6.

20B 2023 Modulation de l’activité enzymatique Kira Weissman

Petit rappel sur la cinétique enzymatique :

Modèle le plus simple de l’activité enzymatique  :

Equation de Michaelis Menten :

Vmax : constante qui correspond à la concentration

maximale de produit que peut produuire l’enzyme
par unité de temps à saturation (M.s-1)
Km : constante Michaelis-Menten qui dépends des
deux étapes de réaction. C’est la concentration de
substrat pour avoir Vmax/2 (M)
Kcat : = Vmax /[E0] Fréquence représentant le nombre maximum de molécule de substrat converti en produit par
unité de temps pour chaque site actif. (S-1)

Si [S]>>>>Km : Vi = Vmax
Si [S] = Km : Vi = Vmax/2
Si [S]<<<Km : Vi = Vmax

Pour le mécanisme le plus simple, kcat=k2 car il y a une seule étape chimique.
Ce n’est pas toujours le cas par exemple le modèle cinétique des protéases à Ser est :

Kcat/Km : Kapp de 2ème ordre pour la réaction entre E et S.

 Correspond à l’efficacité catalytique (s-1.M-1) Kcat /Km = 108-109M-1.s-1

 Donc kcat reliée à ES

 Kcat/Km reliée à l’E libre

Modification de l’activité enzymatique : effet de la température et du pH

Facteur qui modifient l’activité enzymatique  :
1. [enzyme] : fonction de l’équilibre entre sa synthèse et la dégradation/sécrétion (en effet sur l’état
oligomérique)
 Vi est proportionnelle [E]
2. [Substrat], [produit]
 Vi est proportionnelle [S]
3. pH, température, environnement oxydo réducteur, force ionique…

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4. Agents modulateurs : comosés qui se fixent à l’enzyme.

- Covalente ( phosphorylation)
- non-covalente (allostérie)
5. Localisation des enzymes dans des compartiments cellulaires spécifiques : Peut avoir un effet sur tous les
autres facteurs

Effet d’une variation de la T°C

Permet de déterminer des informations
complémentaires.
Au cours de l’augmentation de la T° :
1. Augmentation de la température donne de
l’énergie aux molécules leur permettant de
réagir
2. T° optimal pour l’enzyme.
3. Phase de dénaturation
4. Teta’ = température d’arret

2 moyens d’augmenter la vitesse :

6. Diminuer ΔG¥ (ceux qui font les enzymes)
7. Augmenter la T°C

Q10 : Coefficient de température

Facteur du progrès d’un système chimique ou
biologique quand on augmente la température.

Il ne dépend que de 2 mesures d’activité :

8. R1 = K,V,… à T1
9. R2 = K, V, … à T2
Où T2=T1 + 10

Pour les réactions biologique (enzymatique) : Q2≈2

- Q10 = 1, si la vitesse de la réaction est complètement indépendante de la température
- Q10 > 1, si la vitesse de la réaction augmente avec la température
 Plus une réaction est dépendante de la température, plus la valeur de Q10 sera élevée

Un moyen plus rigoureux : Loi d’Arrhenius

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Inactivation pat le froid

Pour des T en dessous de la T optimale.
Les interactions hydrophobes sont moins efficaces :
- Dénaturation de la protéine
- Dissociation d’un oligomère
- Perte d’activité

→ Si augmentation de la température :
▫ Faible : Perturbations des liaisons faibles des structures II, III et IV des protéines
= Inactivation réversible = perte réversible d’activité
▫ Forte : Dénaturation des protéines
= Inactivation irréversible = perte irréversible d’activité

Cela entraine une cassure dans le graphe d’Arrhénius.

Conclusion : Il faut choisir soigneusement la gamme de T à utiliser pour calculer Ea. Il faut une gamme restreinte et il
faut établir en fonction de l’enzyme en particulier.

Estimation des paramètre énergétique :

A partir de Ea on peut déterminer d’autre paramètre :
- ∆H = Ea- RT
- ∆G = RT ln(K)
- ∆G = ∆H - T∆S

Etude de la phase de dénaturation :

V inactive = K inactive x [E]
Log([E]/[E0] = -(kinact/ 2,3) . t
Il est difficile de mesuree la concentration en enzyme donc on mesure l’activité résiduelle en fonction du temps.
A est proportionnelle à E donc Log([E]/[E0] = -(kinact/ 2,3) . t  Log([A]/[A0] = -(kinact/ 2,3) . t

− Ea
Kinact = A e RT (relation de k et
T)

→ On s’attend à ce que E a soit positive car il faut de l’énergie pour

casser des liaisons.

Effet d’une variation du pH sur l’activité enzymatique :

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Le principal objectif des études de pH est d’identifier le ou les groupement(s) ionisable(s) impliqué(s) au niveau du
site actif de l’enzyme
 Détermination du/des pKapp
 Détermination du pHoptimum

Le pH optimal peut suggérer les conditions dans lesquels l’enzyme travaille. Par exemple le pH optimal des enzymes
qui sont dans l’estomac est très faible.

Le pH peut agir à 2 niveaux :

1. Sur le S, si le S comprend des groupes fonctionnelles ionisables.
 L’état d’ionisation peut avoir un effet sur la fixation (préférence pour un état) et du coup sur l’activité
 On doit travailler dans une gamme de pH ou l’état d’ionisation su S ne change pas.

2. Sur l’E et son activité :

- Changement de l’état d’ionisation de certains résidus (effet réversible, si on revient au pH initial on
retrouve toute l’activité
- Dénaturation de l’enzyme (effet irréversible)  pas voulu donc on travaille avec des pH ou les
enzymes sont stables : zone de stabilité

Comment définir cette zone de stabilité ?

1. Préincubation pendant un temps fixe à pH varié et on mesure l’activité résiduelle au pH optimal.
 Si toute l’activité de l’enzyme est retrouvé on est dans la zone de stabilité.

Rappel chaine latérales ionisables :

- Basique : lysine arginine et histidine

- Acide : glutamate aspartate
- Tyrosine OH ionisable
- Cystéine avec le SH ionisable

Quels sont les rôles résidus clés :

1. Rôle à la fixation du S
2. Rôle catalytique
3. Rôle structural
Ils ont un effet sur l’activité enzymatique
CONCLUSION : réactions enzymatiques doivent se faire en milieux tamponnés pour éviter les fluctuations de pH et
avoir des groupement ionisable stables.

Mesure de l’effet du pH sur la catalyse :

On mesure Vi en fonction du [S] mais à différent pH dans la zone de stabilité prédéfinies au préalable. On peut alors
déterminer les paramètres cinétiques classiques à chaque pH.

Ensuite on utilise le principe de la conservation de la masse pour obtenir :

[E]0=[E]- + [EH2+] + [EH] + [EHS]
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Mais, on veut une expression pour [E]0 en termes d’[EH], la concentration de la forme active :

- Vmax app ne change pas car le même dans les 2 équations

- Km change : Km app varie en fonction de k2e, k1e et [H+] et donc du pH
 Comme on a une dépendance au pH pour k1e et k2e on va pouvoir déterminer les paramètres.
 On peut utiliser la variation de KM pour déterminer pK1e et pK2e
 pKm apparant = constante – pH

Si [H+] ente ke1 et ke2 :

- Km app = Km donc y = constante
- PH opt = (pk1e + pk2e)/ 2

Donc on travaillait avec l’enzyme libre

Modèle plus complexe/réaliste

Modèle qui prend en compte les ionisation
On travaille avec l’enzyme sous forme complexe et dans l’enzyme libre.
L’intérêt de pouvoir déterminer pK1e, pK1es , pK2e, pK2es

Conclusion :
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- Quand on s’intéresse à l’enzyme libre : on regarde Vmax et Kcat/Km

- Quand on s’intéresse au complexe ES : on regarde Kcat.
 On cherche là les comparer.

Quand on trace les log (Vmax ou Vmax/Km) en fonction du pH.

 L’intersection des 2 oblques avec l’horizontal → les pK
 On peut également tracer directement Vmax ou Vmax/Km en fonction du pH .On obtient une courbe par
supposition. La courbe en cloche est la somme des 2 effets.
 Le point d’inflection → pK

Détermination des valeurs des différents pKs d’ionisation qui ont un effet sur la réaction enzymatique
 Hypothèses sur la nature des groupes impliqués dans l’activité catalytique
MAIS réponse ambiguë car les pKs des groupes ionisables dans les protéines peuvent être considérablement déplacés
suivant leur environnement
Le pKa ne donne pas une preuve directe de quel résidu il s’agit. Plusieurs résidus peuvent avoir le même pKa, celui-ci
varie. Le pKa n’est qu’une suggestion.

Cas de la ribonucléase A :

Une endoribonucléase (du pancréas bovin) qui coupe
préférentiellement après les nucléotides à pyrimidine (3′ de U/C),
en hydrolysant la liaison entre le phosphate et le carbone 5' du
nucléotide suivant (liaison phosphodiester) entrainant la
libération de Py 3′-phosphate

Stratégie catalytique :
1. Catalyse basique générale par HIS 12  Activation de l’hydroxyle en 2’
2. Catalyse covalente assisté par le substrat.
3. Catalyse acide générale par HIS 119 pour stabiliser le GP de type RO-
4. Catalyse électrostatique par la lysine et phenilalanine pour stabilisé le phosphooxyanion.  Oxygène ∂-

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1 Relations structures/fonction
a. Phosphoglycérate kinase
b. Déshydrogénase
c. ADN topoisomerase
2 Coopérativité et allostérie