Acta Botanica Gallica

ISSN: 1253-8078 (Print) 2166-3408 (Online) Journal homepage: https://www.tandfonline.com/loi/tabg20

Création de variétés tolérantes au stress abiotique

chez l'orge (Hordeum vulgare L.) par culture
d'anthères

Ferdaous Guasmi , Walid Elfalleh , Nidhal Marzougui , Tebra Triki & Ali
Ferchichi

To cite this article: Ferdaous Guasmi , Walid Elfalleh , Nidhal Marzougui , Tebra Triki
& Ali Ferchichi (2010) Création de variétés tolérantes au stress abiotique chez l'orge
(Hordeum vulgare L.) par culture d'anthères, Acta Botanica Gallica, 157:3, 445-450, DOI:
10.1080/12538078.2010.10516221

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Published online: 26 Apr 2013.

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Acta Bot. Gallica, 157 (3), 445-450, 2010.

Création de variétés tolérantes au stress abiotique chez l’orge

(Hordeum vulgare L.) par culture d’anthères

par Ferdaous Guasmi, Walid Elfalleh, Nidhal Marzougui, Tebra Triki et Ali Ferchichi

Institut des régions arides, 4119 Médenine, Tunisie ; guasmifer@yahoo.fr

arrivé le 3 juillet 2009, accepté le 28 septembre 2009

Résumé.- L’étude a pour objectif la création de lignées pures d’orge tolérantes

au stress abiotique par culture d’anthère. Cette étude porte sur deux variétés
d’orge : cultivar Ardhaoui, sélectionné pour sa meilleure tolérance au stress abio-
tique (salin et hydrique), originaire de Tunisie, et cultivar Arige, originaire de
Syrie, sensible pour les deux types de stress. L’aptitude androgénique a été éva-
luée chez les parents Ardhaoui et Arige et leurs hybrides (F1) par culture d’an-
thères in vitro. Le stade de mise en culture des anthères a été déterminé sur la
base de critères morphologique et cytologique. Les résultats montrent que la
capacité de régénération des cals diffère d’un génotype à un autre (de 50% chez
les hybrides à 40% chez le parent Arige). Suite aux résultats, il est important de
signaler que le taux d’albinisme observé est remarquable, il dépasse 70% sur-
tout chez le parent Ardhaoui ; il peut être expliqué par la combinaison de plu-
sieurs facteurs. Le contrôle systématique du niveau de ploïdie chez toutes les
plantes permet de constater que la majorité des plantules régénérées sont
diploïdes (70%).

Mots clés : orge Ardhaoui - culture d’anthères - lignées tolérantes - stress abio-
tique.

Abstract.- The study aims the creation of the pure barley variety, tolerant to the
abiotic stress by anther culture. This study was concerned two variety of barley:
cultivar Ardhaoui, selected for their best tolerance to the abiotic stress (salt and
drought) collected from Tunisia, and cultivar Arige, from Syria, sensitive for the
two types of stress. The androgenic aptitude was evaluated in the parents
(Ardhaoui and Arige) and their hybrids (F1) by anther culture. The stage of set-
ting in anther culture was given on the basis of morphological and cytological cri-
teria. The result shows that the capacity of regeneration of cal differs from a
genotype with another (it varies from 50% at the hybrids with 40% in the parent
Arige). Following the results, it is important to announce that the rate of albinism
which we observed is height, it especially exceeds 70% from Ardhaoui; it can be
explained by the combination of several factors. Finally we can deduced that the
majority of the regenerated planted are diploid (70%).

Key words : barley Ardhaoui - anther culture - tolerant varieties - abiotic stress.
446

I. INTRODUCTION

L’orge (Hordeum vulgare L.) est une des plus importantes cultures céréalières à l’échelle
mondiale, sa production étant estimée à 137 MT. Elle représente 15% de la consommation
mondiale de céréales, devancée uniquement par le blé, le riz et le maïs. Comme pour toutes
les céréales cultivées, de nombreuses contraintes (insectes, champignons, virus, stress
hydrique, stress salin, etc.) connues peuvent limiter la production. Parmi celles-ci, le stress
représente une contrainte particulièrement importante pour les producteurs. Un moyen de
lutte efficace et durable contre cette contrainte serait la création de cultivars offrant une
plus grande résistance à la salinité et la sécheresse. Malheureusement, les génotypes
d’orge qui offrent le plus de résistance sont très peu agronomiques et cette résistance repo-
se sur plusieurs gènes (Mesfin et al., 2003). Cependant, la création de variétés tolérantes
ou résistantes dotées de bonnes caractéristiques agronomiques peut nécessiter plusieurs
cycles de sélection, chacun débutant avec un croisement et se terminant avec la sélection
des descendants les plus performants. Ce processus exige de nombreuses années d’efforts
car, avant de pouvoir sélectionner les descendants les plus performants, il faut assurer la
fixation du bagage génétique des progénitures au cours de plusieurs autofécondations suc-
cessives (Bonjean, 1995). Partant de ce constat, il devient important pour le sélectionneur
d`utiliser les voies et moyens possibles pour réduire la durée du cycle de sélection.
L’haplodiploïdisation (production de plantes haploïdes doublées) permet de réduire de
deux à trois ans la durée d’un cycle de sélection chez l’orge et, à ce titre, constitue un outil
des plus précieux. Elle permet d`obtenir des lignées homozygotes en un temps très court
(moins d’un an). Bien qu’il existe diverses techniques permettant de produire des
haploïdes doublés chez l’orge, la réponse des génotypes d’orge à la culture d’anthères varie
considérablement (Larsen et al., 1991 ; Luckett & Smithard, 1992) et il peut arriver qu’un
protocole développé pour un certain type d’orge ne soit pas très performant pour un autre
type. D`après Collins (1977), les principaux paramètres susceptibles d’influer sur la pro-
duction de plantes haploïdes en culture d’anthères sont les conditions de culture des
plantes mères, le génotype, le stade cytologique des microspores, l'environnement de cul-
ture des anthères et la composition des milieux de culture (le pH, le rapport auxine/cyto-
kine, les éléments nutritifs).

II. MATẾRIEL ET MẾTHODES

A. Matériel végétal
Deux accessions d’orge ont été choisies, cultivar Ardhaoui, collecté du Sud tunisien
(tolérant au stress salin et hydrique), et cultivar Arige (issu de Syrie), sensible aux deux
types de stress. L’aptitude androgénique a été évaluée chez les parents (Ardhaoui et Arige)
et leurs hybrides F1

B. Dispositif expérimental
Les fruits (caryopses) des différentes populations (parents et hybrides) sont semés dans
des pots de 15 cm, sous conditions contrôlés (16 h photopériode, 10-15 °C de températu-
re) dans une serre plastique.
 447

C. Prélèvement des épis et mise en incubation Tableau I.- Composition du

Le stade de mise en culture des anthères a été déterminé milieu d’induction.
sur la base de critères morphologique et cytologique : Table I.- Composition of
induction medium.
- critère morphologique : au moment des prélèvements, composants Concentration (mg/L)
les épis d’orge pour lesquels la distance de flagelles (lon-
gueur des filaments en tête de l’épi) est comprise entre 2- Macro éléments
4 cm ont été retenus pour la culture de leurs anthères ; KNO3 1.900
NH4NO3 165
- critère cytologique : quelques anthères prélevées sur des KH PO 170
2 4
fleurs situées au centre de chaque épi ont été posées sur MgSO4, 7 H2O 370
une lame dans une goutte de carmin acétique à 0.5% ; les CaCl2, 2 H2O 440
microspores ainsi extraites ont été recouvertes d’une FeNaEDTA 40

lamelle puis observées au microscope ; seuls les épis qui Micro éléments
renfermaient majoritairement des microspores au stade MnSO4, 5 H2O 22.3
uninucléé moyen ont été retenus pour la mise en incuba- H3BO3 6.2
ZnSO4, 7 H2O 8.6
tion de leurs anthères. CoCl , 5 H O 0.025
2 2
CuSO4, 5 H2O 0.025
D. Mise en culture d’anthères in vitro NaMoO4, 2 H2O 0.25
Les épis ont été d’abord désinfectés par l’éthanol 75%. Organique
Pour des raisons d’homogénéité, les deux épillets de la base Maltose 62
de l’épi et les deux épillets du sommet de l’épi ont été éli- Glutamine 730
minés, seules les anthères des épillets localisées au centre Myo- Inositol
Thiamine HCL
100
0.4
de chaque épi ont été prélevées. Hormones
Chaque quarante cinq anthères sont déposées dans une BAP 1
boîte de Petri de 3 cm contenant 1.5 ml de milieu d’induc- pH 5.6
tion puis mises pendant quatre semaines à l’obscurité à
25 °C. La composition du milieu d’induction est donnée
Tableau II.- Composition de
dans le tableau I. milieu de régénération
Après une trentaine de jours d’incubation, des cals et des (ICARDA).
embryons de différentes tailles sont transférés dans un Table II.- Composition of
milieu de régénération (Tableau II) à raison de trente struc- regeneration medium.
tures en moyenne par boite de Petri de 100 x 20 mm puis composants Concentration (mg/l)
mises en incubation en chambre de culture à 25 °C sous une
CaCl2, 2 H2O 440
photopériode de 16 h. MgSO , 7 H O 370
4 2
FeSO4, 7 H2O 27,85
E. Acclimatation Na2EDTA 37,25
Les plantules chlorophylliennes enracinées ont été trans- KNO3 1900
KH2PO4 170
férées en petits pots de 5 cm de diamètre (2/3 sable et 1/3 NH4NO3 164
terreau) et placées à 25 °C pendant dix jours. MnSO4, H2O 40
COCl2, 6 H2O 0,25
H3BO3 7,5
F. Dénombrement et doublement chromosomique ZnSO4, 7 H2O 10
Les racines ont été nettoyées puis lavées à l’eau couran- CUSO4, 5 H2O 0,25
te. Les extrémités racinaires ont été coupées à 1 centimètre KI 2,5
puis trempées pendant quatre heures à température ambian- BAP 0,8
Myo Inositol 100
te dans une solution de colchicine 0.2%, qui a pour effet de Glutamine 800
bloquer les divisions mitotiques au stade métaphase. Les Thiamine 0,4
plantules ainsi traitées continuaient le cycle d’acclimata- Maltose 36000
Pheta-gel 700
tion. Agar 3000
pH 5.9
448

III. RẾSULTATS

A. Capacité d’induction d’embryoïdes androgéniques

Lors de la mise en culture de 500 anthères par génotype, l’observation de quelques
anthères prélevées sur des fleurs situées au milieu de chaque épi a montré que la majorité
des microspores était au stade uninucléé précoce et surtout moyen, les fleurs d’un épi ne
présentent pas forcément le même stade d’évolution des microspores ; le stade qu’on déter-
mine n’est qu’un stade moyen.
Au terme de la quatrième semaine d’incubation à 25 °C et à l’obscurité, des embryoïdes
ont été formés sur les loges polliniques des anthères.

B .Capacité de régénération des cals

Les embryoïdes formés sur le milieu d’induction ont été transférés sur le milieu de régé-
nération à raison de trente structures par boîte. Ils vont évoluer en structures callogènes.
Nous avons pu noter que la capacité de régénération de ces cals diffère d’un génotype à un
autre (elle varie de 50% chez les hybrides à 40 chez le parent Arige ; Fig. 1).
Suite aux résultats, il est important de signaler que le taux d’albinisme que nous avons
observé est remarquable, il dépasse 70% surtout chez le parent Ardhaoui ; il peut être
expliqué par la combinaison de plusieurs facteurs : l’effet de génotype, les conditions de
culture des plantes et d’incubation (milieu de culture, température, photopériode...).
Le contrôle systématique du niveau de ploïdie chez toutes les plantes permet de consta-
ter que la majorité des plantules régénérées sont diploïdes (70%) : c’est une diploïdisation
spontanée. Pour les plantes haploïdes, un traitement à la colchicine (0.2%) additionnée de
quelques gouttes de tween 20 est nécessaire pour le doublement du nombre de chromo-
somes (Fig. 2).
Il s’avère, d’après cette étude, que la capacité de régénération de plantules vertes chez
les hybrides présente une nette supériorité par rapport à leurs parents.

IV. CONCLUSION ET DISCUSSION

La production de plantes haploïdes pour les génotypes jugés récalcitrants demeure un défi
de taille. Bien que dans le cadre de cette étude des résultats encourageants ont été obtenus
en ce qui concerne l’amélioration de la production de plantes vertes, il reste beaucoup à

Fig. 1.- À gauche : formation des embryoïdes dans le milieu d’induction ; au milieu : trans-
fert dans le milieu de régénération ; à droite : formation des plantules vertes.
Fig.1.- Left: formation of call embryos on induction medium; middle: transfer onto regenera-
tion medium; right: formation of green plants.
 449

Fig.2.- a : plants d’orge haploïdes en vue d’un traitement par la colchicine ; b : traitement
par la colchicine ; c : plants diploïdes après traitement par la colchicine.
Fig.2.- a: haploid barley plants prepared to be treated with colchicines; b: colchicines treat-
ment of haploid barley plants; c: diploid plants in soil after colchicines treatment.

faire. Certains génotypes restent toujours récalcitrants à l’androgenèse. Il a été observé

dans la littérature (Marchand et al., 2008) qu’en culture d’anthères le comportement récal-
citrant de certaines F1 en terme de régénération de plantes vertes reste fortement lié au
potentiel de production de leurs parents, d’où la nécessité d’intensifier les travaux d’opti-
misation. Cependant, il est important de signaler que le travail devient encore plus labo-
rieux quand il s’agit de produire à partir des génotypes récalcitrants un nombre assez élevé
de lignées HD.
Dans le cadre de cette étude, les génotypes (parents et hybrides) soumis à des conditions
de culture identiques ont répondu différemment à l’ensemble des paramètres androgé-
nique : on a observé une différence significative entre les deux génotypes Ardhaoui et
Arige pour la production de cals et la production de plantes vertes. Pour ce qui est des
variables embryon et plantes albinos, les tendances sont respectivement élevées. Le géno-
type Arige produit 17% de plantes vertes contre seulement 5% pour le génotype Ardhaoui
qui souffre d’un effet d’albinisme assez marqué. La diversité de réponse observée chez les
génotypes d’orge en culture d’anthères reste une question d’actualité qui a été abordée
dans la littérature (Hassawi, 2004 ; Jacquard et al., 2006). En effet, tous les travaux sur la
régénération haploïde confirment cette observation ; chez l’orge, Foroughi-Wehr & Friedt
(1984) ont mis en évidence une variabilité génétique de la réponse à l’androgenèse au sein
d’une soixantaine d’hybrides testés. Le même genre de variation a été observé sur 23
hybrides F1 de riz (Reiffers, 1998) et sur 75 cultivars de blé tendre (Foroughi-Wehr &
Friedt, 1984).
Suite aux résultats, il est important de signaler que le taux d’albinisme observé est
remarquable, tant chez les parents que chez les hybrides (taux moins élevé) ; par ailleurs,
l’androgenèse in vitro chez la majorité des graminées ( blé riz, triticale, avoine…) se heur-
te à un même obstacle qui est le taux particulièrement élevé d’albinisme et ou de défi-
ciences chlorophylliennes causés par des développements anormaux des chloroplastes
(Mouritzen & Holm, 1994).
Il s’avère que l’aptitude à l’androgenèse chez la plupart des graminées est sous la
dépendance de plusieurs facteurs environnementaux, allant des conditions de culture des
plantes mères donneuses d’anthères aux conditions de mises en incubation des anthères,
jusqu’à la production de plantules vertes : il est clair que la culture des plantes mères en
450

conditions contrôlées permet le contrôle précis de ces différents facteurs et par voie de
conséquence une meilleure reproductibilité des résultats. Certains auteurs ont pu constater
une meilleure réponse à l’androgenèse chez les plantes de blé tendre cultivées en serre que
celles maintenues au champ (Bonjean, 1995). D’autres auteurs, en revanche, trouvent le
contraire chez l’orge (Larsen et al., 1991), chez le triticale (Hassawi, 2004) et même chez
le blé tendre (Karsai et al., 1994). En conditions de serre, l’intensité lumineuse étant plus
faible en hiver qu’en été, le spectre lumineux est modifié, ce qui permet d’observer, durant
cette période, une réduction du nombre de talles, de la taille et de l’épaisseur des anthères.
Ces caractères entraînent une diminution de la vigueur de la plante mère suivie d’une dimi-
nution de la réponse androgénétique.

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