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Analyses Biologiques
et Contrôle Qualité
Module de Génétique
& Biologie et Moléculaire
La biologie moléculaire:
Analyse au niveau moléculaire de l’information génétique:
Le stockage
La transmission
L’expression
Le contrôle
Discipline au croisement de :
Génétique, Biochimie et Biophysique
Transcription inverse
INTRODUCTION
L`ADN et L`ARN
Exemples:
Méthylation: 5-méthylcytosine
Hydrogénation: 5, 6-dihydrouracile
Bases soufrés : Thiouracile
…etc
N.B.:
Les bases modifiés sont trouvées dans l'ADN et dans
l’ARN, principalement dans les ARNt
Oses des nucléosides et des nucléotides
Les oses des nucléosides, des nucléotides, et, par suite, des
acides nucléiques, sont deux pentoses:
Le D-ribose et le 2-D-désoxyribose.
Liaison ester
Liaison Osidique
Acide phosphorique
Désoxyribose
Structure primaire de l’ADN
L’union entre les nucléotides se fait par l’intermédiaire de liaisons
phosphodiesters reliant le carbone 3’ du désoxyribose d’un
nucléotide au carbone 5’ du désoxyribose du nucléotide adjacent.
Union de plusieurs nucléotides : formation des polynucléotides
Extrémité 5’
Liaison phosphodiester
PO4 libre
(liaison covalente)
5’
Squelette sucre-phosphate orienté
3’
Extrémité 3’
OH libre ADN
A T C G A
Extrémité 5 ’ C1 ’
Extrémité 3 ’
C3 ’
(à gauche) P P P P P OH (à droite)
C5 ’
5’ 3’
p ATCGAOH ou ATCGA : ordre des bases = information génétique
Structure secondaire :
Les travaux de Watson et Crick en 1953 : l'ADN est sous forme de:
double hélice. Deux chaînes complémentaires et antiparallèles
Antiparallèles: 2 brins
5’ → 3’
3’→ 5’
5’ 3’ Complémentarités:
A en face de T : AT
G en face de C: G C
5’ A T 3’
3’ 5’ C G
G C
A T
. .
Appariement des bases 3’ C G 5’
Brin 1 Brin 2
La complémentarité est due :
Encombrement stérique (purine + pyrimidine)
Formation de liaisons hydrogène
Appariement de type Watson-Crick
Distance
entre 2 bases
Droite
Droite
Gauche
La forme A est observée notamment dans les hélices hybrides ADN-ARN. En solution et
dans la cellule, c’est la forme B de l’ADN qui est prédominante. Une forme senestre de
l’ADN étirée en zigzag (ADN-Z) est parfois observée mais dont la signification
physiologique reste incertaine.
L'ADN dans les cellules Eucaryotes
La quantité importante d'ADN stockée dans la cellule (1.4
m dans un noyau de quelques microns de diamètre)
nécessite des techniques d'empaquetage sophistiquées,
capables de le stocker de façon compacte tout en lui
permettant de se répliquer et d'être partagé entre cellules
filles lors de la division cellulaire.
Protéine H1 ADN
attachant l’ADN
Fibre
de 30 nm
Groupe de 8 histones
2x (H2A, H2B, H3 et H4)
Fibre A
Fibre B
Formation du Chromosome
Les protéines non histones
Phénomène d’hyperchromocité
Absorbance
l (nm)
220 260 300
La mesure de l’absorbance à 260 nm permet également :
La quantification ADN et ARN
Pureté des Acides nucléiques
Propriétés topologiques fondamentales de l'ADN
4n
G2
S Mitose
G1
2n
Réplication
conservatrice
Réplication
semi-conservatrice
Mise en évidence expérimentale de la réplication semi conservative
chez les bactéries par Meselson et Stahl (1958)
ADN « mixte »
2 ADN
Brin parental
ADN parental Brin fils
Mécanismes de la réplication
Chez Escherichia Coli : la réplication est assurée par l'ADN polymérase III.
Chez les eucaryotes : la réplication est assurée par l'ADN polymérase α
ADN POLYMERASES
Enzymes de polymérisation des désoxyribonucléotides
Nécessitent une matrice, une amorce
Ont un sens de déplacement précis
La réplication chez les procaryotes
1. Origine de réplication (microscopie électronique: Cairns, 1962)
procaryotes
ori C
Ori C
Dna A: Se fixe au niveau
d’une séquence consensus
Composé de GATCT
3’
5’
Ori C Dna A
Dna B (hélicase),
Dna G (primase)
primosome ...
SSB
3’ 5’
Ori C Dna A
Dna B (hélicase), Dna C
DNA primase
primosome ...
polymérase
SSB
3’ 5’
Ori C Dna A
Dna B (hélicase), Dna C
DNA primase
primosome ...
polymérase
SSB
3’ 5’
origine de la réplication
5’ 3’
3’ 5’
3. Elongation
primosome
brin avancé
DNA hélicase
DNA primase topoisomérase
5’
amorce 5’
ARN
brin retardé
Eucaryotes Procaryotes
Origine de réplication multiple unique
Stabilisation des brins RP-A: Replication protein A SSB
oui oui
synthétisée par α synthétisée par une primase
Amorce ARN suivit par α ou β ou suivit par ADN pol III
dégradé par RNAse H dégradé par l'ADN pol I
trou bouché par α ou β trou bouché par l'ADN pol I
MÉCANISMES DE CORRECTION
Maintenance de l’ADN
L’ADN subit des modifications spontanées multiples engendrant des
anomalies génétiques parmi lesquelles on peut citer les:
Les dépurinations: correspond à la rupture de la liaison entre une
purine (adénine ou guanine) et le désoxyribose auquel elle est
attachée. La dépyrimidination est beaucoup plus rare.
La désamination: correspond à l’élimination d’une fonction amine.
Réparation des dépurinations et des désaminations spontanées
LES ARN (Acides RiboNucléiques)
L'ARN a une structure voisine de celle de l'ADN, pourtant il existe trois
différences essentielles:
L'ose est le ribose et non le désoxyribose.
L'uracile remplace la thymine.
L'ARN est sous forme d'une seule chaîne polynucléotidique.
Des repliements et les appariements par liaisons faibles sont possibles au
sein d'une même chaîne formant des structures IIaires autocomplémentaires
en double hélice de type A souvent sous forme d'épingles à cheveux, de
boucles...
Les ARN sont de 3 types principaux:
ARN ribosomiques: ARNr
ARN de transfert: ARNt
ARN messagers: ARN m
NB: Chez les eucaryotes en + de ces 3 ARN, un grand nombre de petites
molécules d'ARN stables (100 à 300 nucléotides) présentes, dans le noyau
et/ou le cytoplasme, sous forme de ribonucléoprotéines (petits ARN
nucléaires SnRNA pour small nuclear RNA par exemple).
Principales caractéristiques des trois familles
d’ARN chez les eucaryotes
Le même anticodon
Des anticodons différents mais qui correspondent au même
AA (car plusieurs codons du code génétique codent pour le
même AA (“ dégénérescence du code génétique ”)
Brin sens
-35 Pb -10 Pb 1Pb
5’ 3’
-50 Pb TTGACA TATAAT 10 Pb
3’ 5’
Sens de la transcription
Hybride ADN-ARN
Local et transitoire
Deux mécanismes:
Sens de la transcription
Libération de l’ARN
nouvellement synthétisé
Terminaison rho-dépendante:
Modification post-transcriptionnelle
Peu ou pas de modification des ARNm
Il faut pour cela les facteurs de transcription (TF) qui vont se lier au
promoteur.
Addition du « cap » en 5’ :
Méthyle sur l’azote 7 d’une GMP
Mise en place rapide (avant la fin de la transcription)
Protection de l’ARNm des enzymes de dégradation
Addition de polyA
Après transcription, addition d’environ 50 à 250 A
Aide passage vers cytoplasme
Étapes cytoplasmiques :
Maturation du pré-ARNm
Excision et Épissage = coupure des introns, ligation des exons
Les différentes étapes de la transcription
INITIATION
ELONGATION
TERMINAISON
Phase d’initiation:
La zone à transcrire est indiquée par des signaux présents au niveau du
promoteur situé en 3’ du brin à transcrire
Signal de terminaison:
La terminaison est différente pour chaque ARNpol
ARNpol I: Facteur protéique qui bloque la transcription
ARNpol II: La terminaison est couplée à la maturation de l’ARN
ARNpol III: La terminaison impliquerait des séquences riches en U
Formation du complexe d’initiation de la transcription chez
les eucaryotes.
Ce complexe est formé de l’ARN polymérase II et de nombreux facteurs de
transcription. L’un deux, TBP, se lie à la TATA box (séquence consensus
TATAA).
D’autres facteurs de transcription se lient ensuite à TBP et l’ensemble recrute
l’ARN polymérase II qui pourra initier la transcription
+ TF II D
+ TF II A
TBP est nécessaire à l’initiation de la transcription
par chacune des 3 polymérases eucaryotes
Initiation « l’ARN polymérases II »
Fixation simultanée de II B et II A
Fixation du II E et II H
•Capping
•Polyadénylation
•Epissage
L’ajout de la coiffe (capping)
Formation de
la liaison 5'-5' triph.
méthyle sur le N7 du G
Structure de la coiffe
Les Introns sont des régions de l’ADN qui seront éliminés lors de la
maturation des ARNm (régions non traduites)
7700 pb
1872 nucléotides
Les sites d'épissage
Au extrémités des introns existent des séquences consensus:
GU en 5’ (site donneur)
AG en 3’ (site accepteur)
Nucléotides adjacents à GU et AG sont aussi ± conservés
Un A (site de branchement)
entre la bordure 3’ et le A : région riche en pyrimidines
Excision de l'intron par formation d'un lasso
Au site donneur d’épissage G, en 5’ de l’intron, se produit une
hydrolyse entre G et le dernier nucléotide de l’Exon 1. Le P en 5’ du G se
lie de façon covalente au site A (OH en 2’) de branchement
Formation d’une boucle appelée lasso ou lariat
L’extrémité 3’ de l’exon 1 se trouve au voisinage de l’extrémité 5’ de
l’exon 2 et ces nucléotides sont associés par transestérification après
rupture de la liaison du nucléotide à G situé à l’extrémité 3’ de l’intron.
Epissage alternatif
Quelques constats
1. Un organisme unicellulaire, avec un temps de génération très court, doit
pouvoir répondre rapidement à des changements de son environnement.
CAP:
"catabolite activator protein"
Peu de glucose => beaucoup d'AMPc => AMPc-CAP active => liaison à
l'ADN => transcription: utilisation des autres sucres
Beaucoup de glucose => peu d'AMPc => CAP inactive => pas de
transcription => utilisation du glucose
Expression de l’opéron Lactose
Les riborégulateurs
Partie 5’ (non traduite : 5’ UTR) d’un ARNm qui peut lier une
petite molécule cible dont la liaison affecte l’activité du ou des
gènes localisés en aval :
l’ARNm qui contient un ribo-régulateur est directement
impliqué dans la régulation de sa propre activité en fonction de
la présence ou de l’absence de la molécule cible.
Exemple de mécanisme d’action des riborégulateurs
Pendant la transcription, la partie 5’ UTR d’un ARNm contenant un riborégulateur
forme des structures secondaires spécifiques. Ces structures sont des récepteurs pour
des métabolites (M) cellulaires.
Si le métabolite est en concentration suffisante, un complexe se forme entre
le riborégulateur et le métabolite, ce qui réorganise la structure de l’ARNm
et permet la transcription de l’ARNm.
En revanche, en l’absence du métabolite, la structure du riborégulateur
forme un motif tige-boucle (tige terminatrice), ce qui engendre l’arrêt
prématuré de la transcription de l’ARNm et, par le fait même, l’inhibition de
l’expression du gène.
Régulation chez les eucaryotes
La régulation de l’expression des gènes chez les eucaryotes est
différente de celle des procaryotes
Domaines de la chromatine
Les deux formes de la chromatine:
Hétérochromatine : Etat condensé, transcriptionnellement
inactive,
Euchromatine : Ouverte, transcriptionnellement active
2 moyens utilisées pour les changements de forme de la chromatine
Le remodelage et La modification des histones
Le remodelage : repositionnement
des nucléosomes donnant accès à
une région d’ADN
Non covalent
Energie-dépendant
Modifications des histones: (acétylation, méthylation,
phosphorylation)
Les modifications des histones déterminent la structure de la
chromatine :
acétylation: histones acétyl-transférases (HAT), désacétylase
(HDAC)
méthylation, phosphorylation….
L’acétylation des histones induit une décondensation
de la chromatine.
N.B.:
La méthylation est conservée au cours des divisions cellulaires
La méthylation diminue la transcription
Cellules cancéreuses hypométhylées
Régulation de la transcription chez les eucaryotes
Les sites régulateurs d'un gène se situent dans la région 5' non
transcrite du gène promoteur.
Ces sites, au moins au nombre de cinq et constitués de 6 à 15
nucléotides, sont # cis- régulateur.
2. Ponctué:
Codon d’initiation: Codon AUG: Début de la traduction
Codon stop : 3 codons de fin de chaîne : UAA, UAG, UGA: Fin de
la traduction
3. Spécifique:
Chaque acide aminé est spécifié par un ou plusieurs codons qui ne
codent que pour cet acide aminé. Non ambigu
4. Colinéaire:
Il existe une homologie entre la séquence de l’ARNm et la séquence
protéique. L’ordre des codons est le même que celui des acides aminés.
5. Universel :
Le même codon définit le même acide aminé chez tous les êtres vivants.
Il a donc été préservé au cours de l'évolution, sauf quelques exceptions
Exemple :
Sauf pour Met et Trp (un seul triplet), on constate que la 3ème base du
triplet peut varier tout en codant pour le même aa
Cette fluctuation portant sur la 3ème base représente une protection vis-
à-vis des mutations. Une mutation portant sur la 3ème base ne
changera pas l’acide aminé codé et donc la nature de la protéine
La dégénérescence du code fait intervenir des interactions variables
codon anti-codon en 3ème position:
ARNt-Phe ARNt-Leu
ARNt-Phe ARNt-Leu
Ainsi :
La leucine, la sérine l'arginine ont
6 codons chacun
La valine, proline, thréonine, alanine, glycine ont
4 codons chacun
L'isoleucine a 3 codons
La phénylalanine, tyrosine, histidine, glutamine, asparagine,
lysine, cystéine, aspartate et le glutamate ont
2 codons chacun.
Le tryptophane (UGG) et la méthionine (AUG) n'ont qu'un
1 seul codon chacun
LA TRADUCTION
Les ribosomes se déplacent dans le sens 5' vers 3' sur l'ARNm et
synthétisent le polypeptide correspondant de l'extrémité NH2
terminale vers l'extrémité COOH terminale.
L’activation des acides aminés est catalysée par les aminoacyl-tRNA synthétases.
Il en existe au moins une pour chacun des 20 acides aminés.
Ces enzymes sont spécifiques des aa et du tRNA non chargé correspondant.
L’enzyme hydrolyse un ATP en AMP puis active l’acide aminé en liant son COOH
avec le phosphate α de l’AMP. Le PPi est détruit par une pyrophosphatase.
L’acide aminé ainsi activé est transféré ensuite sur une des fonctions alcool du
ribose de l’AMP 3’-terminal du tRNA.
Liaison acide aminé -ARNt
ARNt
Responsables de la lecture du code génétique
et assurent donc la fidélité de la traduction
Initiation:
Association de l’ARNm et de l’Aminoacyl-ARNt initiateur à la
petite sous unité ribosomale,
Suivi par la fixation de la grande sous unité
N.B.
Les deux sous unités sont dissociées dans le cytoplasme
Elongation:
Synthèse du peptide avec la fixation de l’ARNt au site accepteur
(A) et du peptidyl au site (P)
Terminaison:
Fin de lecture a lieu au niveau du "codon STOP "
Initiation de la traduction chez les procaryotes
Après fixation du
complexe d’initiation à
la sous unité 50S, le
GTP est hydrolysé,
l’ARNt initiateur
occupe le site P et les IFs
se dissocient
ARNt-Tyr ARNt-suppresseur
AUG AUC
Différences entre euycaryotes et procaryotes
la traduction assez similaire. Le principe est le même avec quelques variantes.
Il y a des facteurs d'initiation (IF), d'élongation (EF) et de terminaison (RF).
Eucaryotes Procaryotes
Ribosomes 80 s : 40 s + 60 s 70 s : 30 s + 50 s
Coiffe en 5' pas de coiffe
monocistronique polycistronique
séquence de Kozak (5’- séquence SD en -10
ARNm
GCCGCCRCCATGG -3’ où R est A ou G) AUG ou GUG pour le codon
AUG comme codon initiateur initiateur
queue polyA pas de polyA en 3'
ARNt initiateur aa non formylé aa formylé
Si cette protéine est destinée à être incorporée dans les membranes ou les
organites de la cellule, la partie codante de l’ARNm commence par une
séquence de quelques acides aminés qui sert d’adresse pour
l’incorporation de cette protéine dans la membrane.
Reconnaissance de
la SRP par une
récepteur de la
membrane du RE
=> Liaison du
ribosome à la
ribophorine de la
mbra du RE
Le peptide en cours de synthèse est alors dirigé à travers cette membrane pour se
développer dans la lumière du RE. La protéine sera enfin incorporée dans une
membrane ou exportée, à travers l’appareil de Golgi, vers l’extérieur de la cellule.
L’adressage des protéines vers les mitochondries fait appel à un autre type de peptide
d’adressage qui conduit les peptides à traverser la membrane mitochondriale.
Modifications post-traductionnelles
Ces outils ont permis de mettre en place des techniques qui sont
à l’origine du développement de la biologie moléculaire.
I. Méthodes et outils généraux
Chez l’homme
» (2 x 3 109) x 660 / 6,02 1023 6-7 10-12 g/Celllule
600 g d’ADN
Principales étapes de la purification des AN
Différents protocoles pour extraire les AN avec même schéma de principe :
Prélèvement biologique
Solvants organiques
Extraction des AN Agents chaotropiques
Fixation par interaction decharges
Nucléases
Exonucléases Endonucléases
Exo 5’>3’ ou Exo 3’ >5’
DNases RNases
RNase H, A, T1, …
Si l’on suppose que dans l’ADN examiné, l’ordre des 4 bases est
statistiquement aléatoire
Les exonucléases:
libèrent par hydrolyse les nucléotides situés au niveau des extrémités :
5’→ 3’ ou 3’ → 5’
extrémité 5’ Endonucléase extrémité 3’
a
b 3’
P P P P P P OH
5’
Exonucléase Exonucléase
2.2. Copier les acides nucléiques: Les polymérases
Elles permettent de synthétiser soit de l'ADN, soit de l'ARN à partir
d'une matrice ADN ou ARN, le processus s'effectuant toujours de 5' → 3'.
ADN Polymérases
Produit : ADN
Matrice: ADN simple brin + Amorce
Activités exonucléases 3’ 5’ et/ou 5’ 3’ exonucléases : +/-
La Taq polymérase:
Provient de bactéries vivant dans les sources d'eau chaude.
Thermostable et agit à une température voisine de 65°C.
Son utilisation principale est l'amplification enzymatique in vitro
Pas d’activités exonucléasiques
ARN Polymérases
Produit : ARN
Matrice: ADN simple brin
ADN polymérase ARN dépendante (réverse transciptase)
Produit : ADN
Matrice: ARN + Amorce (poly T)
2.3. Coller les acides nucléiques: Les Ligases
Les ADN ligases sont des enzymes qui sont capables de reconstituer la
liaison phosphoester entre le carbone 3’-OH et le phosphate-5’ de deux
nucléotides voisins sur un brin de DNA.
2.4. Marquage de l’ADN
Ln MM en fonction de Rf
Révélations
Coloration chimique des gels
Autoradiographie
Utilisation des molécules fluorescentes
D’autres méthodes de séparation sont également
utilisées:
Dénaturation
complète du DNA 95 °C
Amorce
Boucle en épingle
Les différents types d’hybridation
1 - En solution
Objectif :
Détecter la présence d'une séquence donnée d'un acide nucléique
par l’utilisation d’un fragment d’ADN complémentaire = sonde
Hybridation sur membrane:
Support solide : Membrane de Nylon
Principales techniques:
Southern-blot (hybridation sonde ADN/ADN cible)
Northern-blot (hybridation sonde ADN/ARN cible)
Western-blot (hybridation protéines/Anticorps)
Procédure: Extraction ADN, Fragmentation, Electrophorèse
Transfert, Hybridation, Lavages et Révélation
III. Amplification des acides nucléiques
L’ADN peut être amplifié par clonage: Amplification in vivo
ou in vitro, la PCR (Polymerase chain reaction).
N.B.:
Construits soit à partir de molécules naturelles telles que les
plasmides ou les phages, soit de façon artificielle comme les YAC
(Yeast artificial chromosom), chromosomes artificiels de levure,
BAC….
3. Présentation d’un vecteur : Exemple du plasmide
Origine de
réplication Plasmide : petite molécule
dans la extrachromosomique, d'ADN
bactérie double brin circulaire, de 3 à
10 kilobases. Capable de se
Marqueur de répliquer indépendamment
sélection : du chromosome bactérien et
résistance contre pouvant être transféré d'une
l'antibiotique cellule à une autre.
kanamycine
2. Amplification des acides nucléiques in vitro
Définition:
Amplification exponentielle d’une séquence d’ADN double brin
effectuée in vitro par extension de 2 amorces situées de part et
d’autre de la région considérée à l’aide d’une ADN polymérase
thermostable .
RT PCR
ARNm ADNc
Equation de la PCR:
Xn=X0En
E: efficacité d’amplification
0<E<2; n: nombre de cycles
Si E=2, Xn= X02n
Valeur de CT et quantité d’ADN initiale
+ Concentré - concentré
Séquençage
Etc….
Licence Sciences & Technique
Analyses Biologiques
et Contrôle Qualité
" Biologie Moléculaire "
Fin