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Objectifs de la leçon
1- Définir les termes enzymes, substrat, produits
2- Établir l’équation de Michaélis- Menten
3- Représenter graphiquement l’équation de
Michaélis- Menten
4- Déterminer 3 méthodes de linéarisation de
l’équation de Michaélis- Menten
I-Généralités
• Définition des enzymes :
- Composés protéiques
- Biocatalyseurs spécifiques : modulateurs des
réactions chimiques
- L’activité enzymatique est intimement liée à la
structure tridimensionnelle
- Perte d’activité par dénaturation protéique
I- Généralités
Propriétés générales des enzymes
- Elles ne créent pas les réactions
- Elles accélèrent la vitesse des réactions
chimiques
- Elles abaissent l’énergie d’activation et augment
la concentration des substrats à l’état activé
- Elles ne se perdent pas dans la réaction
- Elles n’interviennent pas dans l’équilibre des
réactions chimiques réversibles
I- Généralités
Propriétés générales des enzymes (suite)
- Les enzymes agissent à de très faibles
concentrations
Activité moléculaire spécifique (AMS) :
103<AMS<106
I- Généralités
Propriétés générales des enzymes (suite)
Les enzymes sont spécifiques :
• Spécificité de fonction
• Spécificité de substrat
• Spécificité optique
Ethanol Acétaldéhyde
- Faits marquants : transfert d’hydrogènes et d’électrons
III-Grandes fonctions enzymatiques
III-2. Les réactions de transfert
Exemple :phosphorylation du glucose
Glucose + ATP Glucose-6 P + ADP
Enzyme de catalyse = transférase
III-Grandes fonctions enzymatiques
III-3. Réactions d’hydrolyse
- réactions réversibles
- Enzyme de catalyse : hydrolases
- Exemple :
CH3-CO-O-CH2-CH2-N+(CH3)3 H3-COOH + OH-CH2-CH2- N+(CH3)3
S+E ES P + E
Remarque :
- S= substrat; E = Enzyme; P = Produit
- Disparition de S se traduit par l’apparition de P
IV- Cinétique enzymatique
Vitesse de la réaction (V)
-Nombre de molécules de substrat (S) transformées en
produit (P) par unité de temps.
V = ‑ d[S] = d[P]
dt dt
- Ordre de réaction 0, 1 ou 2 en cinétique chimique
A…B
V = ‑ d[A] = K[A]
dt
α = ordre de la réaction; K = constante de vitesse
IV- Cinétique enzymatique
Réaction du premier ordre :
- transformation d’un seul substrat
- [S] est une fonction exponentielle décroissante du
temps et de K la constante de vitesse:
Ln [S] = -Kt + Ln [S0] d’où
V = ‑ d[S] = d[P] = K1[S]
dt dt
T1/2=durée de consommation de la moitié de [S]
T1/2 = Ln2/K1
IV- Cinétique enzymatique
Réaction de second ordre :
- réaction où deux substrats réagissent entre eux
pour donner un ou deux produits
A + B …… C
V = d[C] = K[A] [B]
dt K
Remarque : V en Ms-1 et K en M -1 S –1
T1/2 = 1/(K2 [A0])
IV- Cinétique enzymatique
Application à la réaction enzymatique
- 2 étapes essentielles : formation du complexe ES et
étape de catalyse avec apparition de produit (P)
E+S K1 ES K2
E+P
K-1
Remarque :
- ES = complexe de Michaelis – Menten
- ES se dissocie en P et en E. La constante est
appelée constante catalytique K cat (en s -1 )
IV- Cinétique enzymatique
Vitesse initiale
V0 = d[P] = Kcat [ES]
dt
Hypothèse de Brigg et Haldane
- notion d’état stationnaire :
Va = K1[E][S] = Vd= K-1 [ES] + Kcat [ES]
IV- Cinétique enzymatique
Equation de Brigg – Haldane
K1[E][S] = K-1 [ES] + Kcat [ES]= (K-1 + Kcat) [ES] et
(K-1 + Kcat)/ K1 = Km
D’où [E][S] = Km [ES]
Km = constante de Michaelis .
Remarque : Km s’exprime en molarité (ou M), c’est
une concentration.
IV- Cinétique enzymatique
Equation de Michaelis – Menten
V0 = Vmax[S] = équation de MM
Km + [S]
V- Représentation graphique
Cinétique Michaélienne
Courbe de Michaelis-Menten
Vmax
Vmax/2
[S]
Km
V- Représentation graphique
Linéarisation de l’équation de MM
Équation de Lineweaver- Burk (LB)
1 Km 1 1
( )
v V max [ S ] V max
Droite de Lineweaver-Burk
1/V
2/Vmax
1/Vmax
1/[S]
-1/Km
V- Représentation graphique
Linéarisation de l’équation de MM
Transformation d’Eadie-Hofstee
V
Vmax
v/[S]
Vmax/Km
V- Représentation graphique
Linéarisation de l’équation de MM
par Transformation selon Hanes
[S]/V
Km/Vmax
[S]
-Km
Modulation de l’activité enzymatique
Objectifs de la leçon
1- Décrire les différents types d’inhibition
enzymatique
2- Déterminer les constantes Km et Vmax en
absence et en présence d’un inhibiteur compétitif
non compétitif ou incompétitif
3- Représenter la cinétique en absence et en présence
de de chacun des différents inhibiteurs ( compétitif
non compétitif ou incompétitif)
4- Comparer les profils cinétiques de l’enzyme à
cinétique michaélienne et de l’enzyme allostérique
VI- Modulation de l’activité enzymatique
Effecteurs physiques
Effet du pH sur l’activité enzymatique
- activité enzymatique maximale au pH optimum.
Effet de la température sur l’activité enzymatique
- activité enzymatique maximale à température
optimale
- L’augmentation de la température peut dénature
(perte de l’activité enzymatique)
Récapitulatif des effets pH et température
sur l’activité de l’enzyme
Activité relative Activité relative
3 7 12 pH 10 40 70
Température
VI- Modulation de l’activité enzymatique
Activateurs et Inhibiteurs enzymatiques
- Certains composés agissent sur l’activité
enzymatique :
en la favorisant (ce sont les activateurs),
ou en la défavorisant (ce sont les inhibiteurs
• Inhibiteurs réversibles compétitifs
• Inhibiteurs réversibles non compétitifs
• Inhibiteurs incompétitifs.
VI- Modulation de l’activité enzymatique
Inhibiteurs réversibles compétitifs (IRC)
- Les IRC se lient de manière réversible au site
actif de l'enzyme et en bloquent l'accès au
substrat.
- IRC et substrat (S) souvent analogues structuraux
d’où la compétition entre IRC et substrat (S)
Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs
Réversibles compétitifs
Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs
Réversibles compétitifs
Devenir des constantes cinétiques K M et Vmax
K M
Dans l’équation de Michaelis-Menten K M est remplacé
par :
KM' = KM • (1 + [I]/KI )
Vmax
La vitesse maximale v reste la même.
Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs
Réversibles compétitifs
Représentation graphique de Lineweaver-Burk
1/V
E + S + IRC
E+S
VI- Modulation de l’activité enzymatique
Inhibiteurs réversibles non compétitifs
(IRNC)
E+S
VI- Modulation de l’activité enzymatique
Inhibition incompétitive
- l'inhibiteur incompétitif ne se lie que sur le
complexe Enzyme-substrat (ES)
VI- Modulation de l’activité enzymatique
Effet des activateurs
- petites molécules : cations métalliques
- Association à l’enzyme ou au complexe ES
- Effets délétères des chélateurs de ces ions sur
l’activité enzymatique
VII- Support structural- Mécanisme
d’action – Régulation des enzymes
Site actif
- centre catalytique constitué de groupements
fonctionnels
- groupements fonctionnels non forcément voisins
sur la structure I aire mais rapprochés à la faveur des
autres structures (II aire, IIIaire et IV aire)
- Site actif = cible pour le marquage chimique
VII- Support structural- Mécanisme
d’action – Régulation des enzymes
Marquage du site actif de l’enzyme
- marqueurs présentant une affinité des groupements
du sites
- Marqueur inactive l’enzyme
• Exemple de marqueurs :
diisopropylfluorophosphate (cible :ser);
iodacétamide (cible : Cys); acétylation (cible : -NH 2);
estérification (cible : groupe C00H)
VII- Support structural- Mécanisme
d’action – Régulation des enzymes
Importance relative des AA dans l’activité de
l’enzyme
- AA du site actif : rôle de fixation,d’orientation et
d’activation
- AA collaborateurs : pas d’action directe mais leur
fragilisation fragilise l’enzyme
- AA auxiliaires : participent fixation de S et
expulsion de P
- AA non collaborateurs : rôle non établi.
VII- Support structural- Mécanisme
d’action – Régulation des enzymes
Niveau d’organisation des enzymes
- systèmes poly enzymatiques :cas des enzymes
cellulaires (succession des réactions )
- Exemple de chaîne séquentielle :
E1 E2 E3 E4
A → B → C → D → Produit final
VII- Support structural- Mécanisme
d’action – Régulation des enzymes
Enzymes allostériques
Caractéristiques
- enzymes volumineuses, fragiles (purification
difficile)
- enzymes inactives à 0°C; activité optimale à +20°C
- Enzymes formées de plusieurs sous-unités
- Coopérativité des sous-unités par transition
allostérique
VII- Support structural- Mécanisme
d’action – Régulation des enzymes
Enzymes allostériques
Cinétique des enzymes allostériques
-Allure sigmoïdale (Enzyme allostérique)
contrairement à celle hyperbolique (Enzyme à
cinétique michaélienne)
VII- Support structural- Mécanisme
d’action – Régulation des enzymes
[S]
VII- Support structural- Mécanisme
d’action – Régulation des enzymes
Enzymes allostériques
Désensibilisation des enzymes allostériques
- perte de l’effet coopératif
- Insensibilité aux modulateurs
- Activité enzymatique : l’allure sigmoïde est
remmplacée par une hyperbole (cinétique
michaélienne)
VIII- Les Coenzymes
Généralités sur les coenzymes
- Enzymes distinguées en holoenzymes et en hétéroenzymes
- Hétéroenzyme : apoenzyme + partie non protéique
- Partie non protéique :
• Cofacteur = ion métallique
• Coenzyme = molécule organique (groupement prostétique,
co substrat)
Exemples de coenzymes :
NAD; NADP; FAD; FMN, phosphate de pyridoxal;
pyrophosphate de thiamine, Coenzyme A
IX- Les isoenzymes
Généralités sur les isoenzymes
- Isoenzymes = formes moléculaires d’une même
enzyme
- Formes actives sur le même substrat principal
Éléments de différence :
- Charge
- pH optimum d’activité
- Thermostabilité
- Substrats secondaires
- Inhibiteurs chimiques
IX- Les isoenzymes
Intérêts bio cliniques des isoenzymes
Exemple de la lacticodéshydrogénase (LDH)
- 5 isoenzymes LDH1, LDH2, LDH3,LDH4 et LDH5
- Chaque isoenzyme, tétramérique, est formées à
partir de deux types de sous-unités M et H
- origine tissulaire des sous-unités :
• M : prédominant dans le muscle
• H : prédominant dans le cœur (H = Hearth)
IX- Les isoenzymes
Intérêts bio cliniques des isoenzymes
Profil électrophorétique des isoenzymes LDH
M4 M3H1 M2H2 M1H3 H4
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