SECTION 5

a. Représentation en double inverse (Lineweaver et Burk) :

Expérimentalement, il n’est pas possible de déterminer Vmax car on ne connaît
qu’une valeur approchée. On peut retrouver les deux valeurs importantes Vmax et
Km grâce à différents traitements mathématiques, parmi lesquels la représentation
en double inverse.
Représentation en double inverse : 1/V = f (1/S ). Le problème principal de cette
méthode est la prépondérance des faibles de S et de V, pour lesquelles l’incertitude
est pourtant la plus grande qui peut conduire à des estimations fausses. Cette
représentation ne devient donc intéressante que pour des valeurs de [S] élevées,
donc dans des conditions « saturantes ».

Figure 1: Représentation en double inverse

1
 La droite a une pente de 1/Vm, dont l’extrapolation donne –1/Km à l’intersection avec l’axe
des abscisses.

1 KM
=V
MAX V MAX [S ]

Figure 2: Diagramme de Double inverse

• Signification de Km
Déterminer la valeur de Vmax ou 1/2 de Vmax correspond à la même démarche, sauf
qu’une est possible expérimentalement mais pas l’autre.

Km a la grandeur d’une concentration et représente l’affinité de l’enzyme pour son substrat.

2
 Lorsque Km augmente l'affinité de l'enzyme pour son substrat diminue. Lorsqu'on compare 2
substrats possibles d’une enzyme, leurs Km respectifs sont différents (Km2 > Km1). C
ela signifie que, pour atteindre Vmax2, il faut une concentration en S2 supérieure à la
concentration en S1 nécessaire pour atteindre Vmax1.
• Si l’enzyme a un KM faible elle aura une efficacité maximum pour des faibles concentrations
en substrat
• KM est très variable, elle est fonction de la T et du pH.

a. La constante catalytique et l'efficacité catalytique

Kcat est aussi appelé le ‘Turnover number’ : C’est le nombre de cycle d’une enzyme
qui est égale au nombre de molécules de substrat converties en produit par unité de temps par
un seul site actif de l’enzyme à saturation. La valeur de kcat (s-1) = k2, dans les réactions
possédant un mécanisme de type Michaelis-Menten.

kcat = MAX

[E] T

La valeur inverse 1/kcat représente le temps requis pour convertir 1 molécule de substrat
en produit. L'efficacité enzymatique peut être calculée lorsque l'enzyme est non-saturé, [S] <<
KM c'est-à-dire quand beaucoup de sites sont libres. Dans les conditions physiologiques, il est
très rare qu'un enzyme soit saturé, puisque la concentration du substrat est généralement
inférieure au KM de l'enzyme. Dans les conditions où la concentration d'enzyme libre est à peu
près égale à la concentration d'enzyme total, [E] de [E]T. Les paramètres cinétiques d'un
enzyme permettent de mesurer kcat/KM :

kcat = k 2 = k1k 2
K M K M k-1 + k 2

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Ce rapport est maximum lorsque k2>>k-1 . Lorsque la formation de P est rapide par rapport à
sa décomposition, on obtient alors :

kcat/KM s'approche de la valeur de k1 .

Les enzymes dont kcat/KM est de l’ordre de 108 à 109 M-1S-1 catalysent une réaction
pratiquement à chaque fois qu’ils rencontrent une molécule de substrat ; C’est le cas de
plusieurs enzymes comme par exemple : Acetylcholine esterase – catalase – fumarase –
superoxyde dismutase. Ces enzymes ont atteint la perfection catalytique.

Exemples : fumarate hydratase qui est hautement spécifique pour le fumarate et le dérivé fluoro.
Les valeurs de constantes catalytiques, de Michaëlis, de l'efficacité catalytique ceci montre que
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kcat et Km varient d'une façon importante, mais le rapport kcat/KM varie autour de 10

Tableau 1: exemples de kcat/Km

Substrats kcat/Km (M-1 s-1)

Fumarate 1.6 x 108
Fluorofumarate 9.8 x 107
Chlorofumarate 2.0 x 105
Bromofumarate 2.5 x 104

Tableau 2: Les paramètres catalytiques d’enzymes

Enzymes Substrats
-1 -1 -1
kcat (s ) KM (M) kcat /KM (s M )

4 -5 8
Acétylcholine Acétylcholine 1,4 10 9 10 1,6 10

Estérase

Anhydrase
6 -2 7
CO2 1 10 1,2 10 8,3 10

- 5 -2 7
Carbonique II HCO 3 4 10 2,6 10 1,5 10

4
β-lactamase benzylpénicilline
3 -5 7
2 10 5 10 4 10

Catalase
7 1,01
7
H2O2 4 10 4 10

Fumarase Fumarate
2 -6 8
8 10 5 10 1,6 10

Malate
2 -5 7
9 10 2,5 10 3,6 10

3 -5 7
Penicillinase Benzylpenicilline 2 10 5 10 4 10

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ii) Plus qu'un intermédiaire

k1 k2 k3

⇌
‡
E+S ES ⇌ ES ⇌E+P
k-1 k-2 k-3

où ES‡ représente un intermédiaire activé

En appliquant les équations « état stationnaire », on obtient la même
forme d'équation que celle de M-M réversible sauf que l'interprétation des
Vmax et Km pour les réactions en avant et de retour seront plus
compliquées puisqu’ils représentent des fonctions de six paramètres
cinétiques k1, k2, k3, k-1, k-2, et k-3.

- ceci est également juste s’il s’agit de trois ou plus intermédiaires

Il n’est pas possible de caractériser une réaction de plus qu’un

seul
intermédiaire à partir des quatre paramètres cinétiques : V fmax , V rmax ,
P
KSM , et K M,

Les mesures cinétiques faites en régime stationnaire fournissent une

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description phénoménologique du comportement de l’enzyme et laissent

la nature des intermédiaires indéterminée. Les intermédiaires doivent être
caractérisés par d’autres moyens, par exemple la spectroscopie. Une
analyse en régime stationnaire ne peut pas démontrer de façon non
équivoque le mécanisme d’une réaction. Cependant si les paramètres
cinétiques ne sont pas cohérents avec un mécanisme, ce mécanisme doit
être rejeté.
iii) Inhibition par substrat

Décroissance de la vitesse v à hautes concentrations de substrats. Dans

la représentation double réciproque, ceci signifie une courbure
croissante à la valeur 1/[S] faible. Une explication possible est la liaison
avec un 2e site de substrat de faible affinité qui inhibe l'activité