‫الـجمهوريــة الـــجزائريـــة الــــديمقراطيـــة الـــشعـبيـــة‬

‫وزارة التعليـم العالي والبحـث العلمـي‬

People’s Democratic Republic of Algeria

Ministry of Higher Education and Scientific Research
University of Algiers 1 Benyoucef BENKHEDDA

Faculté des Sciences

Département de science de la matière
Master en chimie
Spécialité : chimie analytique

Thème
La centrifugation pour l'extraction du liquide
apoplastique des feuilles à l'aide de Phaseolus
vulgaris "les haricots"
Présenter par :

 Chabane Linda
 Chettibi Marwa
 Khalfouni Rayane Fatma Zohra
 Touzene Abderrahmane Ramzi

Responsable de module : Dr lakehal

Année universitaire : 2022-2023

 Résumé
L'apoplaste est un compartiment extracellulaire distinct dans les tissus végétaux qui se trouve
à l'extérieur de la membrane plasmique et comprend la paroi cellulaire. Le compartiment
apoplastique des feuilles de plantes est le siège de plusieurs processus biologiques importants,
notamment la formation de la paroi cellulaire, l'absorption et l'exportation des nutriments et de
l'eau, les interactions entre plantes et endophytes et les réactions de défense contre les agents
pathogènes. La méthode d'infiltration-centrifugation est bien établie en tant que technique
robuste pour l'analyse de la composition soluble de l'apoplaste de diverses plantes. Le liquide
obtenu par cette méthode est communément appelé liquide de lavage de l'apoplaste (AWF).
Le protocole suivant décrit une méthode optimisée d'infiltration sous vide et de centrifugation
pour l'extraction du liquide de lavage de l'apoplaste à partir des feuilles de Phaseolus vulgaris
(haricot) cv. Tendergreen. Les limites de cette méthode et l'optimisation du protocole pour
d'autres espèces végétales sont discutées. La FAE récupérée peut être utilisée dans une large
gamme d'expériences en aval qui cherchent à caractériser la composition de l'apoplaste et
comment elle varie en réponse à l'espèce végétale, au développement de la plante et aux
conditions environnementales, ou à déterminer comment les micro-organismes se développent
dans le fluide de l'apoplaste et réagissent aux changements de sa composition.
Chapitre 1 Sommaire

Table des matières.....................................................................................................................i

Liste des figures.......................................................................................................................iii

Liste des tableaux.....................................................................................................................iv

Liste des abréviations...............................................................................................................v

Introduction générale...............................................................................................................1

1. Chapitre1 Recharche bibliographique ...........................................................................3

1.1. Definition des haricots .................................................................................................3
1.2. La cellule .....................................................................................................................4
1.2.1. Differents types de cellules...............................................................................4
1.2.2. Les cellules vegetales........................................................................................5
1.2.3. Exemple d'image...............................................................................................5
2. Deuxième chapitre.............................................................................................................6
2.1. Section principale.........................................................................................................6
2.1.1. Une sous section................................................................................................6
2.1.2. Une autre sous section.......................................................................................6
2.2. Une deuxième section principale..................................................................................7
2.2.1. Une sous section................................................................................................7
2.2.2. Une autre sous section.......................................................................................8
2.2.3. Une autre sous section.......................................................................................8
2.3. Conclusion....................................................................................................................8
3. Troisième chapitre.............................................................................................................9
3.1. Section principale.........................................................................................................9
3.1.1. Une sous section................................................................................................9
3.1.2. Une autre sous section.......................................................................................9
3.2. Une deuxième section principale................................................................................10
3.2.1. Une sous section..............................................................................................11
3.2.2. Une autre sous section.....................................................................................11

i
 3.3. Conclusion..................................................................................................................11
Conclusion générale................................................................................................................12

Bibliographie...........................................................................................................................14

A. Titre de l'annexe...........................................................................................................15

ii
B. Titre de l'annexe...........................................................................................................16

Chapitre 2 Liste des figures

Figure 1:haricots communs...................................................................................................12

Figure 2:cellule végétale.........................................................................................................14
Figure 3 : structure des parois cellulaire vegetale...............................................................14
Figure 4 : centrifugeuses de table..........................................................................................15
Figure 5: centrifugeuses de sol...............................................................................................16
Figure 6: Ultracentrifugeuses................................................................................................16
Figure 7: Micro-centrifugeuses.............................................................................................16
Figure 8: Ultracentrifugeuses analytiques............................................................................17
Figure 0.9 Un exemple SDS-PAGE coloré au Coomassie du gel de P. Vulgaris extraits de
feuilles FAE...............................................................................................................18
Figure 10:une malate déshydrogénase standard (MDH)

Figure 11: Pour une glucose-6-phosphate déshydrogénase norme (G6PDH)

iii
iii
Chapitre 3 Liste des tableaux
Tableau 1.1 Les résultats typiques pour les extractions de la FAE P. vulgaris cv.
Tendergreen feuilles ...................................................................................................5

iv
Chapitre 4 Liste des abréviations

- Glucose-6-phosphate G-6-PG
- Glucose-6-phosphate déshydrogénase G6PDH
- Apoplaste fluide de lavage FAE
- Résonance Magnétique Nucléaire RMN
- High performance liquid chromatography HPLC
- Gas chromatography-mass spectrometry GC-MS
- La malate déshydrogénase MDH
- MSTFA N-méthyl-N-(triméthylsilyl) trifluoroacétamide
- Phaseolus vulgaris P.vulgaris

v
Chapitre 5 Introduction générale

Introduction générale :

L'extraction de fluides apoplasmiques des feuilles de plantes à l'aide de Phaseolus vulgaris

(communément appelé haricots) est une technique courante en biologie végétale pour étudier
les composants de l'environnement extracellulaire des plantes. La centrifugation est un
processus clé dans cette méthode.
L'humeur apoplasmique se situe entre les parois cellulaires et est essentielle au transport des
nutriments des plantes, à la défense contre les agents pathogènes et à la signalisation
hormonale. Pour l’extraire, les chercheurs utilisent souvent des légumineuses, notamment
Phaseolus vulgaris, en raison de leur capacité à sécréter de grandes quantités de liquide
apoplasmique
La centrifugation est utilisée pour séparer ce liquide des tissus végétaux. Cette technologie
permet aux scientifiques d’analyser la composition chimique des fluides corporels
apoplasiques et d’explorer leurs fonctions dans le contexte de la physiologie végétale.
L'extraction et la centrifugation du liquide apoplasique à l'aide de Phaseolus vulgaris sont des
méthodes importantes pour mieux comprendre la communication et la régulation au niveau
cellulaire des plantes et pour explorer leurs réponses aux facteurs environnementaux et aux
organismes de stress.

1
 Introduction générale

2
Chapitre 1
B
Définition des haricots commun :

Le haricot commun Phaseolus vulgaris L. est une plante annuelle appartenant à l'ordre des
Fabales et à la famille des Fabacées [1](figure 1), est une plante originaire d'Amérique
centrale et d'Amérique du SudCette plante a été domestiqué séparément en Amérique centrale
(Mexique et Guatemala) et dans les Andes d'Amérique du Sud (principalement le Pérou)
pendant plus de 5000 ans, ensuite elle est transportée vers d'autres continents depuis le 16ème
siècle.[2] Le haricot commun joue un rôle important dans l'alimentation humaine comme
source de vitamines, de protéines, de fibres, de sels minéraux et dans la fixation biologique de
l'azote . Au delà de ses propriétés nutritives interessantes, le haricot possède des vertus
diurétiques, anti-inflammatoires, hypoglycémiantes, régulatrices du transit et cicatrisantes. Il
est un vrai atout pour les troubles rénaux, les douleurs articulaires, le transit, les diabétiques,
la perte de poids ainsi que pour les lésions cutanées [1].

Figure 1:haricots communs

3
La cellule:

Les cellules sont les unités morphologiques et fonctionnelles de tous

les êtres vivants. C'est le plus petit élément pouvant être considéré
comme vivant. [3] Les cellules sont visibles au microscope et sont
généralement constituées d'un noyau contenant de l'ADN, du
cytoplasme et d'une membrane plasmique. [4] Principales
caractéristiques des cellules :

 Taille : Les cellules sont les plus petites unités de vie, dont la taille varie de quelques
microns à plusieurs millimètres.[5]
 Structure : Les cellules sont des structures complexes contenant des organites
spécialisés qui assurent leur fonction.[6]
 Fonction autonome : chaque cellule fonctionne de manière autonome mais en
coordination avec toutes les autres cellules du corps.[5]
 Rôle : Les cellules maintiennent la vie d'un organisme en assurant son fonctionnement
normal[6]
 Division cellulaire : les cellules se reproduisent par le processus de mitose, permettant
la croissance et la réparation des tissus. [5]

La cellule

Les cellules procaryotes Les cellules eucaryotes

Animal Végétale

Différents types de cellules :

3
3
Chapitre 1 Premier chapitre

Les cellules végétales :

Cellules végétales sont les unités élémentaires, très nombreuses, constituant les organismes
végétaux. Les cellules végétales des Angiospermes ont en générale une forme géométrique
car elles sont entourées par une paroi squelettique rigide. L’intérieur de la cellule est occupé
en grande partie par une vacuole. Elle renferme aussi des organites appelés chloroplastes qui
lui sont spécifique.[7](figure 2) .

Figure 2:cellule végétale

Structure des parois cellulaire végétale :

La paroi cellulaire assure la rigidité de la plante et joue un rôle de soutien [8] Elle est
composée de trois couches : couche intermédiaire (ou couche intermédiaire), paroi primaire et
membrane plasmique. Les couches elles-mêmes contiennent de la pectine, de l'hémicellulose
et de la cellulose liées par des microfibrilles de cellulose, ainsi que des protéines solubles. [9]
(figure 3).

4
Chapitre 1 Premier chapitre

Figure 3 : structure des parois cellulaire vegetale

4
Chapitre 1 Premier chapitre

Centrifugation :

La centrifugation est un processus qui implique l'utilisation de la force centrifuge [10] pour la
sédimentation de mélanges à l'aide d'une centrifugeuse. Ce processus est utilisé pour séparer
deux liquides non miscibles, les composants plus denses du mélange migrant loin de l'axe de
la centrifugeuse, tandis que les composants moins denses du mélange migrent vers l'axe. La
centrifugation modifie la force gravitationnelle effective sur le tube/la bouteille de manière à
provoquer plus rapidement et plus complètement l'accumulation du précipité (« pastille ») au
fond du tube. La solution restante est proprement « surnageant». Le liquide surnageant est
rapidement décanté du tube/flacon sans perturber le précipité [11].

La force centrifuge est créée par un mouvement de rotation très rapide dans une centrifugeuse

L'appareil utilisé est une machine tournante à grande vitesse appelée centrifugeuse [12].

Matériels de centrifugation :
En fonction des exigences expérimentales, notamment en ce qui concerne les accélérations
nécessaires, les volumes de matériel à centrifuger, la température de travail, etc., on a créé une variété
d'appareils.

 Centrifugeuses de table :

Les modèles les plus simples, souvent appelées centrifugeuses

cliniques permettent d'atteindre de faibles accélérations (1000 à
3000 xg) à des vitesses de rotation relativement basses (moins
de 3000 RPM). Certains modèles sont réfrigérés, certains
d'autres non.[13]

Figure 4 : centrifugeuses de table

11
Chapitre 1 Premier chapitre

 Centrifugeuses au sol :

Ces appareils sont un peu plus complexes. Elles

permettent d'obtenir des vitesses derotation de l'ordre
de 30 000 RPM, donnant pour les plus petits rotors
des accélérations d'environ 20 000 xg. Tous les
modèles sont réfrigérés.

Figure 5: centrifugeuses de sol

 Ultracentrifugeuses :

Ce sont des appareils complexes et coûteux qui permettent

d'atteindre des accélérations très élevées (jusqu'à 300 000
xg) en faisant tourner des rotors très rapidement (50-85
000 RPM).

De telles vitesses de rotation ne peuvent s'obtenir que sous

pression très réduite. Les faibles pressions permettent aussi
d'éviter la surchauffe du rotor et de l'échantillon.

Tous les modèles sont réfrigérés. Ces appareils doivent

donc être munis de pompe à vide et de systèmes de
réfrigération. Les volumes sont quelque peu limités, généralement on ne trouve pas de rotors
pouvant contenir plus d'une dizaine de tubes de 40 ml.

Figure 6: Ultracentrifugeuses

 Micro-centrifugeuses :

On a aussi développé des centrifugeuses spécialement conçues pour les micro-volumes très
souvent employés en biochimie moderne.

Les microtubes à centrifuger sont des petits tubes coniques

généralement de 1.5 mL fait de polypropylène et assez peu
dispendieux. Les centrifugeuses de ce type peuvent être
réfrigérées et atteindre des accélérations de l'ordre de 12-15

11
Chapitre 1 Premier chapitre

000 x g. Les modèles les moins couteux n'ont pas

de contrôle de vitesse et ne sont pas réfrigérés.

Figure 7: Micro-centrifugeuses

 Ultracentrifugeuses analytiques :

Ce sont des appareils de moins en moins utilisés.

Ces centrifugeuses servent surtout à analyser la
taille et la masse des particules et des protéines.
D'autres techniques beaucoup moins coûteuses sont utilisées de nos jours : électrophorèse,
filtration sur gel...

Figure 8: Ultracentrifugeuses analytiques

Les différents types de centrifugation :

 Centrifugation différentielle :

Elle facilite la séparation d'un homogénat en fonction de la taille et de la densité de ses

constituants grâce à une série de centrifugations à des intervalles de temps et des accélérations
de plus en plus élevées.

 Centrifugation par gradient de densité :

La séparation des substances par centrifugation en gradient de densité consiste à concentrer

les particules dans des solutions de sels de césium ou de saccharose. Cette méthode permet de
fractionner les particules en fonction de leur densité de flottabilité. On désigne la solution de
sels de césium ou de saccharose utilisée comme gradient de densité. Les deux types de
centrifugation en gradient de densité sont la centrifugation zonale et la centrifugation
isopycnique.

L’infiltration-centrifugation :

La méthode d'infiltration-centrifugation est largement reconnue comme une technique robuste

pour l'analyse de la composition des apoplastes solubles de différentes espèces végétales. Le
liquide obtenu par cette méthode est couramment désigné sous le nom de liquide de lavage
des apoplastes.

11
Chapitre 1 Premier chapitre

Chapitre 2
B
Deuxième chapitre

Introduction

Protocole :
La technique d'infiltration-centrifugation est une méthode en deux étapes qui consiste à
remplacer l'espace d'air apoplastique par un liquide d'infiltration aqueux, qui se mélange au
liquide apoplastique natif, puis à récupérer le mélange liquide d'infiltration/fluide
apoplastique par centrifugation des feuilles. Cette installation permet de soumettre
l'échantillon à un large éventail de techniques biochimiques et analytiques en aval, telles que
l'électrophorèse des protéines, la mesure de l'activité enzymatique, la RMN, de nombreux
types de chromatographie et la spectrométrie de masse.

Dans les protocoles suivants, nous décrivons comment réaliser la technique d'infiltration-
centrifugation en utilisant des feuilles de Phaseolus vulgaris

REMARQUE : Au cours de ce protocole, les matières dangereuses contenant des agents

pathogènes microbiens provenant des feuilles infectées ne doivent pas être jetées à l'égout, il
convient plutôt d'utiliser des procédures d'élimination appropriées.

Preparation de la solution de nettoyage apoplastique:

A. Choisir l'appareil en fonction de la taille des feuilles :
1. Infiltrer les petites feuilles à l'aide d'une seringue sans aiguille.
2. Utiliser une fiole à vide pour infiltrer les feuilles trop grandes pour être introduites
dans une seringue.
3. Utiliser de la fiole à vide pour infiltrer plusieurs feuilles simultanément.

11
Chapitre 1 Premier chapitre

4. Diviser les feuilles trop grandes pour la méthode d'infiltration disponible en sections
plus petites à l'aide d'une lame de rasoir.
5. Rincer les sections de feuilles coupées dans de l'eau distillée avant l'infiltration pour
éliminer les contaminants cytoplasmiques exsudant des cellules dégradées.
B. Infiltration des feuilles à l'aide d'une seringue de 60 ml.
1. Détachez la feuille de la plante au niveau du pétiole à l'aide d'une lame de rasoir, puis
détacher les folioles au niveau du pétiole
2. Rincer la feuille fraîchement découpée en plongeant cette dernière dans de l'eau
distillée afin d'éliminer les contaminants de surface. Sécher la feuille en tapotant
soigneusement avec du papier absorbant.
3. Mesurer le poids de la feuille avant l'infiltration.
4. Rouler soigneusement la feuille dans une seringue de 60 ml et remplir la seringue avec
de l'eau distillée .Éliminer l'air présent dans la seringue tout en appuyant sur le piston
jusqu'à ce qu'il atteint approximativement la valeur de 40 ml.
5. Couvrez les extrémités de la seringue avec un doigt ou un morceau de Parafilm, puis
créez une pression négative à l'intérieur de la seringue en retirant le piston vers
l'extérieur jusqu'à la valeur de 60 ml. Relâchez lentement le piston. REMARQUE : un
relâchement rapide de la pression peut entraîner une lyse cellulaire et une
contamination cytoplasmique.
6. Retirez le piston de la seringue et éliminez l'air, puis remettez le piston en place et
appuyez de nouveau sur le piston pour créer une légère pression positive.
7. Répéter les étapes (1, 2,5) et (1, 2,6) jusqu'à ce que la feuille soit complètement
infiltrée, comme l'indique la couleur foncée des zones infiltrées.
8. Retirer la feuille de la seringue. Tapoter délicatement la feuille avec du papier
absorbant afin d'éliminer le liquide de surface.
9. Mesurer le poids de la feuille infiltré et Calculer la différence de poids avant et après
l'infiltration qui correspond de manière approximative au volume d'infiltration.
C. Infiltration des feuilles sous vide :
1. Détacher la feuille de la plante au niveau du pétiole à l'aide d'une lame de rasoir.
2. Rincer la feuille fraîchement excisée en la plongeant dans de l'eau distillée afin
d'éliminer les contaminants de la surface de la feuille.
3. Sécher la feuille en utilisant du papier absorbant. Mesurer le poids de la feuille avant
l'infiltration.

11
Chapitre 1 Premier chapitre

4. Placer la feuille (les feuilles en cas d'infiltration de plusieurs feuilles) dans un flacon à
bras latéral de 250 ml ou plus contenant de l'eau distillée (d'autres liquides
d'infiltration peuvent être utilisés). Recouvrir entièrement les feuilles avec le liquide.
5. Faire le vide dans la fiole. Agiter doucement pour libérer les bulles d'air des feuilles.
Relâcher le vide lentement et avec précaution.

NOTE : Un relâchement rapide du vide peut entraîner une lyse cellulaire et une
contamination cytoplasmique.

6. Répéter l'étape (1, 3,5) jusqu'à ce que la feuille soit complètement infiltrée, comme le
montre la couleur foncée des zones infiltrées.
7. Retirer la feuille de la fiole. Sécher avec du papier absorbant, avec précaution, la
feuille afin d'éliminer le liquide de surface.
8. Mesurer le poids de la feuille infiltrée. Calculer la différence de poids avant et après
l'infiltration, qui correspond approximativement au volume d'infiltration.
D. Récupération de la FTA par centrifugation :
1. Placer la feuille sur un morceau de Parafilm de 10 cm de large. À l'aide d'une pointe
de pipette de 5 ml (ou d'un objet de taille similaire), roulez la feuille à l'intérieur.
2. Insérer la feuille enroulée avec de pointes de pipette dans une seringue de 20 ml.
Placez les bords coupés de la feuille vers le haut. Insérer la seringue dans un tube
propre de 50 ml en polyéthylène ou en polycarbonate.
3. Centrifuger la seringue dans le tube pendant 10 minutes à 1 000 x g dans un rotor à
godets oscillants à 4 °C.

NOTE : L'examen visuel des feuilles après centrifugation doit révéler que la majorité du
liquide d'infiltration a été expulsée. Des taches vertes plus foncées indiquent qu'une durée de
centrifugation supplémentaire est nécessaire.

4. Introduire à la pipette le liquide d'infiltration récupéré dans de nouveaux tubes de 1,5

ml.
NOTE : Le volume de la FAE doit correspondre approximativement au volume d'infiltration
de cette feuille, si le volume est inférieur, il faut augmenter la durée ou la vitesse de
centrifugation.
5. Centrifuger les échantillons de FAE à 15 000 x g pendant 5 minutes pour éliminer les
cellules et les particules. Il est également possible de passer la FAE à travers un filtre
de 0,22 µm pour éliminer les cellules et les particules.
6. Pipeter le surnageant dans un nouveau tube.
11
Chapitre 1 Premier chapitre

7. Conserver les échantillons sur de la glace jusqu'au stockage.

8. Conserver les échantillons de FAE à "-80 °C".

Test de contamination cytoplasmique :

1 Conserver les échantillons de FAE sur de la glace pour minimiser les réactions
enzymatiques et effectuer les analyses immédiatement après les étapes de
centrifugation.
REMARQUE: pour les dosages de métabolites, les échantillons peuvent être congelés
immédiatement après l'extraction et conservés à -80 °C jusqu'à leur utilisation.
2 Pour un protocole standard de dosage une malate déshydrogénase standard (MDH)
protocole de dosage voir (annexe) ; sinon, utilisez un kit de dosage MDH disponible
dans le commerce.
3 Pour une glucose-6-phosphate déshydrogénase norme (G6PDH) protocole de dosage
voir (annexe); sinon, utilisez un kit de dosage G6PDH disponible dans le commerce.
4 Pour la quantification des métabolites cytoplasmiques tels que le glucose-6-phosphate
(G-6-P), en utilisant la GC-MS comme décrit à l'étape 5.

Calcul du facteur de dilution des apoplaste:

1. Préparer deux volumes du liquide d'infiltration utilisé ci-dessus à l'étape "1.2.4" ou

"1.3.4" (de l'eau distillée). Ajouter de la poudre d'indigo carmin à une solution jusqu'à
une concentration finale de 50 µM, ne rien ajouter à l'autre solution.
2. Mesurer l'absorbance à 610 nm de 200 µl de la solution d'infiltration d'indigo carmin à
l'aide d'un lecteur de plaque. Corriger cette valeur en soustrayant l’DO 610 de 200 µL
de solution d'infiltration sans carmin d'indigo.
3. Introduire cette valeur corrigée comme OD 610infiltrate dans l'équation ci-dessous.
4. Effectuer au moins trois répétitions d'infiltrations de feuilles comme ci-dessus à
l'étape (1.2) ou (1.3) en utilisant les deux solutions d'infiltration (avec et sans carmin
d'indigo).
5. Après l'infiltration, rincer les feuilles dans de l'eau distillée afin d'éliminer tout résidu
d'indigo carmin présent sur les surfaces extérieures.
6. Procéder à la centrifugation comme indiqué ci-dessus (étape 1.4).
7. Déterminer la moyenne de la DO610 de 200 µl des extractions de la FAE à l'indigo
carmin. Corriger cette valeur en soustrayant la valeur moyenne de la OD 610 de 200 µl
de la FAE exempte d'indigo carmin. Substituer cette valeur corrigée comme OD 610AWF
dans l'équation ci-dessous.
8. Calculer le facteur de dilution à partir des valeurs d'absorbance corrigées comme :
Apoplaste facteur de dilution = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate - OD 610AWF)

11
Chapitre 1 Premier chapitre

9. Multiplier les valeurs de concentration ou d'activité de l'FAE par le facteur de dilution

pour estimer la concentration/activité dans le liquide apoplastique de la plante.

Concentrez FAE a la force maximale par lyophilisation :

1. Mettre le lyophilisateur en marche et le laisser se stabiliser à la température et à la
pression de travail.
2. Rassembler la quantité souhaitée d'échantillons de FAE frais ou stockés.
3. Répartir uniformément les échantillons dans des tubes à centrifuger de 2 ml
4. Déterminer le volume de reconstitution :
Volume de reconstitution = volume avant lyophilisation / facteur de dilution de
l'apoplaste.
5. Avec les couvercles fermés, congeler les tubes dans l'azote liquide.
6. Transférer les tubes congelés dans un ou plusieurs récipients de lyophilisation
réfrigérés. Pendant le transfert des tubes, remplacer le couvercle par un autre qui a été
percé avec un objet pointu pour permettre l'échange de gaz.
7. Fixer les récipients au lyophilisateur et lyophiliser complètement les échantillons.
8. Retirer les échantillons de la machine et reconstituer la FAE en ajoutant la quantité
calculée d'eau distillée.
9. Remettre le joint non ouvert en place et conserver les échantillons à -80 °C.

Analyse des métabolites :[17]

1. Pipeter 200 µl d'AWF dans un tube de 1,5 ml.
2. Ajouter 700 µl de méthanol contenant 10 µg/ml de ribitol comme étalon interne.
3. On Chauffe à 70°C pendant 10 minutes.
4. Centrifuger pendant 10 minutes à 11 000 x g.
5. Transférer 700 µl de surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml.
6. Ajouter 375 µl de chloroforme froid et agiter au vortex pendant 10 secondes.
7. Ajouter 500 µl de dH2O et vortex pendant 10 secondes.
8. Centrifuger pendant 15 minutes à 2 200 x g.
9. Transférer 150 µl de la couche aqueuse supérieure dans un nouveau tube de 1,5 ml,
puis sécher complètement les échantillons dans un concentrateur sous vide sans
chaleur.
10. Dissoudre les échantillons dans 30 µl de pyridine contenant 20 mg/ml de
chlorhydrate de méthoxyamine.
11. Incuber à 70 °C en agitant vigoureusement pendant 2 heures.

11
Chapitre 1 Premier chapitre

12. Ajouter 50 µl de MSTFA (N-méthyl-N-(triméthylsilyl) trifluoroacétamide).

13. Incuber à 37 °C en agitant pendant 30 minutes.
14. Transférer les échantillons dans des flacons en verre compatibles GC-MS.
15. Procéder à l'analyse GC-MS des échantillons. [Se rapporter à Lisec et al. 2009,
pour plus de détails sur la configuration et les performances de l'équipement GC-
MS].

11
 Chapitre 1 Premier chapitre

Chapitre 3
B Resultats et discussion

Les résultats:

Typiques des extractions de FAE effectuées sur des feuilles saines de P. vulgaris
Tendergreen leaves âgées de 3 semaines, en utilisant de l'eau distillée comme liquide
d'infiltration, sont présentés dans le tableau 2. Les jeunes feuilles de P. vulgaris se prêtent à
l'infiltration et, à la vitesse de centrifugation utilisée ici (1 000 x g), l'élimination de la
majorité du liquide d'infiltration par centrifugation peut être observée directement lorsque les
feuilles reprennent leur couleur verte d'origine. Le poids frais des feuilles de P. vulgaris était
en moyenne de 1,1 x g avant l'infiltration et a produit 0,5 ml de FAE par gramme de poids
frais. La concentration en protéines de la FAE a été déterminée à 0,18 ± 0,08 mg/ml à l'aide
d'un test standard de Bradford sur les protéines. Le facteur de dilution pour ces feuilles,
calculé en mesurant la dilution de l'indigo carmin, était de 2,3 ± 0,3 fois. Les valeurs ci-dessus
peuvent varier considérablement d'une espèce à l'autre et des expériences pilotes sont
nécessaires pour déterminer le rendement de la FAE par gramme de poids frais de feuille,
ainsi que la concentration en protéines de la FAE et le facteur de dilution que l'on peut
attendre pour un type de feuille donné.

L'intégrité des cellules peut être atteinte à la fois lors de l'étape d'infiltration, si les
changements de pression sont trop rapides, et lors de l'étape de centrifugation, si la force
centrifuge est trop élevée. Il est donc nécessaire d'analyser les échantillons d'EAF pour
détecter des signes de contamination cytoplasmique ; idéalement, plusieurs analyses
11
Chapitre 1 Premier chapitre

indépendantes sont effectuées. Les résultats de trois tests possibles sont présentés dans le
tableau" 2".

Phaseolus vulgaris

Volume de FAE (g/mL FW feuilles) 0,49±0.09

Protéine concentration (Mg/mL) 0,18±0,08

Facteur de dilution 2,3±0,3

L'activité de G6PDH (U/mL)

Glc-6-P(mg/mL) Aucun détecté

Activité MDH(U/mL) 2,5±0,9

Tableau 1.1 :Les résultats typiques pour les extractions de la FAE P. vulgaris cv.
Tendergreen feuilles
Dans les extractions bien réalisées des FAE de P. vulgaris, la G6PDH était indétectable par un
test enzymatique standard. Ceci est conforme avec d'autres rapports où l'activité de la G6PDH
n'est détectable qu'au-dessus d'un seuil de force centrifuge [12]. En revanche, un niveau de
base d'activité malate déshydrogénase (2,5 U/ml) était détectable dans tous les échantillons de
P. vulgaris FAE à l'aide d'un test métabolique standard. L'augmentation de la force centrifuge
au-delà d'un seuil de 1 000 x g a entraîné une augmentation de l'activité MDH (résultats non
présentés). Étant donné que l'apoplaste d'autres espèces est connu pour contenir une activité
MDH endogène [18], la quantité détectée ici est considérée comme une activité apoplastique
identique, et des augmentations significatives au-dessus de ce niveau de base indiquent une
contamination. Les métabolites que l'on pense être principalement cytoplasmiques, tels que
les hexose-6-phosphates, peuvent également être utilisés pour évaluer la contamination par les
FAE dans ce cas, l'analyse GC-MS a permis de détecter des niveaux de G-6-P nuls ou à l'état
de traces dans les extractions d’FAE.

11
Chapitre 1 Premier chapitre

L'analyse des métabolites par GC-MS des feuilles de P. vulgaris FAE donne généralement 40
à 60 métabolites identifiables et un nombre à peu près égal de composés non identifiables
(figure 2). Les acides organiques, les sucres simples et les acides aminés représentent la
majeure partie des métabolites identifiables ; toutefois, des métabolites secondaires de plantes
11
ont également été détectés et quantifiés à partir de la FAE. Plusieurs exemples de pics
provenant de ces différentes classes de molécules sont indiqués sur la figure 2. D'autres
techniques d'analyse en aval sont applicables à ces échantillons d'AWF pour quantifier
diverses molécules, par exemple : ICP-MS, RMN, HPLC, spectroscopie d'absorption
atomique, spectrométrie de masse des protéines.

La composante protéique de l'apoplaste est également représentée dans la FAE, comme le

montre le gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie Brilliant Blue de la figure 3. Entre
autres fonctions, les enzymes apoplastiques sont responsables de la synthèse de la paroi
cellulaire et de la génération d'espèces réactives extracellulaires de l'oxygène. Des études
protéomiques de la FAE de diverses espèces ont permis de reconnaître de nombreuses
protéines individuelles et de démontrer que la composante protéique de l'apoplaste réagit au
[13,19]
stress environnemental . Idéalement, l'extrait de
la FAE devrait être exempt de toute contamination
par des protéines cytoplasmiques telles que la
Rubisco ; cependant, dans la pratique, il est difficile
d'y parvenir. La présence d'une bande de protéine
Rubisco à ~53 kDa après SDS-PAGE fournit un test
qualitatif supplémentaire pour l'intégrité des
échantillons de FAE. Par exemple, Par exemple,
l'échantillon chargé sur la trace 2 de la figure 9
contient une plus grande quantité de contamination
par la Rubisco qu'un échantillon de voie.

Figure 9:Un exemple SDS-PAGE coloré au Coomassie du gel de P. Vulgaris extraits de

feuilles FAE

Discussion:

Optimisation de la source de tissu végétal:

11
Chapitre 1 Premier chapitre

Les variations biologiques et techniques peuvent être importantes lors de la réalisation

d'extractions d'apoplastes, de sorte qu'un flux de travail hautement standardisé est utile pour
accroître la continuité entre les expériences (Figure 9). Il est important de standardiser la
source du tissu végétal, y compris le type de feuille, l'âge de la feuille, les conditions de
croissance/environnementales et l'heure de la journée (tableau 1). Il existe de grandes
différences dans la facilité avec laquelle différentes feuilles sont infiltrées et la FAE récupérée
par la suite par centrifugation ; ces différences sont reliées au nombre de stomates, à la taille
de l'ouverture et à la résistance du mésophylle[12,14]. Même entre les différents cultivars de P.
vulgaris, il existe des différences significatives dans la facilité et le rendement de la procédure
d'extraction de la FAE. Par exemple, les feuilles de la variété Tendergreen se prêtent mieux à
l'extraction de la FAE par cette méthode que celles du cultivar Canadian Wonder. Chez P.
vulgaris, les premières vraies feuilles sont les plus grandes et les plus faciles à infiltrer, ce qui
en fait le choix évident pour les extractions apoplastiques. Il a été démontré que le volume
d'air et d'eau apoplastique varie en fonction de l'âge des feuilles chez plusieurs espèces, ce qui
entraîne des différences dans l'extractibilité de la FAE [12,14]. Chez P. vulgaris, les feuilles plus
âgées deviennent nettement plus difficiles à infiltrer et produisent moins de FAE lors de la
centrifugation. Par conséquent, les feuilles ont été récoltées lorsqu'elles ont atteint leur pleine
expansion. Les feuilles qui sont difficiles à infiltrer nécessitent par la suite des vitesses de
centrifugation plus élevées pour récupérer la FAE. Il convient donc de procéder à un examen
détaillé de plusieurs types et variétés de feuilles avant de choisir une source de tissus pour les
extractions de FAE à grande échelle.

Les conditions de croissance des plantes doivent également être normalisées autant que
possible dans le cadre de l'expérience. L'utilisation d'armoires de croissance est préférable car
elles permettent de maintenir des régimes d'humidité, de température et d'intensité lumineuse
cohérents. La récolte des feuilles doit toujours avoir lieu au même moment de la journée car
les concentrations de métabolites, d'enzymes, etc. varient au cours du cycle diurne[14]. Enfin,
pour s'assurer que les feuilles de la plante ont toutes la même pression de turgescence, les
plantes doivent être arrosées peu de temps avant environs 1 heure la récolte.

Optimisation de l'infiltration et de centrifugation à lame

Par conséquent, la procédure pour un type de feuille donné doit être un mélange optimisé
entre la maximisation du rendement et la minimisation de la contamination cytoplasmique de
la FAE. Dans tous les cas, il convient d'utiliser la vitesse de centrifugation la plus basse à
laquelle la FAE peut être récupérée afin d'éviter une éventuelle perturbation mécanique des

11
Chapitre 1 Premier chapitre

cellules de la feuille. L'optimisation de la vitesse de centrifugation doit être déterminée de

manière expérimentale pour chaque type de feuille en contrôlant le volume récupéré et la
contamination de l'apoplaste pour une gamme de vitesses de centrifugation. Il a été observé
que les activités des enzymes identifiées, telles que la MDH, la G6PDH et la glucose-
phosphate isomérase, restent faibles jusqu'à ce qu'un seuil de force centrifuge soit dépassé, au-
delà duquel ces activités augmentent rapidement, probablement en raison d'une fuite du
[9,12,14]
cytoplasme . L'utilisation de Parafilm comme support pendant l'étape de centrifugation,
peut améliorer l'efficacité de l'extraction de la FAE et peut minimiser les dommages
mécaniques. En outre, l'utilisation de Parafilm améliore la visualisation de la feuille après la
centrifugation, lorsqu'il convient d'examiner la feuille pour vérifier qu'elle n'est pas
endommagée et que l'extraction de la FAE est complète.

Manipulation et le stockage du fluide apoplastique extrait est important. FAE a été montré
pour contenir une multitude de proteases et d'autres enzymes [13,20], ainsi que des composés
organiques volatils. Par conséquent, pour réduire les changements à la composition de la FAE
après la récupération il est recommandé de conserver des échantillons sur la glace ou
autrement stockées à -80 ° C. En outre, dosages enzymatiques de la FAE doivent être
effectuées dès que possible après l'extraction de limiter l'inactivation enzymatique.

Limites de la technique

La méthode d'isolement de la FAE par infiltration-centrifugation fait l'objet de quelques mises

en garde. Tout d'abord, la dilution de l'apoplaste pendant l'infiltration peut provoquer une
réaction de la plante. Si les cellules des feuilles voisines détectent une diminution de la
concentration de certains composants du liquide apoplastique, elles peuvent réagir en
excrétant d'autres métabolites, ce qui fausse l'interprétation des concentrations de métabolites.
Lors d'une évaluation de ce problème, il a été observé que ni le temps écoulé entre
l'infiltration et la centrifugation, ni des différences modérées dans la force ionique du liquide
d'infiltration n'affectaient la composition de la FAE extraite14,22.

Un deuxième inconvénient potentiel est que l'élution de la FAE par centrifugation ne tient pas
compte de toutes les molécules présentes dans l'apoplaste pour plusieurs raisons. Certains
composés, en particulier les cations et les protéines peuvent être étroitement associés à la
13.
paroi cellulaire chargée négativement et ne se éluent avec le FAE D'autres molécules telles

11
Chapitre 1 Premier chapitre

que les protéines peuvent être trop grandes pour éluer de manière efficace hors de l'apoplaste
aux vitesses de centrifugation 14 utilisés..

Plusieurs tests existent pour déterminer la contamination cytoplasmique, mais aucune ne est
universellement acceptée. Les dosages d'enzymes cytoplasmiques principalement (par
exemple, G6PDH, phosphate isomérase hexose, MDH) ont l'avantage d'être facile à réaliser,
mais peut ne pas corréler bien avec fuites cytoplasmique (14,18). L'évaluation des métabolites
cytoplasmiques (par exemple, les phosphates de hexose, chlorophylle) est peut-être plus
indicatif, mais est moins bien établie 11. Néanmoins, les deux types de test peut être utile pour
la quantification relative de la contamination entre les échantillons apoplastique. Idéalement,
plusieurs mesures indépendantes devraient être utilisés pour valider l'intégrité de l'échantillon
de la FAE.

Tout en reconnaissant ses limites, la technique d'infiltration-centrifugation est une technique

simple et robuste pour l'étude des protéines apoplastiques, des métabolites primaires et
secondaires et des ions inorganiques.

11
Chapitre 6

Conclusion générale:

 Pour conclure, l'extraction du liquide apoplastique des feuilles de plantes en utilisant

Phaseolus vulgaris (haricots) et la centrifugation sont des techniques essentielles en
biologie végétale. Elles permettent d'explorer les composants de l'environnement
extracellulaire des plantes, en particulier l'humeur apoplasmique, qui joue un rôle
crucial dans le transport des nutriments, la défense contre les agents pathogènes et la
signalisation hormonale.
 Grâce à ces méthodes, les chercheurs peuvent analyser la composition chimique du
liquide apoplastique et acquérir une meilleure compréhension des mécanismes de
communication et de régulation au niveau cellulaire des plantes. De plus, ces
approches offrent des perspectives pour étudier les réponses des plantes aux facteurs
environnementaux et aux stress biotiques.
 En résumé, l'utilisation de Phaseolus vulgaris et de la centrifugation dans l'extraction
du liquide apoplastique représente une avancée précieuse pour la recherche en biologie
végétale, contribuant ainsi à approfondir nos connaissances sur le fonctionnement
interne des plantes et leurs interactions avec leur environnement.

32
Chapitre 7 Références bibliographiques
Voici un autre lien vers les nomes APA

11 : Content ©2014. All Rights Reserved. Created by SJ Everse

10 : Centrifugation par Mme AYOUNI.

12 : GCH‐2100: Éléments de bioprocédés Séparation et purification des produits d’origine biologique

B. Gaillet, A. Garnier, Génie chimique(2013-12-04)

13: laura mckinney 6 avril 2021 différence entre la centrifugation par gradient et par gradient de
densité

14

[1]: BELAADI MANAL Etude de l’effet de la salinité sur la germination et la

croissance de quelques

variétés d’Haricot (Phaseolus vulgaris L.)

(Juin 2014)

[2] : Metouchi Imene et Yahia Lamia. Evaluation de l'effet d'engrais organique sur
l'expression végétative du Haricot cas de la biomasse du romarin et pin pignon
(2019/2020) .70.

[4] : Front. Plant Sci., 13 November 2018

Sec. Agroecology

[3] Signification "cellule" publiée le 01/11/2007

[5] Yorgos Nikas, Wellcome Images, Flickr, CC by-nc-nd 2.0

[6] Ingrid Haberfeld Mis à jour le 15/02/21 18:32

[7] : ZEGHAD .N. Organisation cellulaire des végétaux (4) (8)

[8] : Bailey, R. (2020, January 24). Cell theory: A core principle of biology.
ThoughtCo.

[9]: Signification "paroi cellulaire" publiée le 04/05/201

33
14 : Rico, A., Preston, G. M. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and
apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in
the tomato apoplast. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).

17 Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. Gas chromatography mass
spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).

12 Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves
by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).

18 Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for
peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley
(Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plan

Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of
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(2012).

Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes:
identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).

19 Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast
proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005)

12 Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice
leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668
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18 Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for
peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley
(Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plan

11 Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of
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Pathology. 78, 31-37 (2012).
12 Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes:
identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
19 Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast
proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005)

34
 Annexe A
B
Chapitre 8 Titre de l'annexe

Figure 10:une malate déshydrogénase standard (MDH)

35
Figure 11: Pour une glucose-6-phosphate déshydrogénase norme (G6PDH)

36
37
Abstract

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the
plasma membrane and comprises the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves
is the site of several important biological processes, including cell wall formation, nutrient
and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses against
pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique
for analysing the soluble composition of the apoplast of various plants. The liquid obtained
by this method is commonly referred to as apoplast washing fluid (AWF). The following
protocol describes an optimised vacuum infiltration and centrifugation method for the
extraction of apoplast wash fluid from the leaves of Phaseolus vulgaris (bean) cv.
Tendergreen. The limitations of this method and optimisation of the protocol for other plant
species are discussed. The recovered MEF can be used in a wide range of downstream
experiments that seek to characterise apoplast composition and how it varies in response to
plant species, plant development and environmental conditions, or to determine how micro-
organisms grow in the apoplast fluid and respond to changes in its composition.

38