FARAUS GILLET RIGHINI SCHNEIDER Final

UE 6.
71 Projet en laboratoire 3ème année

CMI - L3SV BBM 2022-2023
Réduction du génome de Vibrio natriegens par

la méthode CRISPR utilisant l’enzyme
CRISPR/Cas9
Manon RIGHINI ; Emmie Gillet ; Emeline Faraüs ; Emma Schneider
Patrick Sobetzko
Cursus Master Ingénierie Biotechnologies en Microbiologie et Mngénierie Moléculaire

Université de lorraine - Faculté des Sciences et Technologies
Revue intermédiaire Année 2022/2023
Sommaire
I. REMERCIEMENTS ................................................................................................................. 4
II. TABLE DES ILLUSTRATIONS ......................................................................................... 5
III. ABREVIATIONS .................................................................................................................. 7
IV. INTRODUCTION ................................................................................................................. 8
1. Escherichia coli : une bactérie micro-usine ............................................................................. 8

2. Bactérie Vibrio............................................................................................................................ 9
a. Vibrio natriegens ................................................................................................................... 9
3. Méthode de délétion................................................................................................................. 10
a. Decouverte du système CRISPR ........................................................................................ 10
b. La protéine Cas9 .................................................................................................................. 11
c. Mécanisme de réparation .................................................................................................... 12
d. Application de la méthode de réparation homologue....................................................... 13
i. Le plasmide pSwap ............................................................................................................ 14
4. Différents mécanismes d’échange d’informations génétiques ............................................. 15

a. Clonage golden gate ............................................................................................................. 15
b. Transformation .................................................................................................................... 16
c. Conjugaison .......................................................................................................................... 18
V. PROBLEMATIQUE ............................................................................................................... 19
VI. ATTENTES CLIENTS ET OBJECTIFS .......................................................................... 21
VII. PRESENTATION DES TACHES ..................................................................................... 23
VIII. MATERIEL ET METHODES ....................................................................................... 25
1. Dilutions des amorces .............................................................................................................. 25

2. Réaction en chaîne par polymérase ....................................................................................... 25
3. Vérification des produits de PCR par électrophorèse sur gel ............................................. 25
4. Construction des fragments T1 .............................................................................................. 26
i. Construction des fragments ............................................................................................... 26
ii. Clonage dans le vecteur ..................................................................................................... 26
5. Construction des plasmides HAIB ......................................................................................... 27

i. Extraction des plasmides HAIB (mini-préparations) ........................................................ 27
ii. Golden Gate clonage avec l’enzyme BsaI ......................................................................... 27
6. Transformation ........................................................................................................................ 28
7. Extraction plasmidique (Mini-préparations) ........................................................................ 28
8. Création des plasmides pSwap à partir d’un clonage golden gate...................................... 28
Pour la réalisation du clonage, nous avons suivi le protocole suivant : ...................................... 28
9. Transformation ........................................................................................................................ 29
10. Conjugaison .......................................................................................................................... 30
11. PCR sur colonies .................................................................................................................. 31
12. Vérification des délétions .................................................................................................... 32
IX. RESULTATS/DISCUSSION .............................................................................................. 33
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1. Définition des gènes essentiels et des zones de délétions ...................................................... 33

2. Construction des séquences d’homologues, des cassettes et des amorces .......................... 35
3. Vérification et purification des produits de PCR ................................................................. 36
4. Vérification de la quantité d’ADN et de la pureté de l’ADN ............................................... 37
5. Créations des plasmides HAIB et T1 ..................................................................................... 38
6. Vérification de l’assemblage optimal des vecteurs HAIB et T1 .......................................... 39
7. Vérification de la quantité et de la pureté de l’ADN ............................................................ 43
8. Transformation et formation des plasmides pSwap ............................................................. 44
9. Conjugaison .............................................................................................................................. 45
10. Vérification de la réussite de nos délétions ........................................................................ 46
X. PERSPECTIVES ..................................................................................................................... 48
XI. GESTION DE PROJET ...................................................................................................... 50
1. Planification ............................................................................................................................. 50
2. Déroulement du projet ............................................................................................................ 51
XII. ANNEXES ............................................................................................................................ 53

XIII. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...................................................................... 55
XIV. REFERENCES ICONOGRAPHIQUES ....................................................................... 57
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I. Remerciements
Nous tenions à présenter nos sincères remerciements aux encadrants du CMI pour avoir mis en place
ce projet en laboratoire et tout particulièrement Monsieur Nicolas SOLER, directeur du cursus.
Nous remercions également notre tuteur, Patrick SOBETZKO pour nous avoir guidé tout au long de
ce projet que ce soit dans nos recherches ou dans nos démarches expérimentales sur ce sujet qui nous
était inconnu.
Un grand merci à Madame VARCIN qui nous a permis de mieux appréhender les articles scientifiques
et qui nous a donné un point de vue objectif sur notre maîtrise de l’anglais en vue de produire une
soutenance plus compréhensible de tous.
Enfin, nous remercions Monsieur Jean-François STRZYKALA, enseignant au sein de l’Université

de Lorraine, pour nous avoir aidé à planifier notre projet grâce à différentes méthodes et outils de
gestion.
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II. Table des illustrations
Figure 1 : Schéma représentant la division cellulaire chez la bactérie E. coli..................................... 8

Figure 2 : Chromosome de la bactérie Escherichia Coli. .................................................................... 8
Figure 3 : Chromosomes 1 et 2 de la bactérie Vibrio natriegens....................................................... 10
Figure 4 : Schéma représentant une séquence CRISPR. ................................................................... 11
Figure 5 : Schéma représentant une séquence CRISPR/Cas. ............................................................ 11
Figure 6 : Schéma représentant le mécanisme CRISPR/Cas9. .......................................................... 12
Figure 7 : Schéma représentant le système de réparation par recombinaison homologue site
spécifique. .......................................................................................................................................... 13
Figure 8 : Schéma représentant une vue d’ensemble de l’assemblage des 7 modules nécessaire à la
création du plasmide pSwap. ............................................................................................................. 14
Figure 9 : Schéma représentant le témoin du bon assemblage du plasmide pSwap : l’expression de la
voie de biosynthèse de la désoxyviolacéine. ..................................................................................... 14
Figure 10 : Schéma représentant la suppression du gène vioC entraînant la formation de
prodésoxyviolacéine après recombinaison. ....................................................................................... 15
Figure 11 : Séquence reconnue par l’enzyme de restriction et la localisation de la coupure sur chaque
brin d’ADN. ....................................................................................................................................... 16
Figure 12 : Schéma représentant le clonage Golden Gate. Dans un premier temps, les séquences sont
insérées dans le vecteur ici appelé « destination vector » (DV) porteur des sites de restriction type
BsaI. Les nucléotides coupés (NNNN) sont prédéfinis au moment de la conception du DV et les
extrémités cohésives résultantes permettent d’ordonner l’assemblage des fragments dans le « vector
assembled » (VA). Ce vecteur est le résultat de l’étape de coupure et de ligation qui se fait
simultanément et dont l’ordre dépend des nucléotides NNNN. ........................................................ 16
Figure 13 : Schéma représentant les deux types de transformation bactérienne. .............................. 17
Figure 14 : Schéma représentant la formation de nanopores suite à un choc thermique en milieu riche
en chlorure de calcium. ...................................................................................................................... 17
Figure 15 : Schéma représentant le mécanisme de conjugaison bactérienne. ................................... 18
Figure 16 : Principe du Golden Gate Clonage. .................................................................................. 29
Figure 17 : Délétion risquée Emeline (appelée délétion 1 Far) ......................................................... 33
Figure 18 : Délétion sécurisée Emma (appelée délétion 2 Far) ......................................................... 33
Figure 19 : Délétion sécurisée d’Emma (appelée délétion 1 Sch) ..................................................... 34
Figure 22 : Délétion risquée d’Emma (appelée délétion 2 Sch) ........................................................ 34
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Figure 20 : Délétion 2 risquée d'Emmie (appelée délétion 2 EM) .................................................... 34

Figure 21 : Délétion 1 risquée d'Emmie (appelée délétion 1 EM) .................................................... 34
Figure 23 : Délétion 4 sécurisée de Manon (appelée délétion 4 EM) ............................................... 35
Figure 24 : Délétion 3 sécurisée de Manon (appelée délétion 3 EM) ............................................... 35
Figure 25 : Résultats de l’électrophorèse des produits PCR pour les régions homologues des délétions
HA et HB 1 à 4 EM dans les puits de 2 à 9. ...................................................................................... 36
Figure 26 : Résultats de l'électrophorèse des produits PCR pour les régions homologues des délétions
HA 1, HA 2, HB 1 et HB 2 Far dans les puits respectivement de 2 à 5 et HA 1, HA 2, HB 1 et HB 2
Sch dans les puits respectivement de 6 à 9. ....................................................................................... 37
Figure 27 : Exemple de vecteur HAIB correctement assemblé ......................................................... 38
Figure 28 : Exemple de vecteur T1 correctement assemblé .............................................................. 38
Figure 29 : Résultats de l'électrophorèse des produits PCR des vecteurs HAIB régions 1 et 2 Sch et
des vecteurs T1 régions 1 et 2 Sch .................................................................................................... 40
Figure 30 : Résultats de l’électrophorèse des produits PCR des vecteurs T1 région 2 Sch et les vecteurs
HAIB régions 1 et 2 EM .................................................................................................................... 40
Figure 31 : Résultats de l’électrophorèse des produits PCR des vecteurs HAIB régions 1 et 2 Far et
des vecteurs T1 des régions 1 et 2 Far ............................................................................................... 41
Figure 32 : Résultats de l’électrophorèse des produits PCR des vecteurs T1 région 2 Far et T1 régions
1, 2, 3 et 4 EM ................................................................................................................................... 41
Figure 33 : Schéma représentant les résultats d’électrophorèse des produits PCR des vecteurs HAIB
régions 3 et 4 EM............................................................................................................................... 42
Figure 34 : Culture des bactéries E. Coli transformées avec le plasmide pSwap pour les délétions EM
........................................................................................................................................................... 44
Figure 35 : Culture des bactéries E. Coli transformée avec le plasmide pSwap pour les délétions Far
et Sch ................................................................................................................................................. 44
Figure 36 : Organisation des différents fragments de vecteur au sein du plasmide pSwap .............. 44
Figure 37 : Exemple de vecteur pSwap correctement assemblé........................................................ 45
Figure 38 : Gel d'électrophorèse des fragments de délétion des régions EM .................................... 46
Figure 39 : Gel d’électrophorèse pour les fragments de délétion des régions Far et Sch.................. 47
Figure 40 : Tableau représentant la matrice RACI du projet............................................................. 51
Figure 41 : Diagramme de Gantt global ............................................................................................ 51
Figure 42 : Diagramme de Gantt de la période expérimentale du projet........................................... 52
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III. Abréviations
Abréviation Signification
Cas CRISPR Associated Protein
CRISPR
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
DynAMic
Dynamique des Génomes et Adaptation Microbienne
E. coli
Escherichia coli
HA Homologie A
HAIB
Homologie A – Insert - Homologie B
HB
Homologie B
NHEJ
Non-Homologous End Joining
PAM
Protospacer-Adjacent Motif
PCR
Réaction en Chaîne par Polymérase
pSwap
Plasmide Swap
OriC Origine de réplication

OriT Origine de transfert
RACI
Responsible – Accountable – Consulted - Informed
RH
Recombinaison homologue
SMART Spécifique – Mesurable – Atteignable – Réaliste - Temporel

SSB
Single-Strand Binding
SWOT Strengths - Weaknesses - Opportunities - Threats

T4SS
Type IV Secretion System
V. natriegens Vibrio natriegens
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IV. Introduction
1. Escherichia coli : une bactérie micro-usine
Escherichia coli est une bactérie Gram négative appartenant à la famille des colibacilles qui a
été découverte par le bactériologiste austro-allemand Theodor Escherich. Elle représente 0,01% du
microbiote intestinal puisqu’elle est colonisatrice du tube digestif humain et des organismes à sang
chaud. Bien que la plupart de ces souches soient commensales et donc inoffensives pour l’homme,
certaines peuvent provoquer des intoxications alimentaires
ou des maladies graves telles que des méningites.
Cependant, l’occupation de cette niche permet d’empêcher
la colonisation par d’autres bactéries potentiellement
pathogènes, illustrant ainsi la notion de mutualisme.
De nos jours, E. coli est couramment utilisée en
laboratoire pour la réalisation de divers projets d’études.
Celle-ci est en effet facile à manipuler possédant un temps
de génération d’environ 20 minutes à 37°C en milieu riche.
Son cycle cellulaire, commun aux procaryotes (Figure 1),
consiste en une réplication de l’ADN puis à une division
cellulaire par fission. Le cycle de réplication de l'ADN est
un processus qui commence par l'ouverture du duplex
d'ADN médiée par DnaA au niveau du site d'origine
chromosomique oriC, ce processus étant commun à
Figure 1 : Schéma représentant la division
l’organisme de référence de ce projet, Vibrio natriegens. cellulaire chez la bactérie E. coli.
De plus, ayant été découverte il y a longtemps, son génome

a pu être entièrement séquencé en 1997 ; Il est caractérisé comme
étant circulaire à double brin et comprenant 4,6 millions de paires
de bases codant environ 4200 protéines. Des études ont montré que
son génome présente de nombreuses séquences d’insertion, ce qui
lui confère une certaine capacité d’adaptation lui permettant de
s’adapter à tous types d’expériences.
Figure 2 : Chromosome de la bactérie
Escherichia Coli.
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Escherichia coli présente un ensemble d’avantages pouvant être exploités en laboratoire. En effet,
elle peut être utilisée en tant que micro-usine, capable de produire rapidement et avec un minimum
d’énergie une grande variété de composés cibles. Elle est facilement modifiable et transformable,
permettant l’obtention de colonies entre 10 et 12 heures selon le milieu de culture utilisé. La
connaissance complète de son génome permet de savoir directement où insérer des séquences et
permet l’utilisation de plasmides d’expression particuliers pouvant réguler un ensemble de gènes. Des
études ont montré qu’il est possible de produire efficacement des dérivés récupérables directement à
partir du surnageant de la culture bactérienne en modifiant ses gènes et en testant différentes
combinaisons (Dubois et al. 2019). Les bactéries appartenant à la famille des Vibrio disposent
également de cette plasticité, et sont de plus en plus étudiées car elles sont considérées comme de
potentielles cibles pouvant remplacer Escherichia coli (Thoma et al. 2021).
2. Bactérie Vibrio
Les bactéries Vibrio sont des bacilles Gram négative appartenant à la famille des Vibrionaceae
qui dispose d’une grande mobilité grâce à la présence d’un ou plusieurs flagelles polaires. Parmi les
différentes souches de Vibrio, la plus connue est Vibrio cholerae en raison de son pouvoir pathogène
important. En effet, elle est responsable d’une maladie épidémique contagieuse chez l’Homme
appelée le choléra, qui est apparue au XVIème siècle. Cette pathologie touche principalement des
populations ayant une faible hygiène de l’eau, qui est le milieu de vie de cet organisme. Vibrio
cholerae possède un génome réparti sur deux chromosomes et sa pathogénicité est due au
bactériophage CTX qui lui a transmis un gène impliqué dans la production de toxines (Thoma et al.
2021). Cependant, ce caractère n’est pas commun à toutes les espèces de Vibrio.
A. VIBRIO NATRIEGENS
La bactérie principale de notre projet, Vibrio Natriegens, est un bacille capable de se

développer très rapidement, avec un temps de génération inférieur à 10 minutes seulement. Elle est
halophile, anaérobie facultative et a été isolée à partir d’éponges marines. De plus, contrairement à
d’autres espèces, elle n’est pas pathogène pour les humains et possède un génome entièrement
séquencé comprenant 2 chromosomes circulaires (Figure 3). De la même façon que E.coli, elle ne
présente qu’une seule origine de réplication qui dépend de la protéine DnaA (Lee et al. 2019).
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Figure 3 : Chromosomes 1 et 2 de la bactérie Vibrio natriegens.
Cette bactérie est actuellement beaucoup utilisée en laboratoire et présente un avenir

prometteur dans le domaine des biotechnologies. En effet, elle dispose de multiples avantages,
notamment son taux de croissance rapide. Elle est capable de se développer à partir de sources de
carbone peu coûteuses et possède la capacité de sécréter certains types de protéines dans son milieu
de culture (Thoma et al. 2021).
Cependant, elle présente également plusieurs caractéristiques qui l’empêchent de remplacer
Escherichia coli pour le moment. Possédant un génome riche, elle dispose d’un grand nombre
d’enzymes et de métabolites qui peuvent interagir de différentes manières entre eux. Cela peut être
problématique dans le cas où ces composants interagissent avec les produits des gènes provenant d’un
clonage ou d’une régulation spécifique. Pourtant, grâce aux avancés en biotechnologies, il serait
possible de réduire le génome de cette bactérie, le rendant moins complexe, afin que Vibrio natriegens
dépasse Escherichia coli en termes de plasticité, d’efficacité de clonage et de rapidité de croissance.
Pour ce faire, la méthode actuelle la plus envisageable est CRISPR qui est un système permettant la
délétion de régions allant d’un gène à des centaines (Lee et al. 2019 ; Thoma et al. 2021).
3. Méthode de délétion
A. DECOUVERTE DU SYSTEME CRISPR
C’est en 1987 que les premières séquences palindromiques répétées ont été découvertes chez
l’organisme E. coli. Cependant, à cette époque, les chercheurs ne se doutaient pas du rôle que
pouvaient jouer ces régions dans les organismes procaryotes. Il a fallu attendre de nombreuses années
avant de prétendre, pour la première fois, que ces séquences ont une potentielle implication dans
l’immunité des bactéries cherchant à se protéger des infections virales.
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Le système est composé de séquences spécifiques (Figure 4) que l’on appelle des palindromes, qui
sont des séquences de 20 à 50 paires de bases intercalées par des Spacers, séquences de 20 à 58 paires
de bases qui sont toutes différentes les unes des autres.
Figure 4 : Schéma représentant une séquence CRISPR.
En analysant ces séquences Spacers, les chercheurs ont remarqué que ces séquences provenaient de
bactériophages, prouvant ainsi l’appartenance de ce mécanisme au système immunitaire procaryote,
analogue de l’immunité adaptative de l’homme.
En amont de ces séquences, des gènes nommés Cas pour Crispr Associated (Figure 5) ont été
identifiés. Ils possèdent 2 fonctions distinctes : ce sont des hélicases, enzymes capables d’induire
l’ouverture de l’ADN double brin, et des nucléases, pouvant créer des cassures au niveau de l’ADN.
Figure 5 : Schéma représentant une séquence CRISPR/Cas.
B. LA PROTEINE CAS9
C’est seulement en 2012 que le mécanisme CRISPR/Cas9, une méthode de modification de

l’ADN multi-fonctionnelle, a été découvert chez Streptococcus pyogenes. Révélé par J. DOUDNA et
E. CHARPENTIER, ce système utilise l’endonucléase Cas9 retrouvée naturellement dans le système
de résistance de certaines bactéries.
Contrairement à d'autres méthodes, cette endonucléase n'a pas de spécificité de séquence
d'ADN. En effet, la spécificité est médiée par deux ARNs non-codants : un crARN contenant des
séquences guides des nucléases et un tracARN transactivateur complémentaire à la séquence répétée.
Ceci forme un complexe que l’on désigne d'ARN guide spécifique étant complémentaire de la
séquence cible. Cette chimère de ces deux ARNs est utilisée comme outil de génie génétique afin de
modifier des séquences d’ADN. De ce fait, les sites cibles ne sont finalement limités que par un motif
PAM (Protospacer-Adjacent Motif) localisé à l’extrémité 5’ (Figure 6 ).
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Figure 6 : Schéma représentant le mécanisme CRISPR/Cas9.
L’enzyme Cas9 possède 2 domaines enzymatiques : un domaine HNH permettant de cliver la

séquence d’ADN complémentaire qui s’associe avec l’ARN guide et un domaine appelé RuvC1 qui
clive la séquence non complémentaire. Initialement un mécanisme de défense chez les bactéries,
lorsqu’un virus envahit une cellule pour la deuxième fois, le double brin d’ADN permet de
reconnaître l’ARN viral comme étranger recrutant ainsi l’enzyme Cas9. L’endonucléase va alors
permettre de casser l’ADN double brin du virus provoquant le silence du gène viral. Cette méthode
est largement utilisée de nos jours en raison de sa simplicité. Modifié, le système Cas9 a été conçu de
telle façon qu'il soit possible de réaliser des délétions ou bien des insertions. Les étapes de base de la
modification de génome chez les bactéries consistent à l'introduction de l'ADN modèle sous forme
de plasmides simple ou double brin, et à son intégration dans le chromosome de la souche d'intérêt
par recombinaison homologue (RH).
C. MECANISME DE REPARATION
Une fois que l’ARN guide a mené la protéine Cas9 jusqu’à la séquence cible, celle-ci va cliver
l’ADN. Mais pour que la cellule reste viable, la cassure créer doit être réparée.
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Dans certains cas, des séquences homologues peuvent

se trouver à proximité de la séquence ayant été modifiée.
Ainsi, par recombinaison homologue site spécifique, une voie
de réparation de l’ADN visant à protéger le génome est
activée permettant d’échanger les séquences nucléotidiques
entre les deux molécules d’ADN similaires. Les protéines qui
tiennent le rôle principal dans ce processus de recombinaison
sont appelées les recombinases. Elles sont présentes chez
toutes les espèces, il s’agit de la protéine RecA chez la
bactérie Escherichia coli. La recombinaison site spécifique
est une réaction qui implique des séquences particulières,
l’événement d’échange de brin se produit entre des segments
Figure 7 : Schéma représentant le système de
réparation par recombinaison homologue site qui n’ont qu’une homologie de séquence limitée. Cette
spécifique.
recombinaison localisée passe par des mécanismes de
recombinaison utilisant obligatoirement des ADN double brin circulaires (Figure 7). Pour autant, la
recombinaison homologue est un processus considéré comme imparfait. Bien que ce mécanisme
favorise le maintien de la stabilité du génome il peut générer une instabilité génétique. Pour limiter
l'excès de recombinaisons homologues, ce mécanisme est régulé et ne peut avoir lieu que durant la
phase de synthèse.
D. APPLICATION DE LA METHODE DE REPARATION HOMOLOGUE
Certaines méthodes basées sur CRISPR/Cas9 peuvent utiliser des systèmes de cicatrisation ou
encore des marqueurs spécifiques. Dans le cadre de ce projet, c'est CRIPSR SWAP qui est utilisé. La
particularité de ce système est qu'il ne comprend ni cicatrisation ni marqueur et qu'il permet des
délétions à grande échelle. Pour appliquer la recombinaison homologue au système CRISPR, un
plasmide que l’on nomme pSwap est produit, de façon à introduire les informations nécessaires au
bon fonctionnement du mécanisme dans la souche bactérienne et que celui-ci soit spécifique de la
région sélectionnée.
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i. Le plasmide pSwap
Le plasmide pSwap (Figure 10) est un plasmide qui

est créé à partir de la combinaison de plusieurs plasmides
disposant d’informations différentes nécessaires au bon
fonctionnement du mécanisme.
La principale information est la partie qui confère la

spécificité à ce système. En effet, l’ARN guide est transféré
grâce aux plasmides T1 et T2 porteurs de cassettes
d’expression. Le plasmide T1 dispose de la région permettant
la reconnaissance, formé de 23 nucléotides incluant le motif
PAM à l’extrémité 5’. La seconde information provient du
Figure 8 : Schéma représentant une vue d’ensemble de
vecteur HAIB qui est porteur des régions HA et HB bornant l’assemblage des 7 modules nécessaire à la création du
plasmide pSwap.
la région où une délétion / insertion peut être réalisée. Ces
régions permettront la recombinaison homologue empêchant ainsi les mécanismes de réparation
NHEJ. Ce sont les régions dites variables de ce module.
Suite à la combinaison de ces informations à partir d’un clonage Golden Gate, le plasmide
pSwap est formé, porteur des différents fragments. Ceux-ci sont disposés dans un ordre précis pour
permettre la création d’une voie métabolique de la désoxyviolaceine (Figure 11).
Figure 9 : Schéma représentant le témoin du bon

assemblage du plasmide pSwap : l’expression de la voie de
biosynthèse de la désoxyviolacéine.
La couleur de la colonie représente le système de sélection multicolore. Les cellules vont

passer du violet au vert après les différents événements. Les cellules porteuses du vecteur pSwap
correctement assemblé sont de couleur violette. Celles qui ont effectué correctement la restriction et
la recombinaison homologue sont de couleur verte (Figure 12).
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Figure 10 : Schéma représentant la suppression du gène vioC entraînant

la formation de prodésoxyviolacéine après recombinaison.
Au sein de ce système, on retrouve donc une sélection multicolore permettant d'éliminer les
erreurs d'assemblage dans les différentes étapes pour aboutir à la modification du génome.
La bactérie E. coli est considérée comme un hôte intermédiaire de ce vecteur. Elle va à la fois
permettre de former le vecteur pSwap grâce à la transformation qu’elle subit à partir des différents
modules et de partager ce vecteur à la souche cible Vibrio natriegens. Pour ce faire, une étape de
conjugaison est nécessaire permettant de mener à bien la méthode de CRISPR/Cas9 sur le
chromosome ciblé par la région sélectionnée pour la délétion.
4. Différents mécanismes d’échange d’informations génétiques
A. CLONAGE GOLDEN GATE
Pour assembler les différents fragments d’un plasmide Pswap il est possible d’utiliser le clonage
Golden Gate (GG). Le GG est une méthode de clonage moléculaire qui permet d'assembler
rapidement et efficacement dans le but de créer des vecteurs recombinants complexes pouvant
comporter plusieurs gènes, des promoteurs, des terminateurs ou encore des étiquettes20. Pour le
clonage GG, les enzymes de restriction et de ligature sont utilisées de manière séquentielle pour
assembler les fragments d'ADN dans un vecteur d'expression. Les fragments d'ADN sont alors clonés
en utilisant une série de réactions de coupure et de ligature, où les fragments sont assemblés en
tandem. Pour le clonage GG, ce sont les enzymes de restrictions coupant hors du site de
reconnaissance qui sont utilisées comme par exemple Bbs1, Esp3I ou encore Bsa1 (Figure 13).
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Figure 11 : Séquence reconnue par l’enzyme de restriction et la localisation de la coupure sur chaque brin d’ADN.
Cela permet, en utilisant des vecteurs de clonage porteurs des sites de restrictions de ces enzymes, de
créer des extrémités cohésives spécifiques pour permettre de cloner, par la suite, dans un ordre précis
différents fragments en une seule étape. Bien entendu, il faut prendre en compte que la technique peut
prendre du temps (généralement en 3h et 5h) de manière à optimiser les résultats (Figure 14)
Figure 12 : Schéma représentant le clonage Golden Gate. Dans un premier temps, les
séquences sont insérées dans le vecteur ici appelé « destination vector » (DV) porteur des
sites de restriction type BsaI. Les nucléotides coupés (NNNN) sont prédéfinis au moment de
la conception du DV et les extrémités cohésives résultantes permettent d’ordonner
l’assemblage des fragments dans le « vector assembled » (VA). Ce vecteur est le résultat de
l’étape de coupure et de ligation qui se fait simultanément et dont l’ordre dépend des
nucléotides NNNN.
B. TRANSFORMATION
Dans ce projet, la transformation va nous être utile afin d’obtenir des souches de E.coli
possédant des régions d’intérêt spécifiques que nous décrirons par la suite (HAHB). La
transformation, qui constitue un type de transfert horizontal, est une technique permettant un transfert
génétique entre plusieurs bactéries à condition que la receveuse soit compétente. En effet, celle-ci
doit être capable d’incorporer de l’ADN libre dans son environnement. Cette compétence peut être
naturelle chez certaines souches de bactéries mais elle peut être aussi artificielle et avoir été acquise
après certains traitements en laboratoire.
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La transformation permet à l’organisme receveur de capter du matériel génétique provenant

d’une bactérie morte (à l’inverse de la conjugaison bactérienne) et va donc entraîner des
recombinaisons génétiques dans le génome, c’est ce qui contribue à l’évolution des espèces. Deux
types de transformations sont possibles : la méthode chimique (connue aussi sous le nom de choc
thermique) ou la technique d’électroporation (Figure 13).
Figure 13 : Schéma représentant les deux types de transformation bactérienne.
La transformation par électroporation est une technique dans laquelle un champ électrique
contrôlé est appliqué aux cellules vivantes afin de perméabiliser la membrane cellulaire et ainsi
d’améliorer l’absorption de l’ADN. En laboratoire, la méthode du choc thermique est beaucoup
utilisée. Elle nécessite un milieu riche en chlorure de calcium qui va permettre de contrer la répulsion
électrostatique entre la membrane cellulaire de la bactérie et l’ADN plasmidique. De plus,
l’augmentation de température entraîne la formation de nanopores réversibles au sein de la membrane
plasmique ce qui va favoriser l’entrée de l’ADN plasmidique dans la cellule (Figure 14).
Figure 14 : Schéma représentant la formation de nanopores

suite à un choc thermique en milieu riche en chlorure de
calcium.
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C. CONJUGAISON
La conjugaison est un processus permettant le transfert d’ADN d’une bactérie à une autre par
contact direct. Celle-ci est très utilisée dans le but de conférer à un organisme des gènes de résistance
à un antibiotique afin de procéder à des étapes de sélection positive. Cependant, ces transferts ont de
nombreuses conséquences dont l’apparition et la multiplication de bactéries multirésistantes ce qui
rend les traitements de certaines maladies plus difficiles. Ici, cette méthode permettra la transmission
d’ADN plasmidique entre notre bactérie donneuse, Escherichia coli, avec notre bactérie receveuse,
Vibrio cholerae, via des pili sexuels.
Le transfert du plasmide conjugatif se déroule en différentes étapes résumées dans la figure ci-dessous
(Figure 15). La première étape est la coupure simple brin dans une oriT (Origine de Transfert) par
une relaxase qui va se lier de manière covalente à l’extrémité 5’ de l’ADN, c’est ce que l’on appelle
le brin T-strand. D’autres protéines vont ensuite s’associer à cette relaxase pour former le complexe
du relaxosome qui permet de libérer le T-strand de l’ADN. Une protéine de couplage met en contact
la relaxase avec le pore de conjugaison (T4SS). Le T4SS (Type IV Secretion System) déplie la relaxase
et la fait passer à travers ce pore tout comme le T-strand. Dans la bactérie réceptrice, la protéine SSB
(Single Strand Binding protein) se fixe sur l’ADN simple brin et le protège des DNases ; la relaxase
se replie, catalyse la circularisation du T-strand et initie la réplication pour obtenir le facteur F double
brin. Dans la bactérie donneuse, le brin complémentaire du facteur F est synthétisé par réplication en
cercle roulant.
Figure 15 : Schéma représentant le mécanisme de conjugaison bactérienne.
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V. Problématique
Le choix des souches bactériennes utilisées dans les expériences scientifiques est crucial pour
assurer la réussite des projets de recherche. Actuellement, Escherichia coli est l'une des bactéries les
plus utilisées en raison de ses nombreux avantages, notamment la connaissance complète de son
génome et sa grande disponibilité en tant que modèle d'étude. Cependant, Vibrio natriegens est une
bactérie émergente et prometteuse pour la recherche scientifique en raison de sa capacité de
croissance rapide, qui permettrait d'accélérer le rythme des expériences. Toutefois, la présence d’une
plus grande quantité de matériel génétique dans cette bactérie peut rendre certaines expériences plus
complexes. En effet, un nombre important d’enzymes et de métabolites sont donc produits, pouvant
potentiellement interagir avec les composants résultants lors d’études génétiques au sein de cet
organisme. Ainsi, nous avons cherché à réduire au maximum le génome de Vibrio natriegens en
éliminant les gènes jugés non essentiels pour améliorer son utilisation en tant que modèle d'étude
scientifique.
La méthode choisie pour obtenir un génome réduit est la suppression de gènes. Cette technique
consiste à déléter sélectivement des gènes en utilisant des outils tel que le système CRISPR/Cas9.
Dans cette approche, CRISPR/Cas9 est utilisé pour couper de manière précise le brin d'ADN cible à
un endroit spécifique. En utilisant E. coli comme hôte intermédiaire, nous cherchons à créer un
vecteur porteur de différents modules comprenant les cassettes d’expression de l’ARN guide et les
séquences HAHB qui vont permettre d’empêcher le système de réparation NHEJ. Une fois ce vecteur
assemblé, il sera transféré à la souche Vibrio natriegens par conjugaison. La cellule utilise alors ce
vecteur pour réparer la coupure de l'ADN, en insérant la séquence comprise entre les deux séquences
homologues dans le génome à la place de la région de l'ADN ayant été clivée.
Une liste regroupant un ensemble d’études portant sur des régions de vingt nucléotides nous a été
transmis par notre tuteur dans le but d’émettre des hypothèses quant à la nécessité de tous les gènes
contenus dans les chromosomes I et II de Vibrio natriegens. Grâce aux données, nous avons calculé
leur fitness pour déterminer s'ils étaient essentiels ou non au développement et à la survie de nos
souches, et donc si nous pouvions les supprimer.
En vue de produire nos vecteurs pSwap porteurs des sites de recombinaison homologue, la
méthode de clonage dans un hôte intermédiaire nous a été proposée, étant considérée comme la plus
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efficace. Pour améliorer nos chances de succès dans la production de plasmides complets, nous allons
procéder en deux étapes. Dans un premier temps, créer le vecteur pSwap puis l’introduire, dans le but
qu’il soit utilisé dans la souche d’intérêt. Pour la réalisation du clonage, ce sont les enzymes de
restriction BsaI qui ont été sélectionnées par le client et fournies dans des documents SnapGene utiles
à la production des amorces des régions ciblées.
Enfin, pour la conception des amorces, deux sont nécessaires pour amplifier les homologues (HA
et HB) de chaque région. De ce fait, 32 oligonucléotides sont demandés au total pour les huit délétions
et 16 pour la construction des ARNs guides porteurs du motif PAM. En définitive, 48 amorces sont
à fournir qui serviront à l’amplification des régions en amont et en aval des huit délétions demandées.
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VI. Attentes clients et objectifs
Le client principal de ce projet est le laboratoire DynAMic dont la thématique de recherche se

base sur les mécanismes d’évolution rapide chez les bactéries et en particulier les groupes de
streptomycètes et de streptocoques.
Comme déjà évoqué, Escherichia Coli est la bactérie la plus utilisée en laboratoire du fait de sa
facilité de manipulation mais celle-ci n’est pas totalement optimale. De ce fait, l’idée est de prendre
un organisme ayant de meilleurs atouts telle qu’une souche particulière de Vibrio appelée Vibrio
natriegens, intéressante car son temps de génération est deux fois plus faible que celui de E. coli.
Cependant, son génome présente un trop grand nombre d’informations génétiques donc l’objectif est
de le réduire un maximum afin de ne garder que les régions utiles. La stratégie choisie afin de réduire
son génome est la technique CRISPR/Cas9.
Nous avons donc testé des régions potentielles pouvant être délétées qui n’ont encore jamais été
testées auparavant. Néanmoins, nous ne pouvons pas tester toutes les régions possibles donc, si nos
expérimentations fonctionnent, l’organisme que l’on va obtenir ne sera pas le plus optimal à utiliser
en laboratoire mais il constituera un intermédiaire pour la suite de cette étude.
Notre client nous a fourni un document Excel dans lequel des petites séquences de 20 paires de
bases ont été testées. Il présente pour chacune des valeurs fitness correspondant au développement
des bactéries en fonction du temps afin de savoir si elles arrivent à survivre après la délétion. Si la
valeur diminue, le gène correspondant est donc considéré comme essentiel à son développement et
ne peut donc pas être délété mais si cette valeur reste constante, la délétion est supposée possible.
L’attente client est de choisir huit séquences différentes, nous avons donc réparti deux séquences
par personne au sein du groupe dont une correspond à une région dite sûre et une autre à une région
dite risquée. Cependant, nous ne prendrons pas de risques trop importants puisque le but est de
pouvoir réutiliser nos résultats par la suite alors nous devons maximiser nos chances de réussite pour
nos expérimentations.
Vibrio natriegens possède deux chromosomes circulaires donc nous avons choisi de
sélectionner quatre séquences au sein du chromosome 1 et quatre autres dans le deuxième
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chromosome dans lequel il est intéressant de travailler. En effet, il possède moins de gènes essentiels
et celui-ci a moins été étudié donc ceci nous permet de réaliser des délétions plus grandes et de
s’assurer qu’elles n’ont pas déjà été testées.
Si nos expériences ne fonctionnent pas et que nous n’arrivons pas à obtenir les résultats
escomptés, différentes stratégies sont possibles pour les personnes qui continueront le projet. Pour les
grandes régions délétées, l’idée serait de les diviser en deux et de répéter la même expérience jusqu’à
déterminer le gène à l’origine de la mort des cellules. Cependant, cette technique demande trop de
temps dans le cadre de ce projet. La deuxième technique serait de sélectionner une région de taille
importante comprenant des gènes ne respectant pas les normes fixées puis de réaliser des délétions
des régions antérieures à ces gènes. L’avantage de cette stratégie est que toutes ces étapes peuvent
être réalisées en parallèle donc cela permet un gain de temps important dans un tel projet mais elle
peut constituer une perte d’argent pour le client puisque si la délétion la plus grande fonctionne, alors
toutes les autres deviennent inutiles.
Les attentes demandées par le client doivent être respectées dans un temps imparti : les
expérimentations commencent à partir du 22 mars 2023 et se terminent le 31 mars 2023 donc
l’organisation de nos séances au laboratoire doit être optimale. Nous allons donc réaliser nos
différents tests en parallèle par chacun des membres du groupe. De plus, il y a d’autres contraintes
auxquelles nous devons faire face comme la commande des primers qui doit être faite au minimum
dix jours avant notre premier jour d’expérimentation car nous devons prendre en compte le temps de
livraison et les éventuels problèmes qui pourraient survenir lors de leur conception.
Enfin, nous devons respecter les jalons qui ont été définis, d’organiser nos expérimentations et
protocoles afin d’optimiser nos séances et de s’assurer que nous aurons tout le matériel nécessaire à
notre disposition au laboratoire.
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VII. Présentation des tâches
Tout d’abord, nous avons commencé par obtenir des informations à partir de sources scientifiques
fiables, telles que des revues scientifiques et des publications. Cette première étape nous a permis de
comprendre le sujet et de recueillir des données qui nous ont été bénéfiques pour la réalisation de ce
projet. Ensuite, nous avons pu élaborer une stratégie afin d’aborder notre problématique et la demande
de notre client.
Nous avons utilisé les études précédentes à ce sujet pour analyser les gènes présents sur les
chromosomes de la bactérie de référence de ce projet, Vibrio natriegens. Après un examen minutieux
des données, nous avons pu émettre des hypothèses sur les gènes qui sont essentiels ou non pour le
développement de la bactérie. Pour tester cela, nous avons choisi de faire huit délétions dans son
génome, deux par membre du groupe.
Pour ce faire, nous prévoyons de faire du clonage, ce qui implique plusieurs étapes importantes.
Tout d'abord, nous devons réaliser une extraction de l'ADN des souches Vibrio natriegens, puis nous
devons insérer les fragments d'ADN codant l'ARN guide et les séquences homologues dans un
plasmide qui servira de vecteur. Ensuite, nous devrons introduire ce vecteur dans une bactérie
intermédiaire pour l'amplifier. Enfin, il faudra provoquer la conjugaison entre les souches
d'amplification et les bactéries ciblées par contact physique.
Il nous faut donc construire huit vecteurs de recombinaison homologue. Pour réaliser ces
délétions, nous devons trouver un encadrement de la séquence que nous souhaitons retirer. Ces
bornes, dont la première se trouve en amont de la séquence à supprimer et la seconde constituant la
fin de celle-ci, forment les séquences homologues contenues dans le vecteur. Nous avons utilisé le
logiciel Snapgene pour les concevoir.
Nous utilisons une technique appelée Réaction en Chaîne par Polymérase (PCR) pour amplifier
nos séquences homologues, et cette méthode requiert l'utilisation d'oligonucléotides dont les
séquences ont été déterminées lors de nos séances de bio-informatique.
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Nous avons choisi de transfecter les souches d’Escherichia coli MDFpir qui possède un système
de transfert RP4 qui donne la possibilité de réaliser la transmission d'ADN par conjugaison, ce qui
permet d'éviter la réalisation d'une étape d'extraction supplémentaire.
Dans le but d'induire la conjugaison entre nos deux souches bactériennes, nous allons les faire
croître dans une même boîte de pétri. Ensuite, nous effectuerons une double sélection positive. Tout
d'abord, nous allons réaliser une sélection par auxotrophie afin d'empêcher la prolifération des
bactéries d'amplification. Ensuite, nous effectuerons une sélection par couleur pour isoler uniquement
les bactéries dans lesquelles la suppression a eu lieu. En effet, les souches de Vibrio natriegens qui
auront récupéré le plasmide pSwap avec les fragments dans le bon ordre seront de couleur violette et
les souches pour lesquelles la délétion aura fonctionné seront de couleur verte.
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VIII. Matériel et méthodes

1. Dilutions des amorces
La première étape est de diluer les tubes des amorces que nous avions commandé afin d’obtenir une
concentration environ égale à une concentration correspondant à 100µM. Pour cela, nous avons
regardé la concentration indiquée sur les tubes correspondants (indiquée en nM) et ajouté un volume
d’eau stérile dix fois supérieur à celle-ci (en µL).
Une deuxième dilution est réalisée en prenant 10µL de la solution standard à 100µM auquel est ajouté
90µL d’eau afin d’obtenir une concentration finale de 10µM.
2. Réaction en chaîne par polymérase
La PCR a été réalisée dans le but d’amplifier les régions HA et HB de chaque délétion. Pour ce faire,
nous avons préparé 16 tubes puisque nous avons 8 séquences possédant chacune une région HA et
une région HB avec 2 amorces différentes pour chaque. Pour faciliter la réalisation de la PCR, il est
nécessaire de préparer un Master Mix qui contient une quantité supérieure à celle requise pour nos
tubes (protocole en annexes). Le tampon utilisé est le Buffer 5X et l’ADN polymérase est la Q5
polymérase. Enfin, le Master Mix est réparti dans chaque tube et les amorces sont ajoutées en fonction
de la région à amplifier avec un volume de 0,5µL.
Une fois les tubes préparés, nous avons sélectionné les paramètres de la machine en fonction de la
nature et de la taille des amorces. La première étape est la dénaturation qui est réalisé pendant 30
secondes à une température de 98°C. Ensuite, la deuxième étape est l’hybridation à 61°C, température
choisie car elle correspond à la plus petite parmi les différentes amorces, pour une durée de 30
secondes. Enfin, la dernière étape est l’élongation réalisée à 72°C pendant 1 minute. En effet,
l’élongation s’effectue en 1 minute pour 1000 paires des bases et nos fragments d’intérêts sont tous
compris entre 500 et 900pb. La réaction est composée de 35 cycles, constitués des 3 étapes
précédentes, avec une dernière étape d’élongation à 72°C pendant 5 minutes.
3. Vérification des produits de PCR par électrophorèse sur gel
Le gel, constitué d’une solution de TBE10X, est coulé sur un support adéquat et deux peignes à 15
crans sont placés. Après séchage, 16 dépôts sont effectués. Au préalable, chaque tube doit contenir
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une goutte de Lade Buffer 6X qui permet une coloration de la solution afin de pouvoir observer la
migration sur le gel. Le volume à ajouter étant relativement faible (1/6 du volume final), il n’était pas
nécessaire de mesurer une quantité précise de cette solution. De plus, il permet de garder les produits
de PCR au fond des puits grâce à son haut poids moléculaire.
L’électrophorèse est réalisée dans un bain de TBE10X pendant 40 minutes à 100V.
4. Construction des fragments T1
i. Construction des fragments
Les différents fragments variables de T1 sont construits en suivant le protocole décrit dans le tableau
ci-dessous. Nous avons huit séquences différentes. De ce fait, nous avons 8 fragments T1 à préparer.
Pour ce faire, nous avons réalisé un Master Mix pour 9 tubes est réalisé afin de faciliter cette étape.
Composants Volume pour 1 tube (50uL) Volume pour 9 tubes (200uL)

Ligase Buffer 10X 5 45
H2O 44 396
Amorce sens 0,5 Dépend de chaque région
Amorce non-sens 0,5 Dépend de chaque région
Les tubes sont placés dans une machine pouvant contrôler sa température comme un thermocycleur.
Nous avons élevé la température à 98°C puis nous avons ajouté les tubes. Enfin, nous avons laissé
diminuer la température jusque 50°C en vue d’hybrider correctement les deux amorces T1 et de
réduire considérablement les risques d’erreurs.
ii. Clonage dans le vecteur
Une fois ces constructions terminées, le clonage de T1 est réalisé selon le protocole suivant avec une
nouvelle fois la préparation d’un Master Mix en amont.

Plasmide 1 9
Ligase (T4) 0,5 4,5
Enzyme de restriction (BsaI) 0,5 4,5
Fragment T1 1 9
H2O 15 135
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Le clonage s’effectue pendant une durée de 5 heures environ pour permettre au fragment et au vecteur
d’avoir le temps d’être coupé par l’enzyme de restriction BsaI et aux deux résultats de l’activité
d’endonucléase de l’enzyme de se lier entre eux grâce à la ligase.
5. Construction des plasmides HAIB
i. Extraction des plasmides HAIB (mini-préparations)
Après clonage des régions HA et HB, il est nécessaire d’extraire l’ADN des résultats de PCR. Pour
cela, des colonnes d’extraction sont utilisées. Ajouter à travers chaque colonne 500µL de tampon et
40µL des produits de PCR correspondants. Une centrifugation des tubes est réalisée pendant 1 minute
à 845G et le surnageant est vidé. Une nouvelle centrifugation a lieu suivant les mêmes paramètres
puis 30µL d’eau doivent être ajoutés dans les colonnes. Enfin, une dernière étape de centrifugation à
112G pendant 1 minute est réalisée. Une fois l’extraction terminée, une étape de Nanodrop est
réalisée, permettant d’obtenir les concentrations d’ADN de chaque échantillon pour chaque plasmide
HA et HB.
ii. Golden Gate clonage avec l’enzyme BsaI
De la même manière que pour les fragments T1, les fragments HAIB sont construits en fonction de
la concentration d’ADN mesurée et de la taille des différentes régions. Cette étape est réalisée
suivant le protocole résumé dans le tableau ci-dessous avec préparation d’un Master Mix en amont
pour limiter le nombre de manipulations.
Volume pour 9 tubes

Composants Volume pour 1 tube (20uL)
(180uL)
Buffer 10X 2 18
Plasmide 1,8 16,2
Ligase 0,5 4,5
Enzyme de
0,5 4,5
restriction (BsaI)
En fonction des En fonction des
Région HA
concentrations calculées concentrations calculées
En fonction des En fonction des
Région HB
concentrations calculées concentrations calculées
H2O 14,20 127,8
Le clonage s’effectue pendant une durée de 5 heures environ. Le clonage appliqué est le clonage
golden gate utilisant l’enzyme BsaI permettant de couper hors du site de reconnaissance. Il permet
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d’ordonner nos fragments dans HAIB selon la programmation des vecteurs qui avait été réalisée, en
amont, dans de précédentes études.
6. Transformation
Une fois les plasmides T1 et HAIB construits, ils doivent être transférés chez une souche MFDpir de
Escherichia coli par une technique de transformation. Pour cela, les vecteurs sont ajoutés dans les
différents tubes de E. coli puis placés à incuber sur la glace pendant 15 minutes. Ensuite, une nouvelle
incubation est réalisée pendant 2 minutes à 42°C pour que le choc thermique puisse avoir lieu sur les
cellules. Les tubes sont replacés sur glace pendant 5 minutes. Après 40 minutes, 1mL de LB est
ajouté à chaque suspension puis les tubes sont placés à 37°C pendant 1 heure afin de permettre
l’expression du gène de résistance à la kanamycine. Enfin, des étalements sur boîtes sont réalisés sur
milieu LB supplémenté en kanamycine et les boîtes sont placées à 37°C pendant une nuit.
7. Extraction plasmidique (Mini-préparations)
Une fois la croissance des bactéries terminée, une étape d’extraction plasmidique par lyse alcaline est
réalisée, le protocole étant présenté en annexe, pour extraire les fragments T1 et HAIB. Afin d’extraire
les ADN possédant tous les fragments d’intérêt, une étape de mini-préparation est réalisée. Cette
technique permet de préparer sélectivement l’ADN plasmidique contenu chez E. coli et d’éliminer
l’ADN de son chromosome bactérien. Elle se compose en différentes étapes. Dans un premier temps,
les cellules sont lysées grâce au NaOH puis les protéines sont précipitées à l’aide d’une solution
spécifique et sont éliminées. D’autres acides nucléiques sont aussi éliminés notamment l’ARN grâce
à l’ajout de la solution 1 contenant des ARNase. Enfin, pour permettre la concentration de l’ADN,
une précipitation est réalisée grâce à une solution d’éthanol. Le Nanodrop est ensuite utilisé afin de
déterminer les concentrations d’ADN plasmidiques de nos échantillons.
8. Création des plasmides pSwap à partir d’un clonage golden gate
Pour la réalisation du clonage, nous avons suivi le protocole suivant :

Ligase 1 9
Plasmide H1 0,8* 7,2*
Plasmide H2 1,3* 11,7*
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En fonction des concentrations En fonction des concentrations

Plasmide T1
Nanodrop Nanodrop
Plasmide T2 0,4* 3,6*
Enzyme de
1 9
restriction (BbsI)
En fonction des concentrations En fonction des concentrations
Plasmide HAIB
Nanodrop Nanodrop
H2O 20 - T1-HAIB - 6,5 180- T1-HAIB- 58,5
*concentration calculée pour chaque tube à partir de la taille des vecteurs.

Exemple :
On sait que 25ng à 1000pb
Or le plasmide T2 est constitué d'environ 4100 pb donc on a besoin de 102,5ng.
Donc en sachant que la concentration de la solution est de 150ng pour 1µl, pour avoir 102,5ng il faut
un volume de 0,4µl.
Le mélange a été réalisé en présence de l’enzyme de restriction BbsI permettant de réaliser un clonage
dont les fragments sont ordonnés et orientés grâce aux extrémités cohésives résultantes de l’enzyme.
Etant donné que l’enzyme à la particularité de couper hors du site de reconnaissance, les régions ou
la cassure a lieu, préparé en amont, cela permet d’obtenir des extrémités qui s’assemble, grâce à la
T4 ligase, selon l’ordre souhaité exemple ci-dessous mais dans notre cas on a plus de fragment qui
seront insérés.
Figure 16 : Principe du Golden Gate Clonage.
9. Transformation
Une fois le plasmide pSwap construit, il doit être transféré à nouveau chez Escherichia coli par une
technique de transformation. Pour cela, le vecteur est ajouté dans les différents tubes où l’on retrouve
les souches de E. coli puis placés à incuber sur la glace pendant 15 minutes. Ensuite, une nouvelle
incubation est réalisée pendant 2 minutes à 42°C pour que le choc thermique puisse avoir lieu. Les
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tubes sont replacés sur glace pendant 5 minutes. Après 40 minutes, 1mL de LB est ajouté à chaque
suspension puis les tubes sont placés à 37°C pendant 1 heure afin de permettre l’expression du gène
de résistance au Chloramphénicol. Enfin, des étalements sur boîtes sont réalisés sur milieu LB
supplémenté en Chloramphénicol et les boîtes sont placées à 37°C pendant une nuit.
10. Conjugaison
Cette dernière étape a pour but de transférer l’ADN plasmidique de la bactérie donneuse, Escherichia
coli, à la bactérie receveuse, Vibrio cholerae, via des pili sexuels. Dans un premier temps, il est
nécessaire de sélectionner les colonies pour lesquelles la transformation a fonctionné. Cette sélection
s’effectue par la présence d’un pigment violet qui permet de s’assurer que la transformation a eu lieu
et que les fragments sont dans le bon ordre dans le plasmide. Ensuite, pour la conjugaison, la première
50 µL étape consiste à mélanger les deux souches dans le même milieu puis
d’étaler des dépôts de 50µL sur boîte de Pétri. Un schéma récapitulatif
1
de la manipulation est illustré ci-contre. Un dépôt est réalisé pour
chaque délétion. Après les dépôts terminés, la boîte ne doit pas être
4 2
agitée sous peine de mélanger les solutions. Un dépôt est réalisé pour
chaque délétion. Après les dépôts terminés, la boîte ne doit pas être
3 agitée sous peine de mélanger les solutions.
Une fois la conjugaison terminée, deux milieux sont utilisés successivement. Dans un premier temps,
le premier milieu est choisi afin de pouvoir faire croître les deux souches. Pour cela, on utilise le
milieu suivant :
Composant Quantité en mL
LB 30
Dap 0,3
NaCl 3
Ensuite, le deuxième milieu permet de contre-sélectionner E. coli. De ce fait, On utilise le même

milieu sans Dap pour que Vibrio Natriegens puisse être la seule bactérie à pousser sur le milieu. Pour
cette deuxième étape, on utilise le milieu suivant :
Composant Quantité en mL
LB 45
NaCl 5
Kanamycine 100 µL
Chloramphénicol 2,5 µL
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Le chloramphénicol est utilisé pour ne sélectionner que les bactéries ayant acquis la plasmide pSwap
contenant le gène de résistance à cet antibiotique. De plus, le plasmide bactérien de V. natriegens
possède le gène de résistance à la kanamycine qui est donc utilisé pour la préparation du milieu. Le
sel quant à lui est utilisé pour favoriser la croissance bactérienne de Vibrio Natriegens dont le milieu
naturel est salé.
Avant étalement, les solutions sont centrifugées 5 minutes à 845G, le surnageant est éliminé et les
cellules sont re suspendues.
Après incubation à 37°C, 2 colonies sont repiquées par boîte de pétri et chacune est ajoutée dans une
solution préparée dans un falcon et contenant 40mL de LB, 5mL de NaCl et 1mL d’arabinose. Ce
mélange est ensuite réparti dans chacun des tubes pour obtenir environ 5mL dans chaque. L’arabinose
permet l’expression du système de recombinaison et l’expression de la protéine Cas nécessaire au
système CRISPR. Les solutions sont de nouveau incubées à 37°C.
Enfin, un dernier étalement des souches est effectué sur un milieu préparé en amont dans un falcon
composé de 45mL de LB, 5mL de NaCl, 100µL de kanamycine, 2,5µL de chloramphénicol et 50µL
de tétracycline, permettant après l’arabinose l’expression et l’activation de la protéine Cas9.
Finalement, les cellules sont mises culture sur une milieu solide LB dont la salinité est de 1/10. Cela
permettant de faire pousser les bactéries Vibrio natriegens normalement porteuses de la délétion
effectuée.
11. PCR sur colonies
Pour s’assurer que la transformation a bien fonctionné, une PCR sur colonie est réalisée (protocole
en annexe) avec le tampon et la polymérase Q5. Les volumes sont adaptés suivant le protocole sachant
que le volume pour un tube est de 10µL pour cette étape. Ensuite, une étape de PCR est réalisée avec
une durée de 20 secondes pour la dénaturation à 98°C, 30 secondes pour l’hybridation à 60°C et 2
minutes pour l’élongation à 72°C puisque les fragments sont supposés être compris entre 1200 et
1800pb si la délétion a fonctionné.
35 cycles de PCR sont effectués. Une fois cette étape terminée, une électrophorèse sur gel est réalisée
pendant 30 minutes à 120V. Le gel permet donc de vérifier que les fragments d’intérêts sont bien
présents. Les colonies qui présentent des résultats positifs sont ensuite mises en culture. Pour cela, il
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faut repiquer la colonie d’intérêt et la mélanger dans un falcon avec 5mL de LB et 5µL de
kanamycine. Les tubes sont mis à incubation sous agitation à 37°C pendant 12 heures.
12. Vérification des délétions
Dans le but de vérifier si les délétions ont correctement fonctionné, une étape de PCR sur colonies
est réalisée à l’aide d’amorces spécifiquement construites pour la délétion puis cette étape est suivie
d’une électrophorèse. Les colonies sélectionnées pour la PCR sont de couleur verte témoignant
normalement que la délétion a bien eu lieu. Après analyse du gel, il est possible que les bandes soient
de faible intensité. Ces résultats peuvent être simplement dus à une absence de résultats ou bien à la
manipulation en elle-même qui ne permet pas toujours d’obtenir des bandes de forte intensité dans le
cas d’une PCR sur colonie.
Il est possible, pour obtenir de meilleurs résultats, de réaliser la PCR directement sur l’ADN des
souches de Vibrio. Pour se faire, une culture en milieu liquide est nécessaire pour pouvoir favoriser
le développement des bactéries utilisées pour la PCR sur colonies précédemment et ainsi optimiser
des résultats. Après un certain temps de croissance, les cultures doivent être préparées pour procéder
à une dernière étape de PCR qui permettra potentiellement d’obtenir de meilleurs résultats sur le gel
du fait de travailler directement avec de l’ADN contrairement à l’étape précédente.
1mL de chaque culture sont placées dans un eppendorf. Les tubes sont centrifugés pendant 1min30s
à 13 000 rpm et le surnageant est éliminé. Les cellules sont re suspendues dans 1mL d’eau stérile puis
les tubes sont placés à 98°C pendant 5 minutes pour permettre de lyser les cellules. Une nouvelle
centrifugation est réalisée pendant 5 minutes à 17 000 rpm et le surnageant est utilisé pour procéder
à l’étape de PCR sur l’ADN. Une fois l’amplification terminée, une électrophorèse sur gel est réalisée
afin de vérifier si la taille des produits de PCR correspond bien à la taille attendue après délétion.
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IX. Résultats/Discussion
1. Définition des gènes essentiels et des zones de délétions
Pour sélectionner les 8 régions à supprimer, nous avons mené une étude approfondie des gènes de
Vibrio natriegens afin de déterminer leur rôle essentiel ou non dans le développement de la bactérie.
Pour ce faire, nous avons consulté des données d'études antérieures et élaboré une liste de régions de
20 nucléotides appartenant à des gènes du chromosome, chacune associée à une valeur de fitness
calculée à partir d'un ratio entre la quantité de bactéries développées immédiatement après l’inhibition
de l’expression du gène et celle développée à un certain moment après cette inhibition. Un rapport
supérieur à 0,8 a été considéré comme indiquant l'essentialité du gène. Nous avons ensuite décidé de
procéder à deux types de délétions : une risquée, dans laquelle nous avons ignoré ce rapport jusqu'à
ce qu'il y ait deux fois un faible ratio dans le même gène, et une considérée comme sûre.
Figure 17 : Délétion risquée Emeline (appelée délétion 1 Far)
Figure 18 : Délétion sécurisée Emma (appelée délétion 2 Far)
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Figure 19 : Délétion sécurisée d’Emma (appelée délétion 1 Sch)
Figure 22 : Délétion risquée d’Emma (appelée délétion 2 Sch)
Figure 21 : Délétion 1 risquée d'Emmie (appelée délétion 1 EM)
Figure 20 : Délétion 2 risquée d'Emmie (appelée délétion 2 EM)
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Figure 24 : Délétion 3 sécurisée de Manon (appelée délétion 3 EM)
Figure 23 : Délétion 4 sécurisée de Manon (appelée délétion 4 EM)
Grâce au logiciel Snapgene, les séquences cibles à retirer du génome de Vibrio natriegens ont été
déterminées. Comme il s'agit d'une bactérie à deux chromosomes, quatre délétions ont été réalisées
sur chaque chromosome. Pour la première délétion, la séquence cible identifiée par Emeline était
composée de 1435 paires de bases, tandis que sa deuxième délétion identifiée contenait 1246 paires
de bases. Pour les délétions identifiées par Emma, la première contenait 1522 paires de bases et la
deuxième 1317 paires de bases. Les séquences cibles identifiées par Emmie avaient des tailles de
1498 et 1639 paires de bases respectivement. Pour les délétions identifiées par Manon, les séquences
cibles avaient des tailles de 1610 et 1380 paires de bases.
2. Construction des séquences d’homologues, des cassettes et des amorces
La délimitation précise des gènes à supprimer nous a permis de déterminer deux séquences
d’homologie par délétions, la première HA en amont des gènes cibles et la deuxième HB en aval. Ces
régions contiennent entre 500 et 800 nucléotides. Ces régions nécessitant d’être amplifiées par PCR,
il a été nécessaire de créer deux amorces pour chacune d’entre elles, une sens et une antisens.
De plus, nous avons choisi une cassette pour chaque délétion, c’est-à-dire une séquence de 20 paires
de bases avec son brin complémentaire suivies du motif PAM. Ce guide a été choisi entre les
séquences d’homologie HA et HB, c’est-à-dire au sein de la séquence que nous souhaitons retirer.
Enfin, deux types d'amorces supplémentaires ont été conçus. Le premier jeu d'amorces est destiné à
vérifier l'assemblage correct des vecteurs HAIB et T1 en utilisant les amorces sens et antisens du
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backbone des plasmides receveurs des inserts. Le deuxième jeu d'amorces est conçu pour vérifier
l'efficacité des délétions réalisées sur les différents chromosomes.
3. Vérification et purification des produits de PCR
Après l’amplification par PCR des régions homologues, nous avons réalisé des gels d’électrophorèse.
Pour chaque gel, nous avons utilisé un marqueur de poids moléculaire dans le puits 1 pour connaître
la taille des échantillons obtenues lors des étapes précédentes. Grâce à cela, nous avons obtenu les
profils de migration suivant (figure X et figure X) révélés sous UV.
Figure 25 : Résultats de l’électrophorèse des produits PCR pour les

régions homologues des délétions HA et HB 1 à 4 EM dans les puits
de 2 à 9.
Les résultats de l'analyse montrent la présence de différentes marques dans les puits. Dans le puits
2, une marque d'environ 600 pb est observée, correspondant à la taille attendue pour la région HA 1
EM de 589 pb. Les puits 3 et 4 présentent deux autres marques, situées à environ 700 pb, qui
correspondent aux régions HB 1 EM de 692 pb et HA 2 EM de 700 pb. Les puits 5 et 6 présentent
deux marques d'environ 850 pb, corrélant avec les résultats attendus pour les régions HB 2 de 840
pb et HA 3 de 860 pb. Enfin, dans les puits 7, 8 et 9, des marques sont observées à environ 700 pb,
600 pb et 550 pb respectivement. Ces résultats sont cohérents avec les tailles attendues pour les
régions HB 3 EM de 684 pb, HA 4 EM de 600 pb et HB 4 EM de 570 pb.
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Les résultats montrent que les marques obtenues

pour les puits 2 et 3 se situent entre 600 et 700
pb, ce qui correspond à la taille attendue des
régions HA 1 et 2 Far, estimée à 650 pb. De
même, les marques observées pour les puits 4
d’environ 750 pb et 5 d’environ 550 pb
correspondent bien aux tailles des régions HB 1
Far de 740 pb et HB 2 Far de 540 pb. Pour les
puits 6 et 7, deux autres marques sont obtenues
Figure 26 : Résultats de l'électrophorèse des produits PCR pour
les régions homologues des délétions HA 1, HA 2, HB 1 et HB 2 autour de 550 pb, correspondant aux tailles des
Far dans les puits respectivement de 2 à 5 et HA 1, HA 2, HB 1 et
HB 2 Sch dans les puits respectivement de 6 à 9. régions HA 1 Sch de 545 pb et HA 2 Sch de 540
pb. On remarque cependant au niveau du puits 8 que la marque à environ 800 pb ne corrèle pas avec
la taille attendue pour HB 1 Sch qui est de 650 pb. Enfin, le puits 9 présente une marque d'environ
700 pb, ce qui est conforme à la taille attendue pour HB 2 Sch d’également 700 pb.
Le problème au niveau du puits 8 est sans doute dû à une erreur de manipulation, la membrane du gel
ayant été perforée pendant l’injection du produit PCR dans le puits. Les autres résultats étant
conformes, on a ainsi pu vérifier que la PCR a correctement fonctionné.
4. Vérification de la quantité d’ADN et de la pureté de l’ADN
Après la formation des plasmides, une étape de clonage de 5 heures a été réalisée, suivie de la
purification de l'ADN obtenu. La quantité et la pureté de l'ADN ont été vérifiées grâce au NanoDrop.
La concentration d'ADN obtenue était bien supérieure à la concentration minimale requise d'environ
12,5 ng/μL pour poursuivre les manipulations. De plus, le ratio de l'absorbance de l'ADN à 260 nm
sur celle à 280 nm, qui reflète la pureté de l'échantillon, était compris entre 1,8 et 2,0 ; indiquant que
l'ADN était pur.
Concentration en ADN Concentration en ADN
HA délétion 1 Far 27,698 ng/μL HA délétion 1 EM 33,47 ng/μL
HB délétion 1 Far 43,329 ng/μL HB délétion 1 EM 23,36 ng/μL
HA délétion 2 Far 35,550 ng/μL HA délétion 2 EM 50,45 ng/μL
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HB délétion 2 Far 32,918 ng/μL HB délétion 2 EM 57,07 ng/μL
HA délétion 1 Sch 56,237 ng/μL HA délétion 3 EM 67,47 ng/μL
HB délétion 1 Sch 74,038 ng/μL HB délétion 3 EM 53,88 ng/μL
HA délétion 2 Sch 71,813 ng/μL HA délétion 4 EM 40,60 ng/μL
HB délétion 2 Sch 45,149 ng/μL HB délétion 4 EM 43,33 ng/μL
Tableau 1 : Dosage des concentrations en ADN plasmidique des produits PCR des régions
homologues HA et HB pour les 4 régions à déléter
5. Créations des plasmides HAIB et T1
Après une nuit d'incubation, des colonies ont été observées sur l'ensemble des boîtes de pétri malgré
la présence de kanamycine dans le milieu de culture. Étant donné que la souche d'E. coli MDFpir
utilisée dans cette expérience ne possède pas de gène de résistance à cet antibiotique, ces bactéries ne
peuvent pas se développer dans un milieu comme celui-ci. Toutefois, les vecteurs HAIB et T1
contiennent une cassette de résistance à la kanamycine, ce qui permet de conclure que les colonies
observées possèdent le plasmide HAIB ou T1 au sein de leur génome.
En somme, les plasmides HAIB et T1 sont constitués d'un vecteur dans lequel les séquences
d'homologie HA et HB de chaque délétion ou la cassette guide T1 ont été insérées. Ce vecteur porte
une cassette de résistance, un gène impliqué dans la voie métabolique de la désoxyviolacéine et deux
sites de restriction pour l'enzyme BbsI.
Figure 28 : Exemple de vecteur T1 correctement Figure 27 : Exemple de vecteur HAIB correctement

assemblé assemblé
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Il est cependant important de souligner que la présence de colonies ne garantit pas une intégration
parfaite du plasmide et que celui-ci peut contenir des erreurs ou des mutations indésirables. Pour
vérifier la qualité des plasmides obtenus, nous avons réalisé un gel d’électrophorèse.
En outre, pour des raisons de contrôle expérimental, il aurait été préférable de réaliser une ou deux
boîtes de pétri avec la bactérie n’ayant pas intégré le plasmide. Ces boîtes de pétri auraient été utilisées
comme témoins pour nous assurer que la résistance à la kanamycine observée était bien due à la
présence du plasmide et non à des mutations spontanées.
6. Vérification de l’assemblage optimal des vecteurs HAIB et T1
Ainsi, pour vérifier que nos plasmides n'ont pas formé de structures circulaires sans avoir intégré les
séquences homologues HA et HB ou la cassette guide T1, nous avons réalisé une PCR. Nous avons
utilisé quatre types d'amorces : l'amorce anti-sens de la séquence d'homologie HB et l'amorce sens du
backbone du vecteur aussi appelé support d’ADN ou encore épine dorsale du vecteur pour le plasmide
HAIB ; l'amorce sens de la cassette T1 et l'amorce anti-sens du support d’ADN pour le plasmide T1.
Nous avons ensuite obtenu des fragments d'ADN et nous avons déterminé leur taille en réalisant un
gel d'électrophorèse. Nous avons également calculé les tailles théoriques des fragments de vecteurs
afin de vérifier s'ils contenaient bien l'insert.
Délétion Taille attendue Délétion Taille attendue
Vecteur HAIB région 1 Far 1612 pb Vecteur HAIB région 1 EM 1550 pb
Vecteur T1 région 1 Far 850 pb Vecteur T1 région 1 EM 850 pb
Vecteur HAIB région 2 Far 1413 pb Vecteur HAIB région 2 EM 1750 pb
Vecteur T1 région 2 Far 850 pb Vecteur T1 région 2 EM 850 pb
Vecteur HAIB région 1 Sch 1534 pb Vecteur HAIB région 3 EM 1750 pb
Vecteur T1 région 1 Sch 850 pb Vecteur T1 région 1 EM 850 pb
Vecteur HAIB région 2 Sch 1472 pb Vecteur HAIB région 2 EM 1400 pb
Vecteur T1 région 2 Sch 850 pb Vecteur T1 région 2 EM 850 pb
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Tableau 2 : Tailles théoriques des vecteurs HAIB et T1 obtenus par PCR pour les délétions des régions
1 à 4.
Figure 29 : Résultats de l'électrophorèse des produits PCR des vecteurs

HAIB régions 1 et 2 Sch et des vecteurs T1 régions 1 et 2 Sch
Dans les puits de 2 à 5, on observe deux bandes d'environ 1 500 pb qui correspondent à la taille
attendue pour le vecteur HAIB 1 Sch de 1534 pb. Ensuite, dans les puits 6, 8 et 9, on observe des
marques d’une taille d'environ 1 000 pb qui ne corrèlent pas avec la taille attendue pour le vecteur
HAIB 2 Sch qui est de 1 472 pb. En revanche, les puits 9 à 15 présentent des marques d’une taille
d'environ 850 pb, cohérentes avec les résultats attendus pour les vecteurs T1 région 1 Sch et T1 région
2 Sch, tous deux de taille 850 pb. Enfin, les puits 3, 4 et 7 ne présentent aucune marque détectable.
Grâce à ces résultats, nous pouvons affirmer que la PCR a correctement fonctionné pour les vecteurs
HAIB région 1, T1 région 1 et T1 région 2 Sch. Toutefois, les résultats obtenus pour le vecteur HAIB
région 2 Sch ne sont pas concluants, ce qui nécessite la réalisation de nouvelles manipulations en
choisissant d'autres colonies.
Figure 30 : Résultats de l’électrophorèse des produits PCR des vecteurs

T1 région 2 Sch et les vecteurs HAIB régions 1 et 2 EM
Les résultats obtenus montrent la présence de deux bandes dans les puits 2 et 3, observées à une taille
d'environ 850 à 900 pb, ce qui correspond à la taille attendue du vecteur T1 région 2. De plus, on
observe la présence de 4 marques dans les puits de 3 à 7, à une taille d'environ 1 500 pb, en cohérence
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avec la taille attendue de 1 550 pb pour le vecteur HAIB région 1 EM. Enfin, on observe la présence
de 4 autres marques à environ 1 700 pb, correspondant à la taille attendue de 1 750 pb pour le vecteur
HAIB région 2 EM.
Ces résultats ont permis de montrer que la PCR a également correctement fonctionné pour les vecteurs
HAIB régions 1 et 2 EM.
Figure 31 : Résultats de l’électrophorèse des produits PCR des vecteurs

HAIB régions 1 et 2 Far et des vecteurs T1 des régions 1 et 2 Far
On observe quatre bandes au niveau des puits 2 à 5 d'une taille d'environ 1 600 pb, correspondant à
la taille attendue de 1 612 pb du vecteur HAIB région 1 Far. Les puits 6 et 9 présentent une marque
d'environ 800 pb, tandis que le puits 8 montre une marque à environ 1 450 pb. Aucune marque n'est
observée au niveau du puits 7. Ainsi, au moins un résultat concorde avec celui attendu du vecteur
HAIB région 2 Far, d'une taille de 1 413 pb. Les puits 10 à 13 présentent quatre bandes d'environ 850
pb, en cohérence avec la taille attendue de 850 pb pour le vecteur T1 région 1 Far. Enfin, aucune
bande n'est visible au niveau des puits 14 et 15.
Les résultats obtenus ont permis de confirmer que la PCR a bien fonctionné pour les vecteurs HAIB
régions 1 et 2 ainsi que pour le vecteur T1 région 1 Far, avec des bandes observées aux tailles
attendues. Toutefois, les résultats ne sont pas concluants pour le vecteur T1 région 2 Far, puisque
aucune bande n'a été détectée dans les puits correspondants.
Figure 32 : Résultats de l’électrophorèse des produits PCR des

vecteurs T1 région 2 Far et T1 régions 1, 2, 3 et 4 EM
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Aucune bande n'a été observée dans les puits 2, 3 et 9. En revanche, on a remarqué la présence de 9
marques dans les autres puits de 4 à 14 à une taille d'environ 850 pb, ce qui est cohérent avec la taille
attendue des vecteurs T1 des régions 1, 2 et 4 EM.
N’ayant, comme précédemment, aucune bande pour le vecteur T1 région 2 Far, on ne peut donc pas
vérifier que la PCR ait bien fonctionné pour lui. Il en est de même pour le vecteur T1 région 3 EM.
Par conséquent, il a été nécessaire de refaire les manipulations en utilisant de nouvelles colonies.
Cependant, les résultats obtenus ont permis de confirmer que la PCR a bien fonctionné pour les
vecteurs T1 régions 1, 2 et 4 EM.
On observe deux marques dans les puits 2 et 5, d'une taille d'environ

850 pb, tandis qu'aucune bande n'est visible dans les puits 3 et 4.
Ces résultats ne correspondent pas à la taille attendue de 1 750 pb
pour le vecteur HAIB 3 EM. En revanche, on observe des bandes
d'une taille d'environ 1 400 pb dans les puits 6, 8 et 9, ce qui est
cohérent avec la taille attendue de 1 400 pb pour le vecteur HAIB
région 4 EM.
Figure 33 : Schéma représentant les résultats
d’électrophorèse des produits PCR des On a donc pu confirmer que la PCR a fonctionné pour le vecteur
vecteurs HAIB régions 3 et 4 EM
HAIB région 4 EM mais pas pour le vecteur HAIB région 3 EM. En
conséquence, nous avons dû sélectionner d'autres colonies et procéder à une nouvelle PCR pour le
vecteur en question.
Plusieurs explications sont possibles pour les régions présentant des bandes de tailles anormales ou
une absence de bande. Des erreurs de manipulation peuvent avoir été commises lors de la réalisation
des expériences, malgré nos précautions, comme la réalisation de quatre essais pour chaque
amplification. De plus, il peut arriver que l'amplification ne donne aucun résultat, nécessitant alors
une nouvelle PCR en modifiant certains paramètres. Il est important de noter que nos manipulations
impliquent des organismes vivants, ce qui peut parfois entraîner des réactions imprévues et des
résultats inattendus. Par conséquent, les colonies choisies pour réaliser la PCR peuvent ne pas être
optimales. Une nouvelle PCR a donc été réalisée le lendemain pour les échantillons présentant des
résultats insatisfaisants. Les résultats obtenus étaient satisfaisants, ce qui nous a permis de poursuivre
nos manipulations en utilisant ces échantillons.
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7. Vérification de la quantité et de la pureté de l’ADN
La quantité et la pureté de l'ADN extrait des bactéries ont été vérifiées grâce au NanoDrop. La
concentration d'ADN obtenue était bien supérieure à la concentration minimale requise pour
poursuivre les manipulations. La mesure de ces concentrations était une étape obligatoire afin de
calculer la quantité d’ADN à ajouter dans le mélange servant à former le plasmide pSwap. De plus,
le ratio de l'absorbance de l'ADN à 260 nm sur celle à 280 nm était compris entre 1,8 et 2,0 ; indiquant
que l'ADN était pur.
Délétion Concentration en ADN Délétion Concentration en ADN
HAIB délétion 1 Far 104,419 ng/μL HAIB délétion 1 EM 100,258 ng/μL
T1 délétion 1 Far 122,921 ng/μL T1 délétion 1 EM 203,859 ng/μL
HAIB délétion 2 Far 62,251 ng/μL HAIB délétion 2 EM 60,348 ng/μL
T1 délétion 2 Far / T1 délétion 2 EM /
HAIB délétion 1 Sch 73,152 ng/μL HAIB délétion 3 EM /
T1 délétion 1 Sch 153,133 ng/μL T1 délétion 3 EM /
HAIB délétion 2 Sch / HAIB délétion 4 EM 84,873 ng/μL
T1 délétion 2 Sch 152,713 ng/μL T1 délétion 4 EM 150,502 ng/μL
Tableau 3 : Dosage des concentrations en ADN plasmidique des produits PCR des vecteurs HAIB et
T1 pour les 4 régions à déléter
Certaines cases de notre tableau de résultats ne contiennent pas de valeurs. En effet, lors de l'analyse
du gel précédent, des problèmes ont été observés pour les régions HAIB de la délétion 2 Sch, T1 de
la délétion 2 EM ainsi que HAIB et T1 de la délétion 3 EM. De ce fait, nous n'avons pas mesuré la
quantité d'ADN ni sa pureté pour ces fragments. Pour ne pas prendre de retard dans notre
planification, nous avons entrepris l'assemblage du plasmide pSwap pour les régions ayant des
résultats satisfaisants, à savoir les délétions 1 Far, 1 Sch, 1 EM et 4 EM. Pendant ce temps, une
nouvelle PCR suivie d’un autre gel d’électrophorèses ont été réalisés sur les fragments
problématiques. Les résultats de la deuxième PCR et des mesures ont été satisfaisants, ce qui nous a
permis de poursuivre la conception des plasmides pSwap pour les régions restantes.
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8. Transformation et formation des plasmides pSwap
Nous pouvons observer que toutes les boîtes de culture présentent des colonies violettes.
Figure 34 : Culture des bactéries E. Coli Figure 35 : Culture des bactéries E. Coli
transformées avec le plasmide pSwap pour les transformée avec le plasmide pSwap pour les
délétions EM délétions Far et Sch
Il est possible d'observer des colonies qui ne présentent pas cette couleur violette. En effet, pendant
leur développement, elles peuvent perdre le plasmide. Lorsqu'une cellule se divise en deux cellules
filles, le plasmide ne peut être hérité que par l'une des deux, et l'autre se retrouve donc sans plasmide.
Il est également possible d'observer quelques contaminations sur nos résultats, probablement dues au
fait que les photos ont été prises après le prélèvement des colonies pour les expériences suivantes.
Ainsi, des contaminations ont pu apparaître au cours de cette manipulation.
La coloration est obtenue uniquement si les bactéries produisent la molécule de déoxyviolacéine, ce
qui indique que le plasmide est correctement assemblé à l'intérieur des bactéries. En effet, la molécule
n'est produite que si les fragments sont dans le bon ordre sur le plasmide. Le pSwap est composé d'un
fragment du vecteur T1 suivi d'un fragment du vecteur T2, puis d'un fragment du vecteur H1 associé
au fragment du vecteur HAIB et enfin d'un fragment du vecteur H2. Chacun de ces fragments possède
un gène de cette voie métabolique.
L'ordre attendu pour ce plasmide est donc le suivant : "T1-

T2-H1-HAIB-H2" :
Figure 36 : Organisation des différents fragments

de vecteur au sein du plasmide pSwap
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Si l’ordre est respecté, le plasmide contient le système de synthèse de ce pigment, ce qui signifie que
la transformation a fonctionné. Nous pouvons donc conclure que les plasmides ont été formés
correctement pour chaque région que nous souhaitions supprimer.
Figure 37 : Exemple de vecteur pSwap correctement assemblé
De plus, les fragments H1 et H2 contiennent des cassettes de résistance aux antibiotiques kanamycine
et chloramphénicol. Ainsi, les bactéries qui ont intégré le plasmide acquièrent ces caractéristiques de
résistance. L'ajout de ces antibiotiques dans le milieu de culture permet alors de sélectionner
uniquement les bactéries ayant intégré le vecteur correctement formé.
9. Conjugaison
Nous avons réalisé une conjugaison entre les bactéries E. coli et Vibrio natriegens, suivie de deux
étapes de sélection pour éliminer les Escherichia coli non transformées et empêcher le développement
des bactéries V. natriegens n'ayant pas intégré le plasmide. Les bactéries ont été remises en culture
sans ajout de DAP dans le milieu. Les bactéries E. coli sont mutées sur le gène codant pour cette
enzyme ainsi elles ne peuvent pas former un composant de leur couche de peptidoglycanes, induisant
leur lyse et leur mort. Nous avons aussi ajouté les antibiotiques kanamycine et chloramphénicol dans
le milieu. La kanamycine seule n'aurait pas suffi à réaliser une sélection, car les bactéries Vibrio
natriegens possèdent un vecteur Cr3 codant pour l'enzyme Cas9 et possédant une cassette de
résistance contre cet antibiotique. Ainsi, seules les bactéries ayant intégré le plasmide pSwap ont pu
se développer.
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Bien que les bactéries ayant subi la délétion doivent exprimer un pigment vert, nous n'avons pas
observé de colonies de cette couleur au sein de nos cultures. La présence de colonies ne garantit pas
une intégration parfaite du plasmide, qui peut contenir des erreurs ou des mutations indésirables. De
plus, le pigment n'est pas produit instantanément, il était donc trop tôt pour l'observer. Nous avons
donc effectué une PCR sur les colonies avec des amorces spécifiques pour vérifier l’efficacité de la
délétion, suivie d'un gel d'électrophorèse pour comparer la taille des fragments obtenus à celle
attendue théoriquement.
Pour des raisons de contrôle expérimental, il aurait été préférable de réaliser une ou deux boîtes de
pétri avec la bactérie n'ayant pas intégré le plasmide. Ces boîtes de pétri auraient été utilisées comme
témoins pour nous assurer que la résistance aux antibiotiques observée était bien due à la présence du
plasmide et non à des mutations spontanées.
10. Vérification de la réussite de nos délétions
Nous avons utilisé le logiciel Snapgene afin d’obtenir la taille de nos délétions :
Délétion Taille attendue Délétion Taille attendue
Fragment délétion région 1 Far 1435 pb Fragment délétion région 1 EM 1498 pb
Fragment délétion région 2 Far 1246 pb Fragment délétion région 2 EM 1639 pb
Fragment délétion région 1 Sch 1522 pb Fragment délétion région 3 EM 1610 pb
Fragment délétion région 2 Sch 1517 pb Fragment délétion région 4 EM 1380 pb
Tableau 4 : Taille théoriques des fragments des 4 régions à déléter
Figure 38 : Gel d'électrophorèse des fragments de délétion des régions EM
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Pour la délétion de la région 1 EM, nous observons quatre bandes pour les puits 5 à 8 aux alentours
de 1500 paires de bases, ce qui correspond à la taille attendue de 1498 paires de bases. Pour la région
2 EM, nous observons deux bandes situées légèrement au-dessus de 1500 paires de bases,
correspondant à la taille théorique du fragment de 1639 paires de bases. En ce qui concerne la région
3 EM, des bandes sont présentes pour les puits 1, 6 et 7. Cependant, la bande du puits 7 se trouve
entre 1000 et 1500 paires de bases, ce qui ne correspond pas à la taille attendue du fragment. Les deux
autres bandes se situent au-dessus de 1500 paires de bases, correspondant à la taille de 1610 paires
de bases. Enfin, nous observons deux bandes pour le puits 4 correspondant à la région 4 EM. La
première bande, se situant à plus de 1500 paires de bases, ne nous intéresse pas. La deuxième bande,
cependant, se situe entre 1000 et 1500 paires de bases, et correspond à la taille attendue pour ce
fragment de 1380 paires de bases. Ces bandes correspondent à la taille des régions que nous
souhaitions supprimer, nous permettant de conclure que les délétions situées sur le chromosome 2 ont
fonctionné.
Toutefois, il est important de noter que certaines bandes étaient étalées ou que leur intensité était très
faible, comme nous pouvons le voir pour les puits 1 et 6 de la délétion région 3 EM, nécessitant une
vérification par une nouvelle amplification suivie d'un gel électrophorétique.
Figure 39 : Gel d’électrophorèse pour les fragments de délétion des régions

Far et Sch
Nous avons obtenu des bandes pour les puits 6, 7, 8, 9, 11 et 12 correspondants à la délétion de la
région 1 Far. Ces bandes se situent aux alentours de 1500 paires de bases, où le fragment possède une
taille théorique de 1435 paires de bases, ce qui correspond à une efficacité de la délétion. Cependant,
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une vérification est nécessaire, car la plupart des résultats présentent deux bandes, ce qui n'est pas
attendu.
Le reste des délétions sur le chromosome 1, nous n'avons pas observé de bandes pour la plupart des
puits. Cela suggère que ces délétions n'ont pas fonctionné. Plusieurs raisons biologiques peuvent
expliquer ce résultat : le chromosome 1 est plus grand que le chromosome 2 et contient un plus grand
nombre de gènes essentiels, ce qui augmente le risque de supprimer un gène essentiel. De plus, la
séquence peut contenir une origine de réplication pour des gènes essentiels en aval.
Toutefois, nous ne pouvons pas tirer de conclusions définitives, car des témoins placés dans certains
puits du gel n'ont pas non plus produit de bandes. Il est possible que cela soit dû à une erreur de
manipulation ou à une amplification PCR qui n'a pas fonctionné. Nous recommandons donc de répéter
l'expérience en utilisant une méthode alternative pour confirmer ces résultats.
X. Perspectives
Le projet visait à réduire le génome de V. natriegens en utilisant l'outil CRISPR/Cas9. Parmi les
huit régions ciblées pour la délétion, seules celles situées sur le chromosome 2, réalisées par Emmie
et Manon, semblent avoir été efficacement supprimées tout en conservant une croissance
bactérienne. Pour confirmer que les séquences des gènes non-essentiels ont été supprimées avec
succès et que notre objectif de réduction du chromosome a été atteint, il serait judicieux d'envoyer
ces régions en séquençage. Dans cette perspective, il faudrait améliorer les résultats de la dernière
PCR qui sont plutôt mitigés et dans certains cas très peu marqués. Pour se faire, il serait pertinent de
répéter les expériences en utilisant des témoins pour assurer la fiabilité des résultats. Si les résultats
s’avèrent positifs, cela permettrait aux chercheurs du laboratoire de combiner les délétions obtenues
sur une même souche de Vibrio Natriegens. En effet, bien que le bon fonctionnement des délétions
permettent une avancée considérable, nous tenons à rappeler que l’objectif final de cette étude est
de produire une souche de Vibrio dont le génome serait fortement réduit, bien plus que les 8
délétions que nous avons réalisé durant cette semaine expérimentale. Pour se faire, il faut donc
poursuivre l'optimisation du génome de V. natriegens en testant la suppression d'autres régions non-
essentielles comme nous l’avons fait ici afin de réduire encore sa taille et d'améliorer ses
performances, mais aussi de combiner l’ensemble des délétions qui ont fonctionnées de manière à
réduire progressivement le génome de la bactérie. En ce qui concerne les régions qui n'ont pas été
supprimées avec succès, il serait important de déterminer l’origine de la mort de la bactérie. Pour
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cela, il est possible de vérifier si leur échec est dû à une erreur dans le système de délétion au cours
du processus réalisé en laboratoire ou bien, à la suppression d'origines de réplication, de
terminaisons, ou même de gènes essentiels non-identifiés provenant de la séquence. Enfin, il
faudrait envisager de refaire les expérimentations depuis le début en choisissant soit une autre
région considérée plus sûre à supprimer. Pour réaliser cela, il existe deux possibilités : (i) En
divisant la région en deux pour comprendre d’où provient la source du problème. (ii) En essayant de
délimiter la même région de façon plus éloignée des gènes risqués et possiblement essentiels. À
long terme, l’objectif d’optimiser au maximum le génome de V. natriegens pour qu'elle puisse
éventuellement remplacer E. coli en tant que bactérie modèle pour les études scientifiques pourra
possiblement être réalisé.
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XI. Gestion de projet

1. Planification
Le 1er février, des groupes ont été formés en fonction des sujets proposés. Pour notre groupe,
quatre membres ont rejoint l’équipe et en amont de la première réunion, nous nous sommes attribué
des rôles en fonction des aptitudes et préférences de chacun. Le rôle de chef de groupe a été attribué
à Manon : son objectif principal est de diriger et de guider l'équipe, de définir des objectifs clairs, de
surveiller les progrès et l'avancement général du projet. Le rôle de secrétaire a été attribué à Émeline.
Chargée de prendre des notes lors des réunions avec ou sans le tuteur, elle a pour but de reformuler
clairement les points abordés et de noter les tâches à effectuer pour les prochaines réunions. Emmie
a assumé le rôle de responsable de communication. Elle est chargée de gérer tous les aspects de la
communication au sein de l'équipe et avec le tuteur. Son objectif est également de tenir toutes les
parties informées (envoi d'e-mails en mettant en copie les personnes concernées). Enfin, Emma est
responsable de la planification. Elle s'occupe d'organiser notre calendrier et de mettre à jour le
diagramme de Gantt en reprenant les étapes clés du projet.
Dans le but d’obtenir une bonne coordination de groupe, nous avons défini les ressources qui nous
permettent de travailler et de communiquer de manière efficace. L’espace de stockage Google Drive
nous a permis de partager les documents de travail en temps réel à toutes les parties du groupe,
notamment : les comptes rendus de nos réunions, les différentes instructions et le rapport
intermédiaire. Ainsi, chaque membre du groupe dispose de toutes les informations nécessaires à la
réalisation du projet. Pour faciliter la communication, un groupe sur la plateforme WhatsApp a été
créé, permettant ainsi d’organiser facilement les réunions et de discuter de l’avancée du projet et
d’évoquer les éventuels problèmes que nous avons rencontré.
Enfin, nous avons utilisé différents outils pour nous aider à analyser et définir les différents
objectifs. L'analyse SWOT (Strengths - Weaknesses - Opportunities – Threats) a été essentielle pour
étudier les forces, les faiblesses, les opportunités et les menaces du projet. Cet outil nous a aidé à
prendre des décisions plus facilement et à anticiper les problèmes. Ensuite, la matrice RACI
(Responsible – Accountable – Consulted – Informed) a permis de définir les responsabilités de chacun
dans la réalisation des différentes tâches.
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Figure 40 : Tableau représentant la matrice RACI du projet.
Nous avons également utilisé des objectifs SMART (Spécifique – Mesurable – Atteignable –
Réaliste - Temporel) en relation avec les jalons pour savoir précisément quoi faire et sur quoi
travailler. Pour finir, nous avons réalisé une liste des choses à effectuer (To Do List) et un diagramme
de Gantt pour élaborer le plan du projet et le diviser en tâches réalisables. Le diagramme de Gantt
nous a également permis d'estimer la durée des tâches de manière optimale en créant une
représentation visuelle de chaque élément.
Figure 41 : Diagramme de Gantt global
Ces outils ont été d’une grande importance pour éviter l'effet tunnel et pour mener à bien ce projet.
2. Déroulement du projet
Comme dans tous projets, nous avons dans un premier temps décrit les différentes étapes en
estimant le temps de chacune d’entre elles. Cela nous a permis, à nous et à notre tuteur, d’avoir une
vue globale du projet et de mieux répartir les tâches entre les différents membres du groupe en vue
d’éviter l’effet tunnel. Les méthodes utilisées pour planifier le projet ont été décrites précédemment.
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Cependant, les délais estimés ne sont pas toujours tenus et nécessitent d’être corrigés et adaptés au
besoin.
En ce qui concerne la planification de la semaine d’expérimentation, nous avions eu un temps

avec notre tuteur de façon à récapituler toutes les étapes et le temps à prendre en compte pour chacune.
Par la suite, nous avons réparti ces étapes en optimisant la semaine d’expérimentation. Par exemple,
nous finissions pratiquement chaque journée par une étape de croissance bactérienne. Cette étape
prenant minimum 8h et ne nécessitant pas de manipulation pendant le temps d’attente, elle pouvait
facilement avoir lieu pendant la nuit. Il semble que la planification que nous avions faite ait été plutôt
bien optimisée car nous n’avons pas dévié du plan original. Même si parfois il nous a fallu rester un
peu plus longtemps que prévu au laboratoire, comme par exemple le dernier jour où nous avons raté
une électrophorèse sur gel d’agarose, l’ensemble de la phase expérimentale s'est bien déroulée.
Figure 42 : Diagramme de Gantt de la période expérimentale du projet.
En définitive, notre groupe a su s’adapter face aux faiblesses et menaces que nous avions
mises en évidence lors de l’étape de réalisation de l’analyse SWOT. La planification initiale de notre
projet a été correctement suivie et plus particulièrement la phase expérimentale qui avait été bien
anticipée. Bien que le projet se soit bien déroulé dans sa globalité, nous avons tout de même dû faire
face à certaines difficultés. Certains membres du groupe était moins impliqué que d’autres ce qui s’est
fait ressentir tout au long du projet ayant même engendré un effet tunnel en début de projet. Mais
nous avons su faire face à ce déséquilibre en nous adaptant et travaillant de manière efficace jusqu’à
la soutenance finale.
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XII. Annexes
PCR et préparation d’un Master Mix (exemple pour 18 tubes)
Composants Volume pour 1 tube (50uL) Volume pour 18 tubes

Tampon 10 180
dNTP 10mM 0,5 9
ADN 0,5 9
ADN polymérase 0,5 9
H2O 37,5 675
Le mélange du Master Mix avec les amorces s’effectuent selon le protocole suivant :
Composants Volume par tube (uL)
Amorce sens 0,5
Amorce non-sens 0,5
Master Mix 49
Clonage T1
Composants Volume pour 1 tube (20uL) Volume pour 9 tubes
(180uL)
Plasmide 1 9
Ligase (BsaI) 0,5 4,5
Enzyme de restriction 0,5 4,5
Fragment T1 1 9
H2O 15 135
Clonage HAIB
Composants Volume pour 1 tube (20uL)
Volume pour 9 tubes
(180uL)
Buffer 10X 2 18
Plasmide 1,8 16,2
Ligase 0,5 4,5
Enzyme de restriction (BsaI) 0,5 4,5
Région HA En fonction des volumes En fonction des volumes
calculés précédemment calculés précédemment
Région HB En fonction des volumes En fonction des volumes
calculés précédemment calculés précédemment
H2O 14,20 127,8
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PCR sur colonies

Composants Volume pour 1 tube (10µL) Volume pour 70 (700µL)
Tampon 2 140
dNTP 0,1 7
Amorce sens 0,1 En fonction de chaque
régions
Amorce non-sens 0,1 En fonction de chaque
régions
ADN polymérase 0,05 3,5
H2O 7,67 535,5
Extraction plasmidique (Mini-préparations)
- Centrifuger pendant 1min à 12000 rpm.

- Re suspendre les cellules dans 250µL de solution 1 contenant de l’ARNase pour éliminer
l’ARN.
- Ajout de 250µL de la solution 2 pour lyser les cellules (NAOH).
- Ajout de 350µL de la solution 3 pour précipiter les protéines.
- Centrifuger 10 min à 12000 rpm.
- Récupérer le surnagent et déposer sur colonne d’extraction.
- Ajouter 500µL d’isopropanol
- Éliminer le surnagent.
- Réaliser 2 lavages à l’éthanol 700µL.
- Réaliser un lavage à l’eau 700µL.
- Centrifuger à 8000 rpm pendant 1 min
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XIII. Références bibliographiques
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XIV. Références iconographiques
Figure 1 : Lebrun, A. (2017, 7 octobre). LA MÉCANIQUE DE LA DIVISION CELLULAIRE. ppt

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Figure 2 : ResearchGate. https://www.researchgate.net/figure/Schematic-representation-of-the-E-

coli-chromosome-A-circular-map-of-the-E-coli_fig1_320172475
Figure 3 : Lee, H. C., Ostrov, N., Wong, B. J., Gold, M. A., Khalil, A. S., & Church, G. M. (2019).
Functional genomics of the rapidly replicating bacterium Vibrio natriegens by CRISPRi. Nature
microbiology, 4(7), 1105-1113. https://doi.org/10.1038/s41564-019-0423-8
Figure 4 : réalisé par l’équipe de projet
Figure 5 : réalisé par l’équipe de projet
Figure 6-7 : ResearchGate. https://www.researchgate.net/figure/A-model-for-Cas9-target-binding-

and-cleavage-a-In-the-unbound-state-Cas9-is-loaded_fig2_261770841
Figure 8-9 : Nagaria, P. K., & Rassool, F. V. (2018). Alternative Non-homologous End-Joining :
Mechanisms and Targeting Strategies in Cancer. Springer eBooks,
375-400. https://doi.org/10.1007/978-3-319-75836-7_15
Figure 10-11-12 : Teufel, M., Klein, C., Mager, M., & Sobetzko, P. (2022). A multifunctional
system for genome editing and large-scale interspecies gene transfer. Nature
Communications, 13(1). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30843-1
Figure 13 : Shop Reagent Products | NEB. https://www.neb.com/products. Consulté le 30 avril 2023.
Figure 14 : Overview of Golden Gate Cloning. https://www.molecularcloud.org/what-is-the-Golden-

Gate-Cloning.html. Consulté le 30 avril 2023.
Figure 15 : Bacterial Transformation and Competent Cells–A Brief Introduction. Thermo Fisher
Scientific. https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/cloning/cloning-learning-
center/invitrogen-school-of-molecular-biology/molecular-cloning/transformation/competent-cell-
basics.html
Figure 16 : Razzaq, A. (2020, 9 avril). Conjugation Bacterial- Hfr- Horizontan gene transfer-
auxotroph. Study Solutions. https://istudy.pk/bacterial-conjugation/
Page 57 sur 57

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UE 6.

71 Projet en laboratoire 3ème année

Réduction du génome de Vibrio natriegens par

Manon RIGHINI ; Emmie Gillet ; Emeline Faraüs ; Emma Schneider

Cursus Master Ingénierie Biotechnologies en Microbiologie et Mngénierie Moléculaire

1. Escherichia coli : une bactérie micro-usine ............................................................................. 8

4. Différents mécanismes d’échange d’informations génétiques ............................................. 15

1. Dilutions des amorces .............................................................................................................. 25

5. Construction des plasmides HAIB ......................................................................................... 27

IX. RESULTATS/DISCUSSION .............................................................................................. 33

1. Définition des gènes essentiels et des zones de délétions ...................................................... 33

XII. ANNEXES ............................................................................................................................ 53

Enfin, nous remercions Monsieur Jean-François STRZYKALA, enseignant au sein de l’Université

II. Table des illustrations

Figure 1 : Schéma représentant la division cellulaire chez la bactérie E. coli..................................... 8

Figure 20 : Délétion 2 risquée d'Emmie (appelée délétion 2 EM) .................................................... 34

OriC Origine de réplication

SMART Spécifique – Mesurable – Atteignable – Réaliste - Temporel

SWOT Strengths - Weaknesses - Opportunities - Threats

V. natriegens Vibrio natriegens

De plus, ayant été découverte il y a longtemps, son génome

La bactérie principale de notre projet, Vibrio Natriegens, est un bacille capable de se

Figure 3 : Chromosomes 1 et 2 de la bactérie Vibrio natriegens.

Cette bactérie est actuellement beaucoup utilisée en laboratoire et présente un avenir

A. DECOUVERTE DU SYSTEME CRISPR

Figure 4 : Schéma représentant une séquence CRISPR.

Figure 5 : Schéma représentant une séquence CRISPR/Cas.

C’est seulement en 2012 que le mécanisme CRISPR/Cas9, une méthode de modification de

Figure 6 : Schéma représentant le mécanisme CRISPR/Cas9.

L’enzyme Cas9 possède 2 domaines enzymatiques : un domaine HNH permettant de cliver la

Dans certains cas, des séquences homologues peuvent

D. APPLICATION DE LA METHODE DE REPARATION HOMOLOGUE

Le plasmide pSwap (Figure 10) est un plasmide qui

La principale information est la partie qui confère la

Figure 9 : Schéma représentant le témoin du bon

La couleur de la colonie représente le système de sélection multicolore. Les cellules vont

Figure 10 : Schéma représentant la suppression du gène vioC entraînant

4. Différents mécanismes d’échange d’informations génétiques

A. CLONAGE GOLDEN GATE

La transformation permet à l’organisme receveur de capter du matériel génétique provenant

Figure 13 : Schéma représentant les deux types de transformation bactérienne.

Figure 14 : Schéma représentant la formation de nanopores

Figure 15 : Schéma représentant le mécanisme de conjugaison bactérienne.

VI. Attentes clients et objectifs

Le client principal de ce projet est le laboratoire DynAMic dont la thématique de recherche se

VII. Présentation des tâches

VIII. Matériel et méthodes

2. Réaction en chaîne par polymérase

3. Vérification des produits de PCR par électrophorèse sur gel

L’électrophorèse est réalisée dans un bain de TBE10X pendant 40 minutes à 100V.

4. Construction des fragments T1

i. Construction des fragments

Composants Volume pour 1 tube (50uL) Volume pour 9 tubes (200uL)

ii. Clonage dans le vecteur

Composants Volume pour 1 tube (20uL) Volume pour 9 tubes (180uL)

5. Construction des plasmides HAIB

i. Extraction des plasmides HAIB (mini-préparations)

ii. Golden Gate clonage avec l’enzyme BsaI

Volume pour 9 tubes

7. Extraction plasmidique (Mini-préparations)

8. Création des plasmides pSwap à partir d’un clonage golden gate

Pour la réalisation du clonage, nous avons suivi le protocole suivant :

Composants Volume pour 1 tube (20uL) Volume pour 9 tubes (180uL)