Maevatianahermance SN MAST 21

FACULTE DES SCIENCES
DOMAINE SCIENCES ET TECHNOLOGIES
MENTION BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE
*******************************
MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME MASTER
PARCOURS BIOTECHNOLOGIES
DESCRIPTION DES PARAMETRES MICROBIOLOGIQUES DES

SOLS SOUS CINQ ESPECES VEGETALES DE L'ECOSYSTEME
MINIER DE MANDENA FORT DAUPHIN
(Morella spathulata, Vernoniopsis caudata, Phillipia floribunda, Polyscia ornifolia,
Vaccinium emirnense)
Présenté par :
MAEVATIANA Hermance
Maître ès Sciences
Soutenu publiquement le 08 Janvier 2021 devant la commission d’examen composée de :
Président : Professeur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina

Examinateurs : Professeur RASAMIRAVAKA Tsiry
Docteur RANDRIANIERENANA Ando Lalaniaina
Rapporteurs: Docteur BAOHANTA Rondro Harinisainana
Docteur ANDRIANANDRASANA Martial Doret
A Dada sy Neny
REMERCIEMENTS
Je remercie avant tout l’Eternel qui par sa grâce m’a donné la force et la persévérance
de mener à terme ce travail.
Ce présent travail est le fruit d’une collaboration étroite entre le Laboratoire de

Biotechnologie-Microbiologie de la Mention Biochimie Fondamentale et Appliquée de la
Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo et du Laboratoire de Microbiologie de
l’Environnement (LME) du Centre National de Recherches sur l’Environnement (CNRE).
Je tiens à adresser mes remerciements les plus vives aux personnes suivantes :
Messieurs le Docteur RAMAHAZOSOA Irrish Parker, Doyen de la Faculté des

Sciences de l’Université d’Antananarivo et Monsieur le Responsable de la Mention Biochimie
Fondamentale et Appliquée de la Faculté des Sciences le Professeur RANDRIANARIVO
Hanitra Ranjàna, de m’avoir permis de soutenir ce mémoire de fin d’étude.
Monsieur le Docteur Yves JEAN MICHEL Mong, les Directeur du CNRE, Monsieur
le Docteur RANDRIAMBANONA Herizo, Chef du Département Ecosystèmes Terrestres du
CNRE et Monsieur le Professeur RASOLOMAMPIANINA Rado, Chef du Laboratoire de
Microbiologie de l’Environnement du CNRE de m’avoir accueilli chaleureusement au sein de
cette institution.
Madame le Docteur BAOHANTA Rondro Harinisainana, Monsieur le Docteur

ANDRIANANDRASANA Martial Doret et Madame RATSIZAFY Irinah pour leur
encadrement, les nombreux conseils et le temps qu’ils nous ont accordé.
Monsieur le Professeur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina d’avoir bien voulu
présider cette soutenance, Monsieur le Professeur RASAMIRAVAKA Tsiry et Madame le
Docteur RANDRIENERENANA Ando Lalaniaina qui ont donné de leur précieux temps pour
examiner ce travail.
Toute l’équipe du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement du CNRE.
Mes co-labos qui ont fait de ce stage une aventure exceptionnelle.
Dada, Neny, Domoina à qui je dois tout. Pour leur soutien moral et financière. Merci
d’avoir soutenu mes choix et d’être là à chaque instant, votre amour fait ma force.
Une personne exceptionnelle qui n’a jamais cessé de me rappeler mes objectifs et m’a
toujours encouragé.
Sincèrement merci !
TABLE DES MATIERES
GLOSSAIRE…………………………………………………………………………………...i
LISTE DES ABREVIATIONS………………………………………………......…………...iii
LISTE DES FIGURES……………………………………………………………………......iv
LISTES DES TABLEAUX…………………………………………………………………...v
LISTE DES ANNEXES……………………………………………………………………....vi
INTRODUCTION……………………………………………………………………………..1
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. Généralités sur le sol ........................................................................................................... 3

II. La rhizosphère ..................................................................................................................... 3
II.1 Les microflores de la rhizosphère et leurs fonctionnements ........................................... 4
II.1.1. Les actinomycètes ........................................................................................................ 4
II.1.2. Les Pseudomonas fluorescens ..................................................................................... 5
II.1.3. Les Bactéries Solubilisatrices de Phosphate ................................................................ 6
II.1.4. Les champignons mycorhiziens................................................................................... 6
II.1.5. Les Mycorhizes à Vésicules et à Arbuscules (MVA).................................................. 7
II.1.6. Les mycorhizes éricoïdes................................................................................................. 8
II.1.7. Les éctomycorhizes. ........................................................................................................ 8
II.2. Les enzymes du sol rhizosphérique. ................................................................................ 8
II.2.1 Les hydrolases. ............................................................................................................ 8
II.2.2. Les enzymes hydrolysant la fluorescéine di-acétate. ................................................... 9
III. La région de l’Anosy et l’exploitation minière ............................................................... 9
III.1. La région de l’Anosy ....................................................................................................... 9
III.2 QMM et l’exploitation d’Ilménite ................................................................................... 9
IV. Notion de restauration écologique ................................................................................. 10
IV.1. Espèces pionnières ........................................................................................................ 11
IV.2. Le phénomène de facilitation : « effet plante nurse » ................................................... 11
MATERIELS ET METHODES
I. MATERIEL D’ETUDE. ................................................................................................... 13
I.1. Matériel biologique. ........................................................................................................... 13
I.2. Echantillonnage des sols ............................................................................................... 13
II. METHODOLOGIE ........................................................................................................... 14
II.1 Analyse des activités enzymatiques .............................................................................. 14
II.1.1 Mesure d’activité microbienne globale du sol par hydrolyse de la Fluorescéine di-
acétate ....................................................................................................................................... 14
II.1.2 Activité des phosphatases microbiennes du sol .............................................................. 15
II.2 Evaluation du potentiel infectieux mycorhizogène des sols. ............................................. 16
II.2.1 Dénombrement des spores de champignons endomycorhiziens. ................................... 16
II.2.2 Identification des spores. ................................................................................................ 17
II.2.3 Estimation du Nombre le Plus Probable (NPP) .............................................................. 17
II.3 Dénombrement des microorganismes ........................................................................... 18
II.3.1. Dénombrement des Bactéries Solubilisatrices de phosphate (BSP) .......................... 18
II.3.2. Dénombrement des Pseudomonas ............................................................................. 19
II.3.3. Dénombrement des Actinomycètes ........................................................................... 19
III. Traitement des données. ................................................................................................ 19
RESULTATS ET INTERPRETATIONS
I. Activités microbiennes des sols ........................................................................................ 22
I.1. Activité microbienne globale du sol par hydrolyse de la Fluorescéine di- acétate ............ 22
I.2. Activité des phosphatases acides du sol ............................................................................. 23
II. Potentiel Infectieux Mycorhizogène des sols.................................................................... 23
II.1. Densité des spores de champignons endomycorhiziens des sols .................................. 24
II.1.1. Densité totale des spores de champignons mycorhiziens par sol .............................. 24
II.1.3. Identification des spores. ............................................................................................... 24
II.2. Méthode du Nombre le Plus Probable (NPP). .................................................................. 26
III. Densité des microorganismes dans les sols. .................................................................. 27
III.1. Nombre de BSP dans les sols. ......................................................................................... 27
III.2. Nombre de Pseudomonas fluorescens dans les sols...................................................... 28
III.3. Dénombrement des actinomycètes. ................................................................................. 28
IV. Corrélation entre tous les paramètres étudiés et les différents types de sol. ................. 30
DISCUSSIONS…………………………………………………………………………...…..33
CONCLUSION ET PERSPECTIVES…………………………..………………………...….38
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………………..………39
GLOSSAIRE
Autotrophe : organisme capable de générer sa propre matière organique à partir d’éléments

minéraux.
Chimioorganotrophe : organisme qui tire son énergie d’un substrat organique.
Enzyme : protéine catalytique spécifique de la réaction catalysée et des substrats.
Hétérotrophe : organisme incapable de synthétiser lui-même ses composants et qui a recours

à des sources de matières organiques exogènes.
Hôte : individu qui héberge un parasite ou un symbiote dont il a investi les tissus. Dans les
cas des champignons parasites l’hôte est toujours spolié. Dans le cas de symbioses fongiques
ou bactériennes, il y a association avec l’hôte.
Hyphe : filament mycélien qui constitue l'appareil végétatif des champignons.
Mésophile : organisme dont la croissance est optimale sous une température comprise entre
20 à 45 °C.
Mycotrophe : qui porte sur leur racine des champignons dit mycorhizes, une plante
mycotrophe est dépendante des associations mycorhiziennes.
Propagule : organe de dissémination et de reproduction (non sexuelle) d’un être vivant

végétal, bactérien ou fongique (spores, kystes).
Pyoverdine : Pigment hydrosoluble jaune vert qui fluoresce sous rayonnement ultraviolet
(UV) à 230 nm.
Sidérophores : sont chélateurs de fer synthétisés et sécrétés notamment par les micro-
organismes pour leur permettre de puiser le fer essentiel à leur développement. Ce sont des
molécules de faibles poids moléculaires ayant une très forte affinité pour l'ion Fe3+. Les
sidérophores sont des peptides capables de former des complexes [sidérophores Fe3+] qui
permettront d'internaliser le fer nécessaire au fonctionnement de la cellule.
Spore : cellule isolée, ou amas pluricellulaire pouvant contribuer, en germant, à la

propagation d’une espèce par la voie végétative.
Symbiose : Désigne un état morpho-anatomique : deux organismes vivant ensemble,

établissant une relation bénéfique pour les deux partenaires.
i
LISTE DES ABREVIATIONS
BSP: Bactéries Solubilisatrices de Phosphate
CNRE: Centre National de Recherches sur l'Environnement
FDA: Fluorescéine di-acétate
INVAM: International Culture Collection of Vesicular and Arbuscular Mycorrhizal Fungi
LME: Laboratoire de Microbiologie de l'environnement
Min env et forêts : Ministère de l’environnement et des forêts
MVA: Mycorhize à Vésicules et Arbuscules
NPP: Nombre le Plus Probable
PIM : Potentiel Infectieux Mycorhizogène
p-npp: para-nitrophenylphosphate
QMM : Qit Madagascar Minerals
SD : Sol Déminéralisé
SEP2D : Sud Expert Plante pour un Développement Durable
SER: Society for Ecological Restaurartion
TFC : Topsoil Forêt dans la zone de Conservation
UFC : Unité Formant le Colonie
ii
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Représentation schématique des trois zones de la rhizosphère................................... 4

Figure 2: Interaction des Pseudomonas fluorescens avec les microorganismes
phytopathogènes et les cellules racinaires .................................................................................. 5
Figure 3 : Les différents types de mycorhizes ........................................................................... 7
Figure 4 : Localisation des sites d’exploitations du QMM SA ............................................... 10
Figure 5 : Activité microbienne globale des sols ..................................................................... 22
Figure 6 : Activité phosphatasique en milieu acide ................................................................. 23
Figure 7 : Densité totale des spores dans 100 g de sol ............................................................. 24
Figure 8 : NPP / 100 g de sol ................................................................................................... 26
Figure 9 : Racines de sorgho mycorhizées observées au grossissement X 40 ......................... 27
Figure 10 : Nombre d’UFC de Bactéries Solubilisatrices de Phosphate / g de sol .................. 27
Figure 11 : Nombre d’UFC de Pseudomonas fluorescens /g de sol ........................................ 28
Figure 12 : Nombre d’UFC d’Actinomycètes / g de sol .......................................................... 29
Figure 13 : Morphologie des microorganismes dénombrés ..................................................... 29
Figure 14 : Cercle de corrélation .............................................................................................. 30
iii
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Dosage de la FDA ................................................................................................. 15

Tableau 2 : Quantité de réactif utilisé pour le dosage de la phosphatase ................................. 16
Tableau 3 : Proportion sable stérile et sol à analyser ............................................................... 17
Tableau 4 : Nombre de spores par espèce identifiée ................................................................ 25
LISTE DES ANNEXES
Annexe 1 : Classification des cinq espèces végétales caractéristiques de l’écosystème minier

de Mandena Fort Dauphin
Annexe 2 : Préparation des solutions tampons
Annexe 3 : Description morphologique des spores
Annexe 4 : Calcul du nombre le plus probable de propagule
Annexe 5 : Composition des milieux de cultures

Introduction
Introduction
Le site de Mandena Fort Dauphin, est actuellement le siège de l’exploitation

d’Ilménite de la société Qit Madagascar Minerals SA (QMM SA), une branche du géant
minier Rio Tinto. Cette zone abrite 614 espèces de plantes avec 87% de plantes endémiques
dont 7% sont dans la zone d’exploitation (QMM ,2016).Une superficie de 25 à 30 Ha y est
régulièrement défrichée et décapée avant le passage d’une drague et d’autres équipements
pour le Dry Mining (ONE, 2013). Cette technique est cependant parmi les plus destructives
du point de vue environnemental (Elaw, 2010) car il en résulte une perte de l’aptitude des
terrains miniers dégradés à soutenir l’installation et le développement d’une couverture
végétale (Sheoran et al., 2010; Bordez et al., 2018). A part les perturbations au niveau
floristique, l’exploitation minière entraîne la dégradation du sol, la réduction du pH,
l’épuisement des matières organiques, la diminution des éléments nutritifs disponibles pour la
plante et la diminution de sa population microbienne (Albert, 2015). De ce fait, les
répercussions négatives de l’exploitation sont double, d’un côté, la destruction et la perte des
écosystèmes et de l’autre côté, l’augmentation des surfaces décapées vulnérables à l’érosion
(Sarraih et Ayrault, 2001).
Tenant compte de ces conséquences néfastes, la compagnie minière s’est engagée à

effectuer une restauration des zones dégradées par l’exploitation (Le Roux, 2002). Une
restauration vise à la fois les aspects chimiques et physiques de l’habitat et les espèces elles
même (Robert, 2010). Quel que soit le niveau de la dégradation, le défi auquel doivent faire
face les acteurs de la restauration consiste à recréer les conditions favorables à la reconquête
végétale tout en améliorant les conditions biotiques (Bordez et al., 2018). Tout ceci repose
donc sur une connaissance aussi précise que possible des caractéristiques physico-chimiques
et microbiologique des terrains et des matériaux à revégétaliser (Jaffre et al., 1997). Les
démarches de la restauration écologique des sites miniers consistent à implanter une première
couverture végétale résistante à base d’espèces natives colonisatrices des terrains dénudés
(Lagrange, 2010). Ainsi, le choix de ces espèces est une étape primordiale pour mener à bien
un projet de restauration (Conservation internationale, 2011). Les plantes utilisées pour
l’initiation peuvent être des espèces de plantes pionnières hautement mycotrophes et fixatrices
d’azote (Ang Lai, 1996), des plantes à croissance rapide sur des sites dégradés (Parrota et al.,
1997), des espèces endémiques du site (Jaffre, 1992) ou des plantes autochtones avec une
adaptation plus rapide (Conservation internationale, 2011). Selon L’huillier et al., 2010,
l’utilisation des espèces pionnières est l’idéal pour la zone dénudée comme les sites
d’exploitation minière.
1
Introduction
Les espèces pionnières vont coloniser et restaurer les propriétés du sol pour permettre
l’installation des autres espèces végétales (Pidwirny, 2006 ; L’huillier et al., 2010). La
communauté pionnière n’est pas durable mais vouée à une évolution rapide (Lagrange, 2010).
Selon la théorie de la succession végétale, la plupart des espèces végétales pionnières peuvent
agir comme plante facilitatrice vis-à-vis des plantules des autres espèces ligneuses qui vont
leur succéder (Baohanta et al., 2012). Ces plantes facilitatrices ou plantes « nurse » sont les
centres d’intérêt de plusieurs étude dans le cadre de programmes de restauration écologiques
(Baohanta, 2011; Danet, 2017; Houles, 2017 ; Bordez et al., 2018). Du point de vue
application, elles se révèlent comme étant un outil très intéressant et innovant pour la
restauration des milieux dégradés (Gómez-Aparicio, 2009). Elles doivent également être
capables d’améliorer la qualité microbiologique du sol par des mécanismes de sélection et de
stimulation des microorganismes du sol (Darvet, 2006 ; Padille et Pugnaire, 2006).
Connaître les caractéristiques du sol rhizosphérique d’une plante alors s’avère être un
moyen efficace pour l’évaluation du potentiel d’une plante dans une restauration écologique.
D’où l’intérêt de notre sujet : « description des paramètres microbiologiques des sols sous
cinq espèces végétales de l'écosystème minier de Mandena Fort Dauphin ». Pour cette étude,
les espèces pionnières de la zone Phillipia floribunda (Eriaceae), Vernoniopsis caudata
(Astraceae) et Morella spathulata (Araliaceae), ainsi que deux espèces non pionnières
Vaccinium emirnense (Ericaceae) et Polyscia ornifolia (Myriaceae) ont été choisies. Pour
mener à bien cette étude, l’objectif principal fixé a été de décrire les paramètres
microbiologiques qui caractérisent les sols rhizosphériques des espèces caractéristiques de
l’écosystème minier de Mandena en vue de leur valorisation dans les programmes de
restauration écologiques. Pour se faire, les objectifs spécifiques ont été de i) faire l’analyse
des activités des enzymes des sols, ii) évaluer la densité et la diversité des microorganismes
bénéfiques dans le sol.
Les travaux effectués sont présentés dans ce document en trois parties à savoir une
synthèse bibliographique, suivie des matériels et méthodes utilisés puis des résultats et
interprétations. La première partie est précédée par une introduction générale tandis que la
dernière partie est suivie par la discussion, la conclusion et les perspectives.
2
Synthèse
bibliographique
Synthèse bibliographique
I. Généralités sur le sol

Le sol est un environnement complexe dans lequel réside une grande diversité
d’organismes (surtout les microorganismes). Cette complexité provient de sa composition
chimique et de sa structure physique (Sharma, 2011). On y trouve une fraction minérale qui
forme le squelette du sol, une fraction organique morte très importante comprenant des
cadavres, et une fraction organique vivante avec tous les règnes représentés (Lauren ,1991). Il
ne constitue pas un environnement homogène, mais une mosaïque d’habitats avec pour
chacun des populations microbiennes propres. C’est un fantastique réservoir de
microorganismes en termes de diversité et de densité. Le nombre et le type d’organismes
varient d’un système et d’un milieu à l’autre (Marilley et al., 2007). C’est aussi un vrai
laboratoire biologique où se déroulent des réactions qu’on ne trouve nulle part ailleurs.
(Pédro, 1996).
II. La rhizosphère
Le concept de rhizosphère a été développé par le microbiologiste Hiltner en 1904
(Hinsinger ,2010). Les racines et la zone du sol les entourant, sous l’influence du métabolisme
de la plante sont désignées sous le nom de rhizosphère .La plante y libère divers éléments
carbonés, dont les photosynthétats, regroupés sous le terme de rhizodépôts. Les rhizodépôts
sont composés d’exsudats racinaires (ou photosynthétats : sucres, acides aminés, acides
organiques, hormones, vitamines), de sécrétions de mucilage (sucres polymérisés, enzymes)
et de cellules sénescentes (cellules de la coiffe racinaire, cellules corticales et épidermiques)
(Lepinay, 2015). La rhizosphère se décompose en trois zones représentées schématiquement
dans la Figure 1: l’endorhizosphère (formé par les tissus racinaires), rhizoplan (surface des
racines), ectorhizosphère (sol rhizosphérique) (Gobat et al., 2004). C’est surtout un lieu
d’échange entre le sol et la racine. La rhizosphère est constituée d’un cortège de
microorganismes qui favorisent l’assimilation des éléments nutritifs par la plante et est le
siège de nombreuses relations symbiotiques entre ces deux organismes (Hinsinger, 2010). La
densité de population de la microflore associée aux racines est d’ailleurs significativement
plus élevée dans la rhizosphère (Vanloon, 2017). Elle est donc un milieu dynamique et
structuré qui abrite une multitude de microorganisme interagissant avec la plante (Lepinay,
2015).
3
Figure 1: Représentation schématique des trois zones de la rhizosphère. (Lepinay, 2015)
II.1 Les microflores de la rhizosphère et leurs fonctionnements

Le sol, est considéré comme une unité vivante et intègre des propriétés
biogéochimiques et biologiques qui sont liées principalement aux activités microbiennes du
sol (Roose ,2014). Les microorganismes y jouent un rôle fondamental comme la
décomposition des matières organiques, le maintien de la structure du sol et la transformation
des nutriments (Attard, 2008). Ces microorganismes de la rhizosphère interagissent avec la
plante de manière directe ou indirecte. Par leur contribution au recyclage des nutriments, ils
fournissent à la plante des éléments minéraux assimilables, participent à la production
d’hormone et aident à la protection contre les agents phytopathogènes (Lepinay, 2015).
II.1.1 Les actinomycètes

Les actinomycètes ont été isolés pour la première fois à partir du sol par Waksman en
1975. Ce sont des bactéries dont la croissance donne lieu à des colonies constituées d’hyphes,
c’est-à-dire des filaments qui irradient par croissance centrifuge (Lechevalier, 2020). Ils sont
largement répandus dans le sol, surtout dans la rhizosphère. Ces microorganismes ont une
importance particulière en raison de leur rôle dans la fertilisation des sols (Ounadjela, 2016).
Ils peuvent s’associer à des plantes comme pour le cas des actinomycètes du genre Frankya
qui s’intègre aux racines de 200 espèces d’angiospermes (Pawlowski et Sirrenberg, 2003) et
participent à la stimulation du développement de son hôte par la production de
phytohormones (Goudjal et al., 2013). De plus, ils empêchent la prolifération de certains
microorganismes nocifs en produisant des inhibiteurs (Rakotoarimanga, 2004 ; Lefebre, 2008;
Andrianasolo, 2017). Ils prolifèrent surtout quand l’action des bactéries ordinaires touche à sa
4
fin ce qui fait qu’ils se développent bien sur les matières organiques partiellement dégradées
(Lefebre, 2008).
II.1.2 Pseudomonas fluorescens

Pseudomonas fluorescens appartiennent au groupe des Eubactéries. Ce genre de
bactérie est ubiquiste (Morgaint, 2015). Ils sont mésophiles, chimioorganotrophes puisqu’ils
peuvent croître dans un milieu minéral ne contenant qu’une seule source de carbone
(Golovleva et al., 1992). Ils se caractérisent par leur aptitude à synthétiser une substance
appelée pyoverdine (substances de couleur bleu-vert qui fluorescens sous UV à la longueur
d’onde 365 nm) surtout en situation de carence en fer. Les pyoverdines sont des sidérophores
qui ont une forte affinité pour le fer (Alabouvette et Cordier, 2018). En accroissant sa capacité
de capture de Fer avec la pyoverdine, Pseudomonas fluorescens augmentent la compétition
avec les autres microorganismes, ce qui réduit la densité et l’activité néfaste des
microorganismes pathogènes (Jacque et al., 1993).Ce phénomène est illustré dans la Figure
2.Aussi, certaines espèces de plantes incapables d’assimiler l’ion ferrique, assurent leur
nutrition ferrique par l’intermédiaire de ces pyoverdines (Cezard, 2014). Par l’activité
antibiotique de ses sidérophores, Pseudomonas fluorescens peuvent aussi provoquer une
augmentation de la résistance des plantes aux maladies (Kaioua, 2015). A part cela, certains
groupes de Pseudomonas fluorescens ont même la capacité de dissimiler l’azote (Golovleva et
al., 1992). Ce qui permet de les classifier parmi les bactéries promotrices de la croissance des
plantes (ou PGPR en anglais) ( Lemanceau, 1992 ; Rainey, 1999).
Figure 2: Interaction de Pseudomonas fluorescens avec les microorganismes phytopathogènes et les

cellules racinaires (Jacque et al., 1993)
5
II.1.3 Les Bactéries Solubilisatrices de Phosphate

Les microorganismes ont une importance primordiale dans la biodisponibilité du
phosphore dans le sol. Les souches les plus effectives sont : Pseudomonas, Bacillus,
Rhizobium et les entérobactéries (Ahmad, 2009). Le mécanisme de solubilisation du
phosphate minéral par les BSP est associé à la production d’acides organiques, qui avec leur
groupement carboxyle et hydroxyle chélatent les cations attachés au phosphate, rendant celui-
ci soluble sous forme d’ion orthophosphate assimilable pour la plante (Chen, 2006). A part la
solubilisation des phosphates, les BSP produisent des phytohormones qui favorisent la
croissance de la plante ainsi que des acides aminés et des vitamines (Ponmurgan, 2006).
II.1.4 Les champignons mycorhiziens

Les mycorhizes sont définis comme des organes résultants d’une symbiose entre les
racines d’une plante et des champignons supérieurs (Ascomycètes et Basidiomycètes) et/ou
champignons inférieurs (Zygomicètes et principalement l’ordre des Glomales) (Durieux,
1993 ; Bordez, 2015 ). Cette symbiose est une relation au cours de laquelle les champignons
hétérotrophes reçoivent de la plante autotrophe des glucides issus de la photosynthèse et
d’autres substances qu’ils utilisent pour leur nutrition. En contrepartie, ils procurent à la
plante une meilleure interception des éléments minéraux dont la mobilité dans le sol est faible,
comme le phosphore (Smith et Red 1997 ; Thunot et al., 2004 ). Le champignon mycorhizien
a accès à un volume de sol beaucoup plus important que celui exploré par le système racinaire
de la plante grâce aux filaments mycéliens extra-radiculaires. Il contribue également à
augmenter la disponibilité et la mobilité des éléments nutritifs présents en quantité limitée
dans la rhizosphère, et ce, en accélérant l'altération des minéraux (Arvieu et al., 2003).
Il y a différents types de mycorhizes: les mycorhizes à arbuscules, les mycorhizes

orchidoïdes et les mycorhizes éricoïdes, et les ectomycorhizes qui sont les plus fréquents et
les plus étudiés (Tederso et al., 2010) illustrés dans la figure 3.
6
Figure 3 : Les différents types de mycorhizes (Botarela, 2012)
II.1.5 Les Mycorhizes à Vésicules et à Arbuscules (MVA)

Les MVA sont rencontrés aussi bien dans les plantes herbacées d’intérêt agronomique
que dans les essences forestières et tropicales (Boudarga et al., 1990). Ce sont des
endomycorhizes, ils sont constitués par la racine colonisée et les structures fongiques (Thunot
et al., 2004). La mycorhization débute lorsqu’un hyphe émis par la germination d’une
propagule de champignon MVA entre en contact avec la racine de la plante. Il poursuit sa
croissance et se différencie ensuite à l’intérieur des cellules végétales pour former les
vésicules et les arbuscules (Johanson et al., 2004). La partie externe des hyphes constitue le
prolongement d’un système racinaire qui puise dans le sol des minéraux et de l’eau et les
vésicules sont des organes ovoïdes de réserve, de survie et de reproduction (Alvarez et al.,
2002).
Pour ce type de mycorhize, des spores sont observées dans les racines et/ou dans le
sol. Ce sont des structures coenocytiques (unicellulaires), de forme généralement sphérique
(30 à 800 µm de diamètre), et possèdent une paroi épaisse formée d’une ou de plusieurs
couches de différentes textures, reliées au réseau filamenteux par un hyphe suspenseur (Fortin
et al., 2008). Ces spores servent d’organes de réserve, de résistance et de propagation.
7
II.1.6 Les mycorhizes éricoïdes

Les champignons éricoïdes ne forment une symbiose qu’avec la famille des Ericacées
(Morissette, 2011) qui croissent normalement dans des sols à pH acide (Leake et Read ,1988).
Ce sont des endomycorhizes dont le mycélium forme un peloton qui remplit pratiquement
toute la cellule (Martino et al., 2007 ; Smith et Read, 2008) et dont l’infection se propage
directement d’une cellule à l’autre (Ndonda, 2019). Les éricoïdes produisent une large gamme
d'enzymes hydrolytiques et oxydatives qui jouent un rôle important dans la mobilisation des
molécules organiques présentes sous formes récalcitrantes dans les sols où on les retrouve
(Morissette, 2011).
II.1.7 Les éctomycorhizes

Les ectomycorhizes résultent des associations entre les champignons supérieurs
appartenant au groupe des Basidiomycètes ou des Ascomycètes et les plantes vasculaires
(Brundrett et al., 1996). Ils jouent un rôle majeur dans l’acquisition des nutriments sous forme
inorganique de la solution du sol, mais aussi dans la mobilisation des formes organiques du
phosphore par sécrétion des phosphatases acides extracellulaires (Smith et Read, 2008).
II.2 Les enzymes du sol rhizosphérique

L’activité des êtres vivants dans le sol se traduit par la synthèse d’enzymes de toutes
sortes, localisés à l’intérieur ou à l’extérieur des cellules, adsorbés sur les parois des microbes
ou sur les minéraux argileux (Burns, 1982). Les mesures d’activités enzymatiques sont
utilisées depuis un demi-siècle pour évaluer la fertilité des sols.Car ces enzymes sont les
marqueurs de la fertilité du sol par leur implication aux cycles des nutriments les plus
importants (Garcia, 2000).
II.2.1 Les hydrolases

La plupart des enzymes du sol appartiennent au groupe des hydrolases. Parmi les
hydrolases, il y a les cellulases qui dégradent les résidus ligno-cellulosiques des plantes
mortes et les phosphatases (ITAB, 2002). Ces enzymes sont majoritairement d’origine
microbienne et ont été suggéré comme un indice important pour l’activité microbienne (Doda
et Tabatabai, 2003). Les phosphatases intracellulaires (phosphatase alcalines) et les
phosphatases extracellulaires (phosphatase acide) sont les principaux responsables de la
minéralisation du phosphore organique dans le sol (Stevenson, 1986).
8
II.2.2 Les enzymes hydrolysant la fluorescéine di-acétate

L’analyse de l’hydrolyse de la di-acétate de fluorescéine (FDA) mesure l’activité
enzymatique de la population microbienne et peut fournir une évaluation de l’activité
microbienne globale dans un échantillon environnemental. L’analyse de cette hydrolyse de la
FDA est sensible à l’activité de plusieurs classes d’enzymes comprenant des lipases, des
estérases, et des protéases (Schnur et Rosswal, 1982).
III. La région de l’Anosy et l’exploitation minière

III.1 La région de l’Anosy
La région Anosy se situe dans l’extrême Sud de Madagascar. Elle est délimitée au
Nord par la région Atsimo Atsinanana, au Sud, par la région Ihorombe, à l’Ouest, par la
région de l’Androy et Atsimo Andrefana et à l’Est, par l’Océan Indien. Elle est constituée de
trois districts : Amboasary Sud, Betroka et Taolagnaro.
III.2 QMM et l’exploitation d’Ilménite

QIT Madagascar Minerals S.A. (QMM S.A.), une compagnie minière détenue à 80%
par Rio Tinto et à 20 % par le gouvernement malagasy représenté par l’Office Nationale des
Mines et des Industries Stratégiques (OMNIS), est le premier grand projet de mine
industrielle de ce type réalisé à Madagascar (Rasolondrainy, 2016). QMM S.A. prévoit
d’extraire l’Ilménite et le Zircon des sables minéraux lourds sur une superficie d’environ 6000
hectares pendant 40 ans. La zone d’exploitation regroupe le site de Mandena, Petriky et Ste
Luce présentés dans la figure 4. Cette activité minière est actuellement en cours sur le site de
2000 ha de Mandena au Nord de Ford-Dauphin (QMM ,2001)
9
Figure 4 : Localisation des sites d’exploitations du QMM SA (QMM, 2001)
III.3. Impacts environnementaux de l’extraction d’Ilménite sur le site de

Mandena
Avant 1998, le site de Mandena était une zone couverte en grande partie de forêt mais
il n’en reste plus que quelques fragments et la zone de conservation (Min env. et forêts, 2013).
Elle assiège 614 espèces de plantes recensées avec 87% de plante endémique dont 7% sont
dans la zone d’exploitation, mais à la fin de l’exploitation, environ 1 665 ha de forêts littoraux
seront perdus (QMM, 2016). Une superficie de 25 à 35 Ha est défrichée régulièrement avant
le passage d’une drague et des équipements de l’exploitation à sec ou dry mining
(ONE/CSER ANOSY, 2013). A part les perturbations au niveau floristique, l’exploitation
minière entraine aussi la dégradation du sol par la destruction de ses structures, l’érosion
accélérée, le lessivage excessif, le compactage, la réduction du pH, l’épuisement des matières
organiques, la diminution des éléments nutritifs disponibles pour la plante (Albert, 2015).
D’où la nécessité d’une restauration écologique.
IV. Notion de restauration écologique

Selon SER en 2004, la restauration écologique est une action intentionnelle qui initie
ou accélère l’autoréparation d’un écosystème en respectant sa santé, son intégrité et sa gestion
durable. Les objectifs de la restauration sont de réparer les processus écologiques, la
productivité et l’intégrité biologique initiale d’écosystème dégradé (Lagrange, 2010). La
restauration vise à la fois les aspects chimiques et physiques de l’habitat et les espèces elles
10
même (Robert, 2010). Les démarches de la restauration écologique consistent à implanter une
première couverture végétale résistante à base d’espèces natives colonisatrices des terrains
dénudés. Une des approches pour la restauration utilise des espèces facilitatrices qui vont
permettre la succession végétale. (Padille et Pugnaire 2006 ; Baohanta, 2011), en la
considérant comme initiant ou accélérant l’assemblage d’une série d’espèce (Cristofoli et
Mahy, 2010). Sur les zones dénudées comme les sites d’exploitation minière, l’idéal serait
d’utiliser des espèces pionnières qui sont particulièrement résistantes et peu exigeantes. Sur
sites moins endommagés, il s’agira d’espèces secondaires, permettant de redynamiser la
succession de groupements végétaux plus ou moins figés (L’huillier et al., 2010).
IV.1. Espèces pionnières
Les espèces pionnières sont des espèces de plantes capables de coloniser un milieu
instable, très pauvre en matière organique et aux conditions climatiques difficiles (Pidwirny,
2006). Elles colonisent en premier les surfaces nues ou les zones dégradées et restaurent les
propriétés du sol par la stimulation des microorganismes rhizosphériques ou par
l’amélioration de la qualité physico chimique du sol permettant ainsi l’installation des autres
espèces végétales (Pidwirny, 2006). Ces espèces, par enrichissement et protection du sol,
faciliteront l’implantation naturelle et progressive de nouvelles espèces plus exigeantes
provenant des zones environnantes, permettant à la couverture végétale d’évoluer vers des
groupements végétaux de plus en plus diversifiés (L’huillier et al., 2010).Selon la théorie de
la succession végétale, la plupart des espèces végétales pionnières peuvent agir comme plante
nurse vis-à-vis des plantules des autres espèces ligneuses qui vont leur succéder (Baohanta et
al., 2012).
IV.2. Le phénomène de facilitation : « effet plante nurse »

Au sein d’un écosystème, les plantes interagissent qu’elles soient de la même espèce
ou non. Le phénomène de facilitation est observable lorsqu’un organisme dit facilitateur
modifie les conditions environnementales initiales de son milieu pour le rendre plus favorable
et plus profitable pour d’autres organismes dit facilités (Stachowicz, 2001). Les plantes
facilitatrices peuvent être des arbustes, arbres, ou fougères arborescent qui procurent une
protection contre les agressions physiques des éléments (Rivière et al., 2008). En effet, les
« plantes nurses » participent à la réduction de l’évaporation, limitent les fluctuations de
température du sol et de l’air, augmentent la disponibilité des nutriments et des minéraux par
11
l’accumulation de litière, accroissent la disponibilité en eau, favorisent le développement des

communautés microbiennes symbiotiques (bactéries, champignons) (Padille et Pugnaire,
2006) et enfin procure une assistance face à la compétition (Harmon et Franklin, 1989). En
modifiant les conditions environnementaux de manière positif, la plante facilitatrice ou
« nurse » met à disposition de l’espèce facilitée, des ressources supplémentaires (espace,
nutriment, nourriture) (Bruno, 2003). Certaines plantes nurse hautement mycotrophes,
améliorent la qualité des conditions de vie de la plante facilitée par l’intermédiaire de la
symbiose mychoriziennes (Darvet, 2006) par la multiplication des propagules fongiques
mychoriziennes, elles permettent aux plantes facilitées d’augmenter la chance d’obtenir à
leur tour une symbiote (Barea 2002 ;Ouahmane ,2006 ;Duponnois, 2010). L’effet de
facilitation dépend cependant du gradient de stress environnemental et de l’adaptation de la
plante bénéficiaire (He et al., 2013 ; Houles, 2017). Les sommes de ces interactions
aboutissent à la formation d’écosystèmes complexes en équilibre dynamique (Houles, 2017 ;
Danet 2017).
12
Matériels et
Méthodes
Matériels et méthodes
I. MATERIEL D’ETUDE
I.1. Matériel biologique
Le sorgho
Le sorgho, présenté dans la Figure 5, est une plante hautement mycotrophe (Planchette
et Morel, 1996). De part ce statut, cette plante a été choisi comme plante test pour l’évaluation
du potentiel infectieux mycorhizogène des sols.
Règne : Plantae
Division : Magnoliophyta
Classe : Equisetopsida
Ordre : Poales
Famille : Poaceae
Genre : Sorghum
Espèce : bicolor
Nom vernaculaire : Apemba Figure 5 : Le sorgho (MAEVATIANA Hermance)
I.2. Echantillonnage des sols

Les sols ont été prélevés le 22 Février 2018 dans la région de l’Anosy, dans le site
d’exploitation minière de la société QMM à Mandena entre les latitudes 24°55' 24,1'' S et les
longitudes 47°01' 31,6'' à une altitude de 7 m. Pour chaque type de sol rhizosphérique, le
prélèvement a été effectué sous trois pieds différents pour une plante de la même espèce. Les
sols rhizosphériques ont ensuite été conditionnés dans des sacs de prélèvement codés, jusqu’à
leur acheminement au laboratoire. A leur arrivés, une partie des sols a été conservés à +4°C et
une partie a été conservé à température ambiante.
Les échantillons de sol ont été codés comme suit :
SOLS RHIZOSPHERIQUES SOUS CODAGE
Vernoniopsis caudata VER I, II, III
Phillipia floribunda PHI I, II, III
Morella spathulata. MOR I, II, III
13
Polyscia ornifolia POLY I , II, III
Vaccinium emirnense VAC I, II, III
LES SOLS DE REFERENCE
Topsoil de la forêt de conservation TFC
Sol déminéralisé SD
La classification de chaque espèce est donnée sans l’annexe 1.

II. METHODOLOGIE
II.1 Analyse des activités enzymatiques

Deux méthodes ont été utilisées pour analyser l’activité des enzymes du sol : la mesure
de l’activité microbienne globale du sol par hydrolyse de la Fluorescéine di-acétate et
l’analyse de l’activité des phosphatases microbiennes du sol.
II.1.1 Mesure d’activité microbienne globale du sol par hydrolyse de la

Fluorescéine di-acétate
Les enzymes intervenant dans la dégradation des matières organiques sont
essentiellement des lipases, des protéases et des estérases (Sanchez-Monedero, 2008). Ces
enzymes hydrolysent la Fluorescéine-diacétate (FDA) d’où l’estimation de l’activité
microbienne totale du sol par la quantité de FDA hydrolysé. L’activité microbienne globale
correspond ainsi à la quantité de produit d’hydrolyse (fluorescéine).
Dosage du produit d’analyse

Quatre pesées de 1g de sol préalablement séché à l’air libre pendant 24 h sont
préparées. Le premier gramme servant de témoin enzyme (TE) et les trois autres pour les
analyses de façon à obtenir trois répétitions par échantillons de sol (E1, E2, E3.) Une
préparation qui ne contient pas de sol a servi de témoin substrat (TS). Les proportions des
préparations sont données par le Tableau 1.
14
Tableau 1 : Dosage de la FDA
TS TE E1 E2 E3
Tampon phosphate (ml) 15 15 15 15 15
FDA (µl) 200  200 200 200
Sol (g) _ 1 1 1 1
Eau déminéralisée (µl) _ 200 _ _ _

TS : Témoin Substrat TE : Témoin Enzyme E : Echantillon
La préparation de la solution tampon est donnée dans l’annexe 2.
Les tubes vissés contenant les mélanges sols et réactifs ont été incubées pendant une
heure à 30°C et sous agitation. A la fin de l’incubation 1 ml de la solution a été prélevé puis
mis dans un tube eppendorf contenant 1 ml d’acétone 100% pour stopper la réaction. Le
mélange a ensuite été centrifugé à 1000 tours pendant 5 min avant l’observation de la densité
optique à une longueur d’onde de 490 nm au spectrophotomètre.
II.1.2 Activité des phosphatases microbiennes du sol

Les phosphatases du sol sont majoritairement d’origine microbienne et sont considérés
comme des indices importants pour l’activité microbienne (Doda et Tabatabai, 2003). Les
phosphatases acides sont les groupes d’enzymes les plus dominants parmi les enzymes qui
participent à la minéralisation du phosphate dans les sols acides (Olander et al, 2000).
II.1.2.1 Préparation de tampon Mc Ilvain (citrate phosphate Buffer)
Le tampon Mc Ilvain est un mélange de la solution A à 0,1M et la solution B à 0,2 M

qui contiennent respectivement de l’acide citrique dissout dans de l’eau distillée et du
Na2HPO4, H2O mis en solution dans de l’eau distillée. Pour l’analyse de la phosphatase acide
le pH de la réaction est fixé à 6.
Le protocole détaillé de la préparation de la solution A et B est présenté en annexe 2.
II.1.2.2 Dosage du produit d’analyse

Après séchage à l’air libre, 100mg de sol ont été pesés et mis en suspension dans 100
µl de para-nitrophénylphosphate (p-npp) et 400 µl de tampon Mc Ilvain (Citrate Phosphate
Buffer). Trois essais (E) ainsi que deux témoins (TS) et (TE) ont été préparés selon les
proportions dans le Tableau 2.
15
Le TS ne contient pas de sol tandis que dans le TE le p-NPP est remplacé par de l’eau
distillée stérilisée.
Tableau 2 : Quantité de réactif utilisé pour le dosage de la phosphatase
TS TE E1 E2 E3
Tampon phosphate (µl) 400 400 400 400 400
p-NPP (µl) _ _ 100 100 100
Sol (mg) _ _ 100 100 100

Eau distillée stérile (µl) _ 100 _ _ _
TS : Témoin Substrat TE : Témoin Enzyme, E : Echantillon
Les préparations ont été mélangées par agitation au vortex puis incubées à 37°C sous
agitation. Après une heure d’incubation, 100 μl de la solution de CaCl2 0,5 M sont ajoutés
dans chaque tube pour complexer la réaction d’hydrolyse. Ensuite 400μl de NaOH 0,5 M y a
été rajouté pour arrêter la réaction.
La densité optique a été lue au spectrophotomètre à une longueur d’onde de 400 nm.
La quantité du produit de dégradation du phosphate est exprimée en µg de p-
Nitrophénol produit par gramme de sol sec par heure.
II.2 Evaluation du potentiel infectieux mycorhizogène des sols (PIM)

Deux méthodes ont été utilisées pour l’évaluation du PIM du sol notamment
l’estimation du nombre le plus probable de champignons endomycorhiziens (NPP) capables
d’infecter une plante hôte mycotrophe et le dénombrement des spores de champignons
endomycorhiziens.
II.2.1 Dénombrement des spores de champignons endomycorhiziens
La densité et la diversité des spores de MVA ont été évaluées selon la méthode décrite
par Sieverding (1991). Les spores ont été extraites à partir des échantillons de sol (100g) par
des séries de tamisages humides (200 µm, 100µm, 80µm, 50µm) .Deux séries de
centrifugations ont été réalisées : la première à 5000 tours pendant 5 mn avec de l’eau distillée
puis le surnageant a été remplacé par du saccharose 60% et une seconde centrifugation à 1000
tours/ min pendant 3min. Les spores ayant migré vers le haut par le gradient de concentration
ont été récupérées sur du papier Wattman et observées sous loupe binoculaire à grossissement
x40. Les spores ont été classées et comptées selon leur taille, leur aspect et leur couleur.
La densité des spores est exprimée en nombre de spores par 100 gramme de sol.
16
II.2.2 Identification des spores
Tout d’abord, la description morphologique des spores a été effectué selon le

diagramme standard de couleur des champignons Glomales établi par INVAM (International
Culture Collection of Vesicular and Arbuscular Mycorrhizal Fungi ) et celle de la forme a été
établi selon les critères de Walker 1983 ; Morton 1985, Schenck et Perez, 1990 ;Muthukamar
et al., 2009 et INVAM qui considère la morphologie, la taille, les couleurs, l’aspect,
l’agencement, la structure des parois et les réactions de colorations donnés en annexe 3. Pour
l'observation anatomique, une spore intacte a été montée sur une lame et colorée avec du
Polyvinyl lactophénol (PVLG) et ensuite des spores écrasées ont été monté entre lame et
lamelle avec une solution de PVLG mélangée à du réactif Melzer (1:1 v/ v) puis observées
sous microscope.
II.2.3 Estimation du Nombre le Plus Probable (NPP)

Il est important de déterminer le NPP dans un sol car il traduit sa richesse en
propagules aptes à générer une mycorhization (Kuszala et al., 2010).
II.2.2.1 Préparation des dilutions de sol

Pour chaque sol, 6 dilutions ont été effectuées à une quantité de 300 g chacune pour
avoir trois échantillons de 100 g par dilution. Les proportions sols-sable stérilisés sont
données par le Tableau 3.
Tableau 3 : Proportion sable stérile et sol à analyser
Niveau de dilution 1 1/4 1/16 1/64 1/256 1/1024
Sols(g) 300 75 18 3 1,2 0,3

Sables stériles (g) 0 225 282 297 298,8 299,7
II.2.2.2 Germination des graines de sorgho

Les graines ont été décontaminées par trempage dans de l’alcool 70°C pendant 5 min
puis rincées avec de l’eau distillée stérilisée. Elles ont été semées sur du sable stérilisée et
placées sous serre pendant deux jours à l’obscurité. Les plantules ont été ensuite transplantées
dans les pots contenant les sols dilués à raison d’une plantule par pot.
17
II.2.2.3 Eclaircissement et coloration des racines

Après 21 j sous serre, les plantes ont été dépotées. Les racines fines issues de chaque
pot ont été prélevées, nettoyées avec de l’eau de robinet et placées respectivement dans des
tubes à essai. Les racines ont ensuite été éclaircies à l’aide d’une solution de potasse (KOH) à
10 % incubées dans une étuve pendant 30 min puis colorées avec une solution de bleu trypan
par incubation à 90°C pendant 30 min.
II.2.2.4 Observation sous microscope

Les racines colorées ont été découpées en fragments d'environ 1cm de longueur. Vingt
fragments choisis au hasard ont été montés entre lame et lamelle dans du glycérol à 40% à
raison de 10 fragments par lame. Finalement, les fragments ont été observés sous microscope
à grossissement x40.
Le NPP est donné par la formule
Log10 NPP=(x log a)- K
x est la moyenne des godets mycorhizés
a est le facteur de dilution
K est donné par la table de Fisher et Yates (1948 ,1976) en annexe 4.
II.3 Dénombrement des microorganismes
Préparation des dilutions en cascade
Avant la préparation des dilutions, les sols ont été séchés à l’air ambiant pendant 24
h. Pour chaque échantillon, cinq grammes de sol ont été mélangés avec 45 ml d’eau distillée
stérilisée. Le mélange a été homogénéisé à l’aide d’un agitateur magnétique afin d’obtenir une
solution mère à 10-1. Ensuite, cent microlitres de la solution mère ont été prélevées puis
mélangées avec 900μl d’eau distillée stérilisée suivi d’une agitation au vortex, pour avoir une
dilution 10-2 et ainsi de suite.
II.3.1 Dénombrement des Bactéries Solubilisatrices de phosphate (BSP)
Les microorganismes capables de solubiliser le phosphate insoluble ont été dénombrés

sur milieu TCP (Tri-calcium phosphate) qui ne contient aucune autre source de phosphore
dans sa composition. Cent microlitres de la solution de sol diluée à 10-2 et 10-3 ont été étalées
sur des boites de Pétri contenant du milieu TCP préalablement stérilisé et solidifié. La
18
composition du milieu TCP est donnée en annexe 5. La capacité des bactéries à solubiliser le
phosphate est témoignée par l’apparition des halos translucides autour des colonies après 48 h
d’incubation à 30°C.
II.3.2 Dénombrement de Pseudomonas fluorescens

Pour provoquer la production de sidérophores, les solutions de sol ont été préparées
avec une solution de Phosphate Buffered Salin (PBS). Cent microlitres de la solution mère à
10-1 ont été étalées sur du milieu King B et incubées pendant 48h à 30°C à l’obscurité. Le
dénombrement a été effectué sous lumière UV à 254 nm. La composition du milieu King B
est donnée dans l’annexe 5.
II.3.3 Dénombrement des Actinomycètes
Le dénombrement des Actinomycètes a été effectué sur le milieu Waksman solidifié
(Waksman, 1961) dont la composition est donnée dans l’annexe 5. Les dilutions 10-2 et 10-3
ont été choisies pour le dénombrement sur milieu Waksman. Les colonies d’Actinomycètes
qui se sont développées sur le milieu de culture ont été comptées après 7 jours d’incubation à
30°C dans une étuve.
II.3.4 Calcul du nombre d’UFC/g de sol

Le nombre de microorganismes est exprimé en nombre d’Unité Formant Colonie ou UFC par
gramme d’échantillon qui est calculé en utilisant la formule suivante :
ΣC
𝑁=
V(n1 + 0.1n2)d
∑C=Somme des colonies des boites interprétables

V=Volume de solution déposé dans les boites
n1=nombre des boites considérées à la 1ère dilution retenue (30 à 300 colonies)
n2=nombre des boites considérées à la 2 ème dilution retenue (30 à 300 colonies)
d1=facteur de dilution de la 1er dilution retenue
III. Traitement des données

Les données ont été soumises à une analyse de variance (ANOVA) en utilisant le
logiciel XLSTAT 2016 pour la comparaison des moyennes entre les espèces à caractériser.
Ceci dans le but d’évaluer les caractéristiques des sols rhizosphériques en fonction des
espèces qui les colonisent. La différence entre les groupes de moyenne statistiquement
homogène a été confirmée par le test de Newman-Keuls au seuil de probabilité de 5% (0,05).
19
La méthode classique d’Analyse en Composante Principale (ACP) a été utilisée pour

mettre en évidence les corrélations entre les espèces caractéristiques (pionnière et non
pionnières) et les paramètres qui caractérisent leurs sol rhizosphériques c'est-à-dire, l’activité
microbienne globale, la phosphatase acide, le PIM, le NPP et le nombre de microorganismes
(BSP, Actinomycètes, Pseudomonas).
20
Résultats et
interprétations
Résultats et interprétations
I. Activités microbiennes des sols
I.1. Activité microbienne globale du sol par hydrolyse de la Fluorescéine di-

acétate
Après une analyse de variance efféctuée sur les données, la Figure 6 résume l’activitée
microbienne globale des sols.
150 (a)
Quantité de fluorescéine
produit / g de sol /h
100
(b) (b)
(b) (b)
50 (b)
(c)
0
TFC PHI VER MOR VAC POLY SD
Types de sol
Figure 6 : Activité microbienne globale des sols

TFC: topsoil de la forêt de conservation PHI: Phillipia floribunda VER: Vernoniopsis caudata MOR: Morella
spathulata VAC : Vaccinium emirnense POLY : Polyscia ornifolia SD : sol déminéralisé
Les histogrammes marqués par la même lettre ne présentent pas de différence significative selon le test de
Newman-Keuls au seuil de probabilité 0.05
Cette Figure montre la distinction de 3 groupes statistiques (a, b et c). L’activité

microbienne globale du topsoil de la forêt de conservation se démarque d’une manière
significative avec une valeur de fluorescéine libérée de l’ordre de 132,18 µg/h/g de sol.
Ensuite, vient le groupe formé par Vernoniopsis caudata, Morella spathulata, Vaccinium
emirnense, Polyscia ornifolia et Phillipia floribunda dont les teneurs en fluorescéines libérées
ont été respectivement de l’ordre de 43,55µg de fluorescéine/h/g de sol, 44,10 µg de
fluorescéine/h/g de sol, 42,31µg de fluorescéine/h/g de sol, 45,80 µg de fluorescéine/h/g de
sol et 29,82 µg de fluorescéine/h/g de sol. Enfin, le sol déminéralisé forme un groupe à part
avec une activité microbienne globale significativement faible (15,64 µg de fluorescéine/h/g
de sol) par rapport aux autres types de sol étudiés ici. Ce qui suggère d’une part que le TFC
reste un sol de référence et d’autre part, que les sols colonisés par les quatre
espèces (Vernoniopsis caudata, Morella spathulata, Vaccinium emirnense et Polyscia
ornifolia) représentent de bons candidats pour les études ultérieures.
22
I.2. Activité des phosphatases acides du sol

L’analyse des donnée a permis d’établir la Figure 7 qui montre les résultats de
l’analyse des variances permettant de classer les résultats obtenus en quatre groupes
statistiques (a, b, c, d).
800 (a)
(b) (b)
(b)
Quantité de p-NPP
en µg/g de sol/h
600
400 (c)
(c)
200
(d)
0
Types de sol
Figure 7 : Activité phosphatasique en milieu acide

Le sol sous l’espèce non pionnière Vaccinium emirnense a une activité phosphatasique
significativement élevée par rapport aux autres sols avec 672,5 µg de para-nitrophénol/h/g de
sol. Les sols sous espèces pionnières sont classés dans un même groupe avec une activité
phosphatasique significativement élevée comparée à celle du TFC. Ces valeurs sont
respectivement de l’ordre de 585,73 µg de para-nitrophénol/h/g de sol pour Phillipia
floribunda, 583,13 µg de para-nitrophénol/h/g de sol pour Morella spathulata et 533,56 µg de
para-nitrophénol/h/g de sol pour Vernoniopsis caudata. Il a été relevé que le sol sous Polyscia
ornifolia et le TFC ont une activité significativement proche avec respectivement 173,98 µg
de para-nitrophénol/h/g de sol et 220 µg para-nitrophénol/h/g de sol. Le sol déminéralisé a
une activité significativement faible avec 11,74 µg de para-nitrophénol/h/g de sol. Ce qui met
en avant les sols sous Vaccinium emirnense, Phillipia floribunda, Morella spathulata et
Vernoniopsis caudata qui ont de meilleures activités que le sol de référence.
II. Potentiel Infectieux Mycorhizogène des sols

Le potentiel infectieux mycorhizogène du sol a été déterminé en utilisant deux
approches : la méthode du Most Probable Number et le dénombrement des spores de
champignons endomycorhiziens.
23
II.1. Densité des spores de champignons endomycorhiziens des sols
II.1.1. Densité totale des spores de champignons mycorhiziens par sol

Suite à l’analyse des variances, quatre groupes statistiques (a, b, c, d), présentés dans
la Figure 8, se sont formés.
4000,00 (a)
(b)
Densité des spores/100g de sol
3000,00
2000,00 (c) (c)

(c)
(c)
1000,00
(d)
0,00
Types de sol
Figure 8 : Densité totale des spores dans 100 g de sol

TFC : topsoil de la forêt de conservation PHI : Phillipia floribunda VER : Vernoniopsis caudata MOR : Morella
Il a été noté que le sol sous Polyscia ornifolia conserve la plus grande densité de
spores. Avec 3609 spores/100g de sol, il dépasse le topsoil de la forêt de conservation (2962
spores /100 g de sol) qui est le sol de référence. Les trois espèces pionnières : Phillipia
floribunda, Vernoniopsis caudata, Morella spathulata et le sol rhizosphérique de Vaccinium
emirnense forment un même groupe avec respectivement 1403 spores/100 g sol, 1440
spores/g de sol, 1249 spores/100 g de sol et 997 spores/100 g de sol. Le sol déminéralisé
possède une densité de spore significativement faible. Ce qui suggère que le sol sous Polyscia
ornifolia a un potentiel remarquable à favoriser la production de spores de champignons
MVA en dépassant même le topsoil de la forêt de conservation qui est le témoin positif.
II.1.3. Identification des spores

Après identification, il a été déterminé que les spores dans les sols à caractériser sont
ceux des espèces Acaulospora sp, Funneliformis Mosseae, Funneliformis coronatum,
Scutellopora, Rhizophagus intraradices et Gigaspora sp.
Le Tableau 4 résume le nombre de spores par sol pour chaque espèce identifiée.
24
Tableau 4 : nombre de spores par espèce identifiée
Funneliformis
Funneliformis
Scutellospora
Gigaspora sp
Rhizophagus
Acaulospora
intraradices
Glomus hoi
coronatum
mosseae
scutata
sp
TFC 59(c) 232(a) 1633(b) 26(c) 30(a) 461(b) 28(b)
PHI 246(a) 130(b) 1284(b) 23(c) 9(b) 41(c) 0(d)
VER 49(c) 17(e) 1395(b) 38(b) 0(b) 92(c) 0(d)
MOR 112(b) 59(d) 1037(c) 82(a) 0(b) 0(d) 0(d)
VAC 38(c) 29(e) 722(d) 15(d) 4(b) 99(c) 7(c)
POLY 137(b) 95(c) 2856(a) 7(e) 28(a) 763(a) 84(a)
SD 0(d) 0(f) 17(e) 0(e) 0(b) 24(d) 0(d)
TFC : topsoil de la forêt de conservation PHI : Phillipia floribunda VER : Vernoniopsis caudata MOR : Morella
(Les sols suivis d’une même lettre constituent un groupe statistiquement homogène, au seuil de probabilité 0,05,
selon le test de Newman-Keuls)
D’un point de vue général, les spores de Glomus hoi sont les plus abondants dans tous
les sols. Selon les résultats des analyses statistiques, d’un côté, c’est le sol sous espèce non
pionnière Polyscia ornifolia qui en renferme un nombre significativement élevé avec 2856
spores de Glomus hoi /100 g de sol. D’un autre côté, le topsoil de la forêt de conservation et
les sols sous espèces pionnières Phillipia floribunda et Vernoniopsis caudata forment un
même groupe statistique avec respectivement 1633, 1284 et 1395 spores de Glomus hoi /100 g
de sol. Le sol sous Vaccinium emirnense contient un nombre de Glomus hoi significativement
inférieur aux autres sols avec 722 spores de Glomus hoi /100 g de sol. Le sol déminéralisé qui
est le témoin négatif contient 17 spores de Glomus hoi /100 g de sol. Pour l’espèce
Acaulospora sp, c’est le sol sous espèce pionnière Phillipia floribunda (246 spores
d’Acaulospora sp/ 100 g de sol) qui en contient un nombre significativement élevé par rapport
aux autres sols. De même pour Funneliformis mosseae, parmi les cinq sols à caractériser, c’est
le sol sous l’espèce pionnière Phillipia floribunda (130 spores de Funneliformis mosseae/100
g de sol) qui en contient un nombre significativement élevé, bien que celui-ci soit inférieur à
celui du topsoil de la forêt de conservation (232 spores de Funneliformis mosseae/100 g de
sol). En ce qui concerne les autres espèces identifiés (Scutellopora, Rhizophagus intraradices
25
et Gigaspora sp), ils sont les moins nombreux dans la majorité des sols sauf pour le sol sous
Polyscia ornifolia qui contient un nombre significativement élevé de Rhizophagus
intraradices avec 763 spores /100 g de sol. Ces résultats montrent ainsi que les sols sont
surtout favorables à la sporulation de Glomus hoi. Le sol sous Polyscia ornifolia se démarque
par le fait qu’elle pourrait servir de source de propagules aussi bien pour l’espèce Glomus hoi
que pour Rhizophagus intraradices.
II.2 Méthode du Nombre le Plus Probable (NPP)

Le NPP de mycorhize dans chaque sol susceptible de coloniser la plante est donné
dans la figure 9.
600,000 (a)
(a)
500,000
NPP/100 g de sol
(a) (a)
400,000 (a) (a)
300,000
200,000
100,000 (b)
0,000
Types de sols
Figure 9 : NPP / 100 g de sol

TFC: topsoil forêt de la zone de conservation PHI: Phillipia floribunda VER: Vernoniopsis caudata MOR:
Morella spathulata VAC : Vaccinium emirnense POLY : Polyscia ornifolia SD : sol déminéralisé
L’analyse des variances a rassemblé tous les sols dans un même groupe sauf le sol
déminéralisé qui a un NPP significativement faible. Les sols sont caractérisés par un NPP
significativement élevé avec 503,238 NPP/100 g de sol pour Polyscia ornifolia, 460,593
NPP/100 g de sol pour Vernoniopsis caudata, 373,402 NPP/100 g de sol pour Vaccinium
emirnense et Phillipia floribunda, 332,660 NPP/100 g de sol pour Morella spathulata et le
topsoil de la forêt de conservation. Aucune différence significative n’a donc été relevé entre
les sols sous espèces pionnières et non pionnières. Ceci suggère que les sols conservent tous
un nombre de propagules apte à générer une bonne mycorhization. La Figure 10 montre les
racines de sorgho mycorhizées observées sous microscope.
26
Vésicules de MVA Hyphes de MVA
Figure 10 : Racines de sorgho mycorhizées observées au grossissement X 40
III. Densité des microorganismes dans les sols

III.1 Nombre de BSP dans les sols
La figure 11 montre les résultats de l’analyse des variances sur le dénombrement des
BSP.
(a) (a)
8000,00 (a)
UFC de BSP /g de sol
6000,00 (b)
(b) (b)
4000,00
2000,00
(c)
0,00
-2000,00
Types de sol
Figure 11 : Nombre d’UFC de Bactéries Solubilisatrices de Phosphate / g de sol
Les BSP ont été identifiées par la présence d’un halo autour des colonies. Ceci a été
observé dans tous les sols sauf le sol déminéralisé. Les sols rhizosphériques des espèces
pionnières Vernoniopsis caudata, Phillipia floribunda, Morella spathulata forment un même
groupe statistique. Ils ont montré un nombre de colonies entourées d’un halo
significativement élevé par rapport aux autres sols avec respectivement 7446 UFC /g de sol,
7109 UFC /g de sol et 6800 UFC /g de sol. Ils sont suivis des sols sous espèces non pionnières
Vaccinium emirnense (4873 UFC /g de sol), Polyscia ornifolia (4133 UFC /g de sol) et du
topsoil de la forêt de conservation (4377 UFC /g de sol). Ces résultats avancent que les sols
27
sous espèces pionnières sont plus intéressants en ce qui concerne les BSP, ils en conservent
plus que le sol forestier de référence.
III.2 Nombre de Pseudomonas fluorescens dans les sols.

Les résultats de l’analyse de variance sur le dénombrement de Pseudomonas par
l’observation de la fluorescence sous ultra-violet à 254 nm sont résumés dans la Figure 11.
UFC de pseudomonas /g de sol
600,00 (a)
500,00 (a)
(b)
400,00 (b)
(b)
300,00
200,00
100,00 (c)
(c)
0,00
-100,00 TFC PHI VER MOR VAC POLY SD
Types de sol
Figure 12 : Nombre d’UFC de Pseudomonas fluorescens /g de sol
Newman-Keuls au seuil de probabilité 0.05.
Quatre groupes statistiques (a, b, b et c) se sont formés. Le premier groupe est formé par le sol
rhizosphérique de Phillipia floribunda qui contient un nombre de Pseudomonas fluorescens
significativement élevé par rapport aux autres sols avec 510 UFC /g de sol. Il est suivi du sol
sous Vaccinium emirnense 390 UFC /g de sol et du topsoil de la forêt de conservation (353
UFC /g de sol). Le troisième groupe comprend le sol sous Polyscia ornifolia (296 UFC /g de
sol) et le sol sous l’espèce pionnière Morella spathulata (256,667 UFC /g de sol) avec un
nombre d’UFC significativement inférieur à celui des sols cités précédemment. Le sol sous
espèce pionnière Vernoniopsis caudata et le sol déminéralisé n’en contiennent aucun.
III.3 Dénombrement des actinomycètes.

Le nombre d’UFC d’actinomycètes contenu dans 100 g de chacun des sols à
caractériser est résumé dans la Figure 12.
28
(a) (a)
UFC d'actynomicètes/g de
10000,00
8000,00 (b)
(b) (b)
(b)
6000,00
sol 4000,00
2000,00 (c)
0,00
-2000,00 TFC PHI VER MOR VAC POLY SD
Types de sol
Figure 13 : Nombre d’UFC d’Actinomycètes / g de sol
L’analyse des variances a classifié le sol sous l’espèce pionnière Morella spathulata
avec 9618 UFC /g de sol et le topsoil de la forêt de conservation avec 9676 UFC/g de sol qui
ont un nombre d’UFC d’actinomycètes significativement élevé par rapport aux autres sols.
Ensuite viennent les sols sous les espèces pionnières Vernoniopsis caudata (5413 UFC/g de
sol) et Phillipia floribunda (4410 UFC/g de sol) et les espèces non pionnières Vaccinium
emirnense (5059 UFC/g de sol) et Polyscia ornifolia (5380 UFC/g de sol) qui n’ont montré
aucune différence significative. Le sol déminéralisé n’a pas montré la présence
d’actinomycètes. Ce qui avance la forte réserve potentielle en actinomycète du sol sous
Morella spathulata dépassant celle du topsoil de la forêt de conservation.
La Figure 13 montre la morphologie des colonies de BSP,de Pseudomonas fluorescens

et d’Actynomicètes.
A B C
Colonie de Pseudomonas
Halo
Figure 14 : Morphologie des microorganismes dénombrés
A : Bactéries Solubilisatrices de Phosphate B : Actinomycètes C : Pseudomonas
29
IV. Corrélation entre tous les paramètres étudiés et les différents types de sol
La Figure 14 résume l’Analyse en Composante Principale des 7 variables : Bactéries
Solubilisatrices de Phosphate, Nombre le Plus Probable, diversité des spores, Actinomycètes,
Pseudomonas, activités microbienne globale, phosphatase acide, qui décrivent les propriétés
microbiologiques des sols.
Variables (axes F1 and F2: 74,54 %) Observations (axes F1 et F2 : 73,95 %)

1 2
FDA
0,75 SPORES VER
VAC
MOR
1
0,5
ACTINO PHI
PSEUD0
0,25
F2 (25,25 %)
F2 (25,79 %)
0
NPP
0 SD
-1
-0,25
POLY
BSP
-0,5
-2
PAC
-0,75
TFC
-1 -3
-1 -0,75 -0,5 -0,25 0 0,25 0,5 0,75 1 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2
F1 (48,75 %) F1 (48,70 %)
Figure 15 : Cercle de corrélation
BSP : Bactéries Solubilisatrices de Phosphate ; NPP: Nombre le Plus Probable SPORES : Diversité des Spores ;
ACTINO : Actinomycètes ; PSEUDO : Pseudomonas ; FDA : Activités microbienne globale, PAC : Phosphatase
acide.
L’ACP a mis en évidence une dispersion de 73,95 % des variables sur les axes
factoriels F1 x F2. Les axes F1 et F2 présentant respectivement 49,70 % et 25,25 % de
l’inertie totale des points ont été retenu pour l’interprétation des résultats.
Les variables ACTINO, PSEUDO, BSP et NPP sont expliquées par l’axe F1. Les
variables PAC et FDA (activités enzymatiques) et densité de spores sont expliquées par l’axe
F2. Les sols sous espèces pionnières VER, MOR et PHI forment un même groupe avec des
caractéristiques similaires essentiellement expliqués par la variable BSP, puisque ces sols en
sont très riches. Les résultats montrent également que le sol sous VAC présente des
caractéristiques similaires à celles des espèces pionnières. Ce dernier montre des
caractéristiques intéressant pour un programme de restauration écologique. Le sol sous
l’espèce non pionnière POLY par contre forme un groupe à part principalement caractérisé
par une densité de spores importante comparée aux autres sols de. Le cercle de corrélation
montre une corrélation fortement positive entre l’activité des phosphatases acide du sol et le
30
nombre de BSP, ainsi que le NPP. Ce qui montre l’interaction entre les BSP et les MVA dans
la transformation du phosphate indisponible du sol en phosphate assimilable pour la plante.
Une corrélation fortement positive est aussi observable entre le NPP et la densité de spores, ce
qui suggère que pour les sols étudiés, les spores sont des formes de multiplications des MVA,
ces sols pourraient donc être utilisés dans des techniques de restauration mettant en avant
l’utilisation du PIM d’un sol.
31
Discussion
Discussion
L’objectif principal de cette étude était de décrire les paramètres microbiologiques qui
caractérisent les sols rhizosphériques des espèces caractéristiques de l’écosystème minier de
Mandena en vue de leur valorisation dans des programmes de restaurations écologiques. Pour
se faire, l’analyse de l’activité des enzymes ainsi que l’évaluation de la densité des
microorganismes bénéfiques ont été effectuées. Pour rappel, trois espèces pionnières :
Phillipia floribunda (Ericaceae), Vernoniopsis caudata (Astraceae), Morella spathulata
(Myriaceae) et deux espèces non pionnières : Vaccinium emirnense (Ericaceae) et Polyscia
ornifolia (Araliaceae) ont été étudiées au cours de ce travail.
Activité des enzymes du sol
En premier lieu, l’analyse de l’activité des enzymes des sols a été effectuée. Pour cela,
la méthode utilisée a été celle qui consiste à suivre l’hydrolyse de la Fluorescéine di-acétate.
Les résultats ont montré que le topsoil de la forêt de conservation présente l’activité la plus
élevée. Les sols rhizosphériques sous les espèces pionnières (Polyscia ornifolia et
Vernoniopsis caudata) ont également montré des activités microbiennes globales élevées. Ces
résultats corroborent ceux d’Andriatahiana (2015) et Baohanta, (2011) qui ont trouvé une
forte activité microbienne globale dans des sols rhizosphériques de plante pionnières.
Vaccinium emirnense qui est une Ericacée présente pourtant une activité similaire à celle des
espèces pionnières. Les Ericacées possèdent des symbiotes mychoriziennes éricoïdes avec un
pic d'activité enzymatique à pH très bas (Morissette, 2011). La différence entre le sol de ces
deux Ericacées pourrait être alors être due à la quantité de litière qu’ils produisent car
Phillipia floribunda est une espèce buissonnante (Rakotoson, 2002) tandis que Vaccinium
emirnense est un arbuste (Danet, 2005). En effet, l’activité microbienne globale est influencée
par le caractère physico-chimique, le taux de matière organique du sol (Schnur et Rosswal,
1982 ; Frankenberg et Dick, 1983) et l’espèce qui colonise le sol (Cabugao et al., 2017). Etant
donné que l’analyse de l’activité microbienne globale du sol permet d’évaluer la qualité
biologique d’un sol (Burns, 1982 ; Garcia et al, 2000 ; Petit Jean, 2019), le sol rhizosphérique
de Phillipia floribunda est donc de qualité biologique faible.
Pour la phosphatase acide, les analyses ont montré que le sol rhizosphérique de
Vaccinium emirnense a l’activité la plus notable. Ces résultats peuvent être expliqués par le
fait que les Ericacées se développent généralement sur des sols acides (Edgar, 1920) et que
naturellement, les phosphatases acides prédominent et montrent une minéralisation optimale
du phosphore dans les sols acides (Olander et al., 2000; George et al., 2002 ;Doda et al.,
33
Discussion
2003). En effet, Vaccinium emirnenense croit sur un sol à pH entre 3,5 et 4 (Krzewińska,
2004). Pour les deux autres espèces pionnières, Vernoniopsis caudata, et Morella spathulata,
les résultats ont montré des valeurs significativement supérieures à celle de l’espèce
secondaire Polyscia ornifolia. Ces résultats rejoignent toujours ceux d’Andriatahiana (2015)
et Rabemanantsoa (2015) qui ont suggéré une activité importante de la phosphatase acide
dans les sols sous espèces pionnières Clydemia hirta et Conyza sumatrensis. La présence de
ces enzymes est d’une grande importance dans les programmes de revégétation (Garcia et al.,
2000) étant donné que la production de phosphatase par les microorganismes augmente la
disponibilité de l’ion ortho phosphate dans le sol (Marschner, 2011) favorisant ainsi la
croissance de plante. Le sol de Mandena étant pauvre en phosphate (QMM, 2001) les espèces
pionnières à forte activité phosphatasique (Phillipia floribunda, Vernoniopsis caudata,
Morella spathulata) et l’espèce non pionnière Vaccinium emirnense seront adaptées pour la
revégétalisation du milieu.
Potentiel infectieux mycorhizogène des sols
Les résultats sur le dénombrement des spores de champignons endomycorhiziens ont

permis d’un coté de mettre en exergue que le sol rhizosphérique sous Polyscia ornifolia et le
topsoil de la forêt de conservation contiennent la plus grande densité de spores. Dans le cadre
d’une restauration écologique, cette densité élevée de spore permet d’augmenter la chance
pour les autres espèces d’obtenir à leur tour une symbiote. En effet pour les champignons
mycorhiziens, les spores sont en même temps une forme de résistance en situation de stress
(Montville & Matthews, 2005) et aussi une forme de dissémination témoin de leur viabilité
(Ohtomo et al., 2018). D’un autre côté, aucune différence significative n’a été observée entre
les sols rhizosphériques sous les espèces pionnières Phillipia floribunda, Vernoniopsis
caudata, Morella spathulata et sous l’espèce non pionnière Vaccinium emirnense. La
différence entre la densité de spore du sol rhizosphérique de ces dernières et celle su sol
rhizosphérique de Polyscia ornifolia pourrait s’expliquer par le fait que la densité et la
diversité des spores varient selon le type de la plante hôte étant donné que les exsudats
racinaires agissent sur la communauté de MVA influençant leur sporulation (Eom et al.,
2000). Chaque sol offre ainsi un microenvironnement différent qui influe sur la sporulation
des champignons mycorhiziens (Seuillon et al., 1998 ; Lovelock, 2003 ; Zeze et al., 2007).
Des analyses plus approfondies ont permis d’identifier les espèces Acaulospora sp,
Funneliformis Mosseae, Funneliformis coronatum, Scutellopora scutata, Rhizophagus
intraradices, Gigaspora sp et Glomus hoi dans les sols. La nature des communautés de MVA
34
Discussion
est liée au type de peuplement végétal et du type de sol (Jeffries et Barea ,2001). Les genres
Gigaspora et Acaulospora tolèrent l’acidité et sont naturellement présents dans les sols acides
tandis que le genre Glomus est favorisé dans les sols proches de la neutralité (Mosse, 1973).
Or, les résultats ont montré que les spores de Glomus hoi sont significativement élevées dans
la majorité des sols surtout dans le sol rhizosphérique de Polyscia ornifolia. Ceci pourrait être
due au fait que les Glomus hoi s’adaptent facilement aux fluctuations environnementales et
sont prépondérants dans des sols sableux (Ouallal et al., 2018 ; Stuthz, 2000). Aussi, le genre
Glomus est dominant dans les zones dégradées d’exploitation minière (CNRT ,2012).
Les sols sont caractérisés par un nombre de propagules apte à générer une
mycorhization très élevée. Aucune différence significative n’a été observée entre les sols sous
espèces pionnières Phillipia floribunda, Vernoniopsis caudata, Morella spathulata et sous
Vaccinium emirnense. Les études de Henkel et al. (1989) ont montré une sensibilité des MVA
par rapport à l’environnement du sol, ils sont plus effectifs dans un sol pauvre en matière
organique, ce qui est le cas pour les sols dégradés de la zone d’exploitation de l’industrie
minier QMM (Rakotoson, 2002). Selon l’ITAB 2002, la référence du nombre le probable des
propagules contenu par kg de sol qui est jugé acceptable autour de 1500 par kg de sol, alors
que les sols présentent jusqu’à 3 fois cette valeur et même 5 fois pour Polyscia ornifolia. Le
PIM d’un sol est d’une grande importance dans le cadre d’un projet de restauration des sols
perturbés (Dechamplin ,2002) notamment pour la valorisation des plantes dans les
phénomènes de facilitation écologiques (Sanon 2005 ; Baohanta 2011 ; Duponnois, 2013).
Les cinq espèces seraient donc des candidates potentiellement utilisables à cet effet. Leurs
sols pourraient restaurer le potentiel mycorhizien de la zone dégradée. Mais il faut aussi noter
que certaines espèces pionnières très mycotrophes s’installent en début de succession végétale
sur des sols dégradés et favorisent par la suite le développement d’autres espèces végétales
via un effet plante nurse (Azcon-Aguilar et al., 2003). Parmi les espèces étudiées,
Vernoniopsis caudata et Morella spathulata ont déjà été évaluées comme des espèces
pionnières hautement mycotrophes (Ramanankierana, 2012). Ces espèces pourraient donc
potentiellement jouer le rôle de plantes nurses et être valoriser dans un projet de restauration
écologique.
Densité des microorganismes dans les sols
Les analyses ont révélé que les sols sous espèces pionnières (Phillipia floribunda,
Vernoniopsis caudata, Morella spathulata) possèdent un plus grand nombre de Bactéries
Solubilisatrices de Phosphate (BSP) par rapport aux sols sous espèces non pionnières. Ces
35
Discussion
résultats sont consolidés par ceux de Cabugao en 2017 qui montrent une différence de la
biomasse de BSP selon le type de plante et de la racine. De plus, une corrélation entre les BSP
et les phosphatases acides a également été montrée car ces mêmes sols présentent les activités
phosphatasiques acides les plus élevées. La présence de ces bactéries dans le sol contribue
ainsi à la solubilisation du phosphate, qui est très peu disponible dans les sols acides
(Ratsimbason ,2019) et en même temps à la croissance de la plante (Khan, 2009). Ces espèces
pourraient alors facilement s’adapter au déficit de phosphore et améliorer la qualité du sol de
Mandena qui est également acide (Sarasin ,2003).
Tous les sols, sauf le sol déminéralisé, contiennent des actinomycètes à différentes
quantités. Le topsoil de la forêt de conservation et le sol sous l’espèce pionnière Morella
spathulata conservent le plus grand nombre de ces microorganismes. Aucune différence
significative n’a été observée entre les espèces pionnières (Phillipia floribunda et
Vernoniopsis caudata) et les espèces non pionnières (Vaccinium emirnense et Polyscia
ornifolia). Ces résultats sont consolidés par ceux de Golinska et Dahm (2011) qui ont aussi
relevé l’abondance des actinomycètes dans les sols rhizosphériques surtout sous les espèces
pionnières. En ce qui concerne la différence entre les sols, cela pourrait être due à la variation
des exsudats racinaires libérés dans le sol (Dommerguez, 2016). Rappelons que les
actinomycètes sont importants de par leurs activités en tant qu’agents de biocontrôle contre
les pathogènes, leurs effets sur la croissance de la plante (Clément et Lozet, 2011 ; Sharma et
al., 2014 ; Ravolomanitrarivo, 2015) et leur rôle dans la fertilisation (Ounadjela, 2016). Ce
qui procurerait à l’espèce Morella spathulata une meilleure résistance et adaptation au milieu
dégradé.
Les sols étudiés sont caractérisés par un nombre de Pseudomonas très faible. En effet,
les Pseudomonas sont plus favorisées par des milieux proches de la neutralité (Boullard et
Moreau, 1962), alors qu’ici, le sol de Mandena a un pH acide (Sarasin, 2017) ce qui
expliquerait la rareté des Pseudomonas dans ces sols. Bien de faible densité, les sols sous
Phillipia floribunda et Vaccinium emirnense présentent le nombre le plus élevé suivi des sols
sous Morella spathulata et Polyscia ornifolia, Vernoniopsis caudata n’en contient aucun. La
plante oriente et sélectionne les microorganismes qui vont constituer la rhizosphère par
l’intermédiaire des exsudats racinaires (Thomas, 2014). Ce qui pourrait expliquer ces
résultats. Tout de même les plantes avec un sol rhizosphérique colonisé par les Pseudomonas
sont avantagées car les Pseudomonas améliorent la santé de la plante, favorise sa croissance et
sont des agents de lutte contre les phytopathogènes (Rainey, 1999 ; Mezaache, 2012).
36
Discussion
Les espèces pionnières colonisent en premier les surfaces nues ou les zones dégradées
et restaurent les propriétés du sol par la stimulation des microorganismes rhizosphériques ou
par l’amélioration de la qualité physico-chimique du sol (Pidwirny, 2006). Les
microorganismes interagissent entre eux et avec la plante modifiant les paramètres physico-
chimiques du sol et en même temps l’adaptation des plantes (Rainey, 1999), ce qui facilite
l’intégration d’autres espèces dans le cadre d’une restauration écologique. De par les résultats
obtenus, les sols des trois espèces pionnières Phillipia floribunda, Morella spathulata et
Vernoniopsis caudata sont suggérées pour cet effet. Comme cette étude n’a pas pris en
compte le paramètre durée de conservation des sols qui influe sur les activités microbiennes
du sol, les résultats donc peuvent donc légèrement s’écarter des conditions réelles sur terrain.
Analyse des composantes principales
L’analyse des composantes principales a montré que les sols sous espèces pionnières
Phillipia floribunda, Vernoniopsis caudata, Morella spathulata forment un même groupe de
caractéristiques similaires, ceci est évident car les espèces pionnières d’une même zone ont
des caractéristiques communes qui est la capacité de se développer dans une zone dégradée.
Cependant, le sol sous l’espèce Vaccinium emirnense présente des caractéristiques similaires
à ceux des espèces pionnières et forment un même groupe avec ces dernières. A notre
connaissance, aucune étude n’a encore été menée sur cette plante dans la zone de Mandena
mais elle est considérée comme pionnière à Arivonimamo (Baohanta, 2011) ce qui pourrait
expliquer ces similitudes. Les résultats ont aussi mis en avant la forte corrélation entre le
nombre d’UFC de BSP, et l’activité des phosphatases acides, ainsi que le NPP. Toro et al. en
1997 et Kothamasi en 2006 ont démontré cette même interaction qui favorise la croissance
de la plante car les BSP mettent à disposition des champignons mycorhiziens les phosphates
solubles, Ce phénomène se produit surtout avec les Gloméromycètes dans un sol pauvre en
phosphate (Arturson, 2006).
37
Conclusion et
perspectives
Conclusion et perspectives
En conclusion, les travaux réalisés sur la caractérisation des cinq espèces végétales
caractéristiques des zones décapées de l’écosystème minier de Mandena Fort Dauphin ont
permis d’établir des données essentielles sur les caractéristiques des sols rhizosphériques de
ces espèces et en même temps de déterminer leurs valorisations possibles.
Il a été relevé d’un côté que les sols des espèces pionnières étudiées (Phillipia
floribunda, Vernoniopsis caudata et Morella spathulata) présentent des caractéristiques
microbiologiques intéressantes. Cependant, Vernoniopsis caudata et Morella spathulata se
démarquent avec des propriétés encore meilleures de par leur richesse en microorganismes
bénéfiques, l’activité des enzymes des sols et leur richesse en propagules aptes à générer une
mycorhization et elles pourraient donc être valorisées dans un programme de restauration
écologique. Il a aussi été observé que le sol rhizosphérique de l’espèce non pionnière
Vaccinium emirnense a des caractéristiques microbiologiques très intéressants, similaires aux
espèces pionnières qui seraient autant valorisables que les espèces pionnières dans un projet
de restauration écologique. D’autre part, Polyscia ornifolia serait une source intéressante de
propagule pour des inoculations futures. A part cela, cette caractérisation a permis aussi de
déterminer des utilisations possibles des plantes pionnières hautement mycotrophes
Vernoniopsis caudata et Morella spathulata pour la restauration du potentiel mycorhizogène
des sols ou en tant que plante nurse dans les projets de restauration.
Ces résultats ne sont que des résultats préliminaires qui nous ouvrent vers de nouvelles
perspectives de travail à savoir :
 Analyser des éléments minéraux essentiels pour la plante (N, P, K, C) ;

 Analyser l’effectivité des spores de champignons endomycorhiziens ;
 Isoler et évaluer l’effectivité des microorganismes bénéfiques ;
 Etudier l’impact des espèces pionnières sur la qualité biologique du sol en
fonction du temps ;
 Evaluer les effets facilitatrices de Vernoniopsis caudata et Morella spathulata
sur d’autres espèces cibles du projet ;
 Déterminer si Vaccinium emirnense est une espèce pionnière de la zone de
Mandena.
38
Références
bibliographiques
Références bibliographiques
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topsoils du site minier de Mandena Fort Dauphin. Mémoire de Master. Université
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48
Annexes
Annexes
Annexe 1 : Classification des cinq espèces végétales caractéristiques de l’écosystème

minier de Mandena Fort Dauphin
Phillipia floribunda
Classe : Equisotepsida
Sous-classe : Magnoliidae
Superordre : Asteranae
Ordre : Ericales
Famille : Ericaceae
Genre : Philippia
Espèce : floribunda
Nom vernaculaire :Anjavidy, Riadriatra
Morella spathulata
Sous-Classe : Magnoliidae
Super-Ordre: Rosanae
Famille : Myriaceae
Genre : Morella
Espèce : spathulata
Nom vernaculaire : Voalaka
Vernoniopsis caudata
Classe : Equisotepsid
Superordre: Asteranae
Ordre : Asteranae
Famille: Astraceae
Genre: Vernoniopsis
Espèce: caudata
Nom vernaculaire : Fitombohantsiny
Vaccinium emirnense
Super-Classe : Angiospermes
Classe : Dicotyledones
Ordre : Ericales
Famille : Ericaceae
Genre : Vaccinium
Espèce : emirnense
Nom vernaculaire : Voaramontsina
Polyscia ornifolia
Superordre : Astaranae
Ordre : Apiales
Famille : Araliaceae
Genre : Polyscia
Espèce : ornifolia
Nom vernaculaire : Tsahatsahanombilahy

Annexe 2 : Préparation des solutions tampons
Préparation du tampon Mc Ilvain
Le tampon Mc Ilvain ou le tampon Universel Modifié est un mélange de la solution A

et la solution B.
Solution A : 19,21g d’acide citrique est dissout dans 1000ml d’eau déminéralisée.
Solution B : 53,65g de Na2HPO4 ,7H2O ou 71,7g de Na2HPO4, 12H2O sont mis en

solution dans 1000ml d’eau déminéralisée.
Le pH du tampon Mc Ilvain varie suivant les quantités de la solution A et de B selon

le Tableau ci-après :
Tableau : Les mélanges des deux solutions A et B avec les pH correspondants
A(X) B(Y) pH
44,6 5,4 2,6
42,2 7,8 2,8
39,8 10,2 3
37,7 12,3 3,2
35,9 14,1 3,4
33,9 16,1 3,6
32,3 17,7 3,8
30,7 19,3 4
29,4 20,6 4,2
27,8 22,2 4,4
26,7 23,3 4,6
25,2 24,8 4,8
24,3 25,7 5
23,3 26,7 5,2
22,2 27,8 5,4
21 29 5,6
19,7 30,3 5,8
17,9 32,1 6
16,9 33,1 6,2
15,4 34,6 6,4
13,6 36,4 6,6
9,1 40,9 6,8
6,5 43,6 7
Annexes
Pour 50ml de tampon Mc Ilvain à pH=7 par exemple, on additionne 6,5ml de la solution A
avec 43,6ml de la solution B. Cette solution à pH=7 est communément appelée solution stock.
Solution tampon potassium phosphate
8,7g de K2HPO4 et 1,3g de KH2PO4 sont dissouts dans 800ml d’eau distillée. Le pH
de la solution est ensuite mesuré et ajusté à 7,6 à l’aide de la soude et le tout est enfin
complété à 1 litre. La solution est soit utilisée directement, sinon elle est conservée à 4°C.
Annexes
Annexe 3 : Description morphologique des spores
Species Color Size Shape subtending ornamentation Arrangement

(µm) hyphae SH
Glomus hoi light brown 50- Globose present (1) none Single
150
Funneliformis Straw to dark 100- Globose to Flared to funnel- none Clusters
mosseae orange-brown 196- subglobose shaped (1)
260
Funneliformis orange-brown 80- Globose, funnel-shaped none Single

coronatum 154- subglobose
220
Rhizophagus White, pale 40- Globose, Cylindrical/slightly none Single
intraradices cream, yellow 140 subglobose flared
brown
Scutellospora Hyaline/white 340- Globose, Present
scutata 640 subglobose
Annexes
Annexe 4 : Calcul du nombre le plus probable de propagule

Le nombre le plus probable de propagules fongiques (NPP) contenu dans le pot sans dilution
est donné par la formule
log 10 NPP = x log a – K
Où a est le facteur de dilution soit 4 dans notre cas.
Donc log 10 NPP = 0.60206x − K
x représente le niveau fertile moyen.
nombre total de plantes mycorhizées
𝑥=
nombre de cultures pour chaque dilution
Soit dans notre cas :
nombre total de plantes mycorhizées
𝑥=
3
Valeurs du facteur k pour des dilutions de facteur 4
Nombres de dilutions
6 ou 6 ou
x 4 5 y 4 5
plus plus
0.4 0.74 0.706 0.707 3.5 0.55
0.6 0.615 0.617 0.618 3 0.548
0.8 0.573 0.576 0.577 2.5 0.545 0.545
0 0.555 0.558 0.559 2 0.537 0.537 0.537
1.5 0.545 0.551 0.553 1.5 0.522 0.522 0.522
2 0.573 0.548 0.551 1 0.488 0.488 0.488
2.5 0.545 0.552 0.8 0.464 0.464 0.464
0.552* 0.6 0.431 0.431 0.431
0.4 0.375 0.375 0.375
La valeur K est déterminée en entrant dans la table avec x ou y.

y représente le niveau stérile moyen.
y = nombre de niveau de dilution – x
soit dans notre cas: y = 6 – x
Annexes
Annexe 5 : Composition des milieux de cultures
COMPOSITION DU MILIEU TCP, pH 7
REACTIFS Quantité
NH4Cl 5g
NaCl 1g
MgSO4 1g
Ca3(PO4)2 4g
Glucose 10g
Agar 20g
ED 1l
COMPOSITION MILIEU KING B, pH 7,2
REACTIFS Quantité
Polypeptone 20g
Glycérol 10g
Phosphate bipotassique 1,5g
Sulfate de magnésium 1,5g
Agar 15g
ED 1l
COMPOSITION MILIEU WAKSMAN
REACTIFS Quantité
Glucose 20g
Casitone 5g
NaCl 5g
Beef extract 3g
Agar 20g
E.D 1l
Nom : MAEVATIANA
Prénom : Hermance
E-mail : maevahermance@yahoo.com
Titre : Description des paramètres microbiologiques des sols sous cinq espèces végétales de
l'écosystème minier de Mandena Fort Dauphin (Morella spathulata, Vernoniopsis caudata,
Phillipia floribunda, Polyscia Ornifolia, Vaccinium emirnense)
Résumé
Un projet de restauration écologique met en œuvre des processus de succession

végétale initié par des espèces pionnières de la zone. L’objectif de cette étude a été de décrire
les paramètres microbiologiques qui caractérisent les sols rhizosphériques de l’écosystème
minier de Mandena Fort Dauphin en vue de leur valorisation dans des programmes de
restauration écologiques.
Les sols rhizosphériques de trois espèces pionnières Vernoniopsis caudata, Phillipia

floribunda, Morella spathulata et deux espèces non pionnières Vaccinium emirnense et
Polyscia ornifolia ont été utilisé pour les caractérisations microbiologiques. L’analyse de
l’activité des enzymes des sols, l’évaluation du potentiel infectieux mycorhizogène des sols
ainsi que le dénombrement des microorganismes ont été effectués.
Les espèces pionnières Vernoniopsis caudata, Phillipia floribunda, Morella spathulata

ont montré des propriétés microbiologiques intéressantes même si Vernoniopsis caudata et
Morella spathulata se démarquent plus avec un nombre de microorganismes bénéfiques, une
activité enzymatique et un nombre de propagule apte à générer une mycorhization plus élevée
qui pourraient être valorisées dans un projet de restauration. Vaccinium emirnense quant à elle
a révélé des caractéristiques similaires à celle des espèces pionnières. Tandis que Polyscia
ornifolia a un sol rhizosphérique riche en spores de MVA et un potentiel infectieux
mycorhizien trois fois supérieur au seuil acceptable.
Mots clés : Restauration écologique, espèces pionnières, Mandena, sols miniers.
Encadreur : Docteur Baohanta Rondro Harinisainana
Docteur ANDRIANANDRASANA Martial Doret

Name: MAEVATIANA
First name: Hermance
E-mail: maevahermance@yahoo.com
Title: Description of the soil microbiological parameters of five plant species of

Mandena Fort Dauphin mining ecosystem (Morella spathulata, Vernoniopsis caudata,
Phillipia floribunda, Polyscia Ornifolia, Vaccinium emirnense)
Abstract
An ecological restauration project uses the process of plant succession initiated by

native pioneer species. The aim of this study was to describe the microbiological parameters
characterizing the rhizospheric soil of typical species of Mandena Fort Dauphin ecosystem in
purpose to valorize them in an ecological restauration program.
Rhizospheric soil from three pioneer species Vernoniopis caudata, Phillipia

floribunda, Morella spathulata and from two non-pioneer species Vaccinium emirnense and
Polyscia ornifolia were chosen for the microbiological characterization. The characterization
parameters were the soil enzyme activities, mycorrhizal infectious capacity and
microorganism density of the rhizospheric soil.
The pioneer species Vernoniopis caudata, Phillipia floribunda, Morella spathulata

shown an interesting microbiological propriety. Though Vernoniopsis caudata and Morella
spathulata have a greater microorganism density, a higher enzyme activity and an outstanding
mycorrhizal infectious capacity, could be valorized in a restauration project. Vaccinium
emirnense revealed the same characteristic as the pioneer ones. Whereas Polyscia ornifolia
have an abundant AMV spores with a higher infectious capacity in its rhisospheric soil.
Key words: ecological restauration, pioneer species, Mandena, mining soil.
Advisor: Doctor BAOHANTA Rondro Harinisainana
Doctor ANDRIANANDRASANA Martial Doret

Maevatianahermance SN MAST 21

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FACULTE DES SCIENCES

DOMAINE SCIENCES ET TECHNOLOGIES

MENTION BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE

MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME MASTER

DESCRIPTION DES PARAMETRES MICROBIOLOGIQUES DES

Président : Professeur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina

Ce présent travail est le fruit d’une collaboration étroite entre le Laboratoire de

Messieurs le Docteur RAMAHAZOSOA Irrish Parker, Doyen de la Faculté des

Madame le Docteur BAOHANTA Rondro Harinisainana, Monsieur le Docteur

LISTE DES ABREVIATIONS………………………………………………......…………...iii

LISTE DES FIGURES……………………………………………………………………......iv

LISTES DES TABLEAUX…………………………………………………………………...v

LISTE DES ANNEXES……………………………………………………………………....vi

I. Généralités sur le sol ........................................................................................................... 3

Autotrophe : organisme capable de générer sa propre matière organique à partir d’éléments

Chimioorganotrophe : organisme qui tire son énergie d’un substrat organique.

Enzyme : protéine catalytique spécifique de la réaction catalysée et des substrats.

Hétérotrophe : organisme incapable de synthétiser lui-même ses composants et qui a recours

Hyphe : filament mycélien qui constitue l'appareil végétatif des champignons.

Propagule : organe de dissémination et de reproduction (non sexuelle) d’un être vivant

Spore : cellule isolée, ou amas pluricellulaire pouvant contribuer, en germant, à la

Symbiose : Désigne un état morpho-anatomique : deux organismes vivant ensemble,

BSP: Bactéries Solubilisatrices de Phosphate

CNRE: Centre National de Recherches sur l'Environnement

FDA: Fluorescéine di-acétate

INVAM: International Culture Collection of Vesicular and Arbuscular Mycorrhizal Fungi

LME: Laboratoire de Microbiologie de l'environnement

Min env et forêts : Ministère de l’environnement et des forêts

MVA: Mycorhize à Vésicules et Arbuscules

NPP: Nombre le Plus Probable

PIM : Potentiel Infectieux Mycorhizogène

QMM : Qit Madagascar Minerals

SEP2D : Sud Expert Plante pour un Développement Durable

SER: Society for Ecological Restaurartion

TFC : Topsoil Forêt dans la zone de Conservation

UFC : Unité Formant le Colonie

Figure 1: Représentation schématique des trois zones de la rhizosphère................................... 4

Tableau 1 : Dosage de la FDA ................................................................................................. 15

Annexe 1 : Classification des cinq espèces végétales caractéristiques de l’écosystème minier

Annexe 2 : Préparation des solutions tampons

Annexe 3 : Description morphologique des spores

Annexe 4 : Calcul du nombre le plus probable de propagule

Annexe 5 : Composition des milieux de cultures

Le site de Mandena Fort Dauphin, est actuellement le siège de l’exploitation

Tenant compte de ces conséquences néfastes, la compagnie minière s’est engagée à

I. Généralités sur le sol

Figure 1: Représentation schématique des trois zones de la rhizosphère. (Lepinay, 2015)

II.1 Les microflores de la rhizosphère et leurs fonctionnements

II.1.1 Les actinomycètes

II.1.2 Pseudomonas fluorescens

Figure 2: Interaction de Pseudomonas fluorescens avec les microorganismes phytopathogènes et les

II.1.3 Les Bactéries Solubilisatrices de Phosphate

II.1.4 Les champignons mycorhiziens

Il y a différents types de mycorhizes: les mycorhizes à arbuscules, les mycorhizes

Figure 3 : Les différents types de mycorhizes (Botarela, 2012)

II.1.5 Les Mycorhizes à Vésicules et à Arbuscules (MVA)

II.1.6 Les mycorhizes éricoïdes

II.1.7 Les éctomycorhizes

II.2 Les enzymes du sol rhizosphérique

II.2.1 Les hydrolases

II.2.2 Les enzymes hydrolysant la fluorescéine di-acétate

III. La région de l’Anosy et l’exploitation minière

III.2 QMM et l’exploitation d’Ilménite