Les acides nucléiques ADN et

ARN

Pr. A. Diatta M.D., Ph D

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 OBJECTIFS
1- Décrire l’action des enzymes sur les
acides nucléiques.
2- Définir les termes suivants: Tm, courbe
de fusion de l’ADN, réappariement,
annealing, Hybridation, PCR, RT-PCR
3- Décrire les principales caractéristiques
de la molécule d’ADN
4- Citer les différents types et rôles des
ARN
 Plan
I-Généralités
II- Acide désoxyribonucléique (ADN)
II-1. Caractéristiques de l’ADN
II-2. Structure de l’ADN
II-3.Propriétés physico-chimiques
III- Acide Ribonucléique (ARN)
III-1. Caractéristiques
III-2. Types d’ARN
IV- Applications et Méthodes d’étude
Conclusion
 Introduction
Définition
ADN et ARN sont des polymères de
nucléotides liés par des
liaisons phosphodiester. Et Chaque
nucléotide est formé de base azotée, de
Sucre et de phosphore.

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 Introduction
 Intérêts :
• ADN : il assure la préservation , la
transmission et l’expression des
informations contenues dans le génome.
• ARN : produit de la transcription de l’ADN
qui préside à la synthèse des protéines
• ADN et ARN = cibles des outils de biologie
moléculaire
• ADN et ARN = vaste champ de recherche
Structure générale du Polymère
de désoxynucléotides (ADN)
 Structure Polymère de nucléotides
(ARN) HO OH
P
O O
CH2 o Base
5’
1’
H H
3’
O OH
HO
Liaison 3’ – 5’ P
phosphodiester O O
CH2 o Base
5’
1’
H H
3’
O OH
Représentation du Polymère de
nucléotides / désoxy nucléotides
 ADN/ ARN : d-pA-G-C / G- C- A- Gp
ou A G C

a O- P-3’
a
P P
b b
5’-H-O-
 Caractéristiques de l’ADN
 ADN = Structure bicaténaire i.e. formé de
deux brins
 Chaque brin est un polymère de nucléotides
 Les deux brins sont anti-parallèles
 Les deux brins sont complémentaires
 Les deux brins forment une structure
hélicoïdale
 L’ADN des cellules est contenu dans le
noyau et la mitochondrie
 Structure secondaire de l’ADN

 Repère historique structure ADN

 Découverte Watson et Crick (1953)

 Structure ADN selon Watson et Crick (1953)
10 pb par pas de l’hélice
 Pas de l’hélice = 3,4 nm
 Diamèthélice : 2 nm
 02 sillons : mineur et majeur
 Caractéristiques de l’ADN
Conformation hélicoidale
 Dans l’espace, les deux chaînes du DNA
présentent une conformation
hélicoïdale régulière.
 L’enroulement des deux chaînes se fait
autour d’un axe hypothétique central
pour constituer une double hélice à
rotation droite. Le plus souvent, il s’agit
de la forme B (Rotation droite) qui est
décrite, rarement la forme A (rotation
droite) ou Z (rotation gauche)
 Caractéristiques de l’ADN
Appariement des brins d’ADN
 complémentarité des bases d’ADN
- Appariement des bases se fait entre
A et T avec 2 liaisons hydrogènes
G et C avec 3 liaisons hydrogènes

NB : Dans une molécule de DNA il y a

autant de A que de T et de G que de C. La
somme des bases puriques est toujours
égale à la somme des bases pyrimidiques
des deux brins d’où
A+ G/ T + C =1
Appariement des bases azotées des brins d’ADN

Les bases sont

appariées :
A=T; G≡C

Les bases sont

situées à
l’intérieur de la
molécule
Le squelette sucre
– phosphate est à
l’extérieur.
l’extérieur
 Propriétés Physico-chimiques de l’ADN
 Viscosité
les solutions de DNA sont très visqueuses
à cause de la rigidité de la double hélice
et de la longueur des chaînes
polydésoxyribonucléotidiques d’où la
nécessité de bien les diluer pour
permettre leur étude.
 Absorption dans L’ultra-violet :
absorbance maximale à 260 nm
 Propriétés Physico-chimiques de l’ADN
Effet de la chaleur
 la chaleur dénature le DNA, en séparant
les 2 brins complémentaires.
 Tm = température à laquelle 50 % des
brins sont séparés.
 Tm varie avec la composition en bases.
Tm ↑ avec le % en GC .
 Propriétés Physico-chimiques de l’ADN
 Effet de la chaleur
 La dénaturation est réversible ⇒ les 2
chaînes peuvent se réassocier et on parle de
réappariement ou annealing des régions
complémentaires des brins.
 Le réappariement des brins s’opère pour toute
température < à la Tm.
• si le refroidissement se fait très lentement
le DNA initial est reconstitué
• si le refroidissement se fait très rapidement
⇒ la recombinaison n’est plus possible
 Propriétés Physico-chimiques de l’ADN
 Hydrolyse acide ⇛ acide apurinique
 Les bases puriques sont éliminées
préférentiellement : les emplacements
de désoxyribonucléotides à purine
sont occupés par des groupements
désoxyribose-phosphates
 Les désoxyribonucléotides à
pyrimidine gardent leur place initiale
 Propriétés Physico-chimiques de l’ADN
 Hydrolyse enzymatique : types
d’enzymes
 Exonucléases : phosphodiestérases
- absence de spécificité vis-à-vis
des bases.
- Cibles : 5’ –OH ou 3’-OH libres
 Endonucléases
 ADN : Hydrolyses par exonucléases
 Exonucléases : phosphodiestérases
 Pas de spécificité vis à vis des bases
 attaquent à partir de l’extrémité OH
libre en 3’ ou 5’
 Exonucléase de classe a
 Exonucléase de classe b
 III-1-Hydrolyses par les exonucléases
Exonucléases de classe a
ex : phosphodiestérase du venin de
serpent
 attaquent à partir de l’extrémté 3’ OH
libre en coupant les liaisons de type a.
 exemple 1 :
CpApApU → pU + pA + pA + C

 exemple 2 : d-TpTpCpGp →
 ADN : Hydrolyses par exonucléases
Exonucléases de classe b
exemple : phosphodiestérase
splénique bovine
 attaque à partir de l’extrémité 5’
OH libre en coupant les liaisons b.
 Exemple : dApTpCpG → dAp + Tp +
Cp + G
 ADN : Hydrolyses par endonucléases

Caractéristiques :
 attaquent les acides nucléiques en
plusieurs endroits à l’intérieur de la
chaîne
 Endonucléases spécifiques de base
- Endonucléase de classe a
- Endonucléase de classe b
 Endonucléases spécifiques de
séquences = enzymes de restriction
ADN : Hydrolyses par les endonucléases
 Endonucléases de classe a
ex : la désoxyribonucléase I ou DNAse I
- coupe la liaison a entre un nucléotide
à base purique suivi d’un nucléotide à
base pyrimidique d’un ADN.
exemple : d -pGpCpApCpApAp
↓
d-pG +d-pCpA+d-pCpApAp
ADN : Hydrolyses par les endonucléases
 Endonucléases de classe b
ex: désoxyribonucléase II ou DNAse II
- coupe la liaison b entre un nucléotide à
base pyrimidique suivi d’un nucléotide
à base purique d’un ADN.
ex : d-pGpCpGpTpAp → d-pGpCp + d-
GpTp +dAp
ADN : Hydrolyses par les endonucléases
Enzymes de restriction :
 Enzymes bactériennes
 Cibles : séquences dites palindrome
 Palindrome = portion d’ADN dont les
deux brins constitutifs présentent des
séquences strictement identiques
lorsque l’on lit dans les sens 5’ →3’
 Notion de Palindrome
Laval
Esope reste ici et se repose
L’âme sure ruse mal
Palindrome de l’ADN
Exemple :

5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
Exemple d’enzymes de restriction: EcoRI

5’NNNNNGAATTCNNNNNN3’
3’NNNNNCTTAAGNNNNNN5’

5’NNNNNG 3’OH 5’P AATTCNNNNNN

3’NNNNNCTTAA5’P OH3’GNNNNNN
Enzymes de synthèse des acides nucléiques
 Enzymes Réplication de l’ADN
 ADN polymérases :
 Enzymes de synthèse de l’ARN
 RNA – polymerases ( I, II et III)
 Enzyme de synthèse d’ADN à partir de
l’ARN
 Transcriptase inverse
- ADN obtenu de l’ARN= ADN complémentaire
ou ADNc
 Caractéristiques de l’ARN

 structure ARN comparée à l’ADN

 ARN simple brin (ADN double brin)
 Sucre présent dans ARN = Ribose
 Bases communes ARN et ADN : A, G, C
 Base présente seulement dans ARN : U
( ADN : T)
 Caractéristiques de l’ARN


Types d’ARN
 ARN ribosomiaux (ARNr)
 ARN messagers (ARNm)
 ARN de Transfert (ARNt)
Autres ARN : ARN nucléaires et ARN

 ARN ribosomaux
- représentent la majorité de l’ARN
cellulaire
- siège de fabrication des protéines de la
cellule.
40 S

60 S
ARN messager (ARNm)
 ARNt

RNAt
 ARN : Hydrolyses par endonucléases
Ribonucléase I
- coupe les liaisons b d’un ARN si la liaison a
correspondante est fixée sur un nucléotide
pyrimidique.
Ribonucléase T1
- coupe les liaisons b si la liaison a correspondante est
liée à un nucléotide guanylique.
Ribonucléase T2
- coupe les liaisons b si la liaison a correspondante est
liée à un nucléotide pyrimidique ou adénylique.
 HO OH
P
O O
CH2 o Base
5’
1’ A U G

H H
3’
a a -O- P-3’
O OH
P P
HO b
b
P 5’-HO-
O O
Ribonucléase CH2 o Base
5’
1’
H H
3’
O OH
Applications Structure et Propriétés de l’ADN
 Généralités sur l’étude de l’ADN
Extraction de l’ADN
Cibles : cellules nucléées
• Leucocytes sanguins +++
• Biopsies: villosités choriales
• Cultures de cellules: amniocytes, fibroblastes,
lignées lymphoblastiques
• Milieux biologiques: sérum, LCR, urine, salive,
crachat, exsudat, prélèvement de gorge…..
 Généralités sur l’étude de l’ADN
 Recueil et traitement des échantillons
• Tube de prélèvement :
- EDTA de préférence car EDTA
inhibiteur des nucléases
• Extraction sur sang frais de préférence
• Conservation au maximun
1 – 2 jours à 25°C; 7 jours à 4° C
• Eviter congélation – décongélation qui
entraîne des cassures de l’ADN.
 Généralités sur l’étude de l’ADN
 Méthodes d’extraction
Exemple :
• Méthode phénol -chloroforme est la
méthode de référence
• Plusieurs kits commercialisés
 Généralités sur l’étude de l’ARN
 ARN = matériel fragile
Précautions +++
 Extraction dans la glace et
congélation
 Plusieurs kits commercialisés
Méthodes d’étude de l’ADN et ARN
 Technique d’Hybridation
 Techniques d’Amplification :
 PCR (Polymerase chain Reaction)
 RT-PCR (Reverse transcription – PCR)
ARN → ADNc
 Amplification en bactérie
 Clonage moléculaire
 Electrophorèse
 Hybridation
Principe
Phénomène de reconnaissance de deux
séquences nucléotidiques
complémentaires (séquence cible et
sonde marquée) et d’orientation
opposée, avec établissement de
liaisons hydrogène entre bases
complémentaires appariées.
séquence cible 5’ - - - - - A – U – G – C - - 3’
sonde marquée 3’ - - - - - U – A – C – G - - 5’
 PCR
 Principe
La PCR permet de multiplier une petite
séquence d’acide nucléique double brin
délimitée par deux amorces ou primers.

Etapes de la PCR par cycle

1- Dénaturation : 94°C (1mn)
2- Hybridation des amorces : 50 -60 °C
(1mn)
3- Extension 72°C : (1 – 2 mn)
 Etapes du clonage moléculaire

1- préparation de l ’insert

2 -digestion du plasmide

3- Ligation

4- transformation

5 -sélection
 Electrophorèse ADN

Les gels d’électrophorèse

Le gel: Agarose ou Acrylamide
Tampon: pH basique
Résolution: fonction du pourcentage
0,5 % 1- 20 kb
1% 1- 5 kb
1,5% 0,5 – 2 kb
Coloration: agent intercalant:
Bromure d’éthidium,
 Conclusion
Les acides nucléiques constituent un vaste
champ de recherche. L’avènement des divers
outils de biologie moléculaire en permet de
multiples applications dont le gage de
promotion reste la maîtrise technologique et
l’acceptation par la société. En effet « Le
génome n’est pas sacré, ce qui est sacré ce
sont les valeurs liées à l’idée que nous nous
faisons de l’humanité » Anne Fargot-
Largeault