BIOLOGIE MOLECULAIRE DE

LA CELLULE
Le dogme centrale de la Biologie
Moléculaire
 BIOLOGIE MOLECULAIRE

4 classes de macromolécules: Glucides (sucre)

Lipides(Gras) Protéines et Acides nucléiques

Synthèse des polymères =

réaction de condensation (qui implique une
déshydratation)

N.B: - La cellule doit fournir de l’énergie

- Des enzymes sont nécessaires
Partie I
La structure des acides
nucléiques
 Molécules simples

Les acides nucléiques sont composés de

molécules simples

- l’acide phosphorique (PO4H3),

-des oses à 5 carbones (pentoses)
- et des bases azotées (purines ou
pyrimidines).
 Ribose, désoxyribose

Désoxyribose = réduction de la
fonction alcool secondaire du
carbone n°2 du ribose

Le désoxyribose confère à l’ADN une

plus grande stabilité propre à sa
fonction de conservation de
l’information génétique
 Bases puriques

Deux bases puriques : adénine, guanine.

Adénine = un noyau purine dont le

carbone 6 est substitué par une fonction
amine
Guanine = un noyau purine dont le
carbone 2 est substitué par une fonction
amine et le carbone 6 par une fonction
cétone

N.B Adénine: seule base nucléique dont la formule ne

contient pas d’atome d’oxygène.
 Bases pyrimidiques

Trois bases pyrimidiques : Cytosine, Uracile, Thymine.

Cytosine: carbone 4, fonction amine

carbone 2, fonction cétone

Uracile: carbones 2 et 4,
fonction cétone.

Thymine: carbones 2 et 4,
fonctions cétone,
carbone 5 est substitué par un méthyl.
 Nucléosides et nucléotides

BASE + SUCRE = NUCLEOSIDE

BASE + SUCRE +PHOSPHATE = NUCLEOTIDE

NUCLEOSIDE + PHOSPHATE = NUCLEOTIDE

Liaison base azotée avec un des

sucres = liaison N-osidique

Liaison nucléoside ( carbone 5 du sucre) avec un

phosphate = liaison ester
 Nucléosides et nucléotides

En résumé, Un nucléotide est formé d’une

base azotée, liée par une liaison osidique avec
un sucre, lui-même lié par une liaison ester
avec un phosphate

Dans le métabolisme des acides nucléiques

interviennent des substrats riches en énergie,
les nucléosides triphosphates
Nomenclature des unités nucléotidiques
 Nomenclature des unités nucléotidiques

On désigne par nucléotides les nucléosides

monophosphates : AMP ou acide adénylique,
dTMP ou acide désoxythymidylique, etc...

Acides nucléiques = polycondensation de

nucléotides
AMP, CMP, GMP et UMP pour les acides
ribonucléiques,
dAMP, dCMP, dGMP et dTMP pour les acides
désoxyribonucléiques
 Deux exemples de Nucléosides

Autres ribonucléosides : guanosine, cytidine et uridine

 Deux exemples de Nucléosides

Autres désoxyribonucléosides : désoxyadénosine, désoxycytidine et

désoxythymidine, souvent appelée thymidine tout court.
 Quelques exemples de Nucléotides

Autres ribonucléotides : l’AMP, le GMP et le CMP

 Quelques exemples de Nucléotides

Acides nucléiques = condensation de très

nombreux nucléotides, liés par des liaisons
phosphodiester.
 Quelques exemples de Nucléotides

Autres désoxyribonucléotides : le dAMP, le dGMP et le

dCMP.
 Quelques exemples de Nucléotides

L’adénosine triphosphate = nucléotide

composé.
Sa structure comporte l’adénine, liée par une
liaison N-osidique au β-D-ribose et trois
phosphates

Les liaisons anhydrides unissant les acides

phosphoriques sont des liaisons riches en
énergie (ΔG ≥ 31 kJ/mol).

L’ATP est un des substrats des RNA-polymérases

 Quelques exemples de Nucléotides

Enzymes utilisant un nucléoside triphosphate

comme substrat ou comme coenzyme, nécessitent
le cation Mg++ comme cofacteur

Autres nucléosides triphosphates :

le GTP, le CTP, l’UTP, le dATP, le dGTP, le
dCTP et le dTTP
Quelques exemples de Nucléotides

Le dCTP est un des substrats des DNA-

polymérases
 Liaisons hydrogène

Liaison hydrogène =
liaison de faible énergie entre deux atomes, l’un
étant riche en électrons donc nucléophile et
l’autre n’ayant que les protons de son noyau donc
électrophile.

L’atome d’hydrogène = électrophile

Les atomes d’azote et surtout d’oxygène =

nucléophile
Les acides nucléiques
 Les acides nucléiques

Les acides nucléiques sont des enchaînements de

nucléosides 5'-phosphates dont l'assemblage
est réalisé par une liaison phosphodiester.

Remarquons que l'ADN peut contenir des bases

méthylées et que l'ARN contient de
nombreuses bases différentes modifiées
La taille des polymères nucléiques

La taille des acides nucléiques est exprimée en trois

unités selon l'usage :
- la longueur
- la masse moléculaire en Dalton (Da)
- le nombre de nucléotides (ou bases), noté b, pour
les molécules simple brin et le nombre
de paires de base, noté pb, pour les molécules double
brin.
 Représentations simplifiées d'un polymère à
l'aide d'abréviations

ARN
ADN
 On distingue plusieurs espèces d’acides
ribonucléiques

rRNA = acide ribonucléique ribosomique, qui

participe à la structure des ribosomes ; 80% ARN
totaux

— tRNA = acide ribonucléique de transfert,

transporteur des acides aminés activés pour la
traduction ; 15%

— mRNA = acide ribonucléique messager, produit

de la transcription d’un gène qui porte
l’information à traduire 5%
ARN fonctionnels (ARNf)
-snRNA : petits ARN nucléaires, 100 à 200 bases, rôle:
maturation des ARNm (épissage) et des ARNr

- snoRNA : petits ARN nucléolaires, ≈100 bases,

maturation des ARNr
-siRNA, miRNA : petits ARN (≈ 20 bases )

-miRNA : micro ARN intervenant dans la régulation post

transcriptionnelle

- siRNA : petits ARN interférants (small interfering

RNA) après exposition à un ARN étranger,
complémentaires à 100% des ARNm cibles
Certains ARN sont doués de propriétés
catalytiques, ce sont des enzymes constituées
d’ARN, que l’on appelle donc des ribozymes.

Dans le ribosome, par exemple, on sait

maintenant que c’est l’ARN ribosomique qui
catalyse la formation de la liaison peptidique, non
les protéines rôle de stabilisation structurale
La double hélice ADN est composée de deux brins
complémentaires appariés par des liaisons
hydrogènes entre les bases,

A s’appariant avec T, et G avec C (appariements

Watson-Crick).

Dans la double hélice, les deux brins d’ADN sont

antiparallèles, leurs polarités 5’ → 3’ étant inversées.
Cette structure, découverte par James Waston et
Francis Crick à Cambridge en 1953
Les molécules d’acide désoxyribonucléiques sont
formées de deux chaînes de nucléotides
hybridés deux à deux sur toute la longueur.
• Les deux chaînes sont antiparallèles,
complémentaires.
Les bases azotées sont tournées vers
l’intérieur, tandis que les riboses et les acides
phosphoriques, hydrophiles sont tournés vers
l’extérieur.
 La structure primaire de l’ADN consiste donc
en deux brins de nucléotides appariés grâce à
des liaisons hydrogènes entre les bases

l’enroulement des deux brins selon une

doublehélice, ce qui constitue la structure
secondaire de l’ADN.

Une double hélice est formée de deux chaînes

antiparallèles d'ADN qui s'enroulent soit à
droite (sens du tire bouchon ou sens des aiguilles
d'une montre) soit à gauche.
La composition en bases

Quelle que soit l'origine de l'ADN, le nombre de

purines est toujours égal au nombre de
pyrimidines : [Pur] = [Pyr]

ou encore [A] + [G] = [T] + [C]

- de plus, les fractions molaires des bases sont telles

que :
A = T et G = C
Cette caractéristique est désignée sous le nom de
règle de Chargaff qu'il observa en 1940
La transcription
Introduction
Introduction

L’expression du génome se fait par deux

mécanismes principaux :
— la transcription.
— la traduction.
Introduction
Introduction

Pour servir de modèle la transcription doit faire la

copie de la séquence d’un brin de DNA,
qualifié de brin « sens » ; l’autre brin en est le
complémentaire on le dit « antisens ».

La transcription
se fait en synthétisant un RNA complémentaire
de la séquence du brin antisens, donc
identique à celle du brin sens.
Le processus de la transcription
 La polymérase lit le brin antisens en
allant dans le sens 3’ → 5’.

Transcription en trois étapes:

Initiation, élongation, terminaison
Les inhibiteurs spécifiques de la transcription

- Groupe Rifamycines: (Rifampicine, rifamycine et

rifabutine). Inhibiteur de l’ARNp en se fixant sur la
sous unité β
- Streptomycines: Inhibiteur de l’ARNp en se fixant
sur la sous unité β (site différent des rifamycines)
- Actinomycines: inhibition de l’élongation en se
fixant à l’ARN sur les paires de bases GC
 Transcription chez les Eucaryotes

Introduction : Particularités du génome

eucaryote
1 – L’initiation et la terminaison de la
transcription
2 – Les modifications post-transcriptionnelles
 Particularités du génome eucaryote

• Diploïde
• Éclaté ou en mosaïque: introns et exons
• Expression compartimentée
• Unité de transcription est monocystronique
Unité de transcription monocystronique
 Chez les eucaryotes: quatre types
d’ARN polymérase

RNA-polymérase I: Transcription des RNA

ribosomiques (18 S- 5,8 S- 28 S)

RNA-polymérase II: Transcription des RNA

messagers et certains des snRNA

RNA-polymérase III: Transcription des tRNA,

rRNA 5S

RNA-polymérase IV spécialisé dans la transcription

de l’ADN
mitochondrial et la synthèse de l’hétérochromatine
chez les plantes
L ’épissage est réalisé par le spliceosome constitué
de protéines associées à des
snRNA : les snRNP (U1, U2, U4, U5, U6)
5’ GU-----------------A---------AG

1 snRNP = 1 snRNA + 10-20 polypeptides

TRADUCTION
Introduction

Traduction: C’est le mécanisme par lequel le flux

d’information va passer de la forme acide nucléique
ARN (alphabet à 4 lettres) à la forme
protéine(alphabet à 20 lettres) selon un code
universel.

La synthèse de la protéine est polarisée et

se fait au niveau des ribosomes

Les ribosomes synthétisent le polypeptide

correspondant de l'extrémité NH2 terminale
vers l'extrémité COOH terminale.
Code génétique
Code UNIVERSEL: c'est le même pour tous les
êtres vivants sauf quelques rares exceptions:

-Certains protistes : un seul codon STOP (UGA); les

autres codent pour un acide aminé.

-Les mitochondries ont leur propre ADN et leurs

propres ribosomes qui sont plus petits (ressemblent à
ceux des procaryotes).
Le code génétique comporte 61 codons pour
signifier les 20 acides aminés qui participent à
la synthèse des protéines : chaque acide aminé peut
être codé par plusieurs codons (de un à
six) qui diffèrent en général par leur troisième
nucléotide.

On dit que le code est dégénéré.

L'ARN de transfert (ARNt)

Deux zones importantes sur l'ARNt :

L’anticodon est une séquence de trois nucléotides
située à l’extrémité de la boucle inférieure du
tRNA, complémentaire et antiparallèle de la
séquence du codon de l’acide aminé correspondant

Chaque acide aminé est lié spécifiquement

(code génétique) par une amino-acyl-tRNA-
synthétase
à l’extrémité 3’ du tRNA dont l’anticodon lui
correspond (tRNA chargé).
Activation d’un acide aminé
Chez les eucaryotes, la coiffe en 5’ de
l’ARNm sert de point de repère.
LA REPLICATION
 Réplication semi-conservative

Les deux brins du DNA parental au cours de la

réplication servent chacun de modèle pour la
synthèse d’un nouveau brin.

Mise en évidence expérimentale de la

réplication semi conservative
chez les bactéries par Meselson et Stahl
(1957)
Asymétrie est liée à l’activité de l’ADN
polymérase:

- Nécessité d’avoir une amorce

- Dernier résidus de l’amorce doit être
apparié et avoir un groupement 3’OH libre
- Présence de nucléotides et du
magnésium Mg2+ dans le milieu
 Sur le brin précoce,
• synthèse se déroule de façon continue
dans le sens 5’-3’ à mesure que le
duplex parental est déroulé.

sur le brin retardé, :

• Une série de fragments (fragments
d’OKASAKI) de 1000 à
2000 pb est synthétisée chacun de 5’ vers 3’.

• Ils sont ensuite reliés les uns aux autres

pour donner naissance à un brin retardé
intact.
L’élongation

- ADN polymérase lie des nouveaux

nucléotides seulement à l’extrémité 3’ (-OH).
Donc, l’élongation se passe dans la direction
5’ à 3’
- L’amorce est utilisé point de départ à
l’ancrage. Cette séquence est synthétisé par
primase.
- Sur le brin complémentaire, l’élongation doit
aussi se passer dans la direction 5’ à 3’ mais
pas en brin continu…l’ADN polymérase forme
des fragments d’Okazaki.
Réplication continue et discontinue
 L’UNITÉ DE RÉPLICATION OU RÉPLICON

• Zone d’ADN répliquée à partir

d’une même origine de réplication

• 1 réplicon unique chez les

procaryotes

• Plusieurs chez les eucaryotes

Réplication chez les eucaryotes
 Réplication chez les eucaryotes

Même système que celui des procaryotes

avec le brin avancé et le brin retardé >>>
Mais, quelques différences
•ADN plus long
•Plusieurs origines de réplication activées de
manière synchronisée et progressant à la
même vitesse (50 nucléotides/s)
•Plusieurs polymérases ayant des
fonctions différentes:

α: synthèse de l’amorce, élongation et

réparation de l’ADN;
β: réparation de l’ADN,
Υ: réplication de l’ADN mitochondriale …
δ: Elongation des brins plus réparation de
l’ADN
ε: Réparation et remplacement de l’ARN au
niveau du brin retardé (Similaire à Pol )
 PROTÉINES ACCESSOIRES DES ADN
POLYMÉRASES (EUCARYOTES)

Le PCNA (Proliferating Cell Nuclear

Antigen)
• Puissant activateur de l’ADN polymérase
δ.
• Active aussi l’ADN polymérase ε mais non
indispensable.
 PROTÉINES ACCESSOIRES DES ADN
POLYMÉRASES (EUCARYOTES)

Facteur de réplication A (RF-A)

• Se fixe sur l’ADN simple brin.
• Indispensable à l’action des polymérases
α et δ.
• Pourrait être impliquée dans les
phénomènes de recombinaison
 PROTÉINES ACCESSOIRES DES ADN
POLYMÉRASES (EUCARYOTES

Facteur de réplication C (RF-C)

• Se fixe sur l’ADN au niveau des zones
où sont synthétisées les amorces.

• a une activité ATPasique ADN

dépendante stimulée par PCNA et RF-A
Structure complexe des chromosomes
(chromatine et protéines histones)
Que faut il retenir ? :
Réplication de l’ADN
-la réplication est semi-conservative et
nécessite la dissociation de la double hélice

-la synthèse est polarisée (5’-3’) et repose sur

l’appariement de bases complémentaires
 FIN
BIOLOGIE MOLECULAIRE
 Professeur:
Dr DUméUS, MD – PhD (DrSc)
Tel: 3413 8595
Email: stanley.dumeus@ueh.edu.ht

Bio Mol
Méthodes de base a connaitre
 Culture cellulaire : ensemble de techniques
utilisées pour faire croître des cellules hors de leur
organisme (ex-vivo) ou de leur milieu d'origine

 Gel d’électrophorèse : méthode de séparation

de l'ADN, l'ARN ou des protéines en fonction de
leur poids moléculaire.
– Western blot (protéines)
– Southern blot (ADN)

 PCR : permet de copier en grand nombre (≈1

milliard) une séquence d’ADN connue, à
partir d'une faible quantité (≈qqs
picogrammes)
Culture cellulaire

 Comment fait-on des cultures de cellules ?

 Obtention des cellules ?

 Les cellules peuvent

provenir
– du sang : ce :
sont des cellules
- d’organes : ce sont des
circulantes non jointives
cellules jointives (au moins
pour les épithéliums)

Cellules sanguines observées Épithélium respiratoire

au microscope électronique
à transmission
 Pour les cellules circulantes :
 Centrifugation par gradient de
densité

croissante
densité
Sang Plasma
centrifugation Lymphocytes + monocytes
Ficoll
Granulocytes
Ficoll
Hypaque Hématies

Culot cellulaire

A noter : pour séparer des objets biologiques selon leur densité, on

utiliser
peut des méthodes de centrifugation dans des milieux
spécifiques
(gradient de sucrose…)
Pour les organes : 2 méthodes
1.utilisation d'un fragment de tissu :
Les cellules se développent à partir du fragment à la
surface du support baignant dans le milieu de culture.

2.fragmentation de l'organe :
le tissu est dissocié mécaniquement et enzymatiquement :
on obtient une suspension de cellules que l'on peut
partiellement purifier. Les enzymes utilisées sont des
protéases comme la trypsine qui coupent les ponts
protéiques entre les cellules.
L'opération peut être faite à 4°C ou à 37°C avec
quelques risques de destructions cellulaires.

• les cellules sont mises en culture : c'est la culture primaire

• elles sont repiquées : c'est la culture secondaire qui doit

trypsine par par une étape de dissociation des cellules à
aussi passer
exemple.
la
Types de cellules cultivées
 Lignées primaires : caractéristiques des « vraies cellules »,
mais difficile à cultiver car elles entrent en apoptose.

 Cellules « immortalisées » : leur durée de vie est

augmentée par l’infection par un virus :
– Lymphocytes B infectés par le virus Epstein Barr (EBV)

– fibroblastes infectés par le virus SV40

 Cellules tumorales
– Cellules transformées artificiellement par un oncogène
(gène dont l'expression favorise la survenue de
cancers)
– ou prélevées chez un patient (HeLa)

90
En pratique

 La stérilité (hotte stérile)

 Flacons de culture

 Etuves aérobie (contrôle de

la pressions en CO 2 +
température)

 Milieux de culture adéquats

91
Applications
 pour faire progresser la recherche fondamentale

 Mais aussi
– dans l'industrie pour des études de toxicologie
– pour les études chromosomiques (caryotype
fœtal)
– pour la production de peau neuve par culture
pour autogreffe ultérieure(pour les grands
brûlés)
– pour la culture des virus (production de
vaccin ou diagnostic direct ou indirect des
viroses).

92
En pratique

93
En pratique

94
Révélation du gel

Marquage
au bleu de
Coomassie

95
Criblage (screening)
 Utilise dans de nombreux domaines de
la biologie et la chimie
 Principe : tester une banque de molécules sur
des plaques-microtitres.
 Chaque puits permet de tester une protéine
codée par cet ADN

7
Méthodes de base a connaitre
 Culture cellulaire : ensemble de techniques
utilisées pour faire croître des cellules hors de leur
organisme (ex-vivo) ou de leur milieu d'origine

 Gel d’électrophorèse : méthode de séparation

de l'ADN, l'ARN ou des protéines en fonction de
leur poids moléculaire.
– Western blot (protéines)
– Southern blot (ADN)

 PCR : permet de copier en grand nombre (≈1

milliard) une séquence d’ADN connue, à
partir d'une faible quantité (≈qqs
picogrammes)
 Gel d’électrophorèse

 Technique permettant de séparer des

molécules chargées en fonction de leur
taille en les faisant migrer à travers un
gel par application d'un champ
électrique.

 Cette technique peut être utilisée pour

séparer des acides nucléiques (ADN ou
ARN, sur gels d’agarose ou
d’acrylamide) ou des protéines (sur gel
d'acrylamide)
Gel d’ADN : Southern Blot
échelle de marqueur de
 gel d’électrophorèse taille
moléculaire (DNA ladder)

– Pour l’ADN, on peut utiliser un

gel d’agarose, moins toxique
que l’acrylamide
 coloration au Bromure
d’éthydium (BET), ou autre
intercalant moins dangereux,
pour visualisation

 si nécessaire,
buvardage : Southern
Blot
99
Gel d’ADN : Southern Blot

100
Interaction KIF3C / FMRP

calibration expérience contrôle

Appât=Cter KIF3C Appât=Nter
 Électrophorèse
• L'électrophorèse est une méthode
utilisée en biochimie et en biologie
moléculaire pour faire la detection d’ADN,
d’ARN.
• Permet de séparer l'ADN, l'ARN ou des
protéines en fonction de leur taille.
• Matrice: en polyacrylamide ou gel
d'agarose
 Principe
• Dans un milieu basique (pH 8), les acides
nucléiques sont chargés négativement.
• Sous l’effet d’un champ électrique, les
acides nucléiques migrent à travers la
matrice vers l’anode.
• Les molécules de plus petites tailles se
déplacent plus rapidement et migreront
plus loin que les molécules de tailles
supérieures.
 Pouvoir de séparation d'ADN
linéaire, double brin
Concentration d'agarose (%, g/100 ml) Gamme de tailles idéales (en kb)

0.3 5 – 60

0.6 1 – 20

0.7 0.8 – 10

0.9 0.5 – 7

1.2 0.4 – 6

1.5 0.2 – 3

2.0 0.1 – 2

Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
 Agarose
• L’agarose est un polymère à base d'agar
purifié.
• Différentes puretés d'agarose sont
disponibles auprès des fournisseurs.
• En général, de l'agarose de haute pureté
(à la solidification lente est utilisé) lorsque
l'ADN doit être extrait du gel après
migration.
 Révélation de l’ADN
• Basé sur l’utilisation des agents d’intercalation
qui fluorescent lorsqu’ils sont exposés a des
rayonnements ultraviolets
• Peuvent être ajoutés directement au gel avant la
migration ou dans le tampon après.
• La méthode de révélation la plus utilisée est
celle au bromure d'éthidium (agent toxique et
mutagène!)
• SYBR Green I (double brin) ou SYBR Green
(simple brin)
• GelGreen ou GelRed
Exemple
 RAPPEL
Qu’est ce que la biologie moléculaire ?
A : rappels sur le génome
Les acides nucléiques
Le DNA circulaire
La chromatine

B: Les outils de la biologie moléculaire

Enzymes

C: Les techniques de la biologie moléculaire

Purification des acides nucléiques
Electrophorèse sur gel
 Plan du cours: RAPPEL
D : Réplication de l’ADN
Définitions élémentaires
Mécanisme de la réplication chez les eucaryotes

E: La Transcription
Les procaryotes
Les eucaryotes
F: La Traduction
Le Code génétique
L’initiation
L’élongation
La terminaison
G : De l ’ADN
aux protéines
.
Le "dogme central" de la biologie moléculaire (actuel)
1953 1970-1980 2008

Réplication Réplication Réplication

ADN ADN ADN

Transcription Transcription Transcription Transcription

Transcription reverse multiple
réverse

ARN
Evolution Epissage
Epissage
ARN
ARN Edition
Formation Edition
de gènes Régulation
Epigénèse
Traduction
Traduction Traduction

Protéine
Protéine
Protéine
Les acides nucléiques

La chaîne d’ADN
La chaîne d’ARN
La polarité d’une chaine d’acide nucléique
Conformation du brin d’AN
Appariement des bases (règle de complémentarité)
La double hélice
Structure
L’ADN
L’ARN
Structure des AN: Caractéristiques des formes
canoniques A et B des AN
Hélices droites
Hélice gauche
 Hélices

g
g

dr
Hélices droites et hélices gauches

La projection d'une hélice selon Hélice droite: rotation anti horaire

son axe est un cercle Hélice gauche: rotation horaire
 34Å
Å
3,4
Méthodes de base a connaitre
 Culture cellulaire : ensemble de techniques
utilisées pour faire croître des cellules hors de leur
organisme (ex-vivo) ou de leur milieu d'origine

 Gel d’électrophorèse : méthode de séparation

de l'ADN, l'ARN ou des protéines en fonction de
leur poids moléculaire.
– Western blot (protéines)
– Southern blot (ADN)

 PCR : permet de copier en grand nombre (≈1

milliard) une séquence d’ADN connue, à
partir d'une faible quantité (≈qqs
picogrammes)
LA PCR
 DEFINITION
• PCR = Polymerase Chain Reaction ou
amplification en chaîne par polymérase

• Synthèse in vitro d’un fragment d’ADN

cible afin d'en obtenir une quantité
suffisante pour le détecter
 L’histoire de la PCR
• 1953 : Découverte de la structure en double hélice de l’ADN par James Dewey
Watson et Francis Harry Compton Crick, (prix Nobel de physiologie ou médecine
en 1962).
• 1956 : Découverte de l’ADN polymérase ADN dépendante (ADN pol I) par Arthur
Kornberg (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1959).
• 1970 : Co-découverte indépendante de l’ADN polymérase ARN dépendante par
Temin HM et Baltimore D (prix Nobel de physiologie ou médecine en 1975).
• 1986 : Première publication publique sur la PCR par Kary Mullis (prix Nobel de
chimie en 1993).
• 1988 : Première PCR réalisée avec une ADN polymérase thermostable, provenant
de Thermus aquaticus, par Saiki RK.
• 1991 : Première détection du produit de PCR par sonde (sonde d’hydrolyse) par
Holland PM.
• 1992 : Invention de la PCR en temps réel par Higuchi R.
• 1996 : Mise au point des polymérases temporairement inactives et activables par
la chaleur par Birch DE.
Extraction des acides nucleiques
 Plasma, sérum, sang total (sur papier buvard), ou tissu
peut être utilisé
 Détergent pour lyser les membranes cytoplasmique et
nucléaire
 Centrifugation pour séparer les lipides (au fond du
tube) des acides nucléiques (surnageant)
 Silice ou mini-colonne utilisée pour isoler
l’ARN/ADN
 Tampons de lavage et/ou enzyme protéinase K utilisé
pour dégrader et enlever les protéines
 Précipitation des acides nucléiques avec l’éthanol
 Élution dans de l’eau distillée ou dans un tampon
d’élution.
 Réaction de polymérisation en chaîne
(PCR)
• Une méthode qui sert à realiser plus d'un
milliard de copies d´ADN en moins d'une
heure
• Utilise la capacité naturelle de l’ADN
polymérase à copier l´ADN.
• PCR peut servir à identifier une espèce ou un
individu précis à partir d´un seul fragment d
´ADN.
• Santé, criminalistique, et archéologie
 Pratiques du labo de biologie moleculaire

• Le labo PCR idéal est divisé en 3 salles: Salle d’extraction, salle

de préparation des réactifs, et salle d’amplification/détection.
• La détection du produit PCR (amplicon) se fait dans une salle
en dehors des 3 salles si les tubes doivent être ouverts.
• A cause de sa haute sensibilité, la PCR est sujette a la
contamination
• La re-utilisation des réactifs est déconseillée
• Les réactifs contaminés doivent être jetés
• Les gants sans poudres doivent être utilisés
• Une blouse dédiée à chaque salle
 DEFINITION
• Nécessite :
- Une matrice d'ADN
- dATP, dGTP, dCTP, dTTP
- DNA polymerase = Taq polymérase (Thermus
aquaticus)
- Tampon TaqDNA polymerase dont MgCl2 (Cofacteur
enzymatique)
- Un couple d'oligonucléotides spécifiques (encadrant la
région cible) = amorces
 De quoi a-t-on besoin pour la PCR ?

• Quelle partie de la séquence d´ADN ils veulent copier et

quelles sont les séquences qui encadrent les deux extrémités
de la portion désirée.
• 2 Oligo-nucléotides amorces
• DNA polymérase spéciale thermostable (i.e. capable de
résister a la chaleur et aux fluctuations de température)
• Un thermocycleur : un appareil spécial qui contrôle
précisément la température de manière cyclique.
• Solutions de tampons et co-facteurs associés a l’enzyme
 Enzymes
• Les premières ADN polymérases utilisées provenaient
d'une bacterie thermophile (résistante à des températures
très élevées), par exemple
– Thermus aquaticus (Taq polymerase)
– Pyrococcus furiosus (Pfu polymérase)
– Thermococcus litoralis (Vent ou Tli polymérase)
– Thermus thermophilus (Tth polymérase)
• De nos jours, les enzymes utilisées sont dites
recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur
obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées
pour les rendre plus efficaces, plus fidèles, plus stable a la
chaleur…
 DEFINITION
• 3 étapes :

- dénaturation de la molécule d’ADN

- hybridation des amorces
- élongation à partir des amorces fixées

• Ces différentes étapes se font à des températures précises :

- la dénaturation de l’ADN se fait à 95°C

- l’hybridation des amorces est dépendante de la composition en base des
amorces = le Tm
- l’élongation se fait à la température optimale de travail de la Taq
polymérase (≈70°C)
 LA TAQ POLYMERASE

• Enzyme purifiée à partir d’une bactérie thermophile thermus aquaticus qui se

développe dans les sources chaudes (80°C)

• ADN polymerase :
- activité exonucléase 5’-3’
- mais dépourvue d’activité endonucléasique 3’->5’ qui permet la correction des
erreurs

• Température optimale d’activité: 70 – 75°C

Cette propriété de thermorésistance est à la base de son utilisation dans

l’amplification PCR
 LES AMORCES

• Double rôle :

- en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier

- avec leur extrémité 3' OH libre, servent d’amorce pour l’ADN polymérase.

• Nécessité de connaître les séquences nucléotidiques des extrémités de la région

ADN amplifiée

• Il ne faut pas que les séquences soient complémentaires entre elles

• Il ne faut pas que les séquences contiennent de séquences répétées inversées (pas
de repliement intramoléculaire)
 Le Tm

• Un ADN double brin en solution soumis à un chauffage progressif va se dissocier

à une température définie -> liaisons hydrogène rompues par l’énergie thermique
fournie au milieu

• A longueur égale, plus une séquence d’ADN est riche en GC, plus la température
nécessaire pour rompre les liaisons sera élevée -> dépend donc du %GC et %AT

• La température de fusion, appelée Tm (Melting Temperature), correspond au

moment où 50% d’ADN est sous forme simple brin (« dénaturés ») et 50% sous
forme double brin.

• Calcul Tm = [2x (A+T) + 4 x (G+C)]

 PCR : 1ERE ETAPE
1ère étape : dénaturation du double brin d’ADN

à 95°C les brins d’ADN se dénaturent

5’ 3’

3’ 5’
 PCR : 2EME ETAPE
2ème étape : hybridation des amorces

à 60-65°C les amorces s’hybrident

5’ 3’

3’ 5’
 PCR : 3EME ETAPE
3ème étape : élongation à partir des amorces

à 72°C la Taq Polymerase réalise l’extension

5’ 3’

Taq
Pol

3’ 5’
 PCR : 3EME ETAPE
3ème étape : élongation à partir des amorces

à la fin d’un cycle PCR, on obtient de nouvelles molécules

d’ADN identiques du gène ciblé
5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’
 LA PCR
Répétition n fois des réactions de polymérisation de l’ADN.

Amplification exponentielle de l’ADN,

selon l’équation:
Nn = 2 n x N 0

En théorie, une réaction de PCR peut générer 240 (~1012) amplicons

 DIFFERENTES PCR
• PCR conventionnelle :
- qualitative
- détection des produits de PCR par électrophorèse sur gel d’agarose grâce à
un marquage au Bromure d’ éthidium (BET)

• PCR en temps réel :

- qualitative et quantitative
- permet la détection des amplicons pendant que la réaction se déroule

• RT-PCR :
- utilisée pour la détection de cible ARN
- commence par une étape de reverse transcription catalysée par la reverse
transcriptase
- étapes classique de la PCR
- en conventionnel ou en temps réel
 PCR EN TEMPS REEL
• PCR en temps réel ou real-time PCR ou qPCR

• Technique récente et rapide : PCR en 2 étapes

1-Dénaturation à 95°C
2-Hybridation /Elongation ~60-62°C

• Se réalise sur automate

• Utilisation de molécules fluorescentes : augmentation de la sensibilité et de la

spécificité

• Fluorescence directement proportionnelle à la quantité d’ amplicons

• Quantitative, permet de suivre la formation du produit de PCR au cours du

temps

• Diminution du risque de contamination post PCR : pas d’ouverture de tube

 PCR EN TEMPS REEL

Ct (cycle seuil) :
- Cycle à la suite duquel la fluorescence est détectable
- Dépend de la quantité de matrice initialement présente dans l’échantillon
amplifié.
QUANTIFICATION

• Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre

un certain taux de fluorescence est proportionnel à
la quantité d’ADN cible présent au départ.

• Formation du produit PCR suivie au cours du

temps via l’émission de fluorescence in situ.

• Cela permet d’exprimer un nombre de cycles

versus la [C] en log.

• En utilisant une quantité connue de matrice, on

peut établir une courbe standard
 DIFFERENTES
CHIMIES
Agents « intercalants »
• Le SYBR®green I (fluorophore de 2e génération)
• Non spécifique car se fixe sur l’ADN db

Les sondes d’hybridation

• Sondes TaqMan®
• Sondes Molecular Beacon® (hybridization probes)
• Spécifique car sonde spécifique de la séquence cible

Les amorces fluorescentes

• Amorce Scorpions®
• Amorce LUXTM (Invitrogen)
• Amorces Plexor® (Promega)
 DIFFERENTES CHIMIES
SYBR green
A 95°C l’ADN est denaturé
Le SYBR Green ne se fixe pas
Pas de fluorescence émise
5’ 3’

Emission
SG
Excitation SG SG
5’ 3’
3’ 5’

3’ 5’

SG SG
 DIFFERENTES CHIMIES
SYBR green
A 55°C les amorces d’ADN se fixent
le SYBR Green peut se fixer
A 72°C la Taq Polymerase réalise l’extension
les primers et plus de SYBR Green se fixe
5’ 3’

SG
3’
SG SG 5’
 DIFFERENTES CHIMIES
SYBR green
A la fin de l’étape à 72°C l’ADN est double brin
Le SYBR Green se fixe

Excitation Emission

5’ SG SG 3’

3’ 5’
SG SG SG
Lorsque le SYBR Green reçoit l’excitation lumineuse,
il y a émission de fluorescence
 DIFFERENTES CHIMIES
TaqMan
• Basé sur la technologie FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert)

• La sonde est marquée à l’extrémité 5’ par un fluorochrome émetteur

(reporter) à l’extrémité 3’ par un fluorochrome suppresseur (quencher) qui
inhibe l’émission du reporter lorsqu’ils sont à proximité

• Autorise la PCR multiplex

• Lors de la PCR, si la sonde est hybridée sur la cible, elle est hydrolysée par
l’activité 5’ exonuclease de la polymérase. Le reporter ainsi séparé du quencher
émet une fluorescence proportionnelle au nombre de sondes hydrolysées,
mesurable au moment de l’élongation.
 DIFFERENTES CHIMIES
TaqMan

5’ 3’

Emission
5’ 3’
3’ 5’
Excitation RR
Q Q
R

Excitation R

3’ 5’
 DIFFERENTES CHIMIES
TaqMan
Description de la sonde Taqman®:

• Taille: entre 20-40 pb

• contenu en GC: entre 40-60 %
• Tm de 6-10 °c plus élevé que les amorces
• L’absence de séquences répétées
• L’absence de séquences chevauchantes avec les
amorces
• Éviter la présence d’une base G à l’extrémité 5’
(pour éviter la suppression de la fluorescence du
fluorophore donneur par ce dernier)
 DIFFERENTES CHIMIES
TaqMan
Recommanded Filter
Fluorophores Excitation Maxima Emission Maxima
setup

5-FAM,6FAM 495 520 FAM/SYBR channel

JOE 520 548 JOE channel

TET 521 536 JOE channel

VIC 524 555 JOE channel

Yakima Yellow 525 548 JOE channel

HEX 535 556 JOE channel

Cy3 550 570 470/585 hp or 530/585 hp

TAMRA 555 576 530/585 hp

ROX 575 602 ROX channel

Texas 581 596 ROX channel

Red 596 620 ROX channel or Cy 5 channel

Red 640 625 640 Cy5 channel

Cy5 649 670 Cy5 channel

LC 705 685 705 Cy5 channel

 DIFFERENTES CHIMIES
Molecular Beacon
• Le « Molecular beacon » a naturellement une structure en épingle à cheveux, et
porte un reporter et un quencher.
• Etant replié à l’état libre, il n’y a pas d’émission de fluorescence.

• Quand le « molecular beacon » est hybridé à la cible, la molécule fluorescente

et le quencher sont séparés, supprimant ainsi l’action inhibitrice du quencher.
• Les « molecular beacons » restent intacts durant la réaction d’amplification et
peuvent se ré-hybrider à la cible à chaque cible.
 RT-PCR
• Permet d’amplifier de l’ARN en passant par une étape intermédiaire, la
transcription inverse, qui transforme l’ARN en son ADNc, puis une PCR est
réalisée.
 PCR emboîtée ou Nested PCR

• PCR emboîtée, PCR gigogne ou PCR nichée (Nested PCR)

• PCR en deux étapes successives, avec deux couples d’amorce différents,
• Le premier couple d’amorces est conçu pour pouvoir accrocher les
quelques parties stables du génome viral, le deuxième pour identifier le
sous-type.
• le second liant des séquences situées à l’intérieur du premier amplicon.
• Elle permet aussi une meilleure sensibilité du résultat.
• très utilisée par les virologues travaillant sur les virus à ARN qui peuvent
avoir une haute mutabilité
 PCR MULTIPLEXE
• repose sur la technique de PCR

• permet l’amplification de plusieurs cibles dans un même tube réactionnel

• en temps réel : nécessité de sondes spécifiques et de fluorophores différents

pour chaque cible

• en PCR conventionnelle : nécessité que les amplicons aient des tailles

différentes

• veiller :
- à ce que chaque couple d’amorces et/ou la sonde ne détectent pas une
autre cible présente dans le tube
- à ce que les amorces (et les sondes) fonctionnent à la même
température