de la consommation d'énergie, renforçant
ainsi leur dominance dans le microbiote de l'hôte et leur persistance dans l'environnement.
Plusieurs gènes et mécanismes moléculaires codant pour la résistance à l'érythromycine ont été
décrits dans la littérature scientifique, les enzymes méthylases et les pompes à efflux étant les
plus fréquemment identifiées chez les entérocoques (Roberts, 2005). Les gènes msr codent pour
l'efflux de macrolides et de streptogramine B (Roberts, 2005). Le gène msrA, considéré comme
un gène intrinsèque d'E. faecium, a été détecté dans 14 isolats (4 E. faecalis, 10 E. faecium). Ce
111
gène a été fréquemment rapporté chez les entérocoques, bien que dépendant de l'origine
(Roberts, 2005). Cependant, chez les entérocoques, les gènes ermB et ermA, codant pour les
enzymes méthylases, sont jusqu'à présent les déterminants les plus prédominants codant pour
la résistance aux macrolides-lincosamides-steptogramine B (Abbassi et al., 2007a ; Di Cesare
et al., 2014 ; Chajęcka-Wierzchowska et al., 2020). Dans la présente étude, ermA n'a pas été
détecté ; cependant, ermB a été détecté dans 13 isolats. Cette prévalence du gène ermB a déjà
été associée à une variété d'éléments génétiques mobiles, y compris des éléments conjugatifs
intégratifs situés sur les chromosomes et les plasmides tels que les transposons hautement
conjugatifs Tn916/1545, Tn2010 et Tn5385 (Roberts et Mullany 2011). La famille
Tn916/Tn1545 possède une large gamme d'hôtes comprenant 36 genres appartenant à six
phylums (Roberts et Mullany, 2011). Chez les streptocoques, les pneumocoques et les
entérocoques, cette famille de transposons est responsable d'une grande partie de la résistance
aux antibiotiques, notamment la résistance aux tétracyclines (tetM), aux macrolides, aux
lincosamides et aux streptogramines (ermB), à la kanamycine (aphA-3) et au mercure
(merRAB) (Roberts et Mullany, 2011). Par conséquent, leur présence dans les isolats
d'entérocoques opportunistes commensaux représente une importante source de préoccupation
en raison de leur potentiel de transfert horizontal à d'autres bactéries pathogènes, par exemple
Staphylococcus aureus. Dans la présente étude, 27 (27,8%) isolats positifs pour l'Int-Tn ont été
détectés (associés à Tn916 ou Tn1545), dont neuf (33,3%) co-hébergeaient à la fois les gènes
tetM et ermB et 16 (59,2%) seulement portant le gène tetM. Par conséquent, le gène ermB
(présent dans 13 isolats) était probablement associé aux transposons de la famille Tn916/1545
dans 11 isolats ; cependant, les deux isolats ermB-positifs qui étaient négatifs pour In-Tn
peuvent héberger d'autres supports pour les gènes ermB tels que le transposon de type Tn2010
ou Tn5397 (Agersø et al., 2006 ; Zhou et al., 2014). L'existence possible de transposons de type
Tn5397 pourrait également porter le gène tetM dans l'Int-Tn-free comme précédemment
rapporté par Agersø et al., (2006) ; cependant, cette hypothèse nécessite une enquête plus
approfondie. Le rôle dans la propagation horizontale de l’antibiorésistance et la complexité des
événements génétiques à l'origine de l'évolution de ces transposons, et leur détection dans les
collections d'entérocoques devraient être systématiquement étudiés dans les futures études
moléculaires épidémiologiques.
1.6. Conclusion
La présente étude rapporte des taux élevés de résistance aux antibiotiques cliniquement
pertinents chez les isolats d'entérocoques fécaux provenant de lapins dans trois écosystèmes
112
différents. ermB/msrA et tetM représentaient les déterminants les plus importants codant
respectivement pour l'érythromycine et la résistance à la tétracycline. Les transposons de la
famille Tn916/1545 ont probablement un rôle important dans la dissémination de ces gènes. La
surveillance continue de la résistance phénotypique et la caractérisation moléculaire du
résistome des entérocoques sont cruciales pour contrôler la transmission probable de la
résistance aux antibiotiques chez et depuis les lapins captifs et sauvages.
113
2. Résistance aux antibiotiques chez Escherichia coli
Cette partie a fait l’objet d’une publication au Letters in Applied Microbology
Lengliz, S., Benlabidi, S., Raddaoui, A., Cheriet, S., Ben Chehida, N., Najar, T., and
Abbassi, M. S. (2021). High occurrence of carbapenem-resistant Escherichia coli isolates from
healthy rabbits (Oryctolagus cuniculus) : first report of blaIMI and blaVIM type genes from
livestock in Tunisia. Letters in Applied Microbiology, 73(6), 708–717.
https://doi.org/10.1111/lam.13558
2.1. Nombre total de souches et identification
Trente-neuf isolats d’E. coli ont été isolés et étudiés (Tableau 30) : 22 isolées du milieu TBX,
7 isolats du milieu TBX /CTX et 10 isolats à partir du milieu TBX/IMP. Les isolats ont été
identifiés par les tests classiques et par galerie Api 20.
L’étude de la sensibilité aux antibiotiques a montré que sur les 39 isolats d’E. coli collectés 6
(15%) sont sensibles à tous les antibiotiques testés. Dix-neuf (48,7%) isolats sont résistants à la
tétracycline, 17 (43,58%) résistants à l’amoxicilline, 13 (33,33%) à l’acide nalidixique et 11
(28,2%) au triméthoprime/sulfamethoxazole (Tableau 23).
Aucun des sept isolats collectés à partir de milieux contenant du céfotaxime n’est producteur
de bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE), par contre on a pu détecter des isolats présentant
une sensibilité réduite à au moins un des trois disques de carbapénème testés (méropénème,
imipénème, ertapénème).
La production de carbapénèmase a été étudiée par différents tests :
2.2.1. Test de Hodge modifié
Parmi les 10 isolats collectés de TBX/IMP, deux d’entre eux ont montré un test de Hodge
modifié positif (Figure 16, Tableau 23), indiquant la production d’une carbapénèmase.
114
Figure 16 : Photo montrant le test de Hodge modifié positif pour la souche E. coli IM15
2.2.2. Test EDTA
Parmi les 10 isolats collectés sur le TBX/IMP, six ont montré une augmentation des diamètres
d’inhibition autour du disque Imipenème/EDTA par au moins 5 mm par rapport au disque
d’imipenème ceci indique la production d’une métallocarbapénémase. (Figure 17), (Tableau
23).
Figure 17 : Photo montrant le test EDTA 0.5M positif pour la souche E. coli IM22
2.2.3. Test témocilline
Les isolats montrant un diamètre d’inhibition inférieur à 25 mm pour l’ertapénème ont été testé
par un disque de témocilline pour détecter la production de carbapénémase de classe D. Les 16
isolats testés ont montré une résistance à la témocilline indiquant ainsi la production d’une
carbapénémase de classe D (Tableau 23, Figure 18).
115
Figure 18 : Photo montrant la résistance à la témocilline de la souche E. coli IM20
2.3. Caractérisation moléculaire
2.3.1. Caractérisation des gènes codant les carbapénèmases et les BLSE
Pour comprendre les mécanismes de la résistance aux carbapénèmes dans ces isolats, nous
avons étudié par PCR les gènes les plus pertinents codant pour les carbapénémases. La PCR a
montré le gène blaVIM codant la métallocarbapénémase chez deux isolats, l'un d'eux co-
hébergeait également le blaIMI (Tableau 23). Le reste des gènes de carbapénémase n'ont pas été
détectés malgré plusieurs répétitions de PCR des gènes correspondants.
Les gènes codant la production de BLSE et de céphalosporinase plasmidique n’ont pas été
également détectés.
Figure 19 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% du produit d’amplification du gène blaVIM

chez la souche E. coli IM2.
116
Figure 20 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% du produit d’amplification du gène blaIMI

chez la souche E. coli IM2.
2.3.2. Caractérisation des gènes codant la résistance à la tétracycline, aux sulfamides et

aux fluoroquinolones
La résistance à la tétracycline a été observée dans 19 isolats et tetA, tetB et tetC ont été détectés
dans 8, 2 et 5 isolats, respectivement, il est intéressant de noter qu'un isolat abritait ces trois
gènes. Neuf isolats résistants à la tétracycline restants étaient exempts de ces trois gènes. Dans
neuf isolats résistants au triméthoprimes-sulfonamides, sul1 et sul2 ont été détectés dans cinq
et un isolats, respectivement. Le sul3 n’a pas été signalé dans les entérobactéries résistantes au
triméthoprime-sulfaméthoxazole. La résistance aux quinolones à médiation plasmidique a été
détectée dans deux isolats, avec les gènes qnrS et aac(6')-Ib-cr parmi 13 isolats résistants à
l'acide nalidixique.
2.3.3. Détection des intégrons
Les intégrons sont des plateformes de collecte et d'expression de gènes codant pour la résistance
aux antibiotiques. Dans nos isolats, cinq et quatre contenaient respectivement des intégrons de
classe 1 et de classe 2. La région conservée 3' classique (qacΔE-sul1) a été détectée dans tous
les isolats int1-positifs (Tableau 23).
Figure 21 : Electrophorèse sur gel d’agarose à 2% des produits d’amplification des gènes Int1
et Int2 chez les souches TBX.1 : TBX34, 2 : TBX27, 3: TBX21 , 4 : TBX3, 5 : TBX14, 6 :
TBX1, 7 : TBX19, 8 : TBX14, 9 :TBX27, 10 : TBX2, 11 : TBX18, 12 :TBX24, 13 : TBX11,
14 :TBX4 M : marqueur de taille (100pb).
117
Tableau 23 : Caractéristiques phénotypiques et génotypiques de 39 isolats d’E. coli obtenus

de lapins sains.
Détection de carbapénemase
Souches Profile de résistance Gènes/integrons* détectés THM IMI- Test de
EDTA témocilline
TBX34 SXT sul1/int1+ qacΔE-sul1 n.a n.a n.a
TBX21 SXT,TET sul2/- n.a n.a n.a
TBX25 - - n.a n.a n.a
TBX3 TET,SXT,CHL tetC,sul1/int1+qacΔE-sul1 n.a n.a n.a
TBX26 TET tetA/- n.a n.a n.a
TBX4 SXT,NA,TET tetA/- n.a n.a n.a
TBX1 AMX,SXT,KMN,TET,NA,CIP tetB,sul1/int1+qacΔE-sul1 n.a n.a n.a
TBX9 - -/- n.a n.a n.a
TBX27 SXT,TET -/int2 n.a n.a n.a
TBX14 NA,TET tetA,tetC/- n.a n.a n.a
TBX19 SXT,NA,TET -/int1 n.a n.a n.a
TBX2 TET tetA,tetC/- n.a n.a n.a
TBX17 NA -/- n.a n.a n.a
TBX10 - -/- n.a n.a n.a
TBX11 TET,NA,CIP, CHL,KMN tetA,tetB,tetC,qnrS/- n.a n.a n.a
TBX6 - -/- n.a n.a n.a
TBX32 NA -/- n.a n.a n.a
TBX31 - -/- n.a n.a n.a
TBX18 NA,SXT,TET tetA,tetC,sul1/int1+qacΔE- n.a n.a n.a
sul1
TBX24 - - n.a n.a n.a
TBX22 AMX,AMC,IPMI,MEMI,ETPI,TET, tetA,sul1/int1+qacΔE-sul1, - - +
SXT int2
TBX12 TET tetA/- n.a n.a n.a
CTX30 AMX,AMC,CTX,CAZ,MEM,ETP,NA aac(6’)-Ib-cr/- - - +
,SXT,CHL
CTX23 AMX,AMC,CTX,CAZ,ETP -/- - - +
CTX25 AMX,AMC,CAZ,CTX,ETP -/- - - +
CTX17 AMX,AMC,CTX,CAZ,KMN -/- n.a n.a n.a
CTX24 AMX,AMC,CTX,CAZ,FOXI,NA,TET -/- n.a n.a n.a
IM9 AMX,AMC,CTX,CAZ,FOXI,IMPI,ME -/- - + +
M,ETP,TET,NA
IM33 AMX,AMC,CTX,CAZ,FOX,MEM,ET -/- - + +
PI, SXT, KMN
IM2 AMC,AMX,IMI,ETP,MEM,TET blaVIM,blaIMI/- - - +
IM12 AMX,AMCI,MEM,NA,CIP -/int2 + + +
IM26 MEM -/- - - +
IM22 IMPI,MEM,TET,NA -/- - + +
IM20 AMX,AMC,CTX,FOX,MEM,ETP,NA blaVIM/- - + +
IM16 AMX,MEM -/- - + +
IM7 AMX,AMC,MEM,TET -/- - - +
IM15 AMX,MEM,TET,NA,CIP -/int2 + - +
n.a: Non applicable, THM : Test de Hodge modifié , IMI-EDTA : disque d’imipenème +EDTA, AMX: amoxicilline, AMC:
acide amoxicilline-clavulanique, CAZ: ceftazidime, CTX: cefotaxime, FOX: cefoxitine, IMP: impenème, ETP: ertapenème,
MEM: méropenème, NA, acide nalidixique, TET : tetracycline, CIP : ciprofloxacine, SXT : trimethoprime/sulfamethoxazole,
KMN : kanamycine, CHL : chloramphenicole, TBX code : souche isolées à partir de TBX agar sans antibiotique, CTX code :
souches isolées à partir de TBX agar+2 mg/L cefotaxime, IM code : souches isolées à partir de TBX agar+1 mg/L imipenème.
* Chez class 1 integrons la region conservée 3’ (qacΔE-sul1) a été aussi investiguée.
118
2.4. Discussion
Des E. coli résistants aux antibiotiques provenant de volailles et de porcs ont été largement
rapportés ; cependant, rarement signalés chez les lapins (Kylie et al., 2017 ; Zhao et al., 2018 ;
Ben Said et al., 2019). Malgré de nombreuses difficultés, l'élevage de lapins, est une industrie
émergente dans de nombreux pays. Cependant, l'impact des aliments, de l'utilisation des
antibiotiques et des pratiques d'élevage sur l'émergence ou la sélection de bactéries
commensales résistantes aux antibiotiques est largement inconnu ; par conséquent, dans notre
étude, nous avons essayé d'étudier la résistance aux antibiotiques chez E. coli collecté à partir
de fèces de lapins sains et ce pour évaluer l'apparition de phénotypes de résistance aux
antibiotiques et leurs supports génétiques.
D’après les résultats deux souches ont montré un test de Hodge positif et six souches ont produit
une métallo-carbapénémase. De plus, tous étaient résistants à la témocilline et par conséquent
étaient supposés produire une carbapénémase de type D. La discordance entre les trois
méthodes phénotypiques utilisées a déjà été rapportée dans des isolats cliniques
d'entérobactéries (Rodríguez-Lucas et al., 2020 ; Bonnin et al., 2021). Cela a été attribué à
diverses raisons telles que la faible quantité de production de certains carbapénèmes ou au faible
niveau d'hydrolyse des carbapénèmes présentés par d'autres telles que l'OXA-48 (Rodríguez-
Lucas et al., 2020 ; Bonnin et al., 2021). Les variants VIM, en particulier VIM-1, sont
largement trouvés dans les bactéries à Gram négatif cliniques en Italie et en Grèce et sont les
principales métallo-carbapénémases détectées en Tunisie parmi les Pseudomonas aeruginosa
et K. pneumoniae ; cependant, ils sont signalés de manière inquiétante dans E. coli et le
complexe Enterobacter (Dziri et al., 2020). Les carbapénémases IMI typiquement associées au
complexe Enterobacter cloacae, n'ont jamais été rapportées en Tunisie (Madec et al., 2017 ;
Dziri et al., 2020 ; Bonnin et al., 2021).
Dans les produits alimentaires d'origine animale et les élevages, le VIM-1 a déjà été signalé
chez Salmonella Infantis dans les élevages porcins et avicoles, les rongeurs, et le fumier en
Allemagne (Madec et al., 2017) ; tandis que des enzymes IMI-1 ont été signalées chez des
isolats du complexe Enterobacter récupérés de mouton, de poulet et de poisson au Myanmar
(Sugawara et al., 2019) et chez l'isolat d'Enterobacter bugandensis provenant d'échantillons
fécaux de corbeau américain aux États-Unis (Kutilova et al., 2020). A notre connaissance, des
carbapénémases de types IMI et VIM n'ont jamais été rapportées auparavant chez des animaux
dans notre pays (Dziri et al., 2019) et c’est la première fois que des isolats d’E. coli isolés de
119
lapins présentent ces deux carbapénèmases (Fischer et al., 2017). Il faut noter qu'un isolat
abritait à la fois des gènes de type blaIMI et blaVIM, en effet la présence de plus d'un gène codant
pour la carbapénèmase a rarement été rapportée chez les entérobactéries productrices de
carbapénèmase contrairement à leur association commune aux gènes codant pour les BLSE et
pAmpC (Musila et al., 2021). La carbapénémase de classe D OXA48, qui est l'une des
carbapénémases les plus fréquemment détectées chez les isolats cliniques dans notre pays et
dans de nombreux pays méditerranéens, n'a pas été détectée dans nos isolats malgré des résultats
positifs au test à la témocilline. D'autres gènes codant pour cette classe de carbapénèmes
pourraient être hébergés par nos souches comme l'OXA-204 qui est fréquemment rapporté en
Tunisie et dans certains pays méditerranéens (Sghaier et al., 2019). Les isolats résistants aux
carbapénèmes restants dépourvus des gènes de carbapénèmase testés pourraient héberger des
enzymes céphalosporinase avec une faible activité carbapénèmase ou surproduire
constitutivement un AmpC chromosomique. De plus, des changements dans la perméabilité
membranaire dus à la perte ou à la régulation négative des porines sont également probables
(Martínez-Martínez et al., 1999 ; Kim et al., 2013). Ils peuvent aussi simplement disposer
d'autres gènes mineurs de carbapénémases ou d'enzymes spécifiques SHV et CTX-M qui n'ont
pas été évalués dans cette étude, tels que blaGES (Guyane à spectre étendu), blaNMC-A (non
métallo-carbapénémase A), blaSPM (Sao Paulo MBL-1), blaGIM (Allemand imipenemase),
blaSIM (Seoul imipinemase1), blaDIM-1 (Deutch carbapenemase-1), blaKHM-1 (Kyorin University
Hospital MBL-1), blaTMB-1 (Tripoli MBL-1), blaSHV-38 et blaCTX-M-33 (Poirel et al., 2007 ; Taggar
et al., 2020 ; Bonnin et al., 2021) bien que ceux-ci n'aient pas été rappoertés à ce jour dans notre
pays. Une résistance aux carbapénèmes a également été détectée chez des isolats d'E. coli
prélevés sur des milieux non sélectifs (un isolat TBX22) et des milieux contenant du céfotaxime
(CTX23, CTX25, CTX30, CTX33 et CTX34) ; cependant, aucun d'entre eux n'abritait les gènes
de carbapénémase étudiés. Cette découverte est d'un grand intérêt mettant en évidence la
présence d'isolats résistants aux carbapénèmes chez E. coli commensal de lapin dans cette ferme
étudiée. De l’Homme à l’animal ou vice versa, la dissémination d'isolats d'entérobactéries
résistants aux carbapénèmes a été signalée en particulier chez les animaux de compagnie
(Taggar et al., 2020). Ainsi, la transmission possible de tels isolats aux ouvriers agricoles ou
aux éleveurs/vétérinaires en raison de contacts physiques ou aux consommateurs via la chaîne
alimentaire ou même à l'environnement est une source de préoccupation (Woodford et al.,
2014). Selon le responsable de cette ferme, les antibiotiques n’ont pas été utilisés. Par
conséquent, la présence d'E. coli producteurs de carbapénèmases pourrait s'expliquer par deux
hypothèses. Tout d'abord, un éventuel transfert direct de ces souches des ouvriers colonisés vers
120
les lapins. Deuxièmement, il est bien connu que certains aliments commerciaux contiennent des
métaux lourds, qui sont connus pour sélectionner des souches tolérantes/résistantes aux métaux.
Les mécanismes de cette tolérance sont liés à des mutations ponctuelles dans des porines
spécifiques permettant la pénétration des métaux lourds correspondants ainsi que de certains
antibiotiques, ou à la synthèse d'une pompe à efflux capable d'extruder des ions de métaux
lourds toxiques et un certain nombre d'antimicrobiens structurellement indépendants de la
cellule bactérienne (Delmar et al., 2014).
L'hypothèse susmentionnée peut en partie expliquer l'absence de transfert de résistance aux

carbapénèmes de tous les isolats résistants aux carbapénèmes puisque les mutations ponctuelles
des porines ou des gènes codant pour les pompes à efflux sont principalement localisées dans
les chromosomes (Delmar et al., 2014).
Les isolats collectés à partir de milieux contenant du céfotaxime n'ont pas montré de production
de BLSE et tous ont présenté une hyperproduction de céphalosporinase ainsi qu'une résistance
aux carbapénèmes chez cinq d'entre eux. En Tunisie, des E. coli producteurs de BLSE/pAmpC
ont été couramment isolés du bétail et des produits alimentaires, en particulier de la volaille, de
la viande de volaille et du lait bovin (Hassen et al., 2019, 2020b ; Sghaier et al., 2019), mais
jamais chez le lapin. Cependant, Ben Saïd et al., (2019) ont rapporté le CMY-2 dans un isolat
d'E. coli de lapin sauvage.
La résistance à la tétracycline a été observée chez 19 isolats dont les gènes tetA (8), tetB (2) et
tetC (5) ont été détectés avec un isolat qui abritait ces trois gènes. La résistance à la tétracycline
chez les entérobactéries est principalement codée par les gènes tetA, tetB avec faible fréquence
de détection du gène tetC (Soufi et al., 2009, 2011). Les neuf isolats résistants à la tétracycline
restants qui étaient exempts de ces trois gènes pourraient héberger d'autres gènes non étudiés,
bien que rarement signalés dans les entérobactéries, telles que tetL, tetM, tetO, tetK, et tetQ (Di
Francesco et al., 2021). Les sulfamides et le triméthoprime ont été utilisés pendant longtemps
chez le bétail, en particulier dans les élevages de volailles et de porcs, ce qui a provoqué la
sélection et la propagation d'isolats d'entérobactéries résistants aux antibiotiques, en plus, des
taux élevés de résistance ont été signalés (Soufi et al., 2009, 2011). Dans neuf isolats résistants
aux triméthoprimes-sulfonamides, sul1 et sul2 ont été détectés dans cinq et un isolats,
respectivement. Le sul3 est rarement rapporté dans les entérobactéries résistantes au
triméthoprime-sulfaméthoxazole ; cependant, sul1 et sul2 restent les gènes les plus importants
codant pour la résistance aux sulfamides (Soufi et al., 2009, 2011 ; Kilani et al., 2015). La
121
résistance aux quinolones à médiation plasmidique a été détectée dans deux isolats, qnrS et
aac(6')-Ib-cr parmi 13 isolats résistants à l'acide nalidixique. En Tunisie, ces gènes ont été
rapportés d'origines différentes (Abbassi et al., 2010 ; Kilani et al., 2015, Hassen et al., 2019,
2020a, b) ; cependant, contrairement à d'autres parties du monde, qnrA et qnrB sont moins
fréquents chez les isolats d'E. coli d'origine animale. Les isolats résistants aux quinolones
restants pourraient contenir des mutations ponctuelles chromosomiques dans les gènes gyrA
et/ou parC codant des sous-unités de l'ADN gyrase et de la toposiomérase IV, respectivement
(Abbassi et al., 2010).
Les intégrons sont des plateformes de collecte et d'expression de gènes codant pour la résistance
aux antibiotiques. Chez nos isolats, cinq et quatre contenaient respectivement des intégrons de
classe 1 et de classe 2. La région 3' classique (qacΔE-sul1) a été détectée chez tous les isolats
int1-positifs. Les intégrons de classe 1 sont des structures actives qui collectent plusieurs
cassettes de gènes codant pour la résistance aux antibiotiques ou d'autres fonctions
métaboliques. Leur rôle réel dans la résistance aux antibiotiques cliniquement pertinents est lié
à leur association génétique sur des éléments génétiques mobiles améliorant le phénomène de
co-sélection. La présence d'intégrons proches, soit sur des plasmides, soit sur des chromosomes,
de gènes codant pour les BLSE, les pAmpC ou les carbapénémases est courante chez les
entérobactéries, conduisant à des phénotypes de multirésistance.
2.5. Conclusion
Dans l'ensemble, notre étude a montré une forte occurrence d'E. coli résistant aux carbapénèmes
à partir d'échantillons fécaux de lapins ainsi que d'autres phénotypes de résistance aux
antibiotiques. La présence de ces isolats est un problème alarmant pour la santé humaine et
animale. Nous avons rapporté pour la première fois en Tunisie les carbapénémases VIM et IMP
chez E. coli provenant du bétail. Cependant, les mécanismes de résistance aux carbapénèmes
chez plusieurs isolats n'ont pas été déterminés. Une étude plus approfondie de ces mécanismes
doit être envisagée ainsi que la parenté génétique des isolats collectés afin de mettre en évidence
les voies de propagation de la résistance aux carbapénèmes dans cette ferme.
122
Chapitre III :
Application expérimentale de la souche d’Enterococcus

bactériocinogène comme candidat probiotique sur les
performances zootechniques des lapereaux en croissance
Chapitre III : Application expérimentale
Application de la souche d’Enterococcus bactériocinogène comme candidate probiotique

sur les performances zootechniques des lapereaux en croissance
Un essai a été conduit pour tester la souche E. durans EntA32 chez des jeunes lapereaux en
post-sevrage. L’étude des performances zootechniques, la composition corporelle ainsi que la
microflore caecale (les bactéries lactiques, Escherichia coli et les anaérobies) a été menée.
1. Performances zootechniques
Le Tableau 24 montre que le poids final des lapereaux varie significativement selon le
traitement (P<0,05). Il en est de même pour tous les autres paramètres (GMQ, consommation
alimentaire, consommation hydrique, rapport eau/aliment et indice de consommation).
L’interaction entre le mode d’administration du probiotique (dans l’aliment ou dans l’eau) est
décelé pour tous les paramètres sauf pour le poids final.
Tableau 24 : Analyse de la variance des paramètres zootechniques

Poids
Source de Poids GMQ Consommation Consommation Rapport
à 35
variation final Global alimentaire hydrique Eau/Aliment IC
jours
Traitement N.S. * * * * * *
Mode N.S. N.S. * * ** * *
d’administration
probiotique*
traitement
R² 0,74 0,71 0,66 0,62 0,55 0,49 0,66
N.S. : non significatif ; * : P<0,05 ; ** : P<0,01
Les animaux ayant reçu un probiotique présentent des poids finaux (77 jours) meilleurs que le
lot témoin ; les différences sont significatives (Tableau 24). Les poids les plus importants sont
enregistrés pour les lots ayant reçu les probiotiques mélangés avec l’aliment que ce soit avec le
probiotique commercial (PC) ou avec la souche candidate E. durans EntA32 (PSA). Donc
l’utilisation d’un probiotique a amélioré le GMQ et a conduit à des poids plus importants à la
fin de l’essai. En effet, le gain moyen quotidien (GMQ) le plus faible est enregistré au niveau
du lot témoin alors que les lots PC et PSA présentent les meilleurs GMQ (P<0,05). L’écart est
de 4,9 g/j pour le lot PC et de 4,3 g/j pour le lot PSA par rapport au lot témoin. Le GMQ du lot
PSE, ayant reçu E. durans EntA32 dans l’eau de boisson, est en position intermédiaire.
L’efficacité alimentaire est significativement meilleure (P<0,05) pour le lot ayant reçu le
probiotique E. durans Ent A32 dans l’aliment (PSA), avec une valeur de 3,2. Elle est en
123
moyenne de 3,86 pour les trois autres lots. Le Tableau 25 montre que le lot PSA a consommé
moins d’aliment que les autres lots (T, PC, PSE).
Toutefois la consommation hydrique du lot PSA a été largement plus importante que les autres
lots avec une quantité moyenne d’eau consommée supérieure de 20%. Les lapins du lot PSA
ont consommé une moyenne d’environ 330 g d’eau par jour. Ainsi, le lot PSA a eu un rapport
Eau/Aliment significativement supérieur aux autres lots dont les valeurs sont proches de la
valeur générale reportée dans la bibliographie (des valeurs proches de 2).
Tableau 25 : Paramètres zootechniques des différents lots ; moyennes et écart type.

T PC PSA PSE
Poids moyen à 35 j (g) 670 655 649 663
(41) (35) (46) (42)
Poids moyen à 77 j (g) 2104c 2295a 2263ab 2232b
(210) (165) (184) (146)
GMQ (35-77 j d'âge) 34,14c 39,04a 38,43a 37,36b
(4,7) (3,5) (3,1) (3,7)
Consommation alimentaire de 35 à 142,6ab 148,0a 125,6c 151,5a
77 j (g/j/lapin) (12,3) (13,5) (9,8) (15,3)
Consommation hydrique 35 à 77 j 278,4b 279,4b 329,7a 266,6b

(g/j/lapin) (56,1) (42,7) (34,9) (63,2)
Rapport Eau/Aliment 1,95b 1,89b 2,62a 1,76b

(0,21) (0,19) (0,29) (0,25)
Indice de Consommation 35 à 77 j 4,0a 3,7a 3,2b 3,9a
(0,3) (0,2) (0,3) (0,1)
T : lot témoin, PC : lot recevant le probiotique commercial, PSA : lot recevant le probiotique expérimental dans
l’aliment, PSE : lot recevant le probiotique expérimental dans l’eau de boisson. a, b, c : sur une même ligne, deux
valeurs ayant la même lettre en indice ne sont pas différentes au seuil α =0,05.
Aucune mortalité ni morbidité n’a été décelée au niveau des lots ayant reçu le probiotique E.
durans Ent A32. Un seul cas de mortalité a été enregistré au niveau du lot PC pendant la
cinquième semaine de l’essai suite à une diarrhée. Il convient de signaler que notre essai est
réalisé dans le clapier expérimental de l’INAT nouvellement rénové, ce qui suggère un très bon
état de l’environnement dans lequel il s’est déroulé.
124
2. Caractéristiques de la carcasse
Les animaux ayant reçu le probiotique expérimental E. durans Ent A32 ont des rendements en
carcasses chaudes et froides moins importants que le lot témoin et le lot ayant reçu le
probiotique commercial (Tableau 26). Ceci est dû au poids plus important du tube digestif chez
les lapins ayant reçu le probiotique expérimental. En effet le rendement tube digestif/poids vif
chez le lot PSA (21,9%) est supérieur à celui du lot témoin (20,0%).
Les poids des caeca des trois lots ayant reçu des probiotiques sont plus élevés que ceux du lot
témoin. Les rendements caecum par rapport au tube digestif chez les trois lots (PC (41,3), PSA
(40,6), PSE (39,8)) sont supérieurs à celui du lot témoin (38,9).
Tableau 26 : Rendements en carcasses, rendement du tube digestif par rapport au poids vif et
rendement du poids du caecum par rapport au tube digestif à la fin de l’essai (abattage à 77
jours)
T PC PSA PSE
Rendement carcasse 60,2 59,9 57,4 57,4
chaude
Rendement carcasse froide 59,9 59,7 57,2 57,1
Tube Digestif (% poids vif) 20,0 20,1 21,9 21,7
Poids caecum (% du TD) 38,9 41,3 40,6 39,8
l’aliment, PSE : lot recevant le probiotique expérimental dans l’eau de boisson.
3. Mesure du pH
Le Tableau 27 montre que les pH post mortem et ultimes sont très proches pour les différents
lots. L’ajout des probiotiques n’a pas affecté le stockage des nutriments et de l’énergie dans les
muscles.
Tableau 27 : Evolution du pH post-mortem de la carcasse chaude et du pH-ultime de la
carcasse froide des différents lots (lapins âgés de 77 jours, n =3)
T PC PSA PSE
pH post mortem (pH PM) 6,69 6,71 6,77 6,8
pH ultime (pH U) 5,81 5,76 5,81 5,81
Chute de pH 0,88 0,95 0,96 0,99
l’aliment, PSE : lot recevant le probiotique expérimental dans l’eau de boisson.
La chute des pH n’a pas été affectée par l’ajout des probiotiques confirmant un stockage
similaire des réserves dans le muscle pour les quatre lots.
125
4. Etude de la microflore caecale
Le dénombrement des bactéries lactiques, des Escherichia coli et des bactéries anaérobies, au
niveau du caecum a été réalisé au moment du sevrage, après 1 semaine, 2 semaines et à la fin
du traitement.
Une augmentation des bactéries lactiques a été enregistrée chez les lapereaux ayant subi les
probiotiques par rapport à ceux du groupe témoin. Cette augmentation est plus distinguée dès
la deuxième semaine. La figure 22 montre une croissance parallèle des bactéries lactiques
durant la première semaine du traitement avec les probiotiques. On remarque que les taux des
bactéries lactiques pour les deux lots auxquels les probiotiques ont été administrés à l’aliment
sont légèrement supérieurs chez ceux ayant subi le probiotique à l’eau de boisson avec tendance
de PSA (Tableau 28).
Figure 22 : Quantité de bactéries lactiques dans le contenu cæcal des 4 lots en fonction du
temps.
T : Témoin, PC : lot recevant le probiotique commercial, PSA : lot recevant le probiotique expérimental
dans l’aliment, PSE : lot recevant le probiotique expérimental dans l’eau de boisson.
126
Tableau 28 : Analyse statistique des quantités de bactéries lactiques dans le ceacum des 4
lots.
Les bactéries lactiques (log UFC)

T PC PSA PSE
t0 2 2 2 2
t1s 3,2 5,2 4,9 4,6
t2s 2,7 6 6,39 5,9
t7s 4,9 6,03 6,36 5,37
Somme 12,8 19,23 19,65 17,87
Moyenne 3,2 4,80 4,91 4,46
var s2 1,53 3,65 4,25 2,99
Ecartype 1,23 1,91 2,06 1,72
Pour Escherichia coli, on observe dès la première semaine l’augmentation du nombre des
UFC/g chez le groupe témoin. Par contre les lapereaux traités par les probiotiques ont montré
une évolution moins remarquable de UFC/g d’E. coli. La différence est statistiquement
significative par rapport au lot témoin avec une tendance des lots PC et PSE.
Figure 23 : Quantité d’E. coli dans le contenu cæcal des 4 lots en fonction du temps.
127
Tableau 29 : Analyse statistique des quantités de bactéries E. coli dans les ceaca des 4 lots.
E. coli (log UFC)

T PC PSA PSE
t0 4,3 4,3 4,3 4,3
t1s 5,32 3,77 3,96 3,95
t2s 5,83 5 5,1 4,6
t7s 6,4 4,2 4,64 5
Somme 21,85 17,27 18 17,85
Moyenne 5,46 4,31 4,5 4,46
var s2 0,80 0,26 0,24 0,20
Ecartype 0,89 0,50 0,48 0,44
Concernant les anaérobies, on remarque à la première semaine une légère diminution d’UFC/g
chez le témoin, le PSA et le PSE. Par contre le groupe PC montre un taux stable pour les
anaérobies tout le long de l’essai.
A partir de la deuxième, semaine on observe une augmentation du taux des anaérobies chez le
lot PSA qui reste inchangeable jusqu’à la septième semaine.
Figure 24 : Quantité de bactéries anaérobies dans le contenu cæcal des 4 lots en fonction du
temps.
128
Tableau 30 : Analyse statistiques des quantités de bactéries anaérobies dans les ceaca des 4
lots.
Anaérobie (log UFC)

T PC PSA PSE
t0 5,39 5,39 5,39 5,39
t1 s 4,54 5,39 3,9 4,2
t2 s 4,5 5,2 6,25 4,39
t7 s 4,9 5,4 5,9 4,7
Moyenne 4,83 5,34 5,36 4,67
var s2 0,17 0,01 1,07 0,27
Ecartype 0,41 0,09 1,03 0,52
5. Discussion
Presque tous les animaux étaient en bon état de santé tout au long de cet essai, sans aucun
symptôme de troubles (à l’exception de la mort d’un seul lapereau enregistrée dans le groupe
PC). Le gain quotidien moyen était élevé chez le groupe nourri par E. durans EntA32 dans
l’aliment, PSA (38,43g) et qui se rapproche de celui enregistré chez le groupe ayant reçu le
probiotique commercial (39,04g). Par contre, un meilleur indice de consommation a été noté
chez le groupe PSA, (3.2) contre (4) chez le groupe témoin. Le gain en poids corporel est le
paramètre le plus fréquemment vérifié lors de l’application des additifs. L’application de
probiotique est associé à leur effet bénéfique sur le poids corporel, la morbidité et/ou la
mortalité dans les élevages de lapins (Kritas et al., 2008).
Les résultats de cet essai ont indiqué que la souche bactériocinogène E. durans EntA32, en tant
que candidat probiotique, a amélioré la prise de poids quotidienne moyenne chez les lapereaux
en croissance, ce qui est en accord avec d’autres résultats précédents utilisant les entérocoques
comme probiotiques (Pogany Simonová et al., 2009). Cette amélioration de la croissance avec
une efficacité alimentaire pourrait s’expliquer par la rétention du microbiote bénéfique dans le
tube digestif et l’amélioration de la digestion et de l’absorption des aliments grâce à une
morphologie et une physiologie intestinale améliorée (Liu et al., 2019). Ceci pourrait être
expliqué aussi par l’action des probiotiques sur les glucides non digestibles donnant lieu à des
acides gras à chaine courte favorisant ainsi une meilleure absorption des minéraux et des
nutriments (Pogany Simonová et al., 2015). En effet, le microbiote cæcal est capable de
synthétiser des enzymes, qui aident à la digestion des nutriments par hydrolyse des composants
129
alimentaires des parois cellulaires ou des fibres végétales (principalement les lignines, la
cellulose, l'hémicellulose et les pectines), qui ne peuvent pas être décomposées par les enzymes
digestives de l'hôte.
Le rendement en carcasse chaude et carcasse froide ont été légèrement affectés. Ce rendement
est moins important par rapport au lot témoin et celui ayant reçu le probiotique commercial.
Malgré que certains auteurs aient rapporté l’effet bénéfique des probiotiques sur le rendement
de la carcasse et ses caractéristiques (Fathi et al., 2017 ; Mohamed et al., 2017), d’autres ont
trouvé des résultats similaires aux nôtres tels que Beshara et al., (2018), qui ont utilisé Bacillus
subtilis et Lactobacillus lactis sur des lapins de race égyptienne locale appelée Baladi Black
ainsi que Elbadawi et al., (2017) qui ont testé les performances de croissance de bactéries ou
de levures seules ou en combinaison. Dans notre cas, la diminution du rendement de la carcasse
peut être expliquée par l’augmentation des poids du tube digestif et celui du caecum. En effet,
on note bien une nette différence des proportions des caecums des lapins ayant reçu les
probiotiques exprimés en pourcentage du tube digestif (41,3 (PC), 40,6 (PSA) et 39,8 (PSE))
par rapport aux lapins du lot témoin (38,9%). Des travaux antérieurs menés par Rotolo et al.,
(2014) ont rapporté que le poids du caecum n’était pas affecté par le traitement du probiotique
Saccharomyces cerevisiae boulardi vivant.
Dans les deux modes d’administration de l’entérocoque E. durans EntA32 (dans l’aliment et
dans l’eau de boisson), une augmentation du nombre d’entérocoques et de bactéries lactiques
pendant toute la période du traitement a été observée. Cette augmentation a été aussi rapportée
dans des expériences antérieures avec l’administration de souches d’entérocoques non
autochtones chez le lapin (lauková et al., 2012, Benato et al., 2014) ainsi qu’avec la souche E.
faecium issue de fèces de lapin (Simonová et al., 2020). Les auteurs ont même confirmé la
présence de la même souche probiotique par les examens microbiologiques des échantillons
fécaux après le traitement. Ces résultats confirment la capacité des souches entérocoques
autochtones à coloniser le tube digestif des lapins. D’après nos résultats, les bactéries lactiques
peuvent atteindre 6,4 log10 UFC ceci corrobore les résultats trouvés par Simonová et al., (2020).
Cependant, et contrairement à cette étude où les auteurs ont obtenu les taux des bactéries
lactiques les plus bas dans les échantillons fécaux des lapins ayant reçu le probiotique sous sa
forme lyophilisée ; nous avons trouvé des taux de bactéries lactiques plus élevés dans les fèces
des lapins recevant la forme lyophilisée par rapport à ceux recevant une culture fraiche de la
souche probiotique E. durans EntA32. D’une façon générale, l’augmentation du nombre des
bactéries lactiques dans le caecum crée des conditions non favorables pour la croissance des
130
bactéries pathogènes. L’augmentation des bactéries lactiques dans le caecum des lapins induit
l’amélioration du fonctionnement de l’intestin, la maturation de la microflore intestinale, la
stimulation du système immunitaire, la prévention de la colonisation et l’excrétion de plusieurs
bactéries entériques comme E. coli ainsi que la réduction des taux de mortalités des sujets
traités. En outre, la prolifération et la dominance de la souche probiotique sélectionnée à la base
de sa sensibilité à tous les antibiotiques diminue ainsi la prolifération de souches d’entérocoques
endogènes qui pourraient acquérir des gènes de résistance à partir d’autres genres colonisant le
tube digestif. Ceci diminue le risque de dissémination environnementale des souches
d’entérocoques résistantes aux antibiotiques. Aussi cette souche probiotique ne présente aucun
risque de transfert de résistance aux antibiotiques aux autres bactéries lactiques intestinales.
Ceci est en relation avec nos observations sur la prévalence de l’antibiorésistance chez les
entérocoques des différents écosystèmes étudiés.
La diminution des taux d’E. coli tout au long des traitements par la souche bactériocinogène
sous ses deux formes, lyophilisée ou bien en culture fraiche, est comparable à celle obtenue par
la souche probiotique commerciale ce qui confirme l’effet antibactérien de cette souche
candidate. En effet, l’effet inhibiteur des entérocoques producteurs de bactériocines sur le
microbiote intestinal du lapin a été déjà rapporté par plusieurs études (Simonová et al., 2008 ;
Pogány Simonová et al., 2009 ; Szabóová et al., 2012). Nos résultats confirment aussi ce qui a
été cité par Lauková et al., (2017) qui ont testé la souche E. durans ED26E/7 isolée de fromage
de brebis sur des lapereaux sevrés à l’âge de 35 jours. L’administration de cette souche s’est
faite par culture fraiche de l’ordre de 500µl/animal /jour et ce pendant 21 jours. Les résultats
montrent la colonisation des caecums et des appendices par ED26E/7 avec une diminution des
coliformes montrant ainsi le pouvoir antimicrobien de E. durans. Ceci confirme aussi nos
hypothèses concernant l’augmentation du nombre des bactéries lactiques caecales. Ces
lactobacilles en association avec notre souche bactériocinogène E. durans EntA32 pourraient
aussi jouer le rôle d’inhibiteur de croissance d’E. coli dans le tube digestif de nos lapereaux.
Plusieurs études ont montré l’inhibition d’E. coli pathogène dans l’intestin de poulets ou de
porcs infectés par un pathovar de E. coli spécifique de ces deux espèces par rapport aux sujets
non traités par des probiotiques (Tarabees et al., 2019 ; He et al., 2020).
Ce résultat pourrait être très important, vu que pendant la période du sevrage, la pathologie la
plus importante est la gastroentérite causée par E. coli. L’administration de probiotiques inhibe
la prolifération de cette souche pathogène et réduit l’utilisation de l’antibiotique pour le
traitement de cette pathologie diminuant ainsi l’émergence et la dissémination de souches
131
résistantes aux antibiotiques qui sont actuellement un problème majeur de santé humaine et
animale. Ce ci parait très intéressant vu les taux de résistance élevés observés chez E. coli
isolés de lapins dans notre étude. La diminution des taux des E. coli intestinaux exerce un stress
biologique inhibant les phénomènes de transfert génétique des éléments portants les gènes de
résistance entre les souches d’E. coli ainsi que les autres genres d’entérobactéries intestinales.
Ainsi comme nous l’avons cité pour les entérocoques, l’inhibition de la prolifération des E. coli
réduit le risque sanitaire environnemental de la dissémination de l’antibiorésistance.
Nous avons observé aussi un changement dans le nombre de bactéries anaérobies testées. En
effet les lapins ayant reçu les probiotiques lyophilisés mélangés à l’aliment présentent des taux
élevés de bactéries anaérobies au niveau de leurs caecums. Les bactéries strictement anaérobies
du caecum sont également caractérisées par une activité fibrolytique et pectinolytique (Sirotek
et al., 2001), nous supposons alors une activité fermentative élevée par le microbiote cæcal
anaérobie. De plus, le potentiel cellulolytique des Clostridium spp. in vitro et in vivo à
transformer la cellulose en sucres réducteurs a été montré par Gupta et al. (2012).
6. Conclusion
L’application in vivo de notre souche E. durans EntA32 comme probiotique de lapin a montré
des résultats promoteurs dans les performances zootechniques étudiées et dans la lutte contre
un agent responsable d’entérites chez le lapin. L’inconvénient de cette étude est le nombre
réduit de sujets utilisés et le manque d’études d’autres paramètres tels que la digestibilité, la
composition de la carcasse et la réponse immunitaire.
132
Conclusion Générale et Perspectives
Conclusion générale et Perspectives
Les élevages intensifs (tous types) sont caractérisés par plusieurs pathologies
bactériennes virales et parasitaires ce qui nécessite l’utilisation d’antibiotiques pour
le traitement et ou la prévention des infections. L’utilisation d’antibiotiques provoque la
sélection et l’émergence de plusieurs phénotypes de résistance antimicrobiens. En plus, elle
constitue un coût important pour les éleveurs. Les probiotiques sont utilisés depuis des années
dans plusieurs type d’élevages y compris l’élevage des lapins. Ces probiotiques améliorent les
performances zootechniques des animaux et réduit énormément l’utilisation d’antibiotiques par
lutte biologique contre les agents pathogènes. C’est dans ce contexte que notre étude a été
réalisée dont l’objectif principale était la sélection et la valorisation d’une souche
d’Enterococcus probiotique autochtone. Ainsi, à partir de 108 échantillons de fèces de lapins
sains, nous avons pu isoler 43 souches d’entérocoques bactériocinogènes capables d’inhiber
plusieurs bactéries pathogènes humaines et animales (L. monocytogenes, S. aureus, E. faecalis,
P. larvae, B. cereus). Cette inhibition a été liée à la production de bactériocines codées
principalement par les gènes entérocine EntA, EntB et EntP. Après caractérisation
phénotypique et génotypique afin de déterminer l’innocuité des souches bactériocinogènes
(absence de gènes de virulence, absence de marqueurs de résistance aux antibiotiques, tolérance
au suc gastrique et aux sels biliaires) nous avons sélectionné une souche de E. durans EntA32
qui présentait les meilleures caractéristiques d’une souche probiotique. Cette souche a été testée
(dans l’aliment et dans l’eau de boisson) sur des lapins de laboratoire et a été comparée à une
souche probiotique commerciale. Nous avons observé de bonnes performances zootechniques
comparables à la souche commerciale avec absence de mortalité durant la période d’essai.
L’augmentation du nombre des bactéries lactiques dans le caecum des lapins et la prolifération
modérée des E. coli associés au développement morphologique de la taille du caecum
pourraient être à l’origine de ces performances zootechniques par rapport aux lapins non traités
par les souches probiotiques (la souche expérimentale et la souche commerciale). La limite
de notre étude était le nombre réduit des lapins utilisés au cours de l’essai de laboratoire et
le nombre réduit de caractères d’évaluation des performances zootechniques analysées.
Cependant, le caractère probiotique de notre souche est prometteur.
Actuellement et partout dans le monde, la résistance aux antibiotiques est un problème majeur
de santé humaine et animale. Ainsi plusieurs organisations mondiales (OMS, FAO, OIE, ONU)
133
ont adapté un programme de lutte contre l’antibiorésistance sous l’approche de ‘santé unique’
(One Health). En effet, l’antibiorésistance bactérienne n’est plus un problème clinique
seulement mais elle prend une ampleur environnementale (humains, animaux (élevages,
sauvages), sol (agricole et non agricole) et milieux hydriques). Pour l’évaluation de la
dissémination des bactéries résistantes aux antibiotiques et les gènes codants ces résistances
dans un environnement/niche écologique donnée, plusieurs comités scientifiques mondiaux
considèrent les entérocoques et E. coli comme principaux indicateurs de pollution de résistance
antimicrobienne. En effet, les entérocoques et E. coli sont des bactéries de colonisation des
animaux et de l’Homme et pourraient aussi provoquer des pathologies graves sur terrains
favorables. Ils sont aussi indicateurs de pollution fécale dans plusieurs environnements ; ainsi
ils pourraient donc donner un schéma général sur la dissémination de la résistance aux
antibiotiques chez les animaux et les humains. Pour l’évaluation de l’antibiorésistance chez
E. coli, nous avons collecté 35 prélèvements de matière fécale de lapins sains dans un élevage
de lapins et nous avons isolé 39 isolats d’E. coli sur trois milieux de culture (milieu non sélectif,
milieux d’isolement+céfotaxime, milieux d’isolement+imipénème). Indépendamment des
milieux utilisés, les isolats ont présenté des résistances à plusieurs familles d’antibiotiques
(bêta-lactamines, aminosides, quinolones, tétracyclines). Les bêta-lactamases à spectre étendu
non pas été détectés. Cependant des souches productrices de carbapénémases ont été
caractérisées avec identification pour la première fois en Tunisie des gènes blaVIM (2 isolats) et
blaIMI (un isolat) chez des isolats d’origine animale. Ces résultats montrent que les lapins
de cette ferme est un réservoir important de E. coli résistantes aux antibiotiques avec des
phénotypes très importants en médecine humaine et animale. Ces résultats sont aussi similaires
à ceux observés chez 97 isolats d’Enterococcus spp. (44 E. faecium, 37 E. faecalis, 7
E. gallinarum, 5 E. durans, et 4 E. avium) isolées de lapins de trois niches écologiques (sauvage,
laboratoire, ferme). En effet, des taux de résistance ont été observés contre la tétracycline
[60,8% ; tetM (n = 48 ; 81,3%), tetO (n = 7 ; 11,8%), and tetL (n = 1 ; 1,7%)], érythromycine
[43,3% ; msr(A) (n = 14 ; 33,3%) et ermB (n = 13 ; 31%)], ampicilline [29,9%], streptomycine
[26,8% ; ant(6)-Ia (n = 3 ; 11,5%)], et vancomycine [21,6%; vanA (1 E. faecium + 1 E. faecalis;
9,5%)]. Chez ces souches, la présence des transposons Tn916/1545 joueraient un rôle important
dans la dissémination de la résistance à l’érythromycine et à la tétracycline qui certainement
favoriseraient aussi la dissémination d’autres gènes de résistance.
Enfin et comme perspectives, il est souhaitable de :
- Réétudier les performances zootechniques à travers un essai à grande échelle.
134
- Comparer le mode d’administration (dans l’aliment ou dans l’eau de boisson) avec une
distribution pendant seulement les 2 ou 3 semaines post sevrage.
- Etudier l’effet de l’ajout du probiotique E. durans EntA32 dans l’eau de boisson couplé
avec une restriction hydrique.
- Faire une étude poussée sur la digestibilité chez les lapereaux ainsi que la composition
de certains constituants biochimiques du sang, la réaction du système immunitaire, la
morphologie intestinale ainsi que l’étude moléculaire de la microflore totale caecale et
ce pour comprendre le mécanisme d’action de ce probiotique et sa capacité à interagir
avec l’hôte et avec l’ensemble du microbiote du tractus gastrointestinal.
- Changer le mode d’administration, par micro-encapsulation par exemple, pour garantir
que le probiotique atteindra en grand nombre le site d’action cible.
135
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Abbassi, M. S. (2021). High occurrence of carbapenem-resistant Escherichia coli isolates
from healthy rabbits (Oryctolagus cuniculus) : first report of blaIMI and blaVIM type genes
from livestock in Tunisia. Letters in Applied Microbiology, 73(6), 708–717.
https://doi.org/10.1111/lam.13558

Caractérisation D'un Probiotique Autochtone

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REPUBLIQUE TUNISIENNE

MINISTERE DE L’AGRICULTURE, MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT

INSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE DE TUNISIE

Ecole Doctorale Sciences et Techniques de L’Agronomie et de l’Environnement

THESE DE DOCTORAT EN SCIENCES AGRONOMIQUES

Spécialité Sciences animales

Caractérisation d’un probiotique autochtone et étude de son effet

sur le microbiote caecal et les performances zootechniques

des lapereaux en croissance

Soutenue publiquement par

Sana LENGLIZ BEN RAYANA

Devant le jury composé de

M. Faycel BEN JEDDI, Professeur, INAT Président

À Imen, Maila et Inès.

À l’âme de ma très chère tante Fahima.

À mes amis et mes collègues.

À tous ceux qui me sont chers.

Ce travail a été réalisé entre le laboratoire de recherche de bactériologie de l’Institut

Je tiens à exprimer mon respect et ma profonde reconnaissance à mon directeur de thèse

Tous mes remerciements et ma profonde gratitude à mon collègue et co-encadrant

Au président du jury Monsieur Faycel Ben Jeddi, Professeur et Directeur Général de

Madame Lilia Messadi, Professeur Hospitalo-universitaire en Microbiologie à l’Ecole

A l’examinateur, Monsieur Salah Hammami, Professeur à l’Ecole Nationale

Je tiens à remercier le Directeur général de l’Institut de la Recherche Vétérinaire de Tunisie,

Je remercie M. Taha Sassi de m’avoir fourni la souche probiotique commerciale, M. Anis

AGV : Acide gras volatil

Les entérocoques sont un groupe diversifié et riche en espèces appartenant au groupe

Pour cela notre étude consiste à :

- Réaliser l’isolement d’une collection de souches d’entérocoques bactériocinogènes

- Etudier phénotypiquement et génotypiquement la résistance aux antibiotiques d’une

I. Particularités anatomiques et physiologiques digestives du lapin

Figure 1 : Schéma du tube digestif du lapin (Garreau et al., 2015)

2. Physiologie de l’appareil digestif et digestibilité

Le profil fermentaire du lapin est donc dépendant du microbiote caecal.

Figure 2 : Fonctionnement de la digestion du lapin (d’après Lebas, 2002).

3. Caractérisation de la microflore du caecum

De plus, l’étude de Mi et al., en 2018 suggère fortement la présence de nouvelles bactéries

4. Pathologie digestive chez le lapin

Le comportement alimentaire dominé par la caecotrophie rend le lapin particulièrement sensible

4.1. Les conditions d’élevage pour les lapins

4.3. Les agents infectieux

II. Les probiotiques

2. Utilisation des probiotiques

▪ Réduction du risque de diabète gestationnel ;

N° Genre bactériens probiotique Espèces impliquées

2.2. Utilisation des probiotiques chez les animaux d’élevage

antibiotiques tout en réduisant la propagation des zoonoses et autres agents pathogènes

▪ Probiotiques pour ruminants

probiotique de Propionibacterium freudenreichii et de Lactobacillus acidophilus NP51

▪ Probiotiques pour les lapins

Un système intensif d'élevage de lapins, notamment en période de sevrage, peut engendrer

de Bacillus probiotiques a également augmenté l'abondance des bactéries cellulolytiques et a

▪ Probiotiques pour les volailles

L'inquiétude du public concernant la résistance microbienne aux antibiotiques a conduit à une

L'activité antimicrobienne potentielle des souches probiotiques contre les Campylobacter

De même, plusieurs résultats expérimentaux indiquent que l'application de cultures

3. Mécanismes d’action des probiotiques

Figure 3 : Mécanismes d'action des probiotiques. a) Exclusion compétitive des micro-

III. Les bactéries lactiques et Enterococcus spp.

2.2. Caractères bactériologiques

Les entérocoques sont aussi un important colonisateur de l’intestin de plusieurs animaux,

2.4. Pathogénicité et facteurs de virulence des entérocoques

Tableau 4 : Facteurs de virulence des entérocoques (Chajęcka-Wierzchowska et al., 2017)