Étude de l’intégrité du génome chloroplastique de l’orge

(Hordeum vulgare) en culture de microspores isolées

Mémoire

Rémi Maglione

Maîtrise en biologie végétale

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Rémi Maglione, 2016

Étude de l’intégrité du génome chloroplastique de l’orge
(Hordeum vulgare) en culture de microspores isolées

Mémoire

Rémi Maglione

Sous la direction de :

François Belzile, directeur de recherche

 Résumé

Un enjeu actuel en biotechnologie est d’obtenir des plantes haploïdes doublées par
la technique de la culture de microspores isolées (CMI). Pourtant, la CMI génère parfois
une proportion importante de plantes albinos, laquelle peut atteindre 100 % chez certains
cultivars. Des travaux antérieurs ont indiqué que des remaniements du génome
chloroplastique seraient à l’origine de cet albinisme. Afin de mieux comprendre ce
processus menant à l’albinisme, nous avons entrepris d’étudier l’intégrité du génome
chloroplastique au sein de microspores d’orge et de plantes albinos via une approche de
séquençage à grande échelle. L’ADN total extrait de microspores à un stade précoce de la
CMI, d’une feuille de la plante-mère (témoin), et de feuilles albinos, a été séquencé et les
séquences chloroplastiques ont été analysées. Ceci nous a permis de documenter pour la
première fois une diminution de l'ADN chloroplastique chez les microspores. De plus une
étude de variations structurales a démontré un abaissement généralisé de la quantité de
génomes chloroplastiques chez les microspores. Enfin, d’importants remaniements du
génome chloroplastique ont été observés chez les plantes albinos, révélant une forte
abondance de génomes chloroplastiques altérés de forme linéaire.

iii
 Table des matières

Résumé ............................................................................................................................... iii

Table des matières.............................................................................................................. iv
Liste des tableaux............................................................................................................... vi
Liste des figures ................................................................................................................ vii
Listes des abréviations ..................................................................................................... viii
Remerciements ................................................................................................................... ix
Avant-propos....................................................................................................................... x
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION GÉNÉRALE............................................................... 1
1.1. L’orge : enjeu économique et défis scientifiques ............................................... 1
1.2. Haploïdes doublés et culture de microspore ....................................................... 1
1.3. La problématique de l’albinisme ........................................................................ 2
1.4. Hypothèse et objectifs ......................................................................................... 2
1.5. Structure du manuscrit ........................................................................................ 2
1.6. Résultats majeurs ................................................................................................ 3
CHAPITRE II : REVUE DE LITTÉRATURE .................................................................. 4
2.1. Orge : Enjeux économique et optimisation ......................................................... 4
2.2. Haploïde doublé .................................................................................................. 6
2.3. Développement du grain de pollen ..................................................................... 6
2.3.1. In vivo ............................................................................................................. 6
2.3.2. In vitro............................................................................................................. 7
2.4. Production des haploïdes doublés ....................................................................... 8
2.4.1. Élimination spontanée d’un chromosome parental ......................................... 8
2.4.2. Gynogenèse ..................................................................................................... 9
2.4.3. Androgénèse ................................................................................................... 9
2.4.3.1. Culture d’anthères ........................................................................................... 9
2.4.3.2. Culture de microspores isolées ....................................................................... 9
2.5. Albinisme ............................................................................................................ 9
2.5.1. Phénotype........................................................................................................ 9
2.5.2. Albinisme, à quelle étape de la CMI ? .......................................................... 10
2.6. Albinisme et chloroplaste ................................................................................. 11
2.6.1. Morphologie.................................................................................................. 11
2.6.2. Biochimie ...................................................................................................... 12
2.6.3. Génomique .................................................................................................... 12
2.7. Méthode d’étude de la variation structurale...................................................... 14
2.8. Problématiques, hypothèse et objectifs ............................................................. 16
CHAPITRE III : ARTICLE .............................................................................................. 17
Résumé article....................................................................................................... 17
Abstract ................................................................................................................. 18
Introduction ........................................................................................................... 19
Materials and methods .......................................................................................... 22
Plant materials ................................................................................................... 22
DNA extraction ................................................................................................. 22

iv
 Illumina whole genome resequencing of microspore and green leaf DNA ...... 22
Ion Torrent whole genome resequencing of albino leaf DNA .......................... 23
Mapping and depth of coverage ........................................................................ 23
Detection of structural variation ....................................................................... 24
Detection of genic deletions via PCR ............................................................... 24
Results ................................................................................................................... 25
Abundance and structural integrity of the chloroplast genome in microspores 25
Deletions are not responsible for the low coverage of microspore cpDNA ..... 28
Abundance and structural integrity of the chloroplast genome in albino plants28
PCR analysis of genes previously reported to be lost in albino plants ............. 31
Deletions are not responsible for the low coverage of the LSC regions ........... 32
Discussion ............................................................................................................. 33
Reference .............................................................................................................. 38
CHAPITRE IV : CONCLUSION GÉNÉRALE ............................................................... 40
BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................ 44

v
 Liste des tableaux

CHAPITRE III : ARTICLE

Table 1 Summary statistics of the Illumina reads mapped to the reference chloroplast
genome. ............................................................................................................................. 25
Table 2 Summary statistics of the Ion Torrent reads obtained from six albino plants ..... 29

vi
 Liste des figures

CHAPITRE II : REVUE DE LITTÉRATURE

Figure 1 : Temps de génération de lignées homozygotes par la voie traditionnelle ou en

culture de microspores isolées. ........................................................................................... 5
Figure 2 : Développement d’une microspore en condition in vivo et in vitro. .................. 8
Figure 3: Embryons, plantes vertes et plantes albinos d’orge issus de la culture de
microspores.. ..................................................................................................................... 10
Figure 4 : Morphologie des structures chloroplastiques en microscopie électronique chez
des embryons issues de la fécondation (à gauche) et de microspores à un stade de culture
avancé (à droite). ............................................................................................................... 12
Figure 5 : Génome chloroplastique de l’orge. ................................................................. 13
Figure 6 : Génomes linéaires chloroplastiques formant un nucléoïde (Oldenburg et
Bendich, 2004) .................................................................................................................. 13
Figure 7 : Principales méthodes d’analyse bio-informatique de différentes classes
variations structurales. ...................................................................................................... 16

CHAPITRE III : ARTICLE

Figure 1: Expected and observed depth of normalized coverage resulting from

alignment of reads obtained from either microscopes or a green leaf ....................... 27
Figure 2: Depth of coverage of chloroplast reads in six albino plant......................... 30
Figure 3: DNA amplification products of 4 photosynthetic key genes in albino plant
........................................................................................................................................... 31

vii
 Listes des abréviations

ADN/DNA acide désoxyribonucléique

ADNcp Génome chloroplastique
atpA/E Gène : sous-unité de l’ATP synthase (alpha/epsilon)
CMI Culture de microspores isolées
HD Haploïde doublé
IR Inverted Repeat, Région inversée répétée
LSC Large Single Copy, Région SC longue
Nud Gène de l’orge contrôlant l’état couvert/nu du caryopse
Ori Origine de réplication
PCR Polymerase Chain Reaction, réaction de polymérisation en chaîne
QRT Quantitative Real Time, quantitatif en temps réel
petA Gène : cytochrome f
psaA Gène : sous unité du photosystème I
QTL Quantitative Trait Locus, locus à effet quantitatif
SC Single Copy, Région de l’ADNcp simple copie
SSC Short Single Copy, Région SC courte
VrsI Gène : contrôle de la floraison

viii
 Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier le Dr. François Belzile pour m’avoir offert de travailler
sur ce projet très enrichissant.

Dans un second temps, je souhaiterai remercier toutes les personnes qui ont contribué, de
près comme de loin à la réussite de ce projet :

- Martine Jean pour ces nombreux conseils et réflexions prodigués tout au long de
ma maîtrise.
- Patricio Esteves pour la culture in vitro et la transmission de ses connaissances sur
le protocole de culture de microspore isolées, réalisée avec beaucoup de
pédagogie.
- Sébastien Bélanger pour ses échantillons d’ADN de microspore
- Le service de séquençage de l’IBIS, dirigé par Brian Boyle.
- Le support bioinformatique de Jérôme Laroche et Éric Normandeau
- Monique Turmel et Claude Lemieux pour leurs discussions sur les organelles et
leur génome
- Dominique Michaud pour ses discussions en biotechnologie

Et finalement, je voudrais remercier spécialement les personnes qui m’ont apporté leur
sympathie et ont contribué à mon enrichissement personnel, notamment, les membres de
notre équipe de recherche mais aussi, plus largement, au niveau de la faculté :

- Équipe Belzile : Davoud Torkamaneh, Aurélie Tardivel, Sébastien Bélanger,

Amina Abed, Romain Novaretti, Chiheb Boudhrioua, Maxime Bastien…
- Équipe Bernatchez : Laura Benestan
- Équipe Derome : Jeff Gauthier, Bachar Cheib, Sarach El Kouhry
- Équipe Aubin-Horth : Lucie Grecias, François-Olivier Gagnon Hébert
- Équipe Bernier : Martha Nigg
- Équipe Michaud (Envirotron) : Philippe Jutras

ix
 Avant-propos
L’article inséré dans ce mémoire n’a pas encore fait l’objet d’une soumission.
L’étudiant en est l’auteur principal, sous la supervision étroite de son directeur de
recherche, le Dr. François Belzile. Enfin, les contributions méthodologiques du Dr. Patricio
Esteves ont grandement permis l’élaboration de cet article.

x
 CHAPITRE 1 : INTRODUCTION GÉNÉRALE

1.1. L’orge : enjeu économique et défis scientifiques

L’orge, Hordeum vulgare, de la famille des Poaceae, est une monocotylédone diploïde. En
recherche, l’orge peut être considérée comme une plante modèle, notamment dans la
compréhension de la biologie des graminées. Si l’orge suscite un intérêt certain de la
communauté scientifique, c’est avant tout par son importance économique, de premier plan
sur la scène internationale. Ainsi, une attention particulière lui est attribuée dans le cadre
de programmes d’amélioration. En effet, de nombreux enjeux sont à relever en ce qui a
trait à l’augmentation de rendement, notamment sous influence de sécheresse et de
résistance à certains agents pathogènes et maladies. À l’issue de ces programmes de
sélection, semenciers et chercheurs ont communément pour but d’obtenir des lignées
homozygotes, dont chaque gène, chaque caractère, est identique à chaque locus du génome.
L’intérêt principal est de se dispenser de la ségrégation des caractères chez les générations
suivantes, et ainsi, de posséder un matériel végétal avec un phénotype homogène et donc,
propice à l’étude et à la sélection.

1.2. Haploïdes doublés et culture de microspore

De nombreux outils sont à notre disposition pour produire des cultivars homozygotes.
Parmi ceux-ci, l’un a démontré un fort potentiel et a créé une percée majeure en
biotechnologie : le processus d’haplodiploïdisation. En effet, là où des techniques
traditionnelles de croisement génèrent du matériel homozygote à 96 %, en 7 à 10
générations (7 années), la technique des haploïdes doublés permet de produire un matériel
pur à 100 % en seulement une génération, une année environ. L’haplodiploïdisation est une
technologie révolutionnaire impliquant de doubler le matériel chromosomique d’un
gamétophyte haploïde. Différentes approches permettent d’obtenir des haploïdes doublés :
in vivo, via l’élimination d’un chromosome parental après fécondation interspécifique, et
in vitro, par les voies soit de la gynogenèse ou de l’androgenèse. Chez cette dernière, deux
techniques, la culture d’anthères et la culture de microspores isolées (CMI), rendent
possible l’obtention de nouvelles plantes par le biais de l’induction de l’embryogenèse à
partir de grains de pollen immatures. En androgénèse, après leur avoir fait subir un stress,

1
des gamètes mâles immatures peuvent être prélevés et mis en culture. L’induction des
microspores immatures les conduira sur la voie de l’embryogénèse sans fécondation.
Durant cette phase, le matériel chromosomique haploïde sera spontanément doublé. Chez
l’orge, la CMI a montré les plus forts taux de régénération par rapport à la culture
d’anthères.

1.3. La problématique de l’albinisme

Cette technique d’obtention d’haploïdes doublés aurait donc un fort potentiel mais, elle fait
face à un problème majeur avec l’albinisme. En effet, chez certains cultivars, ce
phénomène peut être observé chez 100 % des plantes régénérées. Le phénotype albinos
présente des plantes blanches. L’intégrité des chloroplastes a donc été explorée, afin de
mieux documenter ce phénomène d’albinisme. Des études ont montré que ce chloroplaste
subirait des altérations aux niveaux morphologique, biochimique et génomique. En effet,
les recherches les plus récentes ont révélé, par approche PCR, que certains gènes essentiels
à la photosynthèse pouvaient être sujets à des délétions. Depuis 2007, le génome
chloroplastique de l’orge a été séquencé. Ainsi, avec l’avènement des technologies de
séquençage de nouvelle génération, il est maintenant possible de conduire une investigation
complète du génome chloroplastique de l’orge en condition de CMI.

1.4. Hypothèse et objectifs

Nous avons établi notre hypothèse selon laquelle il existerait un remaniement du génome
chloroplastique en cours de CMI. Afin de mieux comprendre ce processus menant à
l’albinisme, nous avons entrepris d’étudier l’intégrité du génome chloroplastique au sein
de microspores d’orge et de plantes albinos via une approche de séquençage à grande
échelle.

1.5. Structure du manuscrit

Après ce présent chapitre d’introduction générale, la bibliographie du chapitre II dresse un
tableau complet et précis des différents éléments de littérature nécessaires à la lecture du
chapitre III. Ce dernier se présente sous la forme d’un manuscrit en anglais et retrace
l’ensemble des travaux effectués dans ce projet de maîtrise, leurs analyses ainsi que les
résultats et les points de discussion associés. Enfin, la conclusion générale du chapitre IV
met en avant les résultats apportés par nos travaux et les modèles proposés.

2
 1.6. Résultats majeurs
Cette étude nous a permis de documenter pour la première fois une diminution de 8X de
l'ADN chloroplastique chez les microspores. De plus une étude des variations structurales
a démontré que cet abaissement généralisé était, toutefois, sans modifications génomiques.
Ainsi, le génome chloroplastique des microspores est intact dans les phases précoces de la
CMI. Si des modifications structurales de ce génome liées à l’albinisme existent, elles
seraient observables dans les phases tardives de la CMI.

En effet, d’importants remaniements du génome chloroplastique ont été observés chez les
plantes albinos, révélant une forte abondance de génomes chloroplastiques altérés
vraisemblablement de forme linéaire. De plus, nous avons pu établir que les régions
inversées-répétées étaient protégées pendant la CMI, et plus spécifiquement les régions
proches des origines de réplication. En revanche, une analyse PCR a montré qu’il resterait
une très faible proportion de génomes intacts. Finalement, il se pourrait que l’obtention de
plante albinos, dépendrait d’un trop faible nombre de génomes chloroplastiques préservés
et intacts à l’issue de la CMI.

3
 CHAPITRE II : REVUE DE LITTÉRATURE

2.1. Orge : Enjeux économique et optimisation

L’orge, Hordeum vulgare, de la famille des Poaceae, est une monocotylédone diploïde.
Elle se décline en deux grands types en fonction du nombre de rangées de grains par épi :
deux ou six rangs (Komatsuda et al., 2007). L’orge peut aussi être classée en deux sous-
catégories suivant son cycle de culture : l’orge semée à l’automne ou au printemps (Ellis
et Russell, 1984). La taille de son génome nucléaire est conséquent puisque estimé à 5,1
gigabases (Mayer et al., 2012). En recherche, l’orge peut être considérée comme une plante
modèle d’étude expérimentale et plus particulièrement pour la compréhension de la
biologie des Poaceae. À ce jour, les connaissances publiées ont pu être confirmées et
généralisées à l’ensemble des graminées. Par exemple, d’importants gènes impliqués dans
la floraison ont été caractérisés chez l’orge dont les plus connus sont Nud (Taketa et al.,
2008) et VrsI (Komatsuda et al., 2007). Si l’orge suscite un intérêt certain pour la
communauté scientifique, c’est avant tout par son importance économique de premier plan
sur la scène internationale.

Cette plante est très largement cultivée puisque sa production mondiale qui avoisine les
145 millions de tonnes (United States Department of Agriculture (USDA) Foreign
Agricultural Service, https://apps.fas.usda.gov/psdonline/ ). Ceci en fait la 4ème céréale la
plus cultivée après le maïs, le riz et le blé (Schulte et al., 2009). Sur une moyenne des 50
dernières années, le Canada en est le 3ème producteur mondial, derrière la Russie et
l’Allemagne (Food and Agricultural Organization of the United Nations (FAO),
http://faostat3.fao.org/browse/Q/QC/E). Ainsi, la culture de l’orge représente un enjeu
économique très important.

Une attention particulière lui est attribuée dans le cadre de son amélioration dans des
programmes de recherche. En effet, de nombreux enjeux sont à relever en matière
d’augmentation de rendement, notamment sous influence de sécheresse (Araus et al.,
2002), et de résistance à certains pathogènes et maladie, comme la fusariose de l’orge
(McMullen et al., 2012). De nombreux programmes d’amélioration ont donc été mis en
place afin de sélectionner des caractères d’intérêt. Dans ces démarches, de nombreux outils

4
GHELRWHFKQRORJLHVRQWjGLVSRVLWLRQGHVFKHUFKHXUVFRPPHODVpOHFWLRQDVVLVWpHSDU47/
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5
2.2. Haploïde doublé
L’haplodiploïdisation est une technologie révolutionnaire permettant d’obtenir une plante
homozygote à partir d’un gamète immature haploïde en doublant son matériel
chromosomique. Ce phénomène s’observe à l’état naturel ou peut être induit. Guha et
Maheshwari (1964, 1966) ont été les pionniers dans l’induction et la production in vitro
d’HD. Lors de la production de lignées homozygotes par la voie traditionnelle, la
ségrégation des caractères est très importante à partir de la première génération
d’autofécondation (F2). Cette ségrégation diminuera au fur et à mesure des générations
suivantes, au gré de la fixation génétique qui en résulte. Au contraire, dès sa production,
l’haploïde doublé n’est plus en ségrégation. L’intérêt principal de cette technologie est
l’économie de temps, comparativement aux autres techniques menant à l’obtention de
lignées homozygotes, puisqu’elle ne requiert qu’une seule génération (Jähne et Lörz,
1995). De plus, cette technique assure la génération d’un matériel chromosomique pur à
100%, ce qui permet de passer rapidement à l’évaluation des caractères d’intérêts comme
la production ou la qualité, particulièrement chez l’orge (Devaux et Kasha, 2009).

Les applications des HD sont donc très variées : développement de cultivars, analyse de
lignées issues de rétrocroisement couplé avec une sélection assistée par marqueurs
(Toojinda et al., 1998), sélection de mutants (Szarejko et Forster, 2006), assistance à
l’obtention de plante à stérilité mâle cytoplasmique (Ribarits et al., 2007), et production de
plantes transgéniques (Chauhan et Khurana, 2011).

Différentes techniques permettent d’obtenir des haploïdes doublés. In vivo, par

l’élimination d’un chromosome parental après fécondation interspécifique, et in vitro, via
la gynogenèse ou l’androgénèse. Mais avant de plonger dans ces méthodes, intéressons-
nous de plus près à la voie développementale qui mène à la production de grains de pollen.

2.3. Développement du grain de pollen

2.3.1. In vivo
Comme toutes les plantes supérieures, le cycle vital de l’orge est rythmé par l’alternance
entre une phase sporophytique (nombre de chromosomes = 2n) et une phase

6
gamétophytique (nombre de chromosomes = n). Durant la phase gamétophytique, les
gamètes, produits de la méiose, aboutiront à la formation d’un embryon après fécondation.
Ainsi recommence la phase sporophytique, avec une nouvelle génération. Dans le cas du
développement du pollen, celui-ci résulte de divisions asymétriques d’une microspore, en
mitose I, en deux cellules distinctes : une petite cellule végétative et une grosse cellule
générative (Figure 2). Cette dernière donnera deux cellules spermatiques pendant la mitose
II (nombre de chromosomes = n). La dernière phase de maturation du pollen sera supportée
par la croissance du tube pollinique (Goldberg et al., 1994).

2.3.2. In vitro
En culture in vitro, des gamètes immatures peuvent être reprogrammés et dirigés vers la
voie de l’embryogénèse, plutôt que la gamétogénèse. Dans le cas du pollen, des gamètes
compétents, c’est-à-dire à un stade de développement pré-mitotique, peuvent être
réorientés par une induction (Figure 2). Durant la mitose I et II, des divisions symétriques
aboutiront à la formation d’un nouvel embryon (Zaki et Dickinson, 1991). D’un point de
vue du matériel génétique, les chromosomes se dupliqueront spontanément. Différents
processus ont été proposés, comme l’endoréduplication ou encore la fusion nucléaire
(Kasha et al., 2001). Au terme de ce processus d’embryogénèse, une nouvelle plante
(souvent diploïde et fixée) sera obtenue.

7
Figure 2 : Développement d’une microspore en condition in vivo et in vitro. Gn ; noyau
de cellule génératrice, N ; noyau, SC (sperm cell) ; cellule spermatique, St (starch) ;
amidon, V ; vacuole, Vn ; noyau de cellule végétative. Adapté de (Daghma et al., 2014)

2.4. Production des haploïdes doublés

2.4.1. Élimination spontanée d’un chromosome parental
Lors d’un croisement interspécifique, des zygotes hybrides peuvent être générés. Au sein
de ceux-ci cohabitent les chromosomes de chaque parent. Sous pression du programme
développemental, un chromosome sera éliminé. Le chromosome subsistant dans l’embryon
subira une duplication essentielle pour l’obtention des HD. L’embryon doit être sauvé par
culture in vitro, car la division de l’endosperme échoue lors des étapes précoces du
développement de la graine. Les embryons peuvent être sélectionnés avec une coloration
par marqueur porté par le pollinisateur. Cette technique s’adresse à des croisements réalisés
avec des espèces apparentées et a été utilisé pour produire des HD chez l’orge. En effet,
l’orge appartenant au genre Hordeum, cette technique a permis de générer avec succès des
HD par culture in vitro d’ovules extraites de plantes d’orges (Hordeum vulgare) pollinisé
avec Hordeum bulbosum (Chen et Hayes, 1989).

8
 2.4.2. Gynogenèse
Cette technique permet de générer des embryons HD après stimulation d’ovules non-
pollinisés. L’induction peut se faire grâce à un milieu de culture contrôlé, avec un
traitement de température, ou avec des grains de pollen irradiés. Cette technique a surtout
été développée chez l’oignon (Allium cepa) et la betterave (Beta vulgaris) (Bohanec, 2009),
mais aussi chez l’orge (Castillo et Cistué, 1993).

2.4.3. Androgénèse
2.4.3.1. Culture d’anthères
Pour l’androgénèse, il est possible de récolter et de mettre en culture des épis, au moment
où les microspores sont au stade uni-nucléé médian. Le stade de récolte doit être optimisé
afin d’obtenir un maximum de microspores compétentes. Les anthères récoltées sont tout
d’abord prétraitées au froid ou en condition de stress hydrique avec une solution de
mannitol (Cistué et al., 1994). Puis, ces anthères sont placées sur un milieu d’induction à
une température contrôlée (26°C) et dans le noir. Quelques semaines plus tard, les
microspores, sur la voie de l’embryogénèse, sont transférées en milieu de régénération. La
quantité de plantes haploïdes générées dépendra du nombre de microspores par épi.

2.4.3.2. Culture de microspores isolées

La culture de microspores isolées est très semblable à la culture d’anthères. En effet, une
étape préliminaire est nécessaire durant laquelle les microspores sont mécaniquement
extraites des anthères. De plus, des étapes de rinçage des microspores sont requises dans le
bon déroulement de ce protocole. Cette technique est tout particulièrement utilisée chez
l’orge, puisque cette céréale a montré les meilleurs taux de régénération par rapport à la
culture d’anthères (Li et Devaux, 2005). Cette technique d’obtention d’haploïdes doublés
a donc un fort potentiel dans les programmes de sélection variétale. Mais, elle fait face à
un problème majeur avec l’albinisme. En effet, chez certains croisements, ce phénomène
peut être observé chez 100 % des plantes régénérées.

2.5. Albinisme
2.5.1. Phénotype
L’appareil foliaire des plantes albinos est identifiable par une couleur blanche ; les tiges et
feuilles sont dépourvues de pigment chlorophyllien (Figure 3). Ainsi, les chloroplastes sont

9
FRQVLGpUpVFRPPHODVWUXFWXUHFHOOXODLUHLPSOLTXpHGDQVOHSKpQRPqQHGHO¶DOELQLVPH(Q
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10
1994). À ce jour, l’étape où interviendraient les modifications irréversibles des
chloroplastes reste inconnue.

2.6. Albinisme et chloroplaste

Les processus biologiques conduisant à l’albinisme sont toujours inconnus. Pourtant, de
nombreuses études ont permis de mieux décrire ce phénomène en portant leurs
investigations à différents niveaux de résolution : morphologique, biochimique et
génomique.

2.6.1. Morphologie
Le chloroplaste, lieu de la photosynthèse, possède des structures internes, comme les
thylakoïdes, assurant des fonctions vitales comme le transport d’électrons et la production
d’énergie via l’interception de la lumière. Des études cytologiques en microscopie
électronique, conduites chez le blé en condition d’androgénèse, ont montré l’existence
d’importantes perturbations morphologiques des chloroplastes (Caredda et al., 1999). La
figure 4 montre des structures chloroplastiques bien développées dans un embryon issu de
la fécondation. Elle contraste avec les fortes malformations identifiables chez les
chloroplastes observés au sein de microspores à un stade avancé de culture. Ces anomalies
prennent la forme d’une forte perturbation des membranes et d’une faible présence de
structures thylacoïdales. De plus, il semblerait que, chez des cultivars susceptibles à
l’albinisme, la quantité de chloroplastes soit inférieure chez les microspores en
régénération (4,5 à 28 fois moins, d’après Caredda et al., 1999).

11
Figure 4 : Morphologie des structures chloroplastiques en microscopie électronique chez
des embryons issues de la fécondation (à gauche) et de microspores à un stade de culture
avancé (à droite). g (granum) : empilement de thylakoïdes, S (Starch): amidon, P
(Plastid) : plaste. Étoile noire : malformation de structures chloroplastiques.

2.6.2. Biochimie
Le chloroplaste est l’organite assurant la photosynthèse et joue donc un rôle essentiel dans
la synthèse de la chlorophylle. À l’échelle de la biochimie du chloroplaste, une analyse du
contenu chlorophyllien par spectrométrie a révélé l’absence de chlorophylle a et b chez des
plantes albinos issues de l’androgénèse (Asakaviciute et al., 2006). Pourtant, Manninen et
al (1997) ont montré que la pré-chlorophylle était toujours présente. La biochimie du
chloroplaste des plantes albinos est donc altérée. De nombreuses fonctions clé de la
photosynthèse sont codées par le génome du chloroplaste. Considérant la dégradation de
l’ADNcp avant le prétraitement des microspores, intérêt particulier est porté à l’étude de
ce génome en contexte d’androgénèse

2.6.3. Génomique
Le génome chloroplastique de l’orge, habituellement représenté sous forme circulaire,
contient 83 gènes pour 136 462 paires de bases (Saski et al., 2007). Il possède deux régions

12
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13
En contexte d’androgénèse, ce génome chloroplastique suscite beaucoup d’intérêt car il est
soumis à des contraintes fragilisant sa structure. Une étude par Southern blot a révélé qu’il
existait des altérations dans l’ADNcp extrait de plantes albinos (Dunford et Walden, 1991).
D’autre part, Caredda et al., (2004) ont établi par une approche de microscopie
électronique, que le nombre de copies d’ADNcp par chloroplaste diminuait de façon très
significative chez les microspores de cultivars sensibles à l’albinisme. Enfin, les travaux
les plus récents à ce jour ont décrit, par PCR, que certains gènes clés de la photosynthèse
n’étaient plus amplifiables chez certaines plantes albinos (Mozgova et al., 2012). Mais ces
études ont un spectre d’exploration limité, puisque l’approche ne fait appel qu’à des
amplifications ponctuelles du génome.

Dans la mesure où la séquence complète du génome chloroplastique de l’orge est

disponible (Saski et al., 2007), les techniques de séquençage de nouvelle génération offrent
des perspectives d’étude innovante. En effet, celles-ci permettraient d’élargir grandement
le champ d’investigation des réarrangements structuraux de l’ADNcp en contexte
d’androgénèse, par une étude de ce génome dans son entier.

2.7. Méthode d’étude de la variation structurale

Grâce au pouvoir de résolution conféré par les méthodes de séquençage de nouvelle
génération, la capture d’informations sur les réarrangements structuraux est devenue très
précise (Zhao et al., 2013). Dans un séquençage en paires, l’ADN source est fragmenté et
séquencé aux extrémités. Les lectures de séquences, communément appelées « reads »,
permettent de capturer de nombreux types d’altérations du génome : délétion, insertion,
inversion et transposition. L’approche principale se base sur la capture de séquences en
périphérie ou en chevauchement direct avec ces réarrangements structuraux (Alkan et al.,
2011). La figure 7 illustre les différentes classes de variation structurale et les informations
d’alignement permettant de les détecter. En A, dans le cas d’une délétion, un espacement
trop important entre les deux reads d’une même paire sera interprété comme une délétion.
En effet, au moment du séquençage les reads d’une même paire sont physiquement
espacées par 300 paires de bases. Si la paire de séquence chevauche une jonction de
délétion présente dans le génome source, l’espacement entre les séquences sera supérieur
à la normale après alignement sur le génome de référence. Dans la même logique, à

14
l’échelle d’une séquence unique, si celle-ci porte en son sein un point de jonction de
délétion, chaque partie de cette séquence, bordant cet évènement de délétion, sera alignée
séparément dans le génome de référence, aux bordures de la séquence délétée. Enfin, une
délétion peut-aussi être détectée par une perte locale de profondeur de couverture, qui est
une mesure du nombre de fois que chaque position du génome de référence a été séquencée.
Dans le cas d’une insertion, en B, l’espacement entre les reads d’une même paire sera cette
fois diminué après alignement. De même, pour une séquence unique comportant une
insertion, seules les extrémités bordant cette insertion pourront être alignées sur le génome
de référence. Enfin, tel que présenté en C, un défaut dans l’orientation des reads d’une
même paire, couplé avec une augmentation locale de couverture, peut-être la signature
d’une duplication. En effet, le read droit de la paire 2 peut s’aligner à gauche du read gauche
de la paire 1, puisque séquencée, dans le génome source au niveau de la duplication. Au
moment de l’alignement, toute séquence issue de la duplication contribuera à augmenter,
d’autant de fois que la séquence est dupliquée, la profondeur de couverture de cette même
séquence sur le génome de référence. Tel que montré dans les points A, B et C, le
séquençage de nouvelle génération semble donc offrir de nouvelles perspectives
performantes pour réaliser une étude complète des remaniements du génome
chloroplastique de l’orge en condition d’androgénèse.

15
Figure 7 : Principales méthodes d’analyse bio-informatique de différentes classes
variations structurales. A ; Délétion, B ; Insertion, et C ; Duplication. ref. ; Génome de
référence. Source ; Génome source pour le séquençage. Les flèches indiquent l’orientation
des séquences avant ou après leur alignement sur le génome de référence. Adapté de Alkan
et al. (2011)

2.8. Problématiques, hypothèse et objectifs

L’article de Makowska et Oleszczuk (2014) dresse un portrait de l’ensemble des questions
à ce jour non résolues concernant l’albinisme. Plus spécifiquement, les éléments apportés
par notre revue de littérature ont montré que la biologie des phénomènes conduisant à
l’albinisme en condition d’androgénèse est encore inconnue. De nombreuses évidences,
pointées par la littérature, semblent indiquer que des altérations du génome chloroplastique
seraient à l’origine de ce phénomène. D’autre part, l’étape à laquelle interviennent les
altérations du chloroplaste reste non résolue. Dans ce contexte, nous avons posé
l’hypothèse selon laquelle il existerait des modifications du génome chloroplastique de
l’orge en condition de culture de microspores isolées. Afin de mieux comprendre ce
processus menant à l’albinisme, nous avons entrepris d’étudier l’intégrité du génome
chloroplastique au sein de microspores d’orge et de plantes albinos via une approche de
séquençage à grande échelle.

16
 CHAPITRE III : ARTICLE

Résumé article

L’albinisme, phénomène résultant en des plantes incapables d’accomplir la photosynthèse

et donc non viables, est un des inconvénients de l’androgénèse. Des études antérieures ont
révélé que l’albinisme est associé à des anomalies morphologiques du chloroplaste et à la
perte de certaines parties du génome chloroplastique (ADNcp). Dans ce travail, notre
objectif était d’examiner l’abondance et l’intégrité structurale de l’ADNcp au sein de
microspores et de plante albinos d’orge (Hordeum vulgare) avec une approche de
séquençage de nouvelle génération. L’ADN total a été extrait d’une feuille verte de la
plante donneuse (témoin), de microspores en phase précoce d’androgénèse, et de feuilles
albinos. Ces ADN ont été séquencés et les reads ont été alignés sur le génome de référence
chloroplastique. Nous avons observé une diminution de 8X dans l’abondance de reads
d’ADNcp dans les microspores comparativement au contrôle (feuille verte) ; aucune
preuve de réarrangement structural n’a été trouvée. Dans les feuilles albinos, contrairement
à la situation observée dans les feuilles vertes et les microspores, la profondeur de
couverture de l’ADNcp variait considérablement, les régions inversées-répétées (IR)
bénéficiant d’une abondance moyenne seize fois plus élevée que dans les régions simples
copies (SC). Dans les SC, la couverture était très variable et semble suivre un gradient
diminuant à mesure que l’on s’éloigne des IR. Un tel profil de couverture chez les plantes
albinos n’est pas consistant avec un génome chloroplastique circulaire.

17
 Deep sequencing of the chloroplast genome in barley (Hordeum vulgare)
microspores and albino plants derived from androgenesis

Rémi Maglione, François Belzile and Patricio Esteves

Département de Phytologie and Institut de biologie intégrative et des systèmes,
Université Laval, Quebec City, Quebec, Canada

Abstract

Albinism, a condition that results in plants that are incapable of performing photosynthesis
and are thus unviable, is a drawback of androgenesis. Past studies have revealed that
albinism is associated with morphological anomalies of the chloroplast and the loss of
certain portions of the chloroplast genome (cpDNA). In this work, our goal was to examine
the abundance and structural integrity of the cpDNA in microspores and albino plants of
barley (Hordeum vulgare) using next-generation sequencing. Total DNA was extracted
from green leaves of the donor plant (control), microspores undergoing androgenesis, and
albino leaves. These DNAs were sequenced and reads were aligned against the chloroplast
reference genome. We observed an eight-fold decrease in the abundance of cpDNA reads
in microspores relative to the green leaf control; no evidence of any structural
rearrangement was found. In albino leaves, contrary to the situation in green leaves and
microspores, depth of coverage of the cpDNA varied widely, with inverted repeats (IRs)
enjoying a mean abundance 16 fold higher than the single copy region. Even across the
single copy regions, coverage was highly variable and seemed to follow a gradient sloping
downward with increasing distance from the IRs. Such a profile of coverage in albino
plants is inconsistent with a circular chloroplast genome.

Key words: microspores, albino plant, chloroplast genome, shotgun sequencing, structural
rearrangement, barley

18
 Introduction

Plant breeding in selfing species can be viewed as occurring in two distinct phases. In a
first phase, genetic variation is generated by crossing two parental lines that differ at a
number of loci and recombination ensures that a vast number of novel combinations of
alleles will be obtained. In a second phase, the breeder will perform selection on these new
allelic combinations in the hope of identifying a superior genotype. For this second phase
to be effective, the genotype of each line must be sufficiently fixed to allow these to breed
true. Unfortunately, producing such fixed lines through selfing will take many generations.
In vitro culture techniques have allowed researchers to efficiently produce homozygous
plants in a single generation through various procedures leading to the production of
doubled haploid (DH) progeny (Jähne and Lörz, 1995). These fixed lines can then
immediately be subjected to selection as they will obviously breed true.

Not all crop species, however, are amenable to the production of DH plants (Thomas et al.,
2003). Fortunately, cereals such as rice, maize, wheat and barley, in addition to being key
crops contributing to food security, are among the most amenable. In barley, Hordeum
vulgare, this technology has been widely used by the breeding community and hundreds
of cultivars are known to have been developed through the production of DHs (Devaux
and Kasha, 2009).

Several methods are available for DH generation, including wide crosses, gynogenesis and
androgenesis. Wide crosses often result in chromosome elimination in hybrid endosperm
derived from a cross between wheat (female) and distantly related species such as Hordeum
bulbosum. Although the male parent pollinates the egg cell, its chromosomes will be
subsequently eliminated from the nucleus. DH embryos will be rescued by in vitro culture
(Maluszynski and 1941-, 2003). For gynogenesis, non-pollinated ovules are stimulated and
induced through controlled culture medium or irradiated pollen (Castillo and Cistué, 1993).
Finaly, in androgenesis, immature spikes are exposed to a stressful pretreatment in order
to elicit a genetic reprogramming thanks to which the male gamete will follow a
sporophytic rather than a gametophytic pathway. Following this stress, complete immature

19
anthers or isolated immature microspores are put in culture and initiate the production of
embryos. Usually in barley, DHs are obtained using isolated microspore culture (IMC)
rather than anther culture (Caredda et al., 2000). As mentioned above, the key element in
IMC is the stress applied on microscopes (Huang and Sunderland, 1982). This stress can
be a chemical or temperature treatment (Roberts-Oehlschlager and Dunwell, 1990) of
immature spores (Sunderland and Dunwell, 1974). Influenced by that stress, the
microscope genome can be spontaneously doubled. The resulting DH lines are, thus,
entirely homozygous. Finally, androgenesis techniques are very useful to efficiently
produce genetically fixed lines.

Despite the many desirable features of androgenesis for DH production in barley, in all
genotypes, there is always a certain proportion of progeny that suffer from albinism, and
this proportion can be very high (up to 100%) in some genotypes (Caredda et al., 2000).
For obvious reasons, the chloroplast has been at the center of investigations into albinism
(Mouritzen and Holm, 1994) and much of this work aiming to investigate the causes of
albinism in cereals has been conducted in barley (Dunford and Walden 1991; Mouritzen
and Holm 1994; Caredda et al. 1999, Caredda et al. 2004). Such studies have revealed that,
in genotypes prone to albinism, microspore-derived embryos are characterized by the
presence of small, abnormal chloroplasts containing low amounts of thylakoid and DNA
(Caredda et al. 2004). At a biochemical level, it has been described that low amounts of
pre-chlorophyll a and b are present in albino plants (Asakaviciute et al., 2006), but that
chlorophyll a is not synthesized (Manninen, 2008).

As the chloroplast harbors its own genome, alterations or rearrangements of the plastid
DNA may be linked to albinism. Previous work has suggested that cpDNA is subject to
nucleolytic attack from metallo-nucleases (Sodmergen et al., 1991) or oxidative stress
(Kumar et al., 2014). Furthermore, early work using Southern blot analysis revealed that
plastid DNA extracted from albino plants exhibits deletions and alterations (Dunford and
Walden, 1991). These rearrangements seem to occur during the early stages of
androgenesis (Mouritzen and Holm, 1994; Cistué et al., 1995). Finally, a recent study has
revealed that some key photosynthetic genes could no longer be amplified by PCR in up to

20
38% of albino plants of wheat and triticale (Mozgova et al., 2012), thus again suggesting
that albinism is at least in part attributable to deletions in the cpDNA.

To date, no studies have reported on the abundance and integrity of the entire chloroplast
genome during the process of androgenesis and in albino plants. As the entire sequence of
the barley chloroplast genome is available since 2007 (Saski et al., 2007) and next
generation sequencing (NGS) has shown huge potential to study structural rearrangements
(Zhao et al., 2013), we combined these tools to explore cpDNA abundance and integrity in
barley microspores and albino plants.

21
 Materials and methods

Plant materials
To examine the integrity of the barley chloroplast genome in the early stages of isolated
microspore culture, immature barley microspores were isolated from a six-row barley F1
(UL143 X Myriam) and used to initiate microspore culture as described in Esteves et al.
(2014). Isolated microspores were collected following application of a stressful treatment
meant to induce embryogenesis. As a control, a young green leaf from the F1 donor plant
was collected and frozen in liquid nitrogen. To investigate the structural integrity of the
chloroplast genome in albino plants, young leaves of albino plants, obtained at the term of
isolated microspore culture, were collected and frozen in liquid nitrogen.

DNA extraction
All plant materials, including microspores and green or albino leaves, were subjected to a
total DNA extraction. DNA was extracted from approximately 500,000 microspores or 100
mg of ground leaf tissue using the Qiagen Plant DNeasy Mini Kit (QIAGEN Inc, Toronto,
Canada) according to the manufacturer’s protocol. DNA was quantified on a NanoDrop
spectrophotometer and examined for integrity by gel electrophoresis.

Illumina whole genome resequencing of microspore and green leaf DNA

For each of the first two samples (microspores and green leaf from the same F1), one μg
of total DNA was added to 500 μl of nebulization buffer and fragmented at 30 psi during
2 minutes with a Roche nebulizer. This solution was purified on Qiagen MiniElute columns
and fragmented DNA was eluted in 60 μl. Illumina paired-end libraries were constructed
using the Illumina TruSeq™ DNA Library Prep Kit at the Plateforme d'Analyses
Génomiques (Institut de biologie intégrative et des systèmes (IBIS), Laval University,
Quebec, QC, Canada). The two resulting DNA libraries (each with a distinct barcode) were
combined in a 90:10 ratio (microspores:green leaf) and sequenced on a single lane of an

22
Illumina HiSeq 2000 machine at the McGill University and Génome Québec Innovation
Center (Montreal, QC, Canada).

Ion Torrent whole genome resequencing of albino leaf DNA

For each of six albino leaf samples, 500 ng of total DNA were fragmented using a Covaris
M220 with settings optimized to yield 250 to 350-bp fragments. Ion Torrent single-end
libraries were prepared using the KAPA Hyper Prep Kit (Kapa Biosystems, Wilmington,
MA, USA) at the Plateforme d'Analyses Génomiques (IBIS, Laval University, Quebec,
QC, Canada). All six libraries were barcoded and combined in equimolar fashion prior to
sequencing on a single Ion PI Chip (v3) using an Ion Proton System (Thermo Fisher
Scientific, Waltham, MA, USA).

Mapping and depth of coverage

Illumina and Ion Torrent reads were aligned onto the barley (cv Morex) reference
chloroplast genome (accession number EF115541) using Bowtie 2 (version 2.1). Illumina
libraries were aligned with the following parameters: --very-sensitive -k2. Due to the large
number of indels generated by the Ion Torrent technology, these reads were aligned with
the following parameters: --very-sensitive --mp7,3 –score-min L, -0,-0.2 --rdg1,5 --rfg1,5
-k2. In both cases, the -k2 option allowed reads to map to both copies of the IRs. Depth of
coverage was computed from the BAM files using Pysamstats (version 0.23,
https://pypi.python.org/pypi/pysamstats). To avoid discarding reads with more than one
alignment, the SAM flag was manually set to 8. Depth of coverage on all reads was initially
plotted with RStudio (version 0.99). To facilitate comparisons, normalization was
performed either on the number of reads (43M total reads for microspores and green leaf)
or on the number of reads aligned to the chloroplast genome (151K reads aligned to
cpDNA). Also, to more easily discern each region of the chloroplast genome (LSC, SSC,
IRs), a sliding window analysis was performed on each of them separately with a window
size of 2000 bp and a step of 100 bp (zoo package, version 1.7-12). The results of the
sliding window analysis were plotted with the ggplot2 package (version 0.9.3.1).

23
Detection of structural variation
The detection of structural variation was performed by both a paired-end mapping
approach (using Breakdancer-max v1.2) and a split-read approach (using Pindel v0.2.5).
In both cases, default parameters were used.

Detection of genic deletions via PCR

Polymerase chain reactions were carried out with one ng of total DNA extracted from
albino leaves. Amplification was performed on four genes (psaA, atpB, atpE and petA)
using the same primers as Mozgova et al. (2012). PCR products were separated on a 2.5%
agarose gel in 1X TAE-buffer and revealed by ethidium bromide.

24
 Results

Abundance and structural integrity of the chloroplast genome in microspores

To explore possible structural changes occurring in the barley chloroplast genome in the
course of isolated microspore culture (IMC), we sequenced a genomic library prepared
from total DNA extracted from immature microspores, bound for IMC, and leaf tissue, as
a control. In total, 290 and 43 million reads were obtained for these two samples,
respectively (Table 1). These were mapped onto the barley chloroplast reference genome
to select the subset of reads originating from cpDNA. As expected, a smaller proportion of
reads from the microspore library were derived from cpDNA than was the case for the leaf
library (1.6% vs 6.4%, respectively). Nonetheless, a very high depth of coverage was
achieved in both cases: 3,496X for microspores and 2,043X for the leaf. Thus, despite a
four-fold smaller fraction of reads being of chloroplastic origin in the microspore library,
the larger sequencing effort devoted to this library resulted in high coverage.

Table 1 Summary statistics of the Illumina reads mapped to the reference chloroplast
genome.
Reads Mean depth
Fraction of
Total reads mapped on Mean depth of normalized
Sample chloroplast
(x 106) reference of coverage coverage
reads
(x 106)

Green Leaf 43 2.8 6.4% 2,043 2,043

Microspore 290 4.8 1.6% 3,496 542

We then examined the depth of coverage in each of the components of the chloroplast
genome. As illustrated in the theoretical expectations shown in Figure 1a, we expected the
coverage to be twice as high in the inverted repeat (IR) regions, as these are perfectly
identical and present in two copies relative to the rest of the genome. When we plotted the

25
depth of coverage obtained with the same number of total reads (43M) from either the
microspores or the green leaf (Figure 1b), the results were only partially in agreement with
our expectations. Normalized read depth was obviously much higher in the green leaf
sample relative to the microspore sample as indicated above (Table 1, Mean depth of
normalized coverage). Although depth of coverage was not perfectly uniform, no segment
of the chloroplast genome exhibited a complete lack of reads. Generally speaking, single
copy regions enjoyed a fairly uniform mean coverage that was clearly inferior to the
coverage seen in the IRs. This was true both for the leaf and microspore samples. Also, the
abundant read coverage seen across the entire genome is incompatible with there being any
deletions of a detectable size (>100 bp) shared among all copies of the chloroplast genome
(as has been reported in albino plants derived from microspore culture). Some striking
discrepancies were however noted. Firstly, the depth of coverage in the IRs was on average
2.8-fold higher than that in the single copy regions. Secondly, among the IRs, there was a
clear difference in the coverage with the “internal” portion of the IR (immediately
bordering the SSC) enjoying a notably higher coverage than the “external” portion. Finally,
in both the leaf and microspore, a 7-kb segment of the LSC region (from 126 kb to 133 kb)
was also covered by an exceptionally large number of reads. This was especially notable
in the microspore.

26
)LJXUH  ([SHFWHG DQG REVHUYHG GHSWK RI QRUPDOL]HG FRYHUDJH UHVXOWLQJ IURP
DOLJQPHQW RI UHDGV REWDLQHG IURP HLWKHU PLFURVFRSHV RU D JUHHQ OHDI $ ([SHFWHG
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XVLQJDVOLGLQJZLQGRZDSSURDFKSHUIRUPHGRQDQRUPDOL]HGVHWRIUHDGV0IRUHDFK
VDPSOH

27
Deletions are not responsible for the low coverage of microspore cpDNA
Despite the fact that we saw no evidence of sizeable deletions common to all copies of the
cpDNA, we could not exclude the possibility that there be deletions in some copies of the
cpDNA and that these had eluded detection based on a simple examination of the depth of
coverage of mapped reads. To determine if deletions had occurred in some copies of the
chloroplast genome, we performed further analyses relying on particular features of paired
reads. In a first approach called paired-end mapping, we used BreakDancer to look for
paired reads with an overly large insert size when aligned on the reference cpDNA. This
would occur if a cpDNA molecule bearing a deletion produced a fragment with paired
reads originating from two regions located at an unexpectedly large distance in the
reference genome. Although BreakDancer successfully and accurately detected simulated
deletions on an altered reference genome in which “foreign” sequences had been
introduced (data not shown), it did not find any evidence of deletions in our paired-read
data. In another approach, we used Pindel to look for direct evidence of deletions in the
form of split reads, i.e. reads that overlap a deletion breakpoint. In such a case, one portion
of the read maps to a particular region of the genome that is not immediately adjoining the
region to which the other portion of the read maps. None of the candidate deletion junctions
identified by Pindel were strongly supported (<5 reads). From these analyses, we
concluded that although the cpDNA in microspores was much less abundant than in green
leaves, this loss of cpDNA did not seem to arise through deletions.

Abundance and structural integrity of the chloroplast genome in albino plants

To investigate the abundance and structural integrity of the chloroplast genome in albino
plants obtained at the end of IMC, we sequenced a genomic library prepared from total
DNA extracted from young leaves of six albino plants. On average, 11M reads were
obtained for these albino samples (Table 2). After alignment against the barley reference
chloroplast genome, an average of 3.4% of reads were found to map to cpDNA and this
provided a mean depth of coverage of 372 reads (range = 151 to 720).

28
Table 2 Summary statistics of the Ion Torrent reads obtained from six albino plants
Total reads represent the total of reads sequenced after trimming and filtering.

Fraction of
Total reads Reads mapped on Mean reference
Albino sample chloroplast reads
(106) reference (105) coverage (X)
(%)
1 24 7.1 2.95 720
2 9.3 2.9 3.07 286
3 8.6 4 4.67 402
4 10 3.5 3.39 352
5 9.7 3.2 3.27 321
6 5.7 1.5 2.72 151
Mean 1.13±0.43 3.7±1.25 3.35±0.46 372±126
Green leafR 43 27 6.4 2,042
R
: the previous green leaf Illumina sequencing has been added as control

To examine the uniformity of chloroplast genome coverage across the different albino
plants, we normalized by analyzing the same number of reads that had been mapped to the
reference genome (151K, as found in albino #6). As can be seen in Figure 2, the resulting
depth of coverage showed several differences relative to both the expected coverage and
the coverage previously observed for a green leaf and for microspores (Fig. 1). Read depth
in the single copy region was not uniform. Although no sizeable region of the chloroplast
genome was completely lacking coverage, on average, the single copy regions exhibited
extremely low coverage. More specifically, mean coverage across all samples was 44x,
and it ranged broadly going from as few as 0 reads to as many as 469 reads. In contrast,
the IR regions enjoyed a much higher coverage (711x on average) but also exhibited a
broad range of depths of coverage (8 to 1982 reads). Again, within the IRs, coverage was
the deepest in the “internal” regions bordering the SSC region. Strikingly, the portions of
the LSC region exhibiting the highest coverage were almost systematically adjoining one
or the other IR, but not both in any given albino. At the same time, the transition in depth
of coverage from one IR to a flanking LSC region could be very abrupt. For example, in
the case of albino#1, the LSC region located to the left of IRa initially showed a high depth
of coverage that declined progressively as we move further.

29
Figure 2: Depth of coverage of chloroplast reads in six albino plant. Distribution of
reads along the barley chloroplast genome. The top track is displaying the different regions
of the chloroplast genome.

30
3&5DQDO\VLVRIJHQHVSUHYLRXVO\UHSRUWHGWREHORVWLQDOELQRSODQWV
$VLWKDGEHHQSUHYLRXVO\UHSRUWHGWKDWVRPHJHQHVZHUHXQGHWHFWDEOHLQWKHFKORURSODVW
JHQRPHVRIVRPHRUPRVWDOELQRSODQWVDQGWKDWWKHVHJHQHVZHUHW\SLFDOO\ORFDWHGLQWKH
/6&UHJLRQVZHZDQWHGWRGHWHUPLQHLIWKHYHU\ORZGHSWKRIFRYHUDJHZHREVHUYHGLQWKH
/6&UHJLRQVZRXOGUHVXOWLQDQLQDELOLW\WRDPSOLI\WKHVHJHQLFUHJLRQV)RUWKLVSXUSRVH
ZHVHOHFWHGIRXUSUHYLRXVO\VWXGLHGJHQHVDWS%SHW$SVD$DWS(0R]JRYDHWDO
EDVHGRQWKHLUUHSRUWHGKLJKUDWHRIXQVXFFHVVIXODPSOLILFDWLRQDQGWKHLUORFDWLRQLQSRUWLRQV
RIWKHJHQRPHGLVSOD\LQJDYHU\KLJKGHFUHDVHLQGHSWKRIFRYHUDJHLQWKHDOELQRSODQWV
VWXGLHGKHUH$OWKRXJKZHXVHGWKHH[DFWVDPHSULPHUSDLUVDQGYHU\VLPLODUDPSOLILFDWLRQ
FRQGLWLRQV DOO IRXU JHQHV ZHUH VXFFHVVIXOO\ DPSOLILHG LQ DOO DOELQR VDPSOHV )LJXUH 
7KXVRXUDQDO\VLVRIWKHVHJHQHVVXJJHVWVWKDWDOWKRXJKWKHLUFRS\QXPEHUZRXOGEHPXFK
GHFUHDVHGLQDOELQRSODQWVWKH\ZHUHQRWFRPSOHWHO\ORVWRUXQGHWHFWDEOHLQWKHVHSODQWV

)LJXUH'1$DPSOLILFDWLRQSURGXFWVRISKRWRV\QWKHWLFNH\JHQHVLQDOELQRSODQW
$WS% ES SHW$ ES SVD$ ES DWS( ES SULPHUV ZKHUH XVHG RQ
$OELQRDOELQRVDPSOHUHFRYHUHGIURP,0&*JUHHQOHDIFRQWURO/'1$ODGGHU

31
Deletions are not responsible for the low coverage of the LSC regions
For a circular genome, the markedly reduced depth of coverage seen in the LSC region
would need to occur through deletions preferentially involving such regions and should
leave traces in the form of deletion breakpoints that would result in split reads. To explore
this possibility, we used Pindel to look for split reads. Again, no evidence could be found
for the existence of deletion breakpoints. We therefore conclude that the large decrease in
the depth of coverage of segments of the chloroplast genome that is a unique signature of
the chloroplast genome in albino plants is not due to a simple process whereby deletions
eliminate portions of the genome.

32
 Discussion

Despite the widespread use of androgenesis in many major crops and the common
occurrence of albinism, our understanding of the molecular and genetic causes of this
anomaly remains poor. In this work, we used deep sequencing to investigate the abundance
and integrity of cpDNA in leaves of the donor plant, treated microspores and in leaves of
albino plants derived from androgenesis.

A first observation brought by this study is the lower abundance of cpDNA in treated
microspores. We found that the fraction of chloroplast reads was four-fold lower in treated
microspores than in green leaves (1.6% vs 6.4%). When we take into account that the
amount of nuclear DNA in haploid microspores is half that found in diploid leaf cells, the
true decline in cpDNA abundance is probably closer to eight fold. This decline in reads
mapping to the chloroplast genome is in good agreement with the previously described
decline in the number of plastids found in barley microspores undergoing androgenesis.
Indeed, Caredda et al. (1999) documented that, in anther culture, the most common
treatments used to induce embryogenesis in barley microspores (thermal and osmotic
stress) both lead to a marked reduction in the number of plastids (4.5-fold and 28-fold,
respectively). Thus, from a quantitative point of view, the lower abundance of chloroplast
DNA is in line with the cytological observations on chloroplast abundance. Moreover,
using electron microscopy to assess the abundance of DNA in chloroplasts, Caredda et al
(2004) reported that DNA was 4-7 times less abundant in chloroplast sections in
microspores of barley varieties highly prone to albinism. Thus, based on cytological
observations, both a reduction in the number of chloroplasts and a reduction in the amount
of DNA in these chloroplasts contribute to a decreased amount of DNA in these
microspores. When comparing these different methods for estimating the reduction in the
amount of cpDNA in barley microspores, we feel that the assessments based on read
abundance likely provides the most accurate measure.

As it has often been reported that albino plants suffer from anomalous chloroplasts
(Caredda et al., 1999) and from deletions in the cpDNA itself (Mozgova et al. 2012), we
also wanted to investigate the integrity of the cpDNA in treated microspores. No large and
shared deletions, common to a majority of the cpDNA molecules found in a sample of 1M

33
treated microspores were detected by analyzing the depth of coverage of mapped reads. To
further probe for possible genomic alterations in the cpDNA, two routinely used
approaches were employed: paired-end mapping and split-read analysis. Neither of these
approaches yielded any convincing evidence of deletions or other types of rearrangements.
Based on all of these analyses, the cpDNA in treated microspores, although much less
abundant than in green tissues, does not seem to have been altered structurally following
microsporogenesis and stressful treatment of these to induce androgenesis. These
conclusions seem consistent with the results of a previous study where Mouritzen and
Holm (1994), using Southern blot analysis, reported that the plastid genome apparently
remained intact during microspore culture. Such a deep sequencing approach, however,
provides the most compelling evidence obtained to date for the structural integrity of the
chloroplast genome in treated microspores used to derived DH plants in barley.

As whole genome sequencing had proven quite powerful in providing detailed information
on both the abundance and integrity of the chloroplast genome in treated microspores, we
reasoned that it could similarly shed light on the situation in albino plants. A first
observation was that cpDNA abundance in leaves of albino plants was lower than in green
leaves. Whereas in the latter 6.4% of the reads mapped to the chloroplast genome, this
proportion was almost halved (3.4%) in the leaves of albino plants. To the best of our
knowledge, these are the first data comparing cpDNA abundance in albino vs green plants.

The most striking difference with our observations on treated microspores, however,
concerned the depth of coverage of the chloroplast genome in albinos. Indeed, the genome
coverage was extremely uneven, with the mean coverage of the IRs being many fold deeper
than that of the SC regions. On average, the mean depth of coverage in the IRs was 16 fold
higher than the mean coverage in the SC regions. Even within these broad regions
themselves, depth of coverage varied quite markedly. Strikingly, the internal portion of the
IRs (immediately flanking the SSC region) enjoyed a disproportionately high depth of
coverage relative to other segments of the IRs. Similarly, the portions of the LSC most
distant from the IRs exhibited much lower coverage than those bordering on the IRs.
Finally, there seemed to be a directional gradient in the observed decline in depth of
coverage with increasing distance from the IRs. In most cases, the LSC region to the right

34
of IRb had the highest coverage while, in one case, the LSC region to the left of IRa seemed
to benefit from the most extensive coverage. Taken together, these observations do not fit
well with a circular model of replication in which all SC regions are expected to be even
in coverage at a level half of that seen in the IRs.

One possible explanation for this differential depth of coverage of among the various
segments of a circular chloroplast genome would be that some segments (in this case the
LSC region) are the targets of frequent deletions leading to a multitude of incomplete
copies. If such were the case, we expected to find evidence of such rearrangements in the
form of deletion breakpoints. Despite our efforts, we were not able to find any split reads
supporting the existence of such deletion derivatives of a circular genome.

Previous work has also shed doubt on the circular nature of the chloroplast genome. Using
microscopy, Oldenburg and Bendich (2004) have shown that cpDNA is mainly present in
a linear form. Indeed, their pulsed-field gel electrophoresis coupled to restriction fragment
mapping, and fluorescence microscopy of individual DNA molecules allowed them to
work with unfractionated cpDNA and revealed that only 3-4% of these molecules are
present in circle form. They described that 95% of the cpDNA was found in a complex
where all linear fibers, of uneven lengths, were branched together. They called this supra-
structure a “nucleoid”. Many of the features of such a structure provide a better fit with the
observations derived from our deep sequencing of the chloroplast genome in albino plants.

Firstly, the massive difference observed between the low mean coverage (44x) in the LSC
region and the high mean coverage (771x) in the IRs highly suggest either that the LSC
region was replicated less effectively or that it was more often subject to degradation. As
explained above, in a circular model, smaller circular cpDNA molecules would be expected
to generate breakpoints, but none were found through split-read analysis. In contrast, with
linear cpDNA, it is much easier to imagine how the linear fibers of uneven length described
by Oldenburg and Bendich (2004) could result in the pattern of read coverage observed in
this work. Secondly, an internal portion of the IR showed the highest coverage and,
interestingly, this is where the origins of replication of the cpDNA are located in the IR.
This is consistent with replication being initiated repeatedly in these regions, but not
proceeding to completion. Moreover, this pattern has been observed among our microspore

35
and leaf samples. This is consistent with the existence of a nucleoid structure where linear
molecules are branched. Furthermore, in the stressful environment, caused by the switch
of microspore, from a gametophyte to a sporophytic pathway, the cpDNA may be subjected
to many structural alterations, such as deletions. As replication frequently takes place in
the internal portion of the IRs, we presume that the replication machinery will be
abundantly organized around such regions. Taken together, we anticipate that this
replication machinery will result in a protection against deletion by structural hindrance.
Thus, the region close to the replication origin will be less subject to degradation during
androgenesis. Thirdly, we observed a directional gradient of coverage in the LSC with the
highest depths of coverage occurring immediately next to the IRs and coverage decreasing
as we move away from the IRs. Again, such a gradient is difficult to reconcile with a
circular genome in which no internal deletions could be detected. In contrast, the
“nucleoids” described by Oldenburg and Bendich (2004) would produce the type of
coverage we observed due to the relative scarcity of long linear fibers.

Finally, we wanted to test if the great reduction in read depth in some portions of the LSC
could result in an inability to amplify some genic regions as reported in albino plants of
wheat and triticale reported by Mozgova et al. (2012). Using primers for the genes that had
showed the highest frequency of unsuccessful amplification (atpB, petA, psaA, atpE), we
observed that we could successfully amplify all of these in our six albino barley plants.
Nonetheless, from the data presented in Figure 3, it is clear that the copy number (per cell)
of the different genes coded by the chloroplast genome would differ markedly, and that
this could lead to severe imbalances between the gene products needed to make a functional
chloroplast, be they coded in the nucleus or the chloroplast.

To summarize, we have provided evidence for major changes in the structure of the
chloroplast genome in albino plants derived from androgenesis. As the circular model for
the organization of the chloroplast genome proved incompatible with our observations,
whereas a linear model proved much more compatible, we are led to believe that a linear
form of the chloroplast genome may be more prevalent than previously realized. No such
disturbance was observed among microspores or leaf samples. At the same time, this study
provides, for the first time, the profile of the entire chloroplast genome at early and final

36
stages of the androgenetic process. Considering that many developmental stages exist
between those characterized in this work, these would need to examine to obtain a more
complete view of when and how cpDNA undergoes the striking changes we have
documented. Future functional analyses may provide strong support to reveal the link
between molecular and genetic causes of albinism arising through androgenesis.

37
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39
 CHAPITRE IV : CONCLUSION GÉNÉRALE

L’objectif principal de ce projet était d’évaluer si des défauts d’intégrité du génome

chloroplastique de l’orge pouvaient être observés en condition de culture de microspores
isolées (CMI) et expliquer l’origine des plantes albinos issues de cette technique. Les
résultats obtenus ont permis d’invalider cette hypothèse pour les microspores au stade
précoce de culture et de la valider pour les plantes albinos.

L’obtention de lignées homozygotes grâce aux techniques d’haplodiploïdisation, comme

la culture de microspores, est un enjeu économique important. Mais, la CMI génère parfois
une proportion importante de plantes albinos, laquelle peut atteindre 100 % chez certains
cultivars. Le chloroplaste, et son génome en particulier, a fait l’objet de nombreuses études
afin de mieux comprendre les processus impliqués dans l’albinisme. Avec les approches
de séquençage de nouvelle génération et la disponibilité de la séquence complète du
génome chloroplastique de l’orge, de nouvelles perspectives d’investigation étaient
possibles.

Dans cette optique, nous avons réalisé un séquençage sur des microspores à un stade
précoce de CMI. Cette approche n’avait jamais été réalisée auparavant. Afin de palier à un
potentiel problème de couverture, les ADN des micropores et d’une feuille de la plante
donneuse (témoin) ont été combinés de manière inégale (ratio 9:1) afin de favoriser une
couverture plus élevée des microspores, car nous craignions que cet échantillon puisse
présenter une plus faible abondance d’ADNcp. Ceci nous a permis d’obtenir suffisamment
de reads afin de réaliser une analyse bioinformatique d’abondance et des variations
structurales de l’ADNcp chez les microspores. Comparativement au témoin, les
microspores présentent une réduction de l’ADNcp de 8X. Mais, bien qu’une investigation
bioinformatique poussée ait été menée, aucunes délétions expliquant cette diminution n’ont
été trouvées. Ainsi, nous avons conclu que les microspores présentaient une réduction
généralisée d’ADNcp sans toutefois présenter de modifications structurales du génome
chloroplastique. Ceci serait en adéquation avec la diminution d’ADNcp observé en
microscopie électronique dans les phase précoce de CMI par Caredda et al. (2004).

40
La deuxième partie de nos travaux a été d’appliquer notre approche d’analyse bio-
informatique d’abondance et de variations structurales de l’ADNcp chez des plantes
albinos. Notre objectif était de dresser un portrait de l’ADNcp présent au sein de feuilles
chez des plantes albinos issues de la CMI. En comparant les profils d’alignement obtenus
à ceux de la plante témoin et des microspores, l’ADNcp des plantes albinos présentaient
de nombreuses anomalies.

Ces altérations peuvent être résumées en quatre points :

- Une forte attrition de séquences dans les régions simple copie (SC).
- Une quantité de reads largement supérieure à nos attentes dans les régions inversées-
répétées (IR)
- Une excès de séquences à l’intérieur des IR, au niveau des origines de réplication
- Un gradient de couverture au niveau des régions SC en périphérie des IR.

Ces observations n’étant pas en adéquation avec un modèle circulaire du génome

chloroplastique, nous avons examiné la littérature pour voir si des modèles différents
avaient été proposés et si ceux-ci étaient davantage conformes avec nos observations. Dans
leurs travaux, Oldenburg et Bendich (2004) ont rapporté que la majorité (>95 %) des
molécules d’ADNcp seraient linéaires et organisées sous forme de nucléoïde, un amas de
génomes chloroplastiques.

Inspiré directement de ces travaux, le modèle que nous proposons est donc le suivant : les
molécules d’ADNcp seraient linéaires et regroupées en structures nucléoïdaires connectées
entre elles au niveau des origines de réplication au sein des IR. Cette architecture
procurerait une protection contre une activité nucléolytique pour les régions incluses dans
le cœur du nucléoïde. De plus, une activité de réplication répétée pour ces régions (origine
de réplication et IR) expliquerait leur relative abondance à l’issue de la CMI. Enfin, si on
imagine que la réplication peut s’interrompre avant d’avoir répliqué la totalité de l’ADNcp,
il est facile de concevoir l’apparition de molécules linéaires de tailles différentes : ceci
corroborait l’observation des gradients de couverture. Ainsi, ce modèle d’un génome
linéaire plutôt que circulaire permettrait d’expliquer de manière adéquate l’ensemble des
anomalies constatées au niveau de la couverture du génome chloroplastique chez les
plantes albinos.

41
D’autre part, les gènes photosynthétiques rapportés non amplifiables chez les albinos par
Mozgova et al. (2012) étaient situés au sein des régions SC présentant de fortes attritions
de séquence. Il devenait possible d’expliquer l’impossibilité d’amplifier ces gènes chez
certaines plantes albinos par une forte réduction de l’abondance de ces séquences plutôt
que par des délétions touchant des régions spécifiques du génome. Afin d’explorer cette
hypothèse, nous avons réalisé une amplification PCR des quatre gènes qui s’étaient avérés
les plus sujets à un tel échec de l’amplification. En faisant appel aux mêmes amorces et
aux mêmes conditions d’amplification, tous les gènes ont été amplifiés avec succès chez
chacune de nos plantes albinos ainsi que chez le témoin, Nous en avons déduit que, malgré
les fortes pertes de séquences dans les régions SC, il persiste une quantité suffisante
d’ADNcp dans ces régions pour amplifier ces gènes chez des plantes albinos.

Ainsi, il semblerait que, même si l’ADNcp souffre d’une importante perte de séquences
dans les régions SC, certaines copies, potentiellement complètes, persisteraient à l’issue de
la CMI. Ce fait saillant pourrait être traduit biologiquement par un déficit de génome
chloroplastique complet responsable d’une insuffisance du nombre de copies d’ADNcp
fonctionnel par chloroplaste. Autrement dit, en dessous d’un certain niveau de quantité
d’ADNcp, le chloroplaste ne peut plus assurer ses fonctions, et les plantes régénérées seront
albinos à l’issue de la CMI. Une future étude pourrait s’intéresser au taux d’expression de
ces gènes localisés dans les régions souffrant d’une forte attrition génomique. Une
approche par qRT-PCR permettrait de vérifier s’il existe une corrélation entre la faible
présence de séquences génomiques dans les SC et un faible taux d’expression de gènes
essentiels à la photosynthèse.

De précédentes études avançaient qu’il se produisait une dégradation de l’ADNcp dans les
stades précoces de la CMI ; notre étude vient invalider ces hypothèses et corrobore les
théories de dégradation tardive, c’est-à-dire dans la phase de régénération. C’est dans la
multitude de stades existant entre le stade des microspores prétraitées et les plantes albinos
que se trouve la clef des processus biologiques de dégradation de l’ADNcp conduisant à
l’albinisme en CMI. Des études ultérieures, employant notre approche de séquençage de
nouvelle génération, couplée à une analyse d’abondance et de variation structurales de
l’ADNcp, pourraient être réalisées systématiquement à plusieurs stades de la CMI afin de

42
dresser un portrait précis de ces phénomènes d’altération du génome chloroplastique de
l’orge en CMI. Cette démarche pourrait être employée conjointement avec une
investigation du génome nucléaire. En effet, de nombreuses fonctions chloroplastiques sont
codées par des gènes nucléaires, et de récentes études ont montré que le phénotype de
l’albinisme était en partie sous contrôle nucléaire (Krzewska et al., 2015) .

En conclusion, ce projet, avec son approche novatrice où un séquençage du génome

chloroplastique de microspores a été réalisé pour la toute première fois, a révélé que
l’ADNcp de microspores prétraitées, bien que moins abondant, est intact à ce stade précoce
de la CMI. De plus, l’étude sur les albinos a permis de mettre en évidence de nouvelles
connaissances quant aux dommages de l’ADNcp en condition de CMI. Finalement, d’un
point de vue biologique, la régénération de plante verte ou albinos est condition de la survie
d’une population suffisante d’ADNcp intact, à l’issu de la CMI.

43
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