6.

21 Athanase VISVIKIS

Levures : Saccharomyces cerevisiae et Pichia pastoris

o Existe sous deux formes : haploïde ou

diploïde
o Se multiplie par bourgeonnement (cellules
mères donne naissance à des cellules filles)
o Pour que deux haploïdes fusionnent, il faut
qu’une produise le peptide a et que l’autre
produise un peptide alpha (deux a ne
peuvent pas fusionner par exemple).
o La cellule diploïde peut donner lieu à un
asque qui va libérer des cellules haploïdes qui
vont pouvoir à nouveau bourgeonner.

Elle possède une paroi composée de différents

sucres, des protéines transmembranaires, certaines sont ancrées sur la surface externe de la
paroi. Ces protéines ont un accès bcp plus facilité aux différents substrats, on augmente la
possessivité de l’enzyme donc on facilite la catalyse. Elle possède aussi des plasmides
naturels qui sont retrouvés dans les noyaux mais d’une façon indépendante du génome, ils
vont se répliquer. Il y a une ségrégation entre les cellules filles comme chez E. coli donc on
peut en profiter pour produire des protéines recombinantes en les modifiant. Cependant, le
nombre de copies d’un plasmide est beaucoup plus bas que chez E. coli.

Toutes les étapes d’amplification du plasmide se font chez E. coli puis ensuite on transforme
les levures.
Extraire un plasmide :
1) On met les cellules dans un tampon hypotonique qui contient des RNase
2) Lyse des cellules avec SDS + NaOH et dénaturation de l’ADN (et des ARN)
3) On ajoute de l’acétate de potassium pour former un complexe qui contient de l’ADN
génomique, le SDS, le potassium, la protéine, l’ARN. Après centrifugation, au niveau du
surnageant, il reste le plasmide.
Or, ici le plasmide n’est pas pur. On peut utiliser des membranes en silice qui va retenir le
plasmide mais on peut aussi faire une chromatographie échangeuse d’anions.

Ce qui est intéressant c’est que l’on peu utiliser l’auxotrophie, par ex la levure ne peut pas
synthétiser de lysine parce qu’il manque une enzyme nécessaire à sa synthèse. De ce fait,
elle ne peut pas pousser en absence de lysine donc pour la maintenir on met en culture en
présence de lysine. Cependant, si le gène est présent dans le plasmide, la levure va pouvoir
pousser. On peut aussi utiliser des antibiotiques (produire dans la levure une protéine qui va
conférer la résistance à un antibio).

Le plasmide naturel chez la levure s’appelle 2 microns = 2µm (x) c’est sa longueur en fait). 
3 origines pour initier la réplication du plasmide : 
 Origine 2µ qui permet d’avoir un nombre de copies moyen (40 copies) et assure la
stabilité du plasmide dans la cellule.
 On peut utiliser des séquences qu’on retrouve sur le chromosome de la levure (ARS)
pour favoriser la réplication autonome, on les remet dans le plasmide. 
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 Ou alors : CEN, ils peuvent supporter la réplication de l’ADN

On peut faire une intégration sinon. Aléatoire ou ciblée. Pour sélectionner les levures, pour
maintenir une pression a la cellule pour qu’elle garde le plasmide, il faut des marqueurs de
sélection. Pour que la cellule survive à des conditions spécifiques. 

Marqueurs de selection
On peut utiliser pour ça :
 Des antibiotiques : Blasticidine …
 Le plus souvent on prend des marqueurs d’auxotrophie. On a des levures qui peuvent
synthétiser naturellement des acides aminés (Lys, Leu, His, …). Donc on les met dans
un milieu dépourvu de cet acide aminé. Grâce au plasmide, on complémente
l’auxotrophie en apportant le gène manquant à la levure. Une fois transformée, elle
peut survivre et se multiplier dans un milieu dépourvu de l’aa. 

Pour produire une protéine, il faut d’abord un promoteur.

Quels types de promoteurs il faut utiliser : 
 Promoteurs à activité constitutive : forts, continuel, on ne peut pas les réguler
 Promoteurs à activité régulée : gal : Le plus utilisé (en amont des gènes impliqués
dans le transport et métabolisme du galactose) ou pho (promoteur de gène de
transporteurs de phosphate) 

Éléments nécessaires pour produire la protéine :

On a le promoteur (avec le +1), en amont on a une TATA box et une région riche en CT : tout
ça = promoteur minimal. Plus loin on retrouve des UAS (Upstream Activate Sequence). 

Les ARNm chez S. Cerevisiae : 5% des gènes morcelés contiennent des introns, les autres n’en
ont pas. 
Dans la région 3’Chez la levure la séquence UTR fait entre 60 à 160 nucléotides (chez les
mammifères plusieurs 100aines). Si on a des séquences UTR très longue pour notre protéine
qu’on veut insérer, il faut l’enlever, ça peut faire chier pour la traduction chez la levure).

MCS : Région où on insert la séquence

PolyA signal : Plus loin, séquence nécessaire pour la polyadénylation de notre protéine. Au
niveau de la région 3’UTR il faut cette séquence pour que la protéine soit polyadénylée.
TT : Ensuite on a des terminateurs transcriptionnels.  

Près de l’AUG on devrait avoir les RBS : Mais nan car dans la levure, c’est la coiffe qui
remplace sa fonction.

Il existe le promoteur Gal4 qui est composé par 

 Un domaine de fixation à l’ADN
 Un domaine d’activation de la transcription. 
Une fois que gal 4 se fixe sur l’ADN, il interagit avec gal80. Mais gal 80 en absence de
galactose va masquer le domaine d’activation de gal 4. Donc empêche gal4 d’interagir en
absence de galactose (pas de transcription). 
En absence de galactose gal3 est localisé essentiellement dans le cytoplasme. Gal3 se charge
de galactose et d’ATP donc Gal3 peut interagir avec gal80 Donc on se retrouve avec un
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complexe des 3. L’interaction avec gal80 change la conformation de gal80 et le domaine

d’activation de gal4 n’est plus masqué. Donc → Initiation de la transcription. 
Donc on cultive les levures en absence de galactose et on active la transcription quand on
veut en ajoutant du galactose.

Pichia pastoris
Appartient à la famille des levures méthylotrope, adore le méthanol et peut survivre en
l’utilisant comme seule source de carbone.

En présence d’oxygène  1 ; Le 3 peut être détoxifié suite à une conjugaison avec le
glutathion. HCHO = formaldéhyde peut être détoxifié suite à une conjugaison avec le
glutathion et sera transformé en acide formique, transformé en CO2 et H20. 
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Le 4 permet de réduire le NAD en NADH pour fournir le H+ dont on a besoin pour les
mitochondries tout ça. 
Le 5 permet de d’avoir de la dihydroxyacétone + GAP 
Ensuite on phosphoryle la dihydroxyacétone.
6 + 7 + 8 : On ajoute des phosphates
DHAP + GAP donne du fructose bi phosphate. Le FBP est transformé en F6B et on produit
une molécule GAP et une molécule de xylulose.
1/3 de GAP part dans un constituant cellulaire.

Quand cette levure est cultivée en présence de méthanol on a une très grande production
d’alcool oxydase, la première enzyme qui sert a transformer le méthanol. P.pastor contient 2
gènes codant l’alcool oxydase (Aox1 et Aox2). Aox 2 n’est pas régulable.
Lorsque P.Pastoris est cultivée en présence de méthanol, on a production en grande quantité
d’alcool oxydase, la première enzyme qui sert à transformer le méthanol. P.Pastoris contient
deux gènes codant alcool oxydase (Aox1 et Aox2). Aox1 est inductible en présence de
méthanol sinon il reste silencieux. Aox2 est produit en quantité inférieure par rapport à Aox1
mais c’est une production continue et non régulable.

Si on prend les séquences codant une protéine et on les met sous le contrôle du promoteur
Aox1, dès qu’on donne du méthanol, on a une induction très importante de la transcription
de ce gène. 

Il y a 3 régions A,B,C. Quand on regarde les plasmides qu’on va utiliser, on voit : 

 Origine de réplication pour E. Coli
 Gène de résistance a antibiotique
 En amont : 2 Promoteurs (un pour la levure et un pour E.Coli)
Comme ça celles qui n’ont pas le plasmide meurent
 Terminateur CYC1TT du gène codant la résistance
 Peptide signal de alpha 
 Région 5’Aox1 
 Terminateur Aox1
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Il n’y a pas d’origine de réplication pour Pishia, car pas besoin. Mais le vecteur est intégré
dans le génome de la levure. Pour ça, soit on fait ça aléatoirement soit on le fait par
recombinaison homologue. On remplace le gène Aox1 par le gène codant notre protéine.
Donc maintenant on a un gène qui code notre protéine et qui est sous le contrôle de AOx 1 

La recombinaison homologue est une technique utilisée chez les levures car ces évènements
sont plus fréquents que chez les cellules de mammifères donc on a plus de chance d’avoir
une insertion dans un endroit précis de la cellule.  

Le plasmide contient un marqueur de sélection, qui va nous servir après la première

sélection. Dans l’exemple, le premier plasmide contient HIS4 donc ne peut pas se développer
sans présence d’Histidine je crois. Et dans le 2ème plasmide il y a Kam.

On peut utiliser d’autres stratégies pour l’insertion de vecteur chez P.pastoris. Quand on
transforme la levure par un plasmide toujours sous forme circulaire, la région 3’AOX1
contenue dans le plasmide va se recombiner par recombinaison homologue avec 3’AOX1
dans le génome de la levure. On ajoute ainsi dans le génome la séquence de la protéine. La
levure possède toujours le gène AOX1, il est éventuellement inactivé. 
L’intérêt de cette stratégie : il reste la région 3’AOX1, qu’on peut utiliser pour une insertion
additionnelle. Après cette deuxième insertion, on a une cassette d’expression codant la
protéine 1, une cassette d’expression codant la protéine 2, et ainsi de suite. 

Le premier plasmide contient un marqueur de sélection avec lequel on sélectionne les

levures après la première insertion. Pour la deuxième insertion, le plasmide contient un
marqueur de sélection différent.
Ici les marqueurs de sélection sont pour le : 
 Première plasmide : His- (auxotrophie) 
 Deuxième plasmide : Résistance à la Kanamycine 

Insertion par recombinaison homologue

La recombinaison homologue a été utilisée pour inactiver voire éliminer des gènes. 
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On a besoin de synthétiser une cassette qui contient un gène de résistance à un antibiotique

(Exemple : résistance kanamycin). Il y a des séquences qui entourent le gène cible qu’on veut
éliminer. Les séquences identiques entre la cassette et la levure doit être environ 50nt. Si on veut
faire pareil dans un mammifère, il faut plutôt ajouter 2000nt. Enzyme de restriction puis
recombinaison homologue. Ensuite on les cultive avec de la kanamicyne. Si on travaille avec une
levure diploïde on peut former des spores qui vont hériter de soit le gène muté, soit le gène sauvage.
Ces spores haploïdes auront les gènes mutés.

Recombinases

On peut utiliser des recombinases qui vont reconnaitre des séquences spécifiques et qui vont
provoquer la recombinaison entre ces séquences.
Les recombinases reconnaissent que 1 séquence unique. 
Cre reconnait des séquences ou des site (loxP). La partie
verte : FRT qui reconnait violette : FLP.

Si on regarde la séquence reconnue par la recombinase

Cre. On a environ 15 bases puis en rouge on a le cœur de
la séquence puis encore 15 bases. Les 15 de chaque côté
sont des palindromes inversés. La séquence rouge n’est
pas palindromique mais très importante. Cre provoque la
recombinaison entre 2 sites loxP identiques qui sont dans
la même orientation. Sur une molécule d’ADN, il faut que
les loxP soit distant d’au moins 82pb.

Un dimère se fixe sur la région 5’des 2sites. 

Un dimère se fixe sur la région 5’ des deux sites, un dimère se fixe sur la région 3’ des deux sites. On
prend la première moitié du premier site et on assemble la deuxième moitié du deuxième site. Donc
on a un début de flèche verte, la fin en violet et inversement. 

D’abord on insert les sites loxP. On a déjà préparé notre vecteur avec les sites loxP qui sont dans la
même orientation autour du vecteur. Ensuite on transforme la levure avec ce plasmide, grâce à Cre.
Applications de Cre/lox : 
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 Insertion : si on veut insérer une séquence ADN dans un endroit précis dans un génome, on
insère d’abord un site loxP à l’endroit où on veut l’insertion, par recombinaison homologue
naturelle. 
Le vecteur contient deux sites loxP ayant la même orientation. On transforme la levure avec le
plasmide, on ajoute un deuxième plasmide codant la recombinase Cre. On obtient ainsi le génome
avec deux sites Lox et le gène d’intérêt entre les deux. 

Comment on obtient ce résultat  ? 

Il y a trois sites loxP : un dans le génome (rouge) et deux dans le plasmide (violet et bleu). Au milieu,
le gène d’intérêt (vert). 
On obtient donc ½ site loxP rouge à chaque extrémité. Une partie 5’ ne se recombine qu’avec 3’. 
Le plasmide finira avec un site 5’ et un site 3’ et le génome aura deux sites 5’, deux sites 3’ et le gène
d’intérêt.
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 Excision : on insère en amont et en aval de la séquence d’intérêt des sites loxP. On exprimer
ensuite cre dans la cellule. Avec le même schéma qu’avant, on obtient le résultat du diapo. 
Cette modification du génome ne modifiera pas la physiologie du génome parce que les sites loxP ne
seront pas présent dans le génome (contrairement à l’insertion). 
 Inversion : en vert = gène de résistance à la kanamycine 
On transforme la levure par une cassette avec un gène de résistance à la kanamycine. Le gène de
résistance est entouré des sites loxP (le gène est donc Ploxed). On ajoute ensuite les séquences qui
entoure les gènes que l’on veut remplacer (séquences violette et verte). 
On exprime ensuite Cre, donc on élimine le gène codant la résistance à la kanamycine. 
A la place du gène d’origine, on obtient un site loxP. On peut recommencer avec un deuxième gène
en changeant les séquences qui entourent la cassette, mais on utilise toujours la même résistance
pour sélectionner le clone. 
Si la séquence est entourée de deux sites loxP de sens opposés, on peut éventuellement avoir une
inversion de la séquence. 

Inversion : Si les gènes sont entourés par des sites lox orienté dans le sens inverse, il peut y avoir
éventuellement une inversion de la séquence. Ce n’est pas vraiment utilisé parce que c’est de la
merde 

Bacculovirus et cellules d’insectes

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