UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

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FACULTE DES SCIENCES

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DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

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MEMOIRE POUR L'OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES EN

SCIENCE DE LA VIE

Option : BIOTECHNOLOGIE-MICROBIOLOGIE

APPROCHE A LA PHYTOPATHOLOGIE
ET MICROPROPAGATION DE
Vanilla planifolia (Orchidaceae)

Présenté par : RALAMBOMANANA Fanjaniaina Judith

Maître ès Sciences
___________

Soutenu publiquement le 14 avril 2015 devant le jury composé de

Président : Professeur RALISON Charlotte

Examinateurs : Docteur RAMAMONJISOA Daniel

Docteur RAZAFIARIMANGA Zara

Rapporteurs : Docteur RABEMANANTSOA Christian

Docteur RANDRIANIERENANA Ando L.

 Je dédie ce mémoire à la mémoire de mon père
RALAMBOMANANA (11/05/1957 – 27/02/2002)
« QUE SON AME REPOSE EN PAIX »

« Par la grâce de Dieu je suis ce que je suis »

I Corinthiens 15 : 10
 REMERCIEMENTS

Il m’est très cher d’exprimer ici ma sincère gratitude :

Au Grand Dieu qui m’a donné santé et courage au cours de ce travail ;

Au Professeur Suzanne URVERG RAKOTO-RATSIMAMANGA, Présidente de la
Fondation RATSIMAMANGA, qui a accepté généreusement la réalisation de mon
stage au sein de son Institut ;
Au Docteur RABEMANANTSOA Christian, Directeur de recherche à l’IMRA et
Chef du Département de Biodiversité et Biotechnologie, qui m’a accueillie à bras
ouvert au sein de son Département, a encadré tous mes travaux de laboratoire et qui a
accepté de rapporter ce mémoire ;
Au Docteur RANDRIANIERENANA Ando Lalaniaina, chef du Département de
Biochimie Fondamentale et Appliquée de la Faculté des Sciences, qui n’a pas ménagé
ni son temps ni ses efforts pour m’encadrer et pour rapporter ce travail ;
Au Professeur RALISON Charlotte qui, en dépit de ses nombreuses occupations, a
pris le temps de me donner des précieuses suggestions et des conseils pour améliorer
ce travail et a bien voulu présider le jury de ce mémoire;
Au Docteur RAMAMONJISOA Daniel et au Docteur RAZAFIARIMANGA Zara qui
ont accepté de siéger parmi le jury. Leurs recommandations ont beaucoup contribué à
l’amélioration de ce travail ;
A tous les membres de l’équipe du laboratoire de Microbiologie, de Biotechnologie
Végétale de l’IMRA ;
A toute ma famille, ainsi que mes amies pour leur aide, leur soutien moral et
financier ;
A toutes les personnes qui ont contribué, de près ou de loin, à la réalisation de ce
travail.

Que Dieu vous bénisse !

 TABLE DES MATIERES
GLOSSAIRE
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
I.INTRODUCTION ............................................................................................................ 1
II. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE .............................................................................. 2
II.1 Point sur la vanille ................................................................................................. 2
II.1.1 Origine ........................................................................................................ 2
II.1.2 Systématique ............................................................................................... 2
II.1.3 Description botanique ................................................................................. 3
II.1.4 Ecologie ....................................................................................................... 5
II.1.5 Cycle végétatif ............................................................................................. 6
II.1.6 Principales maladies de la vanille ................................................................ 7
II.1.6.1 Maladies dues aux champignons ...................................................... 7
II.1.6.2 Maladies dues aux bactéries ............................................................. 8
II.1.6.2 Maladies dues aux virus ................................................................ 8
II.1.7 Ravageurs ..................................................................................................... 9
II.2 Généralités sur la culture in vitro ......................................................................... 9
II.2.1 Historique de la culture in vitro .................................................................. 9
II.2.2 Définition de la culture in vitro .................................................................. 10
II.2.3 Les différentes phases de la micropropagation ......................................... 10
II.2.4 Avantages de la culture in vitro .................................................................. 11
II.2.5 Inconvénients de la culture in vitro............................................................ 11
II.2.6 Les différentes hormones de croissance .................................................... 12
III.METHODOLOGIE ........................................................................................................ 13
III.1 Isolement et identification des microorganismes issus
des échantillons de feuilles de vanillier malades ........................................................ 13
III.1.1 Matériels utilisés ......................................................................................... 13
a-Matériel végétal ...................................................................................... 13
b- Matériels et équipements ................................................................. 14
III.1.2 Isolement et identification des microorganismes ........................................ 14
 III.1.2.1 Prétraitement du matériel végétal ................................................ 14
III.1.2.2 Mise en culture .............................................................................. 14
III.1.2.3 Isolement ..................................................................................... 14
III.1.2.4 Purification .................................................................................. 15
III.1.2.5 Identification ................................................................................. 15
III.1.2.5.1 Identification des bactéries ............................................. 15
III.1.2.5.2 Identification des champignons ..................................... 16
III.1.3 Conservation ............................................................................................ 16
III.2 Postulat de Koch ................................................................................................ 16
III.2.1 But ....................................................................................................... 16
III.2.2 Principe .................................................................................................. 17
III.2.3 Inoculation des microorganismes ......................................................... 17
III.3 Microbouturage ................................................................................................ 17
III.3.1But ................................................................................................... 17
III.3.2 Principe ........................................................................................... 17
III.3.3 Matériels utilisés ........................................................................... 17
a-Matériel végétal ........................................................................ 17
b-Milieux de culture ..................................................................... 18
c-Préparation des milieux de culture ........................................... 18
d-Les régulateurs de croissance ..................................................... 18
III.3.4 Mise en culture ................................................................................. 18
IV. RESULTATS ................................................................................................................ 20
IV.1Isolement et identification des microorganismes issus
des échantillons malades ........................................................................................... 20
IV.2 Postulat de Koch ............................................................................................ 27
IV.3 Microbouturage ................................................................................................ 32
V.DISCUSSION ................................................................................................................ 36
V.1 Isolement et identification des microorganismes
issus des échantillons malades ............................................................................... 36
V.2 Postulat de Koch ............................................................................................. 37
V.3 Microbouturage ............................................................................................... 38
VI. CONCLUSION ET PERSECTIVES ............................................................................ 40
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
 GLOSSAIRE

Antifongique : substance possédant la capacité de traiter les mycoses c’est-à-dire de lutter

contre les infections causées par les champignons microscopiques.

Callogenèse : processus aboutissant à la formation des cals (structures de prolifération

cellulaire) en culture in vitro.

Culture in vitro : culture de tissu ou de cellules dans un environnement totalement artificiel et

contrôlé.

Explant: morceau de la plante (pouvant aller de l'ensemble de la partie aérienne à des cellules
isolees en passant par des morceaux de feuille ou de racine, des graines et des bourgeons)
utilisé comme matériel de base servant à la reproduction végétative sur milieu synthétique.

Inflorescence : disposition ou arrangement de l’ensemble des fleurs sur la tige d’une plante.

Languette : excroissance de la tige se prolongeant dans la fleur et qui forme une valve
empêchant tout contact entre les étamines et le pistil.

Mucus : sécrétion visqueuse contenant des protéines et des glucides sous forme de mucines
(grandes protéines fortement glycosylées), produite par les cellules des muqueuses et jouant
un rôle de protection.

Nécrose : état pathologique, dû à une infection bactérienne ou fongique, qui provoque une
mort anormale et non programmée d’une cellule ou d’un tissu.

Plante vivace : plante dont la période de végétation s’étend sur plusieurs années.

Safran : épice jaune d’or extraite de la fleur d’une plante herbacée à bulbe appelée Crocus
sativus.

Totipotence : propriété des cellules végétales à régénérer une plante entière à partir de
quelques cellules-mères.
 LISTE DES ABREVIATIONS

BA : 6 -benzyladénine

IBA : Acide indolbutyrique

IMRA : Institut Malgache de Recherches Appliquées

McF : Mc Farland

MES : [2-N morpholino] éthane sulfonique acide

NA : Nutrient Agar

PDA : Potato Dextrose Agar

SAVA : Sambava -Antalaha- Vohémar -Andapa

UFC : Unité Formant Colonie

 LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Tige et feuilles du vanillier ................................................................................. …..3
Figure 2: Fleur du vanillier.................................................................................................. …..4
Figure 3 : Une grappe de vanille ........................................................................................ …...4
Figure 4 : Maladie du vanillier causée par Phytophtora ....................................................................... 7
Figure 5 : Maladie fusariose du vanillier ................................................................................................ 8
Figure 6 : Feuilles prélevées sur terrain (avec description des symptômes de la maladie étudiée) ...... 13
Figure 7 : Photo des souches pures de bactérie issues des 5 échantillons ............................................. 21
Figure 8 : Photo des souches pures de champignon issues des 5 échantillons ...................................... 23
Figure 9 (a, b, c, d, e) : Symptômes observés après inoculation de la souche V3C2 ............................ 29
Figure 10 (a, b, c, d) : Symptômes observés après inoculation de la souche V3C5 .............................. 31
Figure 11: Microbouturage avec les hormones de croissance ............................................................... 32
Figure 12 : Longueur des racines avec les différentes concentrations d’hormone ................................ 33
Figure 13 : Longueur des pousses avec les différentes concentrations d’hormone ............................... 34
Figure 14 : Nombre de pousses avec les différentes concentrations d’hormone ................................... 34
 LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Milieux de culture avec les hormones de croissance ............................................ 19
Tableau 2 : Caractères macroscopiques des colonies des souches bactériennes ...................... 24
Tableau 3 : Caractères microscopiques des cellules des souches bactériennes ....................... 25
Tableau 4 : Caractères macroscopiques des colonies des souches pures de champignon ....... 26
Tableau 5 : Longueur des racines avec les différentes concentrations d’hormone .................. 32
Tableau 6 : Longueur des pousses avec les différentes concentrations d’hormone ................. 33
Tableau 7 : Nombre de pousses avec les différentes concentrations d’hormone ..................... 34
I. INTRODUCTION
 La vanille semble l’épice la plus chère au monde après le safran. Dans la famille des
Orchidaceae, le genre Vanilla est la seule orchidée utilisée en alimentation humaine ayant une
grande importance économique [JOSEPH, 2012].
Madagascar fait partie des plus grands producteurs de vanille au monde avec l’Indonésie, la
Chine et le Mexique. Couvrant 80% de la production mondiale, c’est un des principaux
produits agricoles exportés par Madagascar [www.vanillefraise-madagascar.com].
A Madagascar, la culture de vanillier fait vivre 80 000 planteurs dont 70 000 dans la région de
SAVA, ainsi que 6000 préparateurs et une trentaine d’exportateurs professionnels
[www.padane.mg].
La principale zone de production de vanille se trouve sur la côte Nord-Est de Madagascar à
cause de son type de sol et son climat. La meilleure qualité de vanille malgache provient de
cette région [www.vanillefraise-madagascar.com].
La baisse des prix de la vanille durant les années 80 a démotivé les producteurs malgaches qui
ont alors négligé leurs plantations de vanillier. Depuis, un certain nombre de maladies a
proliféré dans ces plantations dont celle qui provoque la coloration (jaune, brun, marron) des
feuilles de vanillier [www.indian-ocean-times.com].

Le but de notre travail est de déterminer les microorganismes pathogènes responsables

de la maladie des feuilles de vanillier et de faire un essai de multiplication in vitro de la plante
Vanilla planifolia.

Ce travail comporte 3 étapes : la première consiste en l’isolement et l’identification

des bactéries et des champignons qui colonisent les feuilles de vanillier malades, la seconde
étape est la détermination des microorganismes responsables de la maladie des feuilles et la
dernière présente l’influence de la combinaison de 2 hormones de croissance sur la
multiplication in vitro du vanillier.

Pour présenter ce travail, nous avons adopté le plan suivant :

- Introduction
- Synthèse bibliographique : généralités sur la vanille et la culture in vitro
- Méthodologie
- Résultats et interprétations
- Discussion
- Conclusion et perspectives

1
 II. SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE
II.1 Point sur la vanille
II.1.1 Origine
Le terme vanille vient de l’espagnol « vainilla » diminutif de «vaina» qui signifie une
gaine, une enveloppe ou encore le fourreau d’une épée. Les mexicains l’ont appelé du nom
Aztèque « Tlilxochill » ou « gousse noire » [ANDRIAMAHERY, 2011].
La vanille est originaire de l’Amérique méridionale. Elle croît spontanément au Mexique dans
la baie de Campeche [A.DELTEIL, 1884].

II.1.2 Systématique [BEATRICE, 2005]

Règne : VEGETAL

Sous règne : TRACHEOBIONTA

Embranchement : SPERMAPHYTES

Classe : MONOCOTYLEDONES

Ordres : ORCHIDALES

Famille : ORCHIDACEAE

Genre : Vanilla

Espèce : planifolia

Nom vernaculaire : vanille

Les variétés existantes

La famille des orchidées comprend plus de 110 espèces de vanille mais seules trois
espèces possèdent des qualités aromatiques marchandes et sont cultivés dans le monde :
- l’espèce Vanilla planifolia ou Vanilla fragans est la plus produite et commercialisée
dans le monde.
- l’espèce Vanilla pompona, plus connue sous le nom « vanillon », donne des grosses
gousses courtes.
- l’espèce Vanilla tahitensis, la vanille de Tahiti, possède une faible teneur en vanilline
[www.ctht.org/outdid.php].

2
 II.1.3 Description botanique de Vanilla planifolia

II.1.3.1. Racines
Le vanillier possède 03(trois) sortes de racines :
- Racines souterraines
Ces racines, de 10 à 15 cm de long, avec ses nombreuses ramifications et ses poils
absorbants qui assurent l’absorption des éléments nutritifs du sol, supportent la plante.
- Racines aériennes
Les racines aériennes possèdent aussi des poils absorbants qui captent l’humidité
atmosphérique et l’eau de pluie.
- Racines adventives ou crampons
Les racines adventives fixent la plante au tuteur et puisent éventuellement la nourriture
en provenance du tuteur.

II.1.3.2. Liane
La liane du vanillier est composée d’une tige grimpante vivace, souple, non lignifiée et
peu ramifiée. Sa forme est cylindrique, généralement de couleur verte et peut atteindre 40 m
de longueur. Elle est constituée par des nœuds et des entrenœuds.

II.1.3.3. Feuilles
Les feuilles sont entières, alternes, presque sessiles, charnues et oblongues. Sa
longueur est de 10 à 22 cm et de 4 à 7 cm de large. Elles sont de couleur verte et sont
parcourues par une dizaine de nervures parallèles. Elles se placent sur les nœuds et sont
alternativement opposées.

Feuille

Liane

Figure1 : Tige et feuilles du vanillier [source M. Grisoni &al, 2009]

3
 II.1.3.4. Fleurs
Les fleurs sont grandes, aromatiques, de couleur jaune verdâtre avec des pétales de 5 à
7 cm de long. Les organes mâles et femelles de la fleur sont séparés l’un de l’autre par une
large membrane appelée languette ou rostellum qui s’oppose à leur rapprochement. C’est
donc une plante naturellement stérile.

Figure 2 : Fleur du vanillier [source ANDRIANOMANANA, 2006]

Les fleurs sont groupées en épis qui naissent à l’aisselle des feuilles souvent à la suite d’une
mutilation artificielle ou naturelle de la liane. Un épi est formé d’un rachis ou axe central de 5
à 10 cm de long sur lequel apparaissent une quinzaine de fleurs.

II.1.3.5. Fruit
Le fruit du vanillier est une gousse de couleur vert clair au moment de la récolte.
C’est une capsule cylindrique mesurant de 10 à 25 cm de longueur et de 8 à 15mm de
diamètre. Les gousses se regroupent en grappes.

Gousse

Figure 3 : Une grappe de vanille [source M.Grisoni &al, 2009]

Les graines à l’intérieur du fruit sont extrêmement nombreuses, globuleuses et de couleur

noire [RATSIRAVAINARIVONY, 2011 ; RANJARAFARA, 2009].

4
 Fécondation
 Fécondation naturelle

Ce n’est qu’au XIXème siècle, après des années de tentatives infructueuses, que l’on
découvre que la fécondation de cette orchidée dépend d’une espèce d’abeille [EMMANUEL,
2014].
Cette abeille appartient au genre Mélipone et comporte un grand nombre de variétés, de
couleur variable: vert pâle, jaune rayé, châtain, brun, noir et même bleu.
Cette abeille est capable de s’introduire dans la corolle de l’orchidée afin de déposer du
pollen sur le pistil [www.alliance-essenienne-de-sauvegarde-des-animaux.org].

 Fécondation artificielle
Edmond Albius, en 1841, a découvert la fécondation manuelle de chaque fleur, à
l’aide d’une épine de citronnier, pour mettre en contact le pollen et le pistil des plus belles
fleurs. C’était la seule façon de féconder la fleur dans les pays où l’abeille mexicaine est
absente [EMMANUEL, 2014].
Durant la seule journée où l’orchidée fleurit, cette opération est effectuée à l’heure
d’ouverture des corolles c'est-à-dire le matin entre 6 et 11h. La fleur est tenue délicatement
d'une main, un doigt servant de point d'appui sous la partie centrale de la fleur. Le capuchon
qui protège les organes sexuels mâles est déchiré avec un instrument pointu. Avec ce même
instrument, la languette qui sépare les organes femelles de la partie mâle est redressée et avec
les doigts, on approche l'étamine porteuse du pollen vers le stigmate ainsi dégagé en exerçant
une petite pression pour assurer un bon contact [PAUL, 2010].

II.1.4 Ecologie

Le vanillier pousse sous des latitudes comprises entre 25°N et 25°S.

La plupart des plantations se trouvent entre 0 et 400 m mais jusqu’ à 600 ou 700 m, le
vanillier se développe assez bien sous des précipitations de l'ordre de 2000 mm par an. Il peut
pousser correctement jusqu'à une altitude d'environ 1000 m.
Le vanillier pousse en climat tropical chaud et humide avec des températures situées entre 20
et 30°C [GILBERT, 1955].

5
Le vanillier est naturellement une plante de sous-bois et nécessite un ombrage suffisant pour
empêcher le rayonnement direct du soleil sur les feuilles et les tiges car ce rayonnement
entraîne la mort de la plante [ERIC, 2005].
Le sol riche en humus, poreux, friable et léger est le mieux pour le vanillier ; ce type de sol
permet ainsi aux racines de s’étendre en tous sens et incite l’excès d’eau à s’écouler
facilement [ELODIE, 2007].

II.1.5 Cycle végétatif

En général, la multiplication du vanillier se fait par bouture de tige.

Phase d’installation
Dans les meilleures conditions, après la mise en place de la bouture, l’enracinement se
produit à la fin de la seconde semaine.

Phase de croissance
Cette phase commence trente à quarante jours après la mise en place de la bouture. La
croissance est très rapide, elle varie de 0,60 à 1,20 m par mois.

Phase de floraison
Elle débute, avec des boutures de 1,20 à 1,50 m, 18 mois environ après leur plantation.
Mais pour avoir une floraison généralisée, il faut attendre trois ans. La durée de floraison par
pied varie de un à deux mois environ.

Phase de fructification
Lorsque la fécondation se termine, l’ovaire grandit et atteint sa taille définitive au bout
de 6 à 8 semaines.

Phase de maturation
Les gousses, une fois formées, mettent sept à neuf mois pour arriver à maturité
commerciale.
Le cycle cultural complet d’une liane varie de six à dix ans, l’installation dure trois ans et trois
à sept ans pour la production [RAZAFINDRATAFIKA, 2006].

6
 II.1.6 Principales maladies de la vanille

II.1.6.1 Maladies dues aux champignons

Anthracnose

L’anthracnose se manifeste par l’apparition de taches brunes ou noires sur les

feuilles.
Toutes les parties aériennes de la plante peuvent être atteintes par la pourriture brun- noir,
caractérisée par le développement de petits renflements, qui après la déchirure de l’épiderme
laissent couler une sorte de mucus gélatineux.
Les taches qui apparaissent sur toute la longueur de la liane atteignent souvent les feuilles et
les gousses, elles sont d’aspect humide qui nécrose rapidement les tissus atteints qui se
dessèchent et meurent [JEAN, 1976].

Maladie de la pourriture noire

La maladie débute le plus souvent près de la base de la plante, se propage ensuite à

l'ensemble des tissus [www.gerbeaud.com].
La maladie peut s'attaquer à n'importe quelle partie de la plante. Les organes atteints
deviennent brun-noir, sauf les racines, exhalant une odeur caractéristique. Après ils se
dessèchent et tombent.
La maladie se présente par des taches nécrotiques, d’aspect humide qui détruit les tissus de la
plante [FRANZ et al, 1992].

Figure 4 : Maladie du vanillier causée par Phytophtora [source M. Grisoni & al ,2009]

7
 Fusariose
Le champignon Fusarium, entraîne une pourriture de la liane ; il se développe à partir
de nécroses humides de couleur jaune puis brune. Les tiges qui sont atteintes dépérissent et se
dessèchent rapidement.
La maladie débute le plus souvent dans la partie souterraine du système radiculaire. Elle se
traduit par une pourriture molle qui progresse de part et d’autre de la zone d’attaque puis
gagne la partie aérienne et prend l’aspect d’une nécrose sèche. Cette nécrose qui remonte
détruit la racine jusqu’à son point d’insertion sur la tige [FRANZ, 1992].

Figure 5 : Maladie fusariose du vanillier [source PASCAL, 2010]

II.1.6.2 Maladies dues aux bactéries

Les maladies sont dues à des bactéries, notamment celles des genres Pseudomonas et
Erwinia.
Les symptômes sont un noircissement des feuilles, qui prennent un aspect gluant.
Les maladies se manifestent par une tache molle, remplie de liquide vert foncé, devenant brun
puis noir. L'infection peut entraîner la mort de la plante [orchidees.jimdo.com].

II.1.6.3 Maladies dues aux virus

Onze virus appartenant à cinq espèces différentes peuvent infecter les vanilliers :

Potexvirus cymbidium mosaic virus (CymMV)

Potyvirus au nombre de sept espèces
Cucumovirus cucumber mosaic virus (CMV)
Tobamovirus odontoglossum ringspot virus (ORSV)
Rhabdovirus [SEVERINE, 2007]

8
 II.1.7 Ravageurs
Les cochenilles (Conchaspis angraeci)
Ce sont des insectes piqueurs suceurs de sève. Ils se cachent souvent à la base des
feuilles.

Les Trips
Ce sont des insectes qui sucent les parties tendres des feuilles, des bourgeons et des
fleurs.

Les pucerons
Ce sont des insectes suceurs qui provoquent par leurs piqures la déformation des
jeunes pousses. Ils pompent la sève des plantes et s’attaquent aux parties tendres et en
croissance.

Les acariens
Ils produisent une fine toile sur les feuilles. Ils sont présents à la face inférieure des
feuilles et induisent un aspect terne et décoloré du feuillage.

Les limaces et les escargots

Ils se régalent des racines aériennes, des feuilles tendres, des fleurs et de leur bouton
[PAUL, 2010].

II.2 Généralités sur la culture in vitro

Le développement harmonieux d’un végétal, aussi bien in situ qu’in vitro, nécessite un
contrôle de la mise en place des différentes structures qui déterminent sa morphologie. La
morphogenèse doit donc être contrôlée par des facteurs internes de la plante (hormones…)
mais aussi par des facteurs externes environnementaux.

II.2.1 Historique
Les premières expériences concernant la culture in vitro remontent, avec le botaniste
allemand Gottido Haberlandt, en 1902. Ce botaniste avait compris que les milieux de culture
devraient contenir les éléments nutritifs essentiels au développement de l’explant.
MURASHIGE et SKOOG, en 1962, mettent au point pour des cultures de tissu de tabac, le
milieu de culture M.S. (Murashige et Skoog) utilisé largement en culture in vitro. Le milieu

9
contient des éléments minéraux, des vitamines, du sucre, de l’auxine et de la cytokinine
[didel-old.script.univ-paris-diderot.fr].

II.2.2 Définition de la culture in vitro

La culture in vitro est un terme très général pour designer des cellules ou des tissus qui
se développent dans un milieu nutritif en conditions d’asepsie pour une période indéfinie. La
régénération d’une plante entière autonome et fertile peut être obtenue à partir des cellules
végétales uniquement (totipotence). Aussi, la culture in vitro végétale est définie par la
culture d'explant de plante, sur un milieu synthétique nutritif, dans des conditions
environnementales stériles et contrôlées pour permettre à l’explant un développement rapide
[CELIA, 2005].

La micropropagation, une des principales techniques de la culture in vitro, consiste à

multiplier un individu donné à partir d’un fragment végétal de taille variable. Des jeunes
plantes identiques à l’explant- mère, et dépourvues de bactéries et champignons, peuvent être
obtenues. [JACQUES, 1993 ; RAZAFIARISON, 2010].

II.2.3 Les différentes phases de la micropropagation

Phase d’initiation
Cette phase consiste à la mise en culture, en condition d’asepsie, soit un méristème
prélevé sur un pied mère sélectionné, soit un explant choisi avec soin sur un pied mère.

Phase de multiplication
Elle consiste à découper les microplants en microboutures. Sur un milieu de
multiplication, chaque microbouture donnera naissance à plusieurs microplants identiques à
celui de l’origine.
C’est une phase dans laquelle on cherche le maximum d’unités de propagation dans un
minimum de temps suivant le végétal obtenu. Ces fragments sont remis en culture puis à
nouveau divisés, ceci est nécessaire jusqu’à l’obtention du nombre désiré de plants.

10
 Phase de rhizogenèse
Cette phase consiste à utiliser des milieux riches en auxine pour favoriser la
production de racines et l’enracinement de la plante naissante.

Phase d’acclimatation
C’est l’étape consistant à sortir la plantule du milieu synthétique dans l’atmosphère
confinée du laboratoire et de la réadapter, par une mise en terre, dans les conditions
extérieures. C’est donc le passage vers les conditions de culture naturelle. C’est parfois une
étape délicate car durant son séjour in vitro la plante est à l’abri des stress
[www.rhododendron.fr].

II.2.4 Avantages de la culture in vitro

 La multiplication rapide des génotypes intéressants : régénération de
nouvelles plantes génétiquement identiques à partir d’un explant de
départ
 La conservation ex-situ, à moyen terme des espèces menacées (en
condition de croissance ralentie)
 Le moyen efficace pour la procédure d’échange de ressources
génétiques
 Le raccourcissement des cycles de développement
 Le rajeunissement d’un matériel végétal [www.imra-ratsimamanga.org].

II.2.5 Inconvénients de la culture in vitro

 Certains accidents, non prévisibles au départ, peuvent intervenir en
cours de culture in vitro, comme des malformations dues à un
déséquilibre hormonal (la vitrification)
 La production répétée de grands nombres de plants uniformes (clones)
peut entraîner la perte de certains gènes nécessaires, par exemple, à la
résistance aux maladies nouvelles; il faut donc conserver le pied mère et
à certains moments, repasser par la reproduction sexuée
 L’absence ou insuffisance de souplesse d’adaptation des clones dans des
milieux naturels par rapport aux populations génétiquement hétérogènes

11
  La perte de la diversité génétique
 L’apparition de mutations spontanées provoquant la perte de
l’homogénéité de l’espèce [GERAT, 2010].

II.2.6 Les différentes hormones de croissance

L’homme utilise la multiplication végétative en culture in vitro pour la production en
masse de plantes par régénération à partir d’un fragment végétal ou explant. L’avantage est de
reproduire à l’infini la même plante d’intérêt agronomique ou horticole. Des balances
hormonales sont utilisées pour induire d’abord la division cellulaire, puis la formation de tiges
feuillées (caulogenèse) et la formation des racines (rhizogenèse).

Deux principaux types d’hormone végétale (phytohormones) sont généralement utilisés lors
des cultures in vitro : les auxines et les cytokinines.

II.2.6.1 Les auxines

La synthèse d’auxine est identifiée dans les plantes, et est généralement liée à des
stades de croissance intenses. Les auxines sont des hormones qui stimulent l'allongement de
cellule différentielle et fonctionnent comme des régulateurs de croissance. Ils regroupent les
hormones de croissance favorisant principalement la rhizogenèse (différenciation des cellules
de racine) mais selon la concentration d’auxine utilisée, la réponse de la cellule cible peut être
très différente.

II.2.6.2 Les cytokinines

Les cytokinines sont présentes dans presque tous les tissus. Elles stimulent la division
cellulaire, sous réserve qu'elles soient en présence d'auxine. L'effet précis des cytokinines
porte sur la duplication des chromosomes et sur le recloisonnement cellulaire. Elles agissent
généralement sur l'auxèse (augmentation de la taille des cellules) au niveau de cellules où
l'auxine n'agit pas (exemple des cellules foliaires) mais sont généralement inhibitrices de la
rhizogenèse [svtlagny.free.fr].

12
III. METHODOLOGIE
III.1 Isolement et identification des microorganismes issus des échantillons malades

Le but de cette étape est d’isoler et de purifier tous les microorganismes présents à
l’intérieur des feuilles de vanillier malades.
Les échantillons sont traités et mis dans un milieu de culture spécifique pour les bactéries et
les champignons. Les microorganismes obtenus sont ensuite purifiés et identifiés.

III.1.1 Matériels utilisés

a- Matériel végétal
Les échantillons utilisés proviennent de la région de SAVA. Les symptômes étudiés lors de
cette étude sont représentées dans les figures suivantes :

Taches noires sur la tige et le bout des

feuilles

Feuille marron

Jaunissement et brunissement des feuilles,

Brunissement et taches marron sur les

feuilles

Aucun symptôme observé

Figure 6 : Feuilles prélevées sur terrain (avec description des symptômes de la maladie
étudiée)

13
 b- Matériels et équipements

Les matériels comprennent les matériels de laboratoire (annexe I), les milieux de
culture et les solvants.
Milieux de culture : Pour les bactéries, nous avons choisi le milieu Nutrient Agar (NA) et
pour les champignons le PDA (Potato Dextrose Agar) (Annexe II).
Solvants utilisés pour désinfecter les feuilles : mélange d’alcool 70%, hypochlorite de
sodium, eau distillée stérile.

III.1.2 Isolement et identification des microorganismes

III.1.2.1 Prétraitement des feuilles malades

La désinfection en surface consiste à éliminer tous les microorganismes présents à la

surface des feuilles.
Les feuilles sont lavées avec de l’eau savonneuse puis rincées abondamment avec l’eau de
robinet.
La désinfection se déroule sous hotte à flux laminaire préalablement nettoyée et désinfectée.
Les feuilles sont trempées dans l’alcool 70% pendant 30 secondes. La désinfection se poursuit
par l’immersion des feuilles avec une gamme de concentration différente d’hypochlorite de
sodium 0,3%, 0,5% et 1% pendant 10 minutes puis rincées 3 fois à l’eau distillée stérile.

III.1.2.2 Mise en culture

Sous hotte à flux laminaire, à l’aide des ciseaux stériles, les feuilles sont découpées en
petits carrés stériles qui sont ensuite déposés sur de la gélose nutritive NA additionné
d’antifongique (cycloheximide) pour les bactéries et du PDA additionné d’antibiotique
(chloramphénicol) pour les champignons.
L’incubation des cultures ainsi préparées s’effectue à 25°C pendant 7 jours pour les
champignons et à 37°C pendant 3 jours pour les bactéries. Les cultures sont observées
quotidiennement.

III.1.2.3 Isolement

L’isolement consiste à séparer les bactéries et les champignons contenus dans un

mélange (échantillon).

14
Lorsqu’un mycélium émerge d’une culture, ce dernier est prélevé et repiqué directement sur
un autre milieu PDA sans antibiotique et les souches bactériennes qui émergent sont
transférées sur NA sans antifongique.

III.1.2.4 Purification

La purification consiste à repiquer successivement une colonie préalablement

caractérisé sur milieux solides.
Pour les bactéries, les souches ont étés repiquées toutes les 24 heures sur de nouveaux milieux
NA jusqu’à l’obtention de souche pure.
Pour les champignons, le repiquage se fait tous les 3 jours pour l’obtention de souches pures.
Le nombre de différentes souches isolées et purifiées pour chaque échantillon a été noté.

III.1.2.5 Identification

III.1.2.5.1 Identification des bactéries

 L’observation macroscopique
Les caractéristiques macroscopiques des cultures de 24 heures sont examinées à l’œil
nu. Les critères analysés sont la taille, la couleur, le contour, l’aspect, la consistance, le relief
et la transparence des colonies.

 L’observation microscopique

Examen à l’état frais

L’observation, sous microscope, à l’état frais permet de déterminer le mode de
groupement et la mobilité des bactéries. Cette technique ne nécessite ni une coloration ni une
utilisation de réactif.
Un prélèvement issu d’une colonie isolée de chaque souche pure est monté entre lame et
lamelle avec de l’eau distillée stérile puis observé sous microscope optique.

Coloration de Gram
La coloration de Gram est une technique de coloration de base en bactériologie qui
permet de distinguer les bactéries en deux groupes, bactéries Gram positif (+) et bactéries
Gram négatif (-), selon l’affinité de leur paroi avec les colorants spécifiques utilisés.

15
Une goutte d’eau distillée stérile est versée sur une lame mince pour étaler une partie aliquote
d’une colonie bactérienne prélevée d’une culture pure. Le frottis obtenu, après fixation par
séchage sur une plaque chauffante, est recouvert de violet de gentiane pendant une minute,
puis d’une solution de Lugol pendant 30 secondes avant d’être rincé abondamment à l’eau du
robinet. Le frottis est ensuite décoloré à l’alcool absolu puis rincé à l’eau de robinet. La
préparation est ensuite couverte de Fuschine pendant une minute. Après rinçage à l’eau de
robinet, la lame est séchée sur une plaque chauffante et observée au microscope. La forme et
la couleur des cellules bactériennes sont notées :
- Les bactéries Gram(+) gardent la coloration du violet de gentiane, même après la
décoloration à l’alcool,
- Les bactéries Gram (-) sont décolorées par l’alcool et sont recolorées en rose par la
Fuschine.

III.1.2.5.2 Identification des champignons

Après 5 jours d’incubation, les colonies de champignon sont observées

macroscopiquement : le diamètre de chaque colonie est mesuré, la couleur, la texture, le relief
et la consistance sont notés.

III.1.3 Conservation

La conservation des souches pures est indispensable car elle peut être utile pour
d’autres études ou pour améliorer la recherche faite auparavant.
Il existe de nombreuses méthodes de conservation mais nous avons choisi la conservation au
réfrigérateur +4°C sur gélose pente et à -20°C au congélateur dans des cryotubes contenant de
la glycérine.

III.2 Postulat de Koch

III.2.1 But

Le postulat de Koch a pour but de confirmer le diagnostic d’une maladie infectieuse et

de prouver que l’agent pathogène isole de la plante malade est bien responsable des
symptômes observés.

16
 III.2.2 Principe

Il consiste à inoculer un germe, isole à partir des feuilles malades et susceptibles d’être
le responsable de l’infection, sur une feuille saine.

III.2.3 Inoculation des microorganismes

Les feuilles saines sont abondamment lavées à l’alcool puis rincées 3 fois avec de
l’eau distillée stérile puis essuyées avec du papier buvard. Chaque feuille est ensuite placée
dans une boîte de Pétri stérile.
Pour chaque souche bactérienne, un volume de 3 ml d’inoculum de 108 UFC/ml équivaut à
0,5 McF a été inoculé sur la feuille préalablement blessée par une aiguille stérile.
Pour chaque souche de champignon, le mycélium est coupé en morceaux (de 2 mm à partir
du front de croissance d’une culture jeune) qui sont par la suite inoculés à la périphérie d’une
feuille blessée.

Des billes de verre sont placées dans les boîtes de Pétri contenant les feuilles infectées. Les
boîtes sont ensuite incubées sous lumière blanche continue, à température ambiante à 25°C.
Les feuilles saines « témoin » sont traitées de la même façon mais sans inoculation de germe.

III.3 Microbouturage
III.3.1 But
Le microbouturage a pour but d’augmenter la rapidité et la fiabilité du processus de
croissance des plantes.

III.3.2 Principe

Toutes les cellules d'une plante possèdent le même patrimoine génétique. Ainsi, avec
la totipotence cellulaire, la régénération de la plante entière peut être obtenue à partir d’un
explant qui est un fragment de plante mère.

III.3.3 Matériels utilisés

a. Matériel végétal
Les explants utilisés proviennent de l’IMRA. Ce sont des parties de plantes saines
obtenues par culture in vitro de Vanilla planifolia.

17
 b. Milieux de culture (annexe II)
Les milieux de culture utilisés sont composés de :
- macroéléments : constitués par des ions potassium, magnésium, ammonium,
phosphate et de calcium.
- microéléments ou oligoéléments comme l’iode, cobalt, bore, fer, cuivre.
- vitamines comme la glycine, l’acide nicotinique, la thyamine, la pyridoxine.
- autres compléments organiques comme hydrolysat de caséine, MES, du sucre, des
peptones et de l’agar peuvent être additionnés aux milieux de culture.

c. Préparation des milieux de culture (annexe II)

Nous avons choisi le milieu P6793, qui a été expérimenté pour la culture in vitro de
beaucoup d’espèces d’orchidée, additionné de sucre utilisé comme source de carbone et
d’agar pour solidifier le milieu de culture. Le pH du milieu est ajusté entre 5,6 et 5,8.
Les milieux sont distribués dans plusieurs tubes et stérilisés à 1,5 Bar à une température de
120°C pendant 20 minutes.

d. Les régulateurs de croissance

Lors des cultures in vitro, nous avons utilisé :
- L’hormone synthétique IBA (Indole 3 Butiric Acid) comme auxine.
- L’hormone synthétique BAP ou BA (BenzylAminoPurine) comme cytokinine.
Les hormones IBA et BA sont préalablement préparées sous forme de solution stock avec une
concentration respective de 1mg/ml.

III.3.4 Mise en culture

Le travail se déroule sous hotte à flux laminaire. Les explants utilisés sont des plantes
saines et la désinfection n’est pas nécessaire.
Les plantes sont coupées nœuds par nœuds avec des ciseaux stériles et les explants obtenus
sont ensuite transférés dans différents milieux de culture.

18
Tableau 1 : Milieux de culture avec les hormones de croissance

Milieux P6793 BA IBA

M1 = témoin Sans hormones
M2 = BA1 + IBA1 1mg /l 1mg/l
M3 = BA1 + IBA2 1mg/l 2mg/l
M4 = BA2 + IBA1 2mg/l 1mg/l
M5 = BA2 + IBA2 2mg/l 2mg/l

Après 4 mois, le nombre de pousses obtenues est compté et la longueur des racines ainsi que
la longueur des pousses sont mesurées.

19
IV. RESULTATS
IV.1 Isolement et identification des microorganismes issus des échantillons malades

Quarante-cinq (45) bactéries et 17 champignons ont été isolés des 5 échantillons de

feuilles. Cependant, des doublons ont été repérés et éliminés après la caractérisation
macroscopique. D’où, après purification, 20 souches bactériennes ont étés finalement retenues
(figure 7).
Les souches de bactérie sont désignées comme suit :
V = vanillier, suivi du numéro de l’échantillon
B = bactérie, suivi du numéro de la souche

Echantillon 1

V1B1 VIB2 VIB3 VIB4

Echantillon 2

V2B1 V2B2 V2B3 V2B4

Echantillon 3

V3B1 V3B2 V3B3

20
Echantillon 4

V4B1 V4B2 V4B3 V4B4

Echantillon 5

V5B1 V5B2 V5B3 V5B4 V5B5

Figure 7 : Photos des souches pures de bactérie issues des 5 échantillons (source: auteur)

Quinze champignons ont été obtenues à partir des 5 échantillons, après purification (figure
8).

Les souches de champignon sont désignées comme suit :

V = vanillier, suivi du numéro de l’échantillon
C = champignon, suivi du numéro de la souche

Echantillon 1

V1C1 V1C2

21
Echantillon 2

V2C1 V2C2

Echantillon 3

V3C1 V3C2

V3C3 V3C4

V3C5

22
Echantillon 4

V4C1 V4C2

V4C3 V4C4

Echantillon 5

V5C1 V5C2

Figure 8 : Photos des souches pures de champignon issues des 5 échantillons (source :
auteur)

23
 IV.1.1 Caractéristiques macroscopiques des bactéries

Les caractéristiques macroscopiques observées sur les vingt (20) souches bactériennes sont
représentées sur le tableau 2.

Tableau 2 : Caractères macroscopiques des colonies des souches bactériennes

Souche Taille Transparence Consistance Couleur Aspect Relief Contour

Echantillon 1
V1B1 moyenne translucide crémeuse blanchâtre rugueux semi-bombé régulier
V1B2 moyenne opaque crémeuse jaunâtre lisse bombé régulier
V1B3 moyenne translucide crémeuse blanchâtre lisse plat régulier
V1B4 moyenne opaque grasse blanchâtre lisse plat irrégulier
Echantillon 2
V2B1 petite translucide grasse blanchâtre lisse plat régulier
V2B2 grande opaque grasse jaunâtre lisse bombé régulier
V2B3 petite opaque grasse jaunâtre lisse semi-bombé régulier
V2B4 moyenne translucide crémeuse blanchâtre lisse bombé régulier
Echantillon 3
V3B1 moyenne translucide grasse blanchâtre lisse semi-bombé régulier
V3B2 petite translucide crémeuse blanchâtre lisse plat régulier
V3B3 petite opaque grasse jaunâtre lisse plat régulier
Echantillon 4
V4B1 moyenne translucide crémeuse blanchâtre rugueux semi-bombé régulier
V4B2 petite opaque grasse jaunâtre lisse plat régulier
V4B3 petite translucide grasse blanchâtre rugueux plat régulier
V4B4 petite translucide crémeuse blanchâtre lisse semi-bombé régulier
Echantillon 5
V5B1 moyenne transparente grasse transparente lisse plat régulier
V5B2 moyenne translucide crémeuse blanchâtre lisse plat régulier
V5B3 petite translucide grasse blanchâtre lisse semi-bombé régulier
V5B4 moyenne translucide grasse blanchâtre lisse plat régulier
V5B5 moyenne translucide crémeuse blanchâtre rugueux semi-bombé régulier

Pour chaque échantillon, la taille des colonies varie selon les souches sauf pour V1 dont les
quatre souches sont toutes de taille moyenne. Pour les cinq échantillons, les colonies

24
sont translucides ou opaques sauf pour V5B1 qui possède des colonies transparentes ; de
consistance grasse ou crémeuse ; de couleur jaunâtre ou blanchâtre ; d’un aspect lisse ou
rugueux avec un relief variant du plat à bombé, et ont un contour régulier.

IV.1 .2 Caractéristiques microscopiques des bactéries

Le tableau 3 montre les caractéristiques microscopiques observées sur les vingt (20)
souches de bactérie.

Tableau 3 : Caractères microscopiques des cellules des souches bactériennes

Souche Mobilité Mode de groupement Forme Gram
Echantillon 1
V1B1 mobile 2 par 2 bacille (-)
V1B2 mobile isolé bacille (-)
V1B3 mobile 2 par 2 coccobacille (-)
V1B4 mobile 2 par 2 bacille (-)
Echantillon 2
V2B1 mobile isolé bacille (-)
V2B2 mobile isolé bacille (-)
V2B3 mobile 2 par 2 cocci (-)
V2B4 immobile en amas bacille (+)
Echantillon 3
V3B1 mobile 2 par 2 bacille (-)
V3B2 mobile 2 par 2 bacille (-)
V3B3 immobile 2 par 2 coccobacille (+)
Echantillon 4
V4B1 mobile 2 par 2 bacille (+)
V4B2 mobile en amas coccobacille (-)
V4B3 immobile isolé cocci (-)
V4B4 mobile en chaînette bacille (-)
Echantillon 5
V5B1 mobile isolé coccobacille (-)
V5B2 mobile 2 par 2 cocci (+)
V5B3 mobile isolé coccobacille (-)
V5B4 mobile isolé cocci (+)
V5B5 mobile 2 par 2 bacille (+)

25
L’examen microscopique à l’état frais a permis de déduire que parmi les souches bactériennes
isolées : 17 souches sont formées par des cellules mobiles et 3 par des cellules immobiles. Le
mode de groupement des cellules est soit isolé (7souches) soit 2 par 2 (10souches), soit en
amas (2 souches), soit en chaînette (1 souche).
La coloration Gram a montré que 11 souches de bactérie sont constituées par des bacilles, 5
par des coccobacilles et 4 par des cocci ; 14 souches sont des bactéries Gram (-) et 6 souches
des Gram (+).

IV.1 .3 Caractéristiques macroscopiques des champignons

Les caractéristiques macroscopiques des 15 souches pures de champignon sont

représentées sur le tableau 4.
Tableau 4 : Caractères macroscopiques des colonies des souches pures de champignon

Souche Texture Relief couleur surface consistance Diamètre

Echantillon 1
V1C1 cotonneuse surélevé blanche molle 80 mm
V1C2 velouteuse plat verdâtre dure 30 mm
Echantillon 2
V2C1 cotonneuse avec stries radiales rose molle 85 mm
V2C2 cotonneuse plissé verdâtre élastique 70 mm
Echantillon 3
V3C1 cotonneuse surélevé rose élastique 65 mm
V3C2 duveteuse plissé noire molle 70 mm
V3C3 cotonneuse plissé verdâtre molle 60 mm
V3C4 velouteuse plat verdâtre dure 90 mm
V3C5 cotonneuse surélevé verdâtre molle 80 mm
Echantillon 4
V4C1 cotonneuse avec stries radiales rose molle 85 mm
V4C2 cotonneuse plissé verdâtre molle 60 mm
V4C3 cotonneuse surélevé rose molle 80 mm
V4C4 velouteuse avec stries radiales verdâtre molle 75 mm
Echantillon 5
V5C1 velouteuse surélevé verdâtre molle 85 mm
V5C2 cotonneuse avec stries radiales verdâtre dure 60 mm

26
Les quinze souches de champignon ont montré des colonies à caractères macroscopiques
différents. Les colonies possèdent une texture cotonneuse ou velouteuse sauf pour V3C2 qui
est duveteuse ; leur consistance est molle, élastique ou dure ; leur relief plat, surélevé, plissé
ou à stries radiales ; leur couleur est blanche, rose, verdâtre ou noire ; leur diamètre est
compris entre 30 et 90 mm durant les jours d’incubation.

IV.2 Postulat de Koch

IV.2 .1 Inoculation des champignons

Les résultats de l’inoculation respective des 15 souches de champignon ont montré que
seule l’inoculation des souches V3C2 (figure 9) et V3C5 (figure 10) reproduit les symptômes
de la maladie des feuilles.

IV.2 .1.1 Inoculation de la souche V3C2

(a) 1er jour

27
 6ème jour : des taches jaunes se
(b) développent à la surface du limbe

9ème jour : jaunissement de toute la surface

(c)
du limbe.

12ème jour : jaunissement et brunissement

(d) de tout le limbe.

28
 15ème jour : brunissement de la feuille
(e)

Figure 9 (a, b, c, d, e) : Symptômes observés après inoculation de la souche V3C2

(source : auteur)

Les feuilles témoins sont restées intactes pendant les jours de suivi.
Avec la souche V3C2, l’apparition des symptômes commencent au 6ème jour après
l’inoculation (figure 9b). Le brunissement complet de la feuille n’apparait qu’au 15ème jour
(figure 9e).

29
IV.2.1.2 Inoculation de la souche V3C5

1er jour

(a)

10ème jour : jaunissement de la partie

supérieure du limbe.
(b)

30
 (c) 12ème jour : brunissement de la partie supérieure du
limbe et jaunissement du reste.

14ème jour : brunissement de toute la surface de la

(d)
feuille.

Figure 10 (a, b, c, d) : Symptômes observés après inoculation de la souche V3C5 (source :

auteur)

Avec la souche V3C5, une tache jaune commence à apparaitre au 10ème jour après
l’inoculation (fig10b) mais le brunissement total de la feuille infectée ne surgit qu’au 14ème
jour (figure10d).

IV.2 .2 Inoculation des bactéries

Durant les 20 jours de suivi, aucun symptôme n’est apparu sur les feuilles inoculées

par les souches de bactérie. Toutes les feuilles sont restées vertes et aucun changement n’a été
observé.

31
IV.3 Microbouturage

Lors de 5 répétitions de microbouturage, la longueur des racines et la longueur des

pousses sont mesurées et le nombre de pousses est compté.

Pousses

Racines

(a) (b) (c) (d) (e)

Figure 11: Microbouturage avec les hormones de croissance (source : auteur)

IV.3.1 Longueur des racines

Après 4 mois de culture, les explants qui ont été mis en culture commencent à pousser
(figure 11 a, d, e), mais pour le milieu additionné de BA1+ IBA1 et pour le milieu additionné
de BA2+IBA1 (figure b, c), les explants ne présentent pas de racines.

La longueur des racines, selon les concentrations des hormones utilisées, après 4 mois de
culture, est représentée dans le tableau 5 et dans la figure 12.

Tableau 5 : Longueur des racines avec les différentes concentrations d’hormone

milieu témoin BA1+IBA1 BA2+IBA1 BA1+IBA2 BA2+IBA2

longueur des racines (cm) 5,4± 0,86 0 0 1,6± 0,73 0,7± 0,24

32
 Longueur des racines

Longueur des
racines (cm)
6
5
4
3
2
1
0

Milieu de culture
de Vanilla planifolia

Figure 12 : Longueur des racines avec les différentes concentrations d’hormone

Ces résultats, après 4 mois de culture, montrent que les racines dans le milieu témoin ont été
plus longues par rapport aux racines des milieux additionnés d’hormone de croissance. La
présence d’hormone sur les milieux n’a aucun effet sur la formation de racines. Cependant,
les résultats dans les milieux à hormones ont montré que la formation des racines nécessite de
l’IBA en forte concentration (2 mg/l) :
- aucune apparition de racines n’a été observée sur les milieux à faible concentration
d’IBA (milieux 2 et 3)
- de courtes racines ont été observées dans les milieux à concentration d’IBA plus
élevée (milieux 4 et 5)

IV.3.2 Longueur des pousses

La longueur des pousses, après 4 mois de culture et selon les types d’hormone utilisés,
est représentée dans tableau 6.

Tableau 6 : Longueur des pousses avec les différentes concentrations d’hormone

Milieu témoin BA1+IBA1 BA2+IBA1 BA1+IBA2 BA2+IBA2

longueur des pousses (cm) 4,5±1,48 3,5± 0,63 2,9± 0,8 1,6± 0,37 2,4± 0,86

33
 Longueur des pousses

Longeur des
pousses (cm)
5
4
3
2
1
0

Milieux de culture
de Vanilla planifolia

Figure 13 : Longueur des pousses avec les différentes concentrations d’hormone

Dans le milieu témoin, les pousses sont plus longues par rapport aux autres milieux
additionnés d’hormones de croissance (figure 13, tableau 6) même si leur nombre sont moins
réduite (figure14, tableau 7).

IV.3.3 Nombre de pousses

Le tableau 7 et le figure 14 montrent le nombre de pousses observé après 4 mois de
culture.
Tableau 7 : Nombre de pousses avec les différentes concentrations d’hormones
Milieu témoin BA1+IBA1 BA2+IBA1 BA1+IBA2 BA2+IBA2
3,8± 1,6 5,6± 1,85 4,5± 1,6 5,6± 1,95 5,4± 2,57
nombre des pousses

Nombre de pousses
6
5
nombre de
pousses

4
3
2
1
0

milieu de culture de
Vanilla planifolia

Figure 14 : Nombre de pousses avec les différentes concentrations d’hormone

34
Ainsi, concernant les pousses :
Dans le milieu témoin, les pousses sont plus longues par rapport aux pousses des milieux
additionnés d’hormone de croissance (figure 13, tableau 6), même si leur nombre y est
moindre (figure14, tableau 7).
La longueur des pousses, sauf dans le milieu 4, est inversement proportionnelle aux taux des
hormones dans le milieu (figure 13). La combinaison hormonale BA et IBA dans les milieux
(2, 3,4 et 5) a donné un nombre de pousses plus élevé par rapport au nombre de pousses dans
le milieu témoin sans hormone (figure 14).
D’après les figures 13 et 14, le milieu additionné d’hormone IBA à 1mg/l et BA à 1mg /l
(milieu 2) est le plus efficace pour la formation et l’élongation des pousses.

35
V. DISCUSSION
V.1 Isolement et identification des microorganismes issus des échantillons malades

Quarante-cinq (45) souches de bactéries et 17 souches de champignons ont été isolées

à partir des 5 échantillons de feuilles malades mais, après les différents stades de purification
et d’identification, 20 souches de bactéries et 15 souches de champignons sont obtenues. Ce
qui montre que, dans les feuilles de vanillier étudiées, les champignons ont une colonisation
faible par rapport aux bactéries.
Lors de l’identification macroscopique des 20 souches de bactéries, les colonies ont été
blanchâtres ou jaunâtre. L’identification microscopique a montré que les souches bactériennes
ayant des cellules à formes bacille et Gram négatif sont dominantes.

Selon KNUDSEN en 2013, les bactéries phytopathogènes sont généralement de forme bacille
à Gram négatif et appartiennent à la famille des enterobacteriaceae. Une pourriture molle
bactérienne est causée par l’espèce Erwinia carotovora qui en fait partie.
Même si certaines des souches de bactéries isolées des feuilles de vanillier malades sont de
forme bacille et à Gram négatif, leur inoculation sur des feuilles saines n’a pas donné les
symptômes de la maladie attendus.

Les champignons observés macroscopiquement sont de couleur blanc, rose, vert et noir ; le
diamètre de mycélium pendant les 5 jours d’incubation varie de 30 à 90 mm.
D’après FUNG-KWOK et GRISON en 2012, les champignons sont généralement les
responsables des maladies du vanillier en particulier la fusariose, due à Fusarium oxysporum
fsp vanillae, qui est une maladie très grave et selon HASSENA en 2009, les champignons de
cette espèce sont considérés comme étant les champignons telluriques les plus agressifs.
RAVELOMANANTSOA en 2008, lors de ses études concernant l’isolement des
champignons des explants malades du bananier a montré que les champignons de l’espèce
Fusarium oxysporum sont les plus abondants.
D’après TABUC en 2013, la caractérisation macroscopique de cette espèce montre que la
vitesse de croissance est modérée sur les milieux de culture utilisés. Les colonies sont de
couleur blanche, pêche, rose-saumon à violet et le revers pourpre. Néanmoins, cette espèce
n’est pas à écarter parmi les 15 souches de champignons que nous avons isolées des feuilles
malades de vanillier, mais des identifications microscopiques sont nécessaires.

36
V.2 Postulat de Koch
En 1881, Koch a présenté des règles permettant d’établir les relations de cause à effet
qui existent entre la présence d’un pathogène et l’établissement d’une maladie chez l’homme
ou l’animal.
Le postulat de Koch a été vérifié, par KHEY, en inoculant à des fragments de feuille de
Chamaerrops humilis, maintenu en survie un champignon pathogène. L’inoculation s’est faite
avec des disques mycéliens prélevés à partir du front de croissance d’une culture jeune du
champignon.

Lors de notre travail, la technique adoptée pour vérifier le postulat de Koch est celle de
KHEY en 2013 :
Parmi les 15 souches de champignon que nous avons isolées des feuilles de vanillier malades,
seules deux souches (V3C2 et V3C5) ont provoqué, durant les jours de suivi, les mêmes
symptômes lorsqu’elles ont été inoculées à des feuilles saines. Cependant, les symptômes ont
apparu à des temps différents d’incubation pour les deux souches. Ces deux souches de
champignon sont-elles les agents microbiens responsables de cette maladie ?

D’après KHEY, les symptômes n’apparaissent que 15 jours d’inoculation alors que d’après
KACHKOUCH en 2011 et al, le postulat de Koch sur des feuilles d’Erythnia caffra a montré
que les lésions sur les feuilles apparaissent 4 jours après l’inoculation dans les disques
mycéliens. Notre travail montre que les symptômes ont été visibles dès le 6ème jour et le 10ème
jour respectivement pour les champignons V3C2 et V3C5. Ainsi, le délai d’apparition des
symptômes que nous avons observé se situe entre ceux de KACHKOUCH et de KHEY.

Des symptômes ne sont pas apparus dans les cas d’inoculation des bactéries car les feuilles
saines traitées sont restées vertes. Aucun changement n’a été observé sur les feuilles infectées,
pendant les jours de suivi. Les bactéries isolées ne sont-elles pas responsables de la
symptomatologie ou celle-ci ne se manifeste-t-elle pas in vitro ? VIJAYAN en 2012
mentionnât que le développement des microorganismes in vitro et in planta pourrait se
manifester autrement.
Par ailleurs, les bactéries obtenues après isolement peuvent être considérées comme des
bactéries pathogènes latentes. En effet, d’après RAVELOMANANTSOA en 2004, confirmé
par RAJAONARIVELO en 2006, les endophytes pathogènes latentes sont des
microorganismes qui n’expriment pas leur virulence dans l’immédiat et ne causent pas de

37
symptômes apparents. La période de latence, pour les endophytes pathogènes, est une période
au cours de laquelle, la plante se comporte ″convenablement″ tout en les hébergeant.

V.3 Microbouturage

Après 4 mois de culture, seules les racines dans le milieu témoin se sont développées
et sur les milieux 2 et 3, ayant une faible concentration en hormones, les racines sont absentes
mais les pousses se multiplient.
D’après les résultats obtenus, les racines dans le milieu témoin sont plus longues par rapport
aux milieux additionnés d’hormones de croissance et les racines ne sont formées qu’en
présence de forte concentration en IBA. Le milieu témoin et le milieu additionné en forte
concentration IBA (2mg/l) sont donc favorables à la formation des racines.

Les pousses sont plus longues dans le milieu témoin mais elles sont moins nombreuses que
dans les différents milieux ajoutés d’hormones.
Les résultats montrent que les combinaisons hormonales de concentration BA1+IBA1,
BA1+IBA2 et BA2+IBA2 sont meilleures pour la multiplication des pousses.

D’après les résultats obtenus, le milieu témoin est déjà un bon milieu pour la croissance
normale d’une plante. Ce milieu est caractérisé, d’après SAID et al en 2009, par une très forte
teneur en azote et une concentration élevée en potassium et ces deux composants sont
nécessaires au développement des plantes. L’azote qui est un élément minéral favorisant le
développement végétatif tandis que le potassium favorise la division cellulaire.
Selon SKOOG cité par SAID et al en 2013, lorsque le rapport auxine /cytokinine est élevé,
l’explant évoluera vers la callogenèse, tandis que selon Auge (1989), la concentration élevée
en BA additionnée aux auxines favorise la prolifération des bourgeons.
D’après RAZAFIARISON en 2010, l’hormone BA n’a d’influence que sur le développement
des bourgeons et la croissance des pousses ce qui confirme les propriétés physiologiques des
cytokinines observées lors du présent travail.
Les résultats obtenus, après 4 mois de culture, ne sont pas loin de ceux obtenus par des études
précédentes. Nos résultats montrent que l’utilisation des hormones de croissance de 1mg /l est
déjà suffisante pour le développement des pousses tandis que le développement harmonieux
de la plantule, c’est-à-dire les racines et les pousses bien formées, est obtenu dans le milieu
additionné de BA1+IBA2. Toutefois, la combinaison hormonale entre l’auxine (IBA) et la

38
cytokinine (BA) n’a pas donné de meilleurs résultats par rapport au milieu témoin utilisé alors
que l’emploi des hormones devrait accélérer la croissance des microboutures.

39
VI. CONCLUSION
ET PERSECTIVES
 La vanille, le fruit du vanillier ou Vanilla planifolia (Orchidaceae), est une épice très
appréciée et très consommée dans le monde entier. Elle est surtout utilisée comme arôme et
parfum dans les industries agroalimentaires mais est aussi utilisée en cosmétique et en
parfumerie.

Madagascar est le premier producteur et exportateur de vanille au monde et la vanille de

Madagascar est réputée pour son excellente qualité. La région de la SAVA (Sambava,
Antalaha, Vohémar et Andapa) produit 95% environ de la vanille de Madagascar.

Au cours de ce travail, 20 souches de bactérie et 15 souches de champignon ont été isolées à

partir des échantillons de feuilles de vanillier malades prélevés sur terrain. La maladie se
manifeste par des symptômes qui colorent les feuilles. Seules 2 souches de champignon ont
causés les symptômes de la maladie, après vérification par la méthode de postulat de Koch sur
feuille, tandis qu’aucune des souches de bactérie isolées ne provoque les symptômes de la
maladie sur les feuilles traitées.

Pour la micropropagation des explants de vanillier, le milieu additionné des hormones BA1 et
IBA2 est favorable à leur multiplication mais la bouture obtenue dans le milieu témoin serait
plus convenable pour l’acclimatation puisque le développement des pousses et celui des
racines y sont les meilleurs et plus proportionnels.

Dans l’avenir, il serait primordial de compléter l’identification des microorganismes

responsables des symptômes de la maladie des feuilles de vanillier afin d’envisager une lutte
biologique efficace pouvant améliorer la production de vanille.
Il serait aussi intéressant de procéder à l’acclimatation des plantules de vanillier obtenues lors
de la multiplication in vitro.

40
 REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
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ANNEXES
ANNEXE I : LISTE DES MATERIELS ET EQUIPEMENTS

Agitateur magnétique chauffant

Autoclave
Balance
Balance de précision
Bec bunsen
Bocal
Boîtes de Pétri 90mm
Densichek
Eprouvettes graduée
Erlen meyer gradué
Fiole jaugée
Hotte à flux laminaire
Incubateur
Loupe binoculaire
Micropipettes et cône
Microscope
PH-mètre
Pipette
Réfrigérateur
Tubes à essai
 ANNEXE II : COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE

NA (Nutrient Agar)
Peptone Water 5g/l

Beef Extract 3g/l

Agar microbiologique 15g/l

pH=7,2

Composition du milieu de culture PDA

Pomme de terre 200g/l

Sucre 20g/l

Agar 15g/l

pH= 5,6

Antifongique et antibiotique utilisés et sa concentration

Cycloheximide à 40mg/l

Chloramphénicol 200 mg/l

Composition du milieu de culture P6793 pour 1L

Stock 1(microelements):50 ml

Stock 2(microelements):10 ml

Stock 3 (oligoélements): 10 ml

Stock 4 (vitamine): 1 ml

Sucre 20g

Peptone 1g

Caséine hydrolysat 1g

MES 1g

pH= 5,6
 NH4NO3 4,125 g.
KNO3 4,75g.
Macroéléments CaCl2 H2O 1,1 g.
MgSO4 7 H2O 0,925 g.
KH2PO4 0,425 g.
H3BO3 155 mg.
MnSO4 4 H2O 422,5 mg.
ZnSO4 7 H2O 215 mg.
Microéléments Kl 20,75 mg.
Na2MoO4 2H2O 6,25 mg.
CuSO4 5 H2O 0,625 mg.
CoCl2 6 H2O 0,625 mg.
FeSO4 7 H2O 776 mg.
Oligoéléments
Na2 EDTA 932 mg.
ANNEXE III : RESULTATS APRES ISOLEMENT DES
MICROORGANISMES ISSUS DES ECHANTILLONS
MALADES
 ANNEXE IV : DIFFERENCE ENTRE LES PAROI DES
BACTERIES A GRAM POSITIF ET NEGATIF

Figure : différence entre bactérie gram (+) et bactérie gram (-)

Source : http://www.unige.ch/
 ANNEXE V :

Tableau représentant la longueur des racines (cm), la longueur des pousses (cm) et le
nombre de pousses, après 4 mois de culture de Vanilla planifolia

témoin
1 2 3 4 5
longueur des racines
7 5 4,5 5 5,5
longueur des pousses
5 2,5 3 6 6
nombre de pousses
4 2 2 6 5

BA1+IBA1 1 2 3 4 5
longueur des racines
0 0 0 0 0
longueur des pousses
3 4 4,5 3 3
nombre de pousses
5 6 4 9 4

BA2+IBA1 1 2 3 4 5
longueur des racines
0 0 0 0 0
longueur des pousses
3,5 2 4 3 2
nombre de pousses
2 3 4 6 6

BA1+IBA2 1 2 3 4 5
longueur des racines
3 1,5 1 1 1,5
longueur des pousses
1,5 2 1,5 1 2
nombre de pousses
4 4 8 8 4
 BA2+IBA2 1 2 3 4 5
longueur des racines 1 1 0,5 0,5 0,5
longueur des pousses 2 2 2,5 1,5 4
nombres de pousses 3 7 6 9 2
Name : RALAMBOMANANA

Surname: Fanjaniaina Judith

Title : Approach to plant pathology and micropropagation of Vanilla planifolia

(Orhidaceae)

Abstract

Vanilla, the fruit of Vanilla planifolia (Orchidaceae), is an economically important spice in

the world. It is used as aroma and flavor.

After microbiological studies, 20 bacterium strains and 15 fungal strains were isolated from
samples of diseased leaves harvested from the vanilla of SAVA region. The disease is
manifested by symptoms ranging from yellowing to browning of leaves.

The method of Koch's postulate on leaf has verified the microorganisms responsible for this
disease. Among the isolates, two different strains of fungus V3C2 and V3C5 caused the
symptoms of the disease while all inoculated bacterial strains do not cause any symptoms.

During in vitro culture by micropropagation technique, culture medium supplemented with

the growth hormones BA and IBA, respectively 1 mg / l, is effective for shoot multiplication
while the harmonious development of the seedling, that is say the roots and shoots well
formed, is obtained in the higher concentration of IBA (2 mg / l). Seedlings obtained in the
control medium without hormone would however most favorable to the acclimatization
because the shoots and roots are more developed and proportional.

Keywords: vanilla, Vanilla planifolia, bacteria, fungi, Koch's postulate on leaf,

micropropagation.
Nom : RALAMBOMANANA

Prénoms : Fanjaniaina Judith

Titre : Approche à la phytopathologie et micropropagation de Vanilla planifolia

(Orchidaceae)

Résumé

La vanille, le fruit du Vanilla planifolia (Orchidaceae), est une épice à valeur économique
importante dans le monde entier. Elle est utilisée comme arôme et parfum.

Après des études microbiologiques, 20 souches de bactéries et 15 souches de champignons

ont été isolées à partir des échantillons de feuilles de vanillier malades prélevés dans la région
de SAVA. La maladie se manifeste par des symptômes allant du jaunissement au
brunissement des feuilles.

La méthode de Postulat de Koch sur feuille a permis de vérifier les microorganismes

responsables de cette maladie. Parmi les souches isolées, deux souches différentes de
champignon, V3C2et V3C5, ont provoqué les symptômes de la maladie tandis que toutes les
souches bactériennes inoculées n’engendrent aucun symptôme.

Lors de la culture in vitro par la technique de microbouturage, le milieu additionné des

hormones de croissance BA et IBA, respectivement à 1 mg/l, est efficace pour la
multiplication des pousses tandis que le développement harmonieux de la plantule, c’est-à-
dire les racines et les pousses bien formées, est obtenu dans le milieu à concentration plus
élevée en IBA (2mg/l). Les plantules obtenues dans le milieu témoin sans hormone seraient
cependant les plus favorables à l’acclimatation car les pousses et les racines sont plus
développées et plus proportionnelles.

Mots clés : vanille, Vanilla planifolia, bactéries, champignons, postulat de Koch sur feuille,
microbouturage.