Le Génie Génétique Agro

Université Sultan Moulay Slimane
École Nationale des Sciences Appliquées

Béni Mellal
Pr : Yahya ROKNI
Année universitaire 2021-2022
Introduction à la biologie
moléculaire
ADN / ARN
STRUCTURES / FONCTIONS
1
Introduction :
 50% du poids sec de la plupart des cellules = protéines
 Protéine = polymère (chaîne) d'acides aminés
 Chaque protéine est caractérisée par sa séquence d'acides aminés.

Ex. le lysozyme (126 AA)
Lys-Val-Phé-Gly-Arg-Cys-Glu-Leu-Ala-Ala-Ala-Met-Lys-Arg-His-Gly-Leu-Asp-
Asn-Tyr-Arg-Gly-Tyr-Ser-Leu-Gly-Asn-Trp-Val-Cys-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Ser-
Asn-Thr-Gln-Ala-Thr-Asn-Arg-Asn-Thr-Asp-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr-Gly-Ilu-Leu-
Gln-Ilu-Asn-Ser-Arg-Trp-Trp-Cys-Asn-Asp-Gly-Arg-Thr-Pro-Gly-Ser-Arg-Asn-
Leu-Cys-Asn-Ilu-Pro-Cys-Ser-Ala-Leu-Leu-Ser-Ser-Asp-Ilu-Thr-Ala-Ser-Val-
Asn-Cys-Ala-Lys-Lys-Ilu-Val-Ser-Asp-Gly-Asp-Gly-Met-Asn-Ala-Trp-Val-Trp-
Arg-Asn-Arg-Cys-Lys-Gly-Thr-Asp-Val-Gln-Ala-Trp-Ilu-Arg-Gly-Cys-Arg-Leu
Introduction :
 On connaît actuellement ~ 8000 protéines différentes.

 On en découvre une centaine de nouvelles par mois.
 Nombre total de protéines que peut fabriquer l'organisme
humain = ??? (quelque chose entre
50 000 et 150 000).
 Chaque cellule fabrique les protéines dont elle a besoin.
 Pour fabriquer une protéine, il faut deux choses:
 Des acides aminés.
 La « recette » : quels acides aminés faut-il assembler
et dans quel ordre ?
2
Introduction :
« Recettes »
contenues dans
le noyau
Noyau contient
une matière
appelée
chromatine
Chromatine = protéines appelées histones et d'ADN

ADN = « recettes » des protéines
Introduction :
 Crick et Watson, 1953
 Découverte de la structure de la molécule

d'ADN
 ADN et ARN = acides nucléiques
 Les acides nucléiques = polymères de nucléotides
3
Introduction :
 NUCLÉOTIDE = ose + base azotée + acide phosphorique

Base azotée
Groupement
phosphate
5’
4’ 1’
Sucre
3’ 2’
Introduction :
 L’ose : pentose cyclique

5’ 5’
HOH2C OH HOH2C OH
4’ 1’ 4’ 1’
3’ 2’ 3’ 2’
OH OH OH
Ribose Désoxy-ribose
 L’acide phosphorique :
OH
O P OH
OH
4
Introduction :
 Les bases azotées : puriques ou pyrimidiques
Uracile
ADN : structure
 ADN = Acide DésoxyriboNucléique
 Polymères de nucléotides reliés entre eux par des fonctions esters
4’ 1’
5’ 5’ 3’ 2’
3’
Liaison 3’OH-5’P
 Ose = désoxyribose
 Les bases : Adénine, Guanine, Cytosine et Thymine
 Si on sépare une molécule d'ADN en nucléotides, on obtient toujours :

A=T et G=C
 Pourquoi ?
5
ADN : structure
 Hypothèse de Crick et Watson : A peut s'apparier avec T et

C avec G:
A avec T : deux
liaisons
hydrogène
C avec G :
trois liaisons
hydrogène
ADN : structure
 Donc la molécule d’ADN est formée de 2 brins de nucléotides
 Ces deux brins ont trois propriétés essentielles :
 antiparallèles
 complémentaires
 hélicoïdaux
6
ADN : structure
 L'orientation entre les liaisons donne une

structure en forme de double hélice à pas
droit :
 Les plans des bases sont perpendiculaires à
l’axe de l’hélice
 Donc les bases s’empilent
ADN : structure
 10 paires de base par pas de l’hélice

 Pas de l’hélice = 3,4 nm
 Diamètre de l’hélice : 2 nm
 Les brins antiparallèles délimitent deux
sillons de taille inégale : les sillons mineur et
majeur
 Certains atomes des bases sont accessibles
dans les sillons permettant la reconnaissance
spécifique d’une séquence d’ADN
7
ADN des différents être vivants :
 Dans tous les organismes :

Support de l’information génétique
Structure en double hélice (sauf certains virus)
 Différences :
Nombre de molécules d’ADN : 1 pour E. Coli et 46 pour l’Homme
Longueur : quelques milliers de nucléotides à plusieurs millions
Forme : linéaire ou circulaire
Localisation dans la cellule : séparé ou non du cytoplasme par une
membrane
Séquence en bases
 Virus : génomes les plus petits (quelques milliers de nucléotides) à

ADN ou à ARN
ADN des différents être vivants :
 Procaryotes : ADN dans le cytoplasme

Un seul chromosome « circulaire » = continu
Plusieurs millions de nucléotides
Présence de plasmides = petits morceaux d’ADN
circulaires, indépendants de l’ADN principal
 Eucaryotes : ADN dans le noyau

Plusieurs chromosomes avec ADN fortement
compacté et linéaire ADN
Plusieurs milliards de nucléotides
ADN associé à des protéines
Histones
 Cas de l’ADN des mitochondries :
ADN circulaire
Code génétique différent de l’ADN nucléaire
Transmission maternelle uniquement
8
ARN : structure
 ARN = Acide RiboNucléique
 Polymères de nucléotides reliés entre eux par des fonctions esters

5’
HOH2C OH
 Ose = ribose
Ribose
4’ 1’
3’ 2’
OH OH
 Les bases : Adénine, Guanine, Cytosine et Uracile
 ARN = un seul brin
 Appariement entre 2 ARN différents, entre un brin d’ADN et un brin

d’ARN ou sur lui même : A avec U et G avec C
Les différents ARNs :
 ARNr = ARN ribosomique

Participent, avec les protéines ribosomiques, à la formation
des ribosomes (molécules nécessaires à la synthèse des
protéines)
 ARNt = ARN de transfert

Transfert les acides aminés vers le lieu de synthèse des
protéines
 ARNm = ARN messagers

Portent l’information génétique de l’ADN vers le lieu de
synthèse des protéines
 ARNsn= ARN small nuclear

Présent dans le noyau uniquement
Participent à la régulation post-transcriptionnelle
9
Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques :
 Propriétés importantes pour l’isolation et l’étude des acides

nucléiques
 Stabilité : Liaisons H = spécificité de l’appariement des bases

Interactions hydrophobes et aromatiques
 Solubilité : solubles dans phénol, solutions salines et alcalines

Précipités par l’alcool et les solutions acides fortes
En solution aqueuse, ils sont très acides
 Viscosité : ADN long et mince donc solution très visqueuse
 Densité : environ 1,7 g/cm3, isolation possible sur gradient de césium
 Dénaturation : chimique par l’urée ou le formamide

thermique : ARN dénaturation progressive à la chaleur
ADN dénaturation à une température
précise (Tm) dépendant du contenu en G-C (propriété ayant permis la
création de la PCR)
Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques :
 Propriétés importantes pour l’isolation et l’études des acides

nucléiques
 Absorption UV : Les bases absorbent dans l’UV avec un maximum

à 260 nm
 Quantification : concentration déterminée par l’absorption à 260 nm

solution à 1mg/ml dans une cuve de 1 cm, A260=20
 Pureté de l’ADN : utilisation du rapport A260/A280

Si A260/A280 > 1,8 contamination par ARN
Si A260/A280 < 1,8 contamination par protéines
10
Le code génétique :
 ADN = Lieu de stockage de l’information génétique
 Sous forme CODÉE = chaque protéine est codée par un gène (ou
plusieurs si la protéine est polymérique)
L’unité de base des protéines est l’acide aminé
Chaque acide aminé est codé par un codon
Codon = triplet de nucléotides (ex : AGC = Ser)
 Pourquoi utiliser un code de trois nucléotides ?
 4 nucléotides :
Si 2 nucléotides = 1 acide aminé
On ne disposerait que de 16 acides aminés (24)
Si 3 nucléotides = 1 acide aminé

On disposerait de 64 acides aminés (34)
 Or il existe 20 acides aminés différents
Le code génétique : (déchiffré entre 1960 et 1964)
AAA Phénylalanine AGA Sérine ATA Tyrosine ACA Cystéine

AAG Phénylalanine AGG Sérine ATG Tyrosine ACG Cystéine
AAT Leucine AGT Sérine ATT STOP ACT STOP
AAC Leucine AGC Sérine ATC STOP ACC Tryptophane
GAA Leucine GCA Proline GTA Histidine GCA Arginine
GAG Leucine GCG Proline GTG Histidine GCG Arginine
GAT Leucine GCT Proline GTT Glutamine GCT Arginine
GAC Leucine GCC Proline GTC Glutamine GCC Arginine
TAA Isoleucine TGA Thréonine TTA Asparagine TCA Sérine
TAT Isoleucine TGG Thréonine TTG Asparagine TCG Sérine
TAG Isoleucine TGT Thréonine TTT Lysine TCT Arginine
TAC Méthionine TGC Thréonine TTC Lysine TCC Arginine
CAA Valine CGA Alanine CTA Asparagine CCA Glycine
CAT Valine CGG Alanine CTG Asparagine CCG Glycine
CAG Valine CGT Alanine CTT Ac. glutamique CCT Glycine
CAC Valine CGC Alanine CTC Ac. glutamique CCC Glycine
N.B. 64 combinaisons pour 20 acides aminés.

Code redondant (il est dit dégénéré): plusieurs triplets
différents peuvent coder pour le même acide aminé.
Trois triplets signifient la fin du message = triplets STOP
11
Le code génétique : Propriétés
 Dégénéré : Un acide aminé est codé par plusieurs codons
 Universel : Identique chez tous les êtres vivants

Exception : ADN mitochondrial (4 codons sont différents)
 Non chevauchant : Les codons sont lus en série depuis un point de

départ jusqu’au codon stop
La notion de gène :
 Un segment d'ADN portant toute l'information nécessaire pour la

synthèse d'une protéine = gène
 Gène de de la protéine Phé-Arg-Leu-Phé-Leu
12
 Les gènes chez les procaryotes contiennent :
 Une zone d’initiation de la transcription
 Une zone de terminaison de la transcription
 Une partie codante
Initiation Région codante Terminaison
ADN
ARN
 Les gènes chez les eucaryotes contiennent :
 Une zone d’initiation de la transcription
 Une zone de terminaison de la transcription
 Une partie codante composée d’introns et d’exons
13
 Les Exons sont des régions de l’ADN contenant l’information génétique

(régions traduites)
 Les Introns sont des régions de l’ADN qui seront éliminés lors de la
maturation des ARNm (régions non traduites)
De l’ADN à la protéine:
 L’information génétique n’est transmise que dans un sens
Réplication
Transcription Traduction
ADN ARN Protéine
 Exception : les Virus à ARN

Réplication
Transcription Traduction
ADN ARN Protéine
Rétrotranscription
14
La réplication de l’ADN:
 C’est le mécanisme de transmission de l’information génétique d’une

cellule mère à ses cellules filles
 L’ADN des cellules filles est identique à celui de la cellule mère
 La réplication est semi-conservative
Chaque molécule d’ADN est constituée

d’un brin parental et
d’un brin néoformé
La réplication chez les procaryotes:
 Les différents acteurs :

L’ADN parental = matrice
Les nucléotides : sous forme triphosphate dATP (désoxy
Adénosine TriPhosphate)
Les enzymes (séparation des brins, incorporation des
nucléotides…)
Co-facteurs (ex : Mg++)
 La réplication se déroule de 5’ vers 3’, de façon complémentaire et

antiparallèle
 La réplication est bidirectionnelle
O : origine de réplication
T : terminus
15
La réplication chez les procaryotes:
 La réplication est discontinue pour l’un des deux brins
 Brin avancé : synthèse dans le sens de la propagation
 Brin retardé : synthèse « à reculons »

3’
Amorce d’ARN
5’
ADN parental double brin Brin avancé

5’ 3’
3’ Brins retardés =
5’ fragments d’Okasaki
Amorce d’ARN
3’
5’
3’
5’
Sens de propagation de la réplication
La réplication chez les procaryotes: ex : E. coli
 L’initiation de la réplication :
Réplication débute dans une région précise (l’origine de
réplication) : ORI C
Fixation du complexe multimérique de DnaA
Ouverture de la double hélice
Fixation des protéines DnaB (hélicase)
Fixation des protéines SSB : stabilise les simples brins d’ADN
Fixation de l’ADN polymérase (Pol I et Pol III)
ORI DnaA DnaB
Bulle (œil) de
réplication
Pol III
16
 L’élongation :
L’hélicase DnaB ouvre la double hélice en aval de la polymérase
Synthèse des amorces ARNs par la primase
L’incorporation des nucléotides du brin avancé s’effectue par Pol III
La synthèse des fragments d’Okasaki débute par Pol III
et se termine par la digestion et le remplacement des amorces
d’ARN par la polymérase I (Pol I) et leur liaison par la ligase
Fragments d’Okasaki
Brin avancé
 La terminaison :
Les deux fourches de réplication se rencontrent à 180° d’ORI,
au niveau des sites Ter
La protéine Tus inhibe l’action de l’hélicase, donc les deux
molécules d’ADN double brins restent liées
Dissociation par la topoisomérase IV
Initiation Élongation Terminaison
ORI
Sites Ter
Topoisomérase IV
17
La réplication chez les eucaryotes :
 Mécanisme comparable aux procaryotes
 La réplication est bidirectionnelle, complémentaire, antiparallèle,

simultanée pour chaque brin mais discontinue pour l’un des deux brins
 Elle s’effectue dans le sens 5’-3’, avec des amorces d’ARN
 Mais comme le génome est plus grand et réparti sur plusieurs

chromosomes, il existe plusieurs sites d’initiation sur chaque
chromosome
 La réplication débute simultanément au niveau de plusieurs sites

d’initiation
La transcription :
 Mécanisme de synthèse des ARNs
 ARNm : copie d’une portion d’ADN (gène)
 Tout l’ADN n’est pas transcrit (région codante/non codante)
 Synthèse : dans le sens 5’-3’

de manière antiparallèle par rapport à l’ADN copié
de façon complémentaire
 Les différents acteurs :

Matrice d’ADN
Nucléotides sous forme triphosphate ATP, CTP, GTP UTP
RNA polymérase (plusieurs sous-unités : abb’s)
Cofacteurs (Mg++)
18
La transcription : chez les procaryotes
 Initiation de la transcription :
 Par convention : +1 = 1er nucléotide transcrit

-1 = nucléotide précédent le 1er nucléotide transcrit
 ARN polymérase doit reconnaître les gènes à transcrire
 Le promoteur = séquence d’ADN en amont de la région transcrite du

gène, qui est spécifiquement reconnue par l’ARN polymérase
 Séquences –35 et -10 : séquences à environ 35 et 10 paire de base en

amont du site d’initiation, 3 bases fortement conservées (TTGACA et
TATATT)
 Initiation de la transcription :
 L’ARN polymérase se fixe sur l’ADN grâce aux séquences –35 et –10
 L’ADN double brin est dénaturer entre les position –10 et +1

-60 -35 -10 +1 +20
-60 -35 -10 +1 +20
-10 +1
-60 -35 +20
19
 Élongation :
ARN polymérase ajoute des nucléotides à l’extrémité 3’ de l’ARN en
cour de synthèse.
Elle avance dans la direction 3’ vers 5’ du brin matrice
+1
TTACT
5’ TTACT TTACT 3’
3’
3’ AATGA AATGA 5’
AATGA
ARN en cour de synthèse

5’
+1 CTGTA
5’CTGTA CTAAT 3’
3’GACAT CUGUA
3’ GATTA 5’
GACAT
5’
Sens de la transcription
 Terminaison :
 Terminateur = séquence d’ADN formant une structure secondaire
de type épingle à cheveux, suivie d’une région riche en AT
 Transcription du terminateur
 Formation de l’épingle à cheveux sur l’ARN
 Ralentissement de l’ARN polymérase
 Arrêt et décrochage de l’ARN polymérase
20
 Modification post-traductionnelle
 Peu ou pas de modification des ARNm
 Traduction débute avant la fin de la transcription
CTGTA
5’ 3’
CTGTA CTAAT
GACAT 3’ GATTA
3’ 5’
CUGUA
GACAT
ARN en cour de synthèse
5’
Protéines en cour de synthèse
La régulation de la transcription : chez les procaryotes
 L’opéron Lactose :
 Séquence d’ADN contenant :
Gènes lac Z, lac T et lac A,codant pour enzymes nécessaires à

l’utilisation du lactose par la bactérie (gènes de structure)
Un promoteur unique pour les trois gènes (ARN polycystronique)
Séquence opérateur =élément de contrôle de la transcription
Gène régulateur : lac I codant pour le répresseur
21
 E. coli utilise le lactose quand il est la seule source de carbone
disponible
 Fonctionnement :
Inducteur = lactose, allolactose et IPTG (isopropylthiogalactopyranoside)
Absence d’inducteur :
Le promoteur de lac I permet la transcription du gène lac
I, donc la synthèse du répresseur (lac)
Formation de tétramère lac
Fixation du tétramère lac sur la région opératrice O lac
blocage de la transcription des gènes de structure
 Présence d’inducteur :
Inducteur se fixe sur le tétramère lac
Changement de conformation et perte de l’affinité pour Olac
Transcription des gènes de structure
 Inducteur épuisé :
Tétramère lac se fixe sur Olac
Transcription bloquée
22
La transcription : chez les eucaryotes
 Mécanisme similaire, mais beaucoup plus complexe
 Plusieurs ARN polymérase :

ARN polymérase I : ARNr
ARN polymérase II : ARNm, ARNsn
ARN polymérase III : ARNt
 Nombreux cofacteurs protéiques nécessaire à la fixation de l’ARN

polymérase sur l’ADN
 Structure des gènes des eucaryotes :

Gènes fragmentés
Exons : ADN contenant l’information génétique (traduit en acides
aminés)
Introns : séquences intercalaires, fonctions ?
La transcription : chez les eucaryotes
 Les différentes phases de la transcription :
 Étapes nucléaires :
Transcription intégrale du gène (exons + introns)

 Addition du « cap » en 5’ :
GMP méthylé sur l’azote 7 (donc charge +)
Mise en place rapide (avant la fin de la transcription)
Liaison au 1er nucléotide par une liaison anhydride
Protection de l’ARNm des enzymes de dégradation
 Addition de polyA
Après transcription, addition d’environ 250 A
Aide passage vers cytoplasme
 Étapes cytoplasmiques :
 Maturation du pré-ARNm
 Épissage = coupure et élimination des introns
23
La traduction :
 Les éléments nécessaires :
 Les acides aminés :

20 acides aminés
Relié entre eux par une liaison peptidique
= Liaison entre –COOH porté par le Ca de l’acide aminé n°1 et
le –NH2 porté par le Ca de l’acide aminé n°2
 Les ARNm
 Les ARNt :
adaptateurs entre l’ARNm et les acides aminés
Fait correspondre un codon à un acide aminé précis par
l’intermédiaire d’un anticodon complémentaire
La traduction :
 L’initiation :
 « codon initiateur », « codon signal » : AUG situé à environ 100 pb

de l’extrémité 5’ de l’ARNm, indiquant le début de la traduction
 AUG = Met : toutes les protéines commencent par une méthionine

(qui sera clivée lors de la maturation de la protéine)
 Ribosome : complexe protéiques + ARNr permettant la formation

de la liaison peptidique
 Petite sous-unité s’associe avec l’ARNm au niveau du codon AUG et

avec l’ARNt portant la Met
 Grande sous-unité se fixe à la petite sous-unité
24
La traduction :
 L’élongation :
 1ère étape :
Accrochage d’un nouvel ARNt-AA dans le site A
 Codon n°2 (après l’AUG) détermine l’ARNt, donc l’AA
 2ème étape :
 Rupture liaison entre Met et le premier ARNt (élimination)
 Formation de la liaison peptidique entre la Met et l’AA n°2
 3ème étape :
 Translocation : le ribosome se décale d’un codon vers 3’ de
l’ARNm, donc l’ARNt n°2 passe sur le site P et le site A (libre)
acceille l’ARNt n°3
La traduction :
 La terminaison :
 S’effectue quand le ribosome rencontre un codon stop
 Aucun ARNt se fixe en face de ce codon
 Coupure liaison entre le dernier AA et son ARNt
 Dissociation du ribosome et libération de l’ARNm
 N.B : un même ARNm peut servir de matrice à plusieurs ribosome en

même temps = polysome
25
Altérations et réparation de l’ADN :
 Mutations :
 Accidents de copie des bases
 Le plus souvent au cours de la réplication
 ADN fils ≠ ADN parental
 Mutations ponctuelles :
 substitution : remplacement d’une base par une autre
 délétion : perte d’une base
 insertion : ajout d’une base
 Transmission des mutations :

 Procaryotes : mutation transmise aux descendants
 Eucaryotes supérieurs : mutation transmise uniquement si elle
touche les cellules sexuelles
 Mutations ARN :
 Possible mais moins importante car pas de transmission à la
descendance et nombre de mutant < nombre de sauvage
 Effet des mutations :
 Mutations silencieuses :
Changement de base ne modifie pas l’AA (ex : UUU → UUC = Phe)
 Mutations conservatrices :
Changement de base induit un changement d’AA, mais ayant les

mêmes propriétés (ex : AAA (Lys) → AGA (Arg) : 2 AA basiques)
 Mutations faux sens :
Changement de base induit un changement d’AA, n’ayant pas les

mêmes propriétés (ex : AAA (Lys, basique) → GAG (Gly, acide))
26
 Effet des mutations :
 Mutations du codon stop :
Changement d’un codon AA en codon stop = protéine tronquée

Changement d’un codon stop en codon AA = protéine allongée
 Mutations avec changement du cadre de lecture :
Due aux délétions ou insertions
AUG GCC UCU

Met Ala Ser
Délétion
AUG CCU CUA
Met Pro Leu
 Conséquences des mutations :
 Avantages : principe de l’évolution : individus portant la mutation

sont mieux adaptés à leur environnement
 Maladies : ex : Anémie falciforme = maladie génétique caractérisée par
une hémoglobine anormale. Anomalie dans la chaîne ß de l'hémoglobine :
6e acide aminé = VAL alors qu'il devrait être GLU (T remplace A)
Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys-Ser-Ala-Val-Thr-Ala-Leu-Try-Gly-Lys-Val-
Asp-Val-Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Gly-Arg-Leu-Leu-Val-Val-Tyr-
Pro-Try-Thr-Glu-Arg-Phé-Phé-Glu-Ser-Phé-Gly-Asp-Leu-Ser-Thr-Pro-Asp-
Ala-Val-Met-Gly-Asp-Pro-Lys-Val-Lys-Ala-His-Gly-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-
Ala-Phé-Ser-Asp-Gly-Leu-Ala-His-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Gly-Thr-Phé-Ala-
Thr-Leu-Ser-Glu-Leu-His-Cys-Asp-Lys-Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asp-Phé-
Arg-Leu-Leu-Gly-Asp-Val-Leu-Val-Cys-Val-Leu-Ala-His-His-Phé-Gly-Lys-
Glu-Phé-Thr-Pro-Pro-Val-Glu-Ala-Ala-Tyr-Glu-Lys-Val-Val-Ala-Gly-Val-
Ala-Asp-Ala-Leu-Ala-His-Lys-Tyr-His
27
 Mutation de certains gènes peut participer à l’apparition de tumeur :
Ex : gènes contrôlant la division cellulaire
 Tumeur bénigne :
• Les cellules demeurent regroupées et ne
se séparent pas.
• La tumeur demeure bien circonscrite.
 Tumeur maligne:
• Des cellules se détachent de la tumeur principale et vont

former d'autres tumeurs dans le corps = cancer
 Mutation de certains gènes peut participer à l’apparition de tumeur :
Ex : gènes contrôlant la division cellulaire

Tumeur du cerveau
Tumeur de la prostate
Tumeur du sein
28
 Réparation de l’ADN :
 La plupart des mutations sont corrigées par des enzymes de
réparation au cours de la réplication
 Enzymes reconnaissent brin néoformé car il n’est pas encore
méthylé
 Endonucléases coupent l’ADN en amont ou en aval de la mutation
 Exonucléases : coupent l’ADN jusqu’à la mutation
 ADN polymérase III comble la brèche selon le modèle du brin
parental
 Ligase relie les deux parties
du brin néoformé
PCR
29
Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
But et principe
– Le mélange réactionnel et les cycles de température
– La dénaturation
– L’hybridation
– Les amorces
– L’élongation
– La Taq polymérase
– Les conditions réactionnelles
– Détection et analyse des produits PCR
Applications
– Le clonage acellulaire
– La RT-PCR (reverse-transcriptase PCR)
– La PCR quantitative en temps réel
– La PCR semi-quantitative ou compétitive
– La PCR appliquée au diagnostic
– Maladies génétiques
– Maladies infectieuses
– La PCR appliquée à l’identification
But et principe
Amplification (multiplication) du fragment d'ADN d'intérêt
(gène entier ou tronqué) par PCR : Polymerase Chain
Reaction
La PCR est une réaction de polymérisation en chaîne à partir

d'amorces spécifiques de l'ADN d'intérêt, grâce à l'action
d'une enzyme, l’ADN polymérase dans un milieu contenant
des nucléotides.
30
PCR
PCR : réaction en chaîne par polymérase (Polymerase Chain
Reaction) est une méthode de biologie moléculaire
d’amplification génique in vitro qui permet de copier en
grand nombre une séquence d’ADN connue, présente dans
l’échantillon même en très faible quantité
Historique de la PCR
31
Historique de la PCR
Principe de la PCR
La PCR permet donc d’obtenir par réplication in vitro de
multiples copies d’un fragment d’ADN à partir d’un extrait.
L’ADN matriciel peut tout autant être de l’ADN génomique
que de l’ADN complémentaire obtenu par RT-PCR à partir
d’un extrait d’ARN messagers (ARN poly-A), ou encore de
l’ADN mitochondrial.
32
Principe de la PCR
La réaction de polymérisation en chaîne est réalisée dans
un mélange réactionnel qui comprend l’extrait d’ADN (ADN
matriciel), la Taq polymérase, les amorces et les quatre
désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP) en excès dans
une solution tampon.
Les tubes contenant le mélange réactionnel sont soumis à

des cycles de température répétés plusieurs dizaines de fois
dans le bloc chauffant d’un thermocycleur.
Thermocycleur
Appareil qui comporte une enceinte où
l’on dépose les tubes échantillons et
dans laquelle la température peut
varier, très rapidement et
précisément, de 0 à 100°C par effet
Peltier).
L’appareil permet la programmation de
la durée et de la succession des cycles
de paliers de température. Chaque
cycle comprend trois périodes de
quelques dizaines de secondes.
33
Dénaturation : 94°C
La première période s’effectue à une température de 94°C,
dite température de dénaturation.
À cette température, l’ADN matriciel, qui sert de matrice au
cours de la réplication, est dénaturé : les liaisons hydrogène
ne peuvent pas se maintenir à une température supérieure à
80°C et les ADN double-brin se dénaturent en ADN
simple-brin (ADN monocaténaires).
Hybridation : 40 – 70°C
La deuxième période s’effectue à une température
généralement comprise entre 40 et 70°C, dite température
d’hybridation des amorces.
La diminution de la température permet aux liaisons
hydrogène de se reformer et donc aux brins
complémentaires de s’hybrider.
Les amorces, courtes séquences monocaténaires
complémentaires de régions qui flanquent l’ADN à amplifier,
s’hybrident plus facilement que les longs brins d’ADN
matriciel. Plus la température d’hybridation est élevée, plus
l’hybridation est sélective, plus elle est spécifique.
34
Amorces (Primers)
Pour parvenir à amplifier sélectivement des séquences
nucléotidiques à partir d’un extrait d’ADN par PCR, il est
indispensable de disposer d’au moins une paire
d’oligonucléotides.
Ces oligonucléotides, qui vont servir d’amorces pour la réplication,
sont synthétisés par voie chimique et doivent montrer la meilleure
complémentarité possible avec les deux extrémités de la séquence
d’intérêt que l’on souhaite amplifier.
L’une des amorces est conçue pour reconnaître par
complémentarité une séquence située en amont du brin 5’-3’ du
fragment d’ADN d’intérêt ; l’autre pour reconnaître, toujours par
complémentarité, une séquence située en amont du brin
complémentaire (3’-5’) du même fragment d’ADN.
Amorces (Primers)
Les amorces sont des ADN monocaténaires dont l’hybridation sur les
séquences flanquant la séquence d’intérêt permettra sa réplication de façon
sélective.
La taille des amorces est généralement comprise entre 10 et 30 nucléotides
afin de garantir une hybridation suffisamment spécifique sur les séquences
d’intérêt de l’ADN matriciel.
D’autres critères, importants mais secondaires par rapport aux précédents,
doivent être pris en compte pour la conception et l’emploi des amorces.
La séquence des amorces doit comporter la plus grande proportion possible
de guanines et de cytosines.
En effet, la liaison entre guanines et cytosines est assurée par trois liaisons
hydrogène au lieu de deux entre les adénines et les thymines, ce qui se
traduit par une meilleure stabilité de la liaison au moment de l’hybridation
des amorces.
35
Amorces (Primers)
Plus les amorces sont riches en cytosines et guanines, plus leur
température d’hybridation (Tm) peut être élevée (elle est en général
comprise entre 40 et 65°C, mais peut atteindre 70°C) et donc plus la
spécificité de l’hybridation est grande.
À des températures d’hybridation basses, les amorces s’hybrident de façon

beaucoup moins sélective ce qui peut se traduire par l’amplification de
séquences d’ADN non souhaitées (amplification non spécifique).
Il ne faut pas non plus que les amorces présentent de fortes

complémentarités de séquence sans quoi elles s’associeraient entre elles
et n’effectueraient pas correctement l’amorçage de la réplication.
Amorces (Primers)
Il faut encore noter que certaines modifications chimiques du
milieu réactionnel permettent d’optimiser la spécificité
d’hybridation des amorces.
L’ajout de détergent ou de glycérol, par exemple, inhibe la

formation des liaisons hydrogène, rend plus difficile
l’hybridation des amorces.
36
Elongation : 72°C
La troisième période s’effectue à une température de 72°C,
dite température d’élongation.
À 72°C, la Taq polymérase se lie aux ADN monocaténaires
amorcés et catalyse la réplication en utilisant les
désoxyribonucléosides triphosphates présents dans le mélange
réactionnel.
Les régions de l’ADN matriciel en aval des amorces sont
ainsi sélectivement synthétisées.
Elongation : 72°C
Au cycle suivant, les fragments synthétisés au cycle précédent
servent à leur tour de matrice et au bout de quelques cycles,
l’espèce prédominante correspond à la séquence d’ADN
comprise entre les régions où les amorces s’hybrident.
Il faut compter 20 à 40 cycles pour synthétiser une quantité
analysable d’ADN (environ 0,1 microgramme).
Chaque cycle voit théoriquement doubler la quantité d’ADN

présente au cours du cycle précédent.
37
Elongation : 72°C
Il est recommandé de rajouter un cycle final d’élongation à
72°C, notamment lorsque la séquence d’intérêt est de grande
taille (supérieure à 1 kilobase), à raison de 2 minutes par
kilobase.
La PCR permet d’amplifier des séquences dont la taille est
inférieure à 6 kilobases
38
39
Taq polymérase
L’ADN polymérase permet la réplication. On utilise une
ADN polymérase purifiée ou clonée à partir d’une bactérie
extrêmophile, Thermus aquaticus, qui vit dans les sources
chaudes et résiste à des températures supérieures à 100°C.
Cette polymérase (Taq polymérase) possède la
caractéristique remarquable de résister à des températures de
l’ordre de 100°C, lesquelles sont généralement suffisantes
pour dénaturer la plupart des protéines. Thermus aquaticus
trouve sa température de confort à 72°C, température
optimum pour l’activité de sa polymérase.
11
Conditions réactionnelles
Les volumes de milieu réactionnel varient entre 10 et 100 µl.
Il existe une multitude de formules de milieux réactionnels.
Il est toutefois possible de définir une formule standard qui
convient à la plupart des réactions de polymérisation en
chaîne.
Cette formule, à peu de chose près, a été choisie par la plupart
des fabricants et fournisseurs qui, du reste, délivre une
solution tampon prête à l’emploi avec la Taq polymérase.
Concentrée 10 fois, sa formule est à peu près la suivante :
100 mM Tris-HCl, pH 9,0 ; 15 mM MgCl2, 500 mM KCl.
Il est possible de rajouter des détergents (Tween 20, Triton
X-100…) afin d’augmenter les conditions de stringence qui
rendent plus difficile et donc plus sélective l’hybridation des
amorces.
Cette démarche est généralement employée pour réduire le
niveau d’amplifications non spécifiques dues à l’hybridation
des amorces sur des séquences sans rapport avec la séquence
d’intérêt.
12
On peut aussi réduire la concentration en KCl jusqu’à
l’éliminer ou encore augmenter la concentration en MgCl2.
En effet, certains couples d’amorces fonctionnent mieux avec
des solutions enrichies en magnésium.
D’autre part, lorsque sont utilisées de fortes concentrations en

dNTP, il convient d’augmenter la concentration en
magnésium à cause des interactions stœchiométriques entre
magnésium et dNTP qui réduisent la quantité de magnésium
libre dans le milieu réactionnel.
Les dNTP (desoxyribonucléotides) fournissent à la fois
l’énergie et les nucléotides nécessaires à la synthèse de
l’ADN lors de la polymérisation en chaîne. Ils sont incorporés
au milieu réactionnel en excès, soit environ 200 µM final.
Selon le volume réactionnel choisi, la concentration en

amorce peut varier entre 10 et 50 pmol par échantillon.
13
L’ADN matriciel peut provenir de n’importe quel
organisme et même de matériels biologiques complexes qui
comprennent des ADN de différents organismes.
Mais pour garantir la réussite d’une PCR encore faut-il que
l’ADN matriciel ne soit pas trop dégradé
14
15
BIOLOGIE SYNTHÉTIQUE
La biologie synthétique est une nouvelle

discipline qui utilise les connaissances du génie
génétique et moléculaire pour fabriquer des
composés ou des systèmes biologiques qui
existent ou non dans la nature.
1
Le monde enchanté des
manipulations génétiques
2
Un peu de biologie…
De l’organisme vivant au gène…
Tissu
végétal
Chromosomes
Cellule végétale
3
Les 4 bases
A G T C
Le code génétique
AGTGAAATTATCTCTTACTGGGGATTCCCTAGTGAGGAATA
CCTAGTTGAACAGAAGATGGATATATTCTGTGCCTTAACCG
AATTCCTCATGGGAGGAAGAACCTTCTGACAAAGGTATGG
GAAGGCTCTTAAAAGTAAAAACCAGAATTCTTCTGGGTTTT
GAAGATGGATATATTCTGTGCCTTAACCGATCCCTAGTGAG
GAATACCTAGTATGGATATATTCTGTGCCTTAACCGATCCCG
Double hélice d’ADN TGAAATTATCTCTTACTTATTGCTGTGCCTTAACCGAATTCC
TCATGGGAGGTATTCTGTGCCTTAACCGATCCCTAGTGAG
GAATACAAGATGGATATATTCTGTGCCTTAACCGA
• 3 milliards de paires de bases et 30 000 à 50 000

gènes chez l’homme
L’ADN
Les gènes : 2 à 5% de l’ADN

Introns
Le gène
Promoteur
Exons
A quoi ça sert…
ADN
Promoteur Exon Intron
Transcription
ARN m
Traduction
Quantité Protéine
Enchaînement de
20 acides aminés
4
Manipuler le vivant…
La matière première L’ADN
Les outils  les enzymes de restriction (couper)
 la PCR ou les plasmides (copier)
 les enzymes de ligation (coller)
…et fabriquer des OGM
La construction génétique
+
Transgène
= gène d’intérêt
Plasmide Plasmide recombinant Biolistique
+ séquences virales
+ marqueur Ab
Transfection Electroporation
Micro injection
Agrobacterium
Cellule végétale
Animal
génétiquement
modifié Plante génétiquement modifiée Cellules végétales
transformées
5
Qu’est ce qu’un OGM ?
Définition : Toute entité biologique capable de se reproduire ou de transférer

(comme les virus) du matériel génétique, ce dernier ayant été
modifié « d’une manière qui ne s’effectue pas naturellement par
multiplication et/ou par recombinaison naturelle »
Franchissement de la barrière d’espèce naturelle
Un bref historique…
 1953 : Découverte de la structure en double hélice de l’ADN
 1972 : Premier OGM (microorganisme)
 1978 : Production d’insuline
 1983 : Première plante transgénique : le tabac
 1986 : Premières expérimentations en champ en Europe
 1996 : Début de la commercialisation des OGM aux États-Unis
 1998 : Moratoire instauré en France
 2004 : Levée du moratoire

 2006 : Une loi qui nous protége des OGM ou qui légalise
leur dissémination (dispersion) ???
6
Quels organismes concernés ?
Sources de gènes OGM produits
Des
plantes…
Bactérie
Virus
Soja Maïs Coto Colza
n
Souris
Papillon Riz P. de terre Blé Tabac
Scorpion
Betterave Tomate Papaye Tournesol

Homme … /…
… /…
Vigne Laitue Artichaut Peuplier Eucalyptus Gazon …

Des animaux… Des microorganismes…
Saumon Tilapia Truite

Bactéries Levures
Et demain …
Chèvre Vache Poulet
Souris l’homme ???

Rat
7
Les 3 niveaux:
Génome, Transcriptome et Protéome
les méthodes directes de

transfert de l'ADN
8
Introduction
Les Organismes Génétiquement Modifiés
sont des organismes vivants dont l’ADN a été
modifié artificiellement (mutation, insertion ou
délétion de gènes) dans le but de leur conférer
de nouvelles propriétés.
AGM : Animaux Génétiquement Modifiées;;
PGM : Plantes Génétiquement Modifiées;
VGM : Virus Génétiquement Modifiées;
MGM: Microorganisme Génétiquement Modifiées;
Principe
Principaux étapes de la création des OGM
9
Manipulation génétique
Gène d’intérêt
Bactéries
Vecteur (plasmide) Identification

Isolement
Multiplication
= CLONAGE
Transfert du gène
dans un autre
organisme
Production
d’une protéine
Thérapie
génique OGM Ex : Insuline,
Plante Hormone de
Animaux
transgénique transgéniques croissance
10
• Méthode chimique : - PEG
• Méthode électrique : - Electroporation
• Méthode physique : - Microinjection,
- Biolistique
Les differentes methodes direct

de transfert de l’ADN
Méthode chimique
11
polyéthyléneglycol (PEG)
Le PEG est un polymère qui déstabilise de façon
réversible les membranes plasmiques,
permettant ainsi le transfert de l'ADN au
travers de la membrane.
Méthode électrique
12
Electroporation
D’une façon générale...
3 étapes sont nécessaires
13
Méthodes Physique
La biolistique
14
La biolistique
Microinjection
15
Microinjection
16
OGM: Méthodes de transfert des gènes
Transfert chez les animaux

Insertion d’ADN directement
dans le noyau de la cellule œuf produite
par fécondation in vitro => animaux
transgéniques
TRANSFERT DIRECT
L'action du Polyéthylène Glycol (PEG)

Cette méthode a permis l'obtention de maïs résistant à une
matière active herbicide, le glufosinate. Elle est également
utilisée sur la betterave.
17
Des OGM, pourquoi faire ?
Au niveau médical : « … l’insertion des gènes dans les
bactéries promet de faire de celles-ci des usines
vivantes et peu coûteuses. ( l’insuline, de l’interféron,
des hormones de croissance, des acides aminés )
Au niveau de l’agriculture : la manipulation génétique
devrait pouvoir améliorer les plantes, augmenter leur
capacité de résistance aux ravageurs et augmenter leur
productivité, etc.
Au niveau industriel : les OGM pourront être mis à
contribution pour produire des levures, des arômes,
des colorants, des détergents, des textiles, ..
18
Exemple de
l’insuline
Les principales plantes

génétiquement modifiées (2005)
Aujourd’hui, les cultures OGM se répartissent comme suit :
le soja (60%) le maïs (24%)
le coton (11%) le colza (5%)

Source ISAAA 2005
19
INCONVENIENTS : Risques, réels ou
potentiels
•Sur la santé humaine et animale:

• toxicité, allergie, nutrition, résistances aux
antibiotique
• Sur l’environnement :
• toxicité , résidus des produits de traitement,
pollution génique
AVANTAGES DES OGM

•L‘environnement : Une agriculture sans pesticides
•Faim mondiale : produire davantage a faibles couts
Améliorer les aliments
•Produire des médicaments bio technologiquement
•Produire industriellement biotechnologiquement
20
La technique de transgénèse est encore toute jeune et de
nombreuses questions restent en suspens. On constate
qu’elle présente de nombreux avantages mais également
des risques non négligeables. Utilisés de façon appropriée,
les OGM pourraient apporter de nombreux moyens pour
contribuer à l’amélioration des conditions de vie.
Cependant, la rapidité avec laquelle peuvent survenir les
modifications entraînées par le génie génétique peut avoir
des effets encore inconnus.
21
Génie Génétique
02/12/2021
Principe de l'ingénierie de la biologie

moléculaire
 Mutagenèse
 Transgénèse : les étapes
 Biologie de synthèse
 Obtention d’une variété OGM
 Porte-greffe OGM
 Inactivation des gènes par méthylation
 Crispr-cas9
1
Les exemples d’application effectifs de la transgénèse ou ceux au stade
de recherche sont nombreux et peuvent être regroupés en quatre grandes
catégories :
• Améliorations agronomiques,
• Qualités alimentaires,
• Production de molécules à intérêt industriel,
• Et production de molécules destinées à la santé humaine.
2
Modes d’action de nouveaux outils moléculaires : édition de gènes
ou retouche génétique
La connaissance des génomes et surtout de leur fonctionnement a

permis depuis une dizaine d’années de développer de nouveaux outils
de sélection qui incluent d’une part, des modifications du génome
(insertion, modification ou inhibition de gènes) et d’autre part,
l’utilisation de protéines qui interfèrent avec l’expression du génome.
C’est grâce aux progrès sur le génie génétique et la bio-informatique
que ces outils ont vu le jour.
Utilisation de fragments d’ADN ou de protéines

pour induire la mutagénèse ou la transgénèse
La fabrication d’oligonucléotides et de nucléases de synthèse est désormais courante dans les
laboratoires de recherche. Ces fragments d’ADN (oligonucléotides) ou ces protéines (nucléases)
permettent de produire des mutations du génome, ponctuelles, spécifiques et contrôlées.
Un oligonucléotide est un assemblage synthétique de nucléotides. Dans le cas de la mutagénèse ou

de la transgénèse il est identique à celui d’une partie d’un gène que l’on veut modifier à
l’exception d’un nucléotide « différent ».
Introduit dans la cellule, il s’apparie avec l’ADN de la plante et sert de modèle pour le mécanisme
naturel de réparation de l’ADN de la cellule. Celui-ci détecte le nucléotide « différent » et copie le
changement voulu dans l’ADN de la plante. Ainsi, l’oligonucléotide n’est pas introduit dans le
génome de la plante et est rapidement dégradé.
3
La méthylation d’une séquence
d’ADN ne modifie pas la séquence,
mais modifie son expression, en
conduisant, dans la plupart des cas, à
la disparition d’un caractère.
Il s’agit d’un effet épigénétique, c’est-

à-dire de modifications de l’expression
du génome d’un organisme mais sans
modification de la séquence de
l’ADN.
Certaines régions de l’ADN peuvent parfois être pourvues d’un groupement

méthyle (CH3) lié à un nucléotide. Il bloque les mécanismes de la transcription et
donc la synthèse protéique.
Les nucléases à doigt de zinc se

caractérisent par la présence d’un
ion de Zinc qui donne une forme
tridimensionnelle particulière en
ciseaux.
Elles comprennent un domaine
de liaison à l’ADN spécifique
(qui est responsable de la
reconnaissance de l’ADN) et un
domaine catalytique non
spécifique (qui induit la coupure
du double brin d’ADN).
Le domaine de liaison à l’ADN
est constitué par une succession
de peptides reconnaissant chacun
une séquence de trois paires de
bases.
4
TRANSFORMATION TRANSITOIRE
AVEC CRISPR-CAS
• CRISPR-Cas9 est un outil
d’ingénierie du génome
couramment utilisé dans les
laboratoires de recherche pour
produire des ruptures ciblées du
double brin d’ADN. Cas9 est une
enzyme spécialisée, une
endonucléase, qui associée à un
ARN-guide est capable de couper
l’ADN à un site déterminé par la
séquence de cet ARN-guide.
AVEC CRISPR-CAS
• Ces cassures induites, comme toute cassure de l’ADN, vont être
réparées par la machinerie interne de réparation de la cellule, ce qui
peut conduire à l’inactivation ou à la modification fine d’un gène, ou
encore à l’insertion d’un transgène.
• la modification de quelques nucléotides peut s’effectuer par
recombinaison homologue à partir d’une séquence « modèle », pour
induire un changement de fonction du gène ciblé. Cette technique de
modification précise du génome a été utilisée par des équipes de
l’INRAE pour prémunir la tomate contre les potyvirus.
5
AVEC CRISPR-CAS
De tels mutants chez la tomate et le melon ont permis d’obtenir une
certaine résistance mais avec un spectre étroit et surtout au prix d’une
réduction de croissance et de fertilité de la plante.
D’autres mutations naturelles de ce gène ont été observées chez le
poivron qui confèrent une résistance plus large et sans effets négatifs par
ailleurs : dans ce cas, ce sont deux acides aminés de la protéine qui sont
modifiés.
Les chercheurs ont d’abord testé l’efficacité de coupures du gène à
l’endroit désiré à l’aide de différents « ciseaux moléculaires » TALENs
et CRISPRs. Le système CRISPR-Cas s’est avéré l’outil le plus
efficace et le moins cher.
6
OUTILS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
ET GENIE GENETIQUE
Introduction
• les méthodes de la biologie moléculaire sont essentiellementbasées
sur l’hybridation entre les bases purique (A et G) et pyrimidiques
(C, T et U)
• Les enzymes de restriction permettent de couper l’ADN dans des
endroits précis
• l’ électrophorèse permet de séparer les segments ADN obtenus en
fonction de leurs poids moléculaires.
1
Introduction
La contribution de la biologie moléculaire est considérable.
 Connaissance de la physiologie moléculaire ; contenu de la

cellule.
 Détermination des séquences des gènes;
 Connaissance sur les mécanismes de régulation de
l’expression des gènes ;
 La pathologie moléculaire ;
 Diagnostic des maladies héréditaires ;
 Elle contribue au conseil génétique ;
Introduction
 Elle possède des applications en médecine légale comme :
– La reconnaissance des personnes lors des grandes catastrophes :
– La reconnaissance de paternité,
– La destruction des individus en criminologie
mis en œuvre l'empreinte génétique permettant d'identifier sans
erreur un individu à partir d'un échantillon de son ADN, Les
matériaux qui sont typiquement recherchés sont le sang, les poils, la
salive, les excréments, des échantillons de peau ou de mucus ainsi
que d’autres types de tissus. La principale méthode utilisée pour
analyser ces matériaux est l’analyse ADN.
2
Coupure des acides nucléiques:
Les enzymes de restriction : ER
Les enzymes de restriction sont extraites de micro-organismes, le
plus souvent des bactéries.
Les bactéries parasitées par des virus à ADN, synthétisent des

enzymes de restriction qui sont capables de cliver les ADN étrangers.
Pour éviter une auto-destruction de leur propre ADN, elles se

protègent contre leurs propres enzymes de restriction par une
modification des sites de restriction correspondants.
Modification des nucléotides de l’ADN bactérien en les
méthylant pour ne plus être reconnus par l’ER par une enzyme
méthylase.
 Ou Absence du site de restriction de l’ADN bactérien
L’ensemble du gène de restriction et du gène de méthylation

constitue un système de défense de la Bactérie vis-à-vis ADN
étrangers.
Nomenclature des enzymes de restriction:

 Désignées selon une sorte de codification comprenant:
Le nom de la bactérie, puis celui de la souche et un numéro

d’ordre en chiffre romain
Pour spécifier la séquence reconnue, un seul brin est écrit dans le

sens 5’→ 3’et la liaison hydrolysée est représenté par un trait
Enzyme Séquences Micro-organismes
EcoRI G/AATTC Escherichia coli
HpAI GTT/AAC Haemophilus parainfluenzae
BamHI G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens
AluI AG/CT Arthobacter luteus
HindIII A/AGCTT Haemophilus influenzae
Smal CCC/GGG Serratia marescens
3
Enzymes
Enzymes de restriction
Molécules extraites à partir de microorganismes

(généralement des bactéries) et qui coupent les liaisons
phospho-diester au niveau des acides nucléiques.
Exo nucléases:
Elles digèrent l'ADN à partir de l'extrémité 5' ou 3'.
Enzymes Enzymes de restriction

Endo nucléases:
Elles coupent l'ADN à l'intérieur en cassant les liaisons phospho-diester.
Elles coupent au niveau de sites spécifiques appelés « sites de
restrictions »,
ces sites sont de nature palindromique, c'est-à-dire que la lecture
des deux brins complémentaires dans des sens opposés donne la
même séquence.
5’ ATGCTAGATAGCAT 3’
3’ TACGATCAATCGTA 5’
Séquence
palindromique
4
Endo-nucléases
Il y a deux catégories d'endo-nucléases : celles qui donnent des
extrémités franches et celles qui donnent des extrémités cohésives. d’où la
possibilité de lier des fragments d’ADN d’origine différentes : c’est le phénomène de la
recombinaison génétique.
Exemple de quelques types

d’enzymes de restriction. Il existe trois types d’enzymes
de restriction.
Les enzymes de type I et III ne
sont pas utilisées en pratique,
car elles coupent l’ADN de
façon aléatoire.
Les enzymes de restriction de
type II, clivent spécifiquement
les deux brins d’ADN au niveau
d’une séquence bien définie.
Elles ont la particularité de
reconnaitre et de couper des
sequences palindromiques
5
Les sites de restrictions
ER catalysent la coupure de l’ADN non méthylé en hydrolysant les
liaisons phosphodiester en des sites d’ADN:
Site de restriction = séquence palindromique de 4, 6 ou 8 bases dans

une orientation anti-parallèle.
Selon la position de la liaison hydrolysée, les fragments ont une

propriété particulière:
Une coupure décalée par rapport à la séquence reconnue forme

des fragments collants ou cohésifs: Coupures cohésives
 Une coupure au milieu de la séquence palindrome donne des

fragments non cohésifs: coupures Franches
6
Copier les acides nucléiques: Les polymérases
Elles permettent de synthétiser soit de l'ADN, soit de l'ARN à partir d'une
matrice ADN ou ARN, le processus s'effectuant toujours de 5' → 3'.
ADN Polymérases
 Produit : ADN
 Matrice: ADN simple brin +Amorce
 Activités exonucléases 3’5’et/ou 5’3’exonucléases : +/-
La Taq polymérase:
 Provient de bactéries vivant dans les sources d'eau chaude.
 Thermostable et agit à une température voisine de 65°C.
 Son utilisation principale est l'amplification enzymatique in vitro
 Pas d’activités exonucléasiques
ARN Polymérases
 Produit : ARN
 Matrice: ADN simple brin
ADN polymérase ARN dépendante (réverse transciptase)
 Produit : ADN
 Matrice: ARN + Amorce
Enzymes
Ligases
Elles réalisent des liaisons phospho-diester, pour souder deux
segments d'ADN.
7
Coller les acides nucléiques: Les Ligases
Les ADN ligases sont des enzymes qui sont capables de reconstituer la
liaison phosphoester entre le carbone 3’-OH et le phosphate-5’ de deux
nucléotides voisins sur un brin de DNA.
Vecteurs
Ce sont des molécules d’ADN construites à partir de plasmides ou
de virus (cosmides), qui permettent le transfert de gènes entre
cellules.
Tous les vecteurs possèdent un poly-linker refermant plusieurs sites
de restriction, où on peut ouvrir le vecteur pour insérer une
séquence d’ADN et un gène de résistance aux antibiotiques.
Il existe deux grandes catégories de vecteurs :
8
Vecteur de clonage
Vecteur de clonage Petite molécule d'ADN autoréplicative -
généralement un plasmide ou un chromosome viral - dans
laquelle un ADN étranger est inséré lors du processus de clonage
de gènes ou de séquences nucléotidiques d'interêt.
Il peut transporter l'ADN inséré et être multiplié dans une cellule
hôte.
Vecteur d'expression
Renferme un promoteur, il permet de faire exprimer un gène Schéma

simplifié
9
Synthèse de molécules thérapeutiques
la production de l’insuline destinée au traitement du diabète
insulino- dépendant est aujourd’hui assurée par des bactéries dans
lesquelles on a introduit le gène humain.
Le facteur de coagulation VIII, absent chez les hémophiles, peut

être de la même manière.
Le gène qui sera transcrit est inséré dans un vecteur d’expression,

après ouverture de ce dernier par l’enzyme de restriction
appropriée.
Le vecteur recombinant ainsi obtenu servira à transformer une

cellule réceptrice.
L’insuline est alors produite par la cellule réceptrice dans des

fermenteurs. Le produit final est ensuite extrait et purifié.
10
Technologies de l’ADN recombinant
Principe
ORGANISME VECTEUR
DONNEUR : (fragment d'ADN
Extraction d'un capable de
fragment d'ADN réplication
d'intérêt autonome)
Exemple : gène associé à

une maladie Insertion du fragment
d'intérêt dans le vecteur
Obtention d'un ADN Recombinant
Amplification de cet ADN, expression des protéines

correspondantes...
11
L'ADN recombinant provient d'une combinaison entre l'ADN d'un
organisme donneur et celui d’un vecteur (qui peut être d'une espèce
totalement différente).
Génie Génétique ou technologie de l’ADN recombinant : ensemble des

techniques de construction d’un ADN recombinant et ses utilisations.
Les cellules modifiées (ayant intégré un ADN recombinant) peuvent
exprimer la protéine recombinante (par exemple une protéine d’une
espèce différente, une protéine modifiée (mutée, fusionnée à une
étiquette…)).
 Le clonage désigne plusieurs choses :

-Une multiplication à l'identique (conservation parfaite de l'information
génétique) : à l’échelle cellulaire (clonage cellulaire) ou à l’échelle de
l’organisme entier (clonage reproductif).
-L’amplification d’un fragment d’AND par des micro-organismes après son
insertion dans un vecteur.
Principe de la technologie de l’ADN recombinant

I) Obtention de l’ADN recombinant
ORGANISME VECTEUR
DONNEUR : (fragment d'ADN
Extraction d'un capable de
fragment d'ADN réplication
d'intérêt autonome)
Exemple : gène associé à

une maladie Insertion du fragment
d'intérêt dans le vecteur
Obtention d'un ADN Recombinant

l’ADN recombinant
II) Utilisation de
Expression et purification des protéines correspondantes,

étude du niveau d’expression et des fonctions des
protéines...
12
Avantages des systèmes d’expression procaryotes
Croissance rapide et peu onéreuse (1 génération toutes les 20-

30 min pour E. Coli), non pathogènes pour l’homme
 Système génétique bien connu, nombreuses souches

améliorées pour optimiser l’expression de la protéine
 Expression des gènes facilement contrôlable
Nombreux vecteurs d’expression disponibles, facilité de

transformation dans les cellules-hôtes
 Bons rendements de production des protéines (plusieurs

dizaines de grammes par litre de culture)
 Facilité de purification
Inconvénients des systèmes d’expression procaryotes
 Surexpression de la protéine recombinante (toxicité)
 Pas de modification post-traductionnelle

Activité biologique différente de la protéine native
 Protéine insoluble et mal repliée
 Présence d’endotoxines bactériennes en large quantité
13
L'électrophorèse sur gel d'agarose est une méthode utilisée en
biochimie et en biologie moléculaire pour séparer l'ADN,
l'ARN ou des protéines en fonction de leur masse moléculaire
14
Séparation des fragments d’ADN
Plusieurs techniques de séparation de l’ADN sont utilisées
 Electrophorèse sur gel (Agarose, polyacrylamide….)
Ln MM en fonction de Rf
 Révélations
 Coloration chimique des gels
 Autoradiographie
 Utilisation des molécules fluorescentes
15
Dégâts provoqués par une centrifugeuse mal équilibré
16
Génie génétique
• Le génie génétique est un ensemble de techniques de biologie moléculaire
permettant d'isoler des gènes spécifiques, de les reconstruire puis de les
réinsérer dans des cellules ou des organismes.
• Ces techniques ont fourni à la médecine et à l'industrie un moyen efficace de

produire en grandes quantités de protéines spécifiques, qui, auparavant,
n'étaient disponibles qu'en quantité extrêmement faibles.
• Ces techniques ont permis également d'étudier la régulation de leur expression

et ainsi de mieux comprendre le développement de maladies génétiques.
• Les différentes étapes passent par : la construction d'une banque d'ADN, le

criblage de la banque et l'expression du gène
Le clonage moléculaire est une des bases du génie génétique.
Différences principales entre le clonage et le génie génétique
• Le clonage et le génie génétique sont deux types de techniques biotechnologiques

utilisées pour produire des organismes utiles.
• Le clonage est la création d'une réplique parfaite d'un organisme particulier.
• Le génie génétique est la création d'un nouvel organisme par la modification du

génome d'un organisme particulier.
• La différence principale entre le clonage et le génie génétique est que dans le

clonage, le nouvel organisme est génétiquement similaire à l'organisme parent
alors qu'en génie génétique, le nouvel organisme n'est pas génétiquement
identique à l'organisme parent.
• Le clonage peut également être considéré comme un processus naturel, car il se

produit pendant la reproduction asexuée..
1
Différence principale entre le clonage et le génie génétique
Naturel / Artificiel
Clonage: Le clonage peut se produire naturellement dans la reproduction asexuée et

artificiellement par le clonage moléculaire et le clonage reproductif.
Le génie génétique est une technique artificielle.
Matériel génétique
Clonage: Le clonage est la production de copies génétiquement identiques..
Le génie génétique modifie le matériel génétique d'un organisme particulier.
Rôle
Clonage: Le clonage est important pour le maintien des caractéristiques bénéfiques

d'un organisme particulier au fil des générations.
Le génie génétique est impliqué dans l'introduction de nouvelles caractéristiques

souhaitées pour un organisme particulier.
Qu'est-ce que le génie génétique?
La modification de l'ADN afin de produire de

nouveaux types d'organismes en insérant ou en
supprimant des gènes.
L'organisme à ADN modifié est connu sous le

nom d'organisme génétiquement modifié
(OGM).
2
Transgénèse
• La transgénèse est le fait d'incorporer un ou plusieurs gènes dans le génome

d'un organisme vivant.
• Ce transgène pourra être exprimé dans l'organisme transformé.
Transgénèse
• Stratégie servant initialement aux chercheurs pour étudier la fonction des gènes,
cette approche est également utilisée par les industries pharmaceutique et agro-
alimentaire.
• Elle est entre autres la nouvelle stratégie d’obtention de variétés végétales ou

animales résistantes au stress biotique (parasites, insectes) ou abiotique (sécheresse,
faible luminosité).
3
Transgénèse
• Plusieurs découvertes scientifiques ont permis d'aboutir à l'obtention de la
première plante transgénique en 1983.
• La compréhension des mécanismes responsables de la galle du collet, maladie

connue depuis l'antiquité, a permis la mise en évidence d'un transfert génétique
naturel.
• Elle est à l'origine des techniques de transformation génétique utilisées

aujourd'hui.
Transgénèse : Agrobacterium tumefaciens

• Agrobacterium tumefaciens est une bactérie pathogène des végétaux responsable d'une
maladie appelée galle du collet.
• Le mécanisme de formation des galles est dû à un plasmide appelé plasmide Ti

qui rend les bactéries virulentes.
4
• Un fragment d'ADN du plasmide Ti, l'ADN-T est transféré de la bactérie vers la

plante, puis intégré dans le génome végétal où il induit la formations des galles
caractérisés par la multiplication anarchique des cellules végétales.
• Agrobacterium réalise donc, naturellement, une transgenèse d’une partie de ses

gènes (grâce à pTi) dans un organisme végétal. L’ADN qui est ainsi transféré est
nommé ADN-T.
• Il a donc été rapidement proposé, une fois ce mécanisme connu, de le détourner

dans un but de transgenèse.
• Pour cela, il « suffit » de remplacer l’ADN-T par un autre ADN portant un gène
d’intérêt, par exemple
5
Exemples de transgénèse
6
GFP
7
8
9
Epigénétique : Comment
l’environnement influence nos gènes
Notre environnement a une influence sur notre génome par des
modifications dites épigénétiques.
Par exemple, avec des patrimoines génétiques identiques, deux

jumeaux peuvent évoluer différemment en fonction de leurs
environnements respectifs. Les individus, et par voie de
conséquence leurs gènes, sont en effet soumis à de nombreux
facteurs environnementaux : alimentation, maladies, médicaments
et toxiques, stress, lieu & hygiène de vie, qui peuvent modifier
autant leurs cellules que leur ADN.
Epigénétique : Comment
l’environnement influence nos gènes
Ainsi dans les paires de jumeaux monozygotes, de grandes
différences en ce qui concerne la trajectoire de vie ont été
constatées.
L’un pouvait développer une obésité et l’autre rester mince ; l’un

pouvait être sain d’esprit et l’autre développer une pathologie
mentale. Quelques exemples pris chez l’animal et l’homme mettent
en évidence le rôle de l’épigénétique dans la transmission de
caractères acquis.
10
Méthylation : clé de
l’épigénétique
• On sait aujourd’hui que les gènes peuvent être « allumés »
ou « éteints » par plusieurs types de modifications
chimiques qui ne changent pas la séquence de l’ADN
comme des méthylations de l’ADN et des modifications des
histones, ces protéines sur lesquelles s’enroule l’ADN pour
former la chromatine
l’épigénétique
• Les modifications épigénétiques sont induites par l’environnement
au sens large : la cellule reçoit en permanence toutes sortes de
signaux l’informant sur son environnement, de manière à ce
qu’elle se spécialise au cours du développement, ou ajuste son
activité à la situation (Lire L’épigénétique, le génome et son
environnement). Ces signaux, y compris ceux liés à nos
comportements (alimentation, tabagisme, stress…), peuvent
conduire à des modifications dans l’expression de nos gènes, sans
affecter leur séquence.
11
l’épigénétique
• Le phénomène peut être transitoire, mais il existe des
modifications épigénétiques pérennes, qui persistent lorsque
le signal qui les a induites disparaît. Contrairement aux
mutations génétiques qui sont irréversibles, le « marquage
» épigénétique peut changer.
• Un simple changement d’environnement peut modifier le

fonctionnement des gènes dont nous héritons à la naissance,
et donc de notre « phénotype »
12
Extraction, purification et
révélation des acides nucléiques
09/12/2021
TECHNIQUES GÉNÉRALES
DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
Plusieurs outils ont été développés pour étudier les acides

nucléiques:
Les séparer, les purifier, les analyser, les amplifier, les cloner, pour
les transporter grâce à des vecteurs de clonage, les intégrer dans
des cellules hôtes
Ces outils ont permis de mettre en place des techniques qui sont à
l’origine du développement de la biologie moléculaire et du génie
génétique
1
I. Méthodes et outils généraux
1. Extraction et purification du matériel génétique
L’extraction et la purification des AN sont les premières étapes dans la

plupart des études de biologie moléculaire et dans toutes les techniques
d’ADN recombinant.
L’objectif des méthodes d’extraction des acides nucléiques dans le cas

présent est d’obtenir des acides nucléiques purifiés, tirés de sources
diverses, afin de pouvoir mener une analyse spécifique.
Vu qu’il existe une grande diversité de méthodes d’extraction et de

purification des AN, le choix de la technique la plus adéquate repose
généralement sur les critères suivants :
 L’acide nucléique cible,
 L’organisme source et le matériel de départ (tissu, feuille,
graine, matériel transformé, etc.),
 Les résultats escomptés (rendement, pureté, temps de
purification requis, etc.),
Quantité extraite
ADN des cellules eucaryotes animales = ADN nucléaire
+ADNmit
 Source: le sang, tissus (biopsies), cultures cellulaire,
plantes, aliments…
 Chez l’homme
 6-7 10-12 g/Cellule
 1ml de sang 5-6 106 leucocytes soit 3 10-6 g d’ADN
Et 1014 cellules dans le corps humain soit
600 g d’ADN
2
Principales étapes de la purification des AN
Différents protocoles pour extraire les AN avec même schéma de principe :
Prélèvement (Echantillons)
Lyse des cellules nuclées  Lyse par détergents

 Traitement mécanique
Dégradation des protéines  Traitement par la protéinase K
 Solvants organiques
Extraction desAN  Agents chaotropiques
 Fixation par interaction decharges
Précipitation de l’ADN  Alcools
Introduction
Toute étude de génétique moléculaire implique la disposition
d’échantillons d’acides nucléiques.
L'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler

l'acide désoxyribonucléique (ADN) des cellules ou des tissus.
L'ADN ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour des
recherches de biologie moléculaire, telles que le séquençage,
la PCR ou le clonage…
3
• Il existe différents protocoles pour extraire l'ADN, qui
suivent approximativement le même schéma de principe :
• Lyse des cellules

• Elimination des protéines
• Elimination des autres acides nucléiques (acide
ribonucléique (ARN), etc.)
• Concentration de l'ADN par précipitation à l'éthanol
Réalisation
Différentes variantes sont employées, suivant que l'on cherche à
extraire de l'ADN génomique (issu du ou des chromosomes des
cellules analysées) ou de l'ADN plasmidique (provenant de
plasmides portés le plus souvent par des cellules bactériennes
comme Escherichia coli).
Il existe aujourd'hui des kits commerciaux permettant de

réaliser rapidement ces extractions à l'aide de réactifs prêts à
l'emploi.
4
Préparation d'ADN génomique
On commence en général par une lyse des cellules ou des tissus,

consistant éventuellement en un broyage, suivi d'une extraction par
des détergents, qui vont disperser les bicouches lipidiques des
membranes et dénaturer les protéines, et en particulier celles qui
sont associées à l'ADN dans la chromatine.
La solution obtenue est en général très visqueuse, car l'ADN ainsi

libéré forme de très longs filaments qui s'opposent aux écoulements
hydrodynamiques.
5
En biologie, un environnement cellulaire hypotonique est un environnement
ayant une concentration en solutés inférieure à celle du cytoplasme
L'étape suivante est la déprotéinisation de la solution qui

se fait par une extraction au moyen de solvants
organiques, en général du phénol additionné de plus ou
moins de chloroforme. Les protéines dénaturées forment
un précipité à l'interface phénol-eau, tandis que l'ADN
reste en solution dans la phase aqueuse qui est récupérée
par décantation ou par centrifugation.
6
L'ADN est ensuite précipité par addition d'éthanol ou

d'isopropanol dans la phase aqueuse, collecté par
centrifugation et dissout dans du tampon.
Pour éliminer les traces de phénol et d'autres

contaminants, on peut enfin pratiquer une dialyse ou une
étape de purification par chromatographie préparative.
Précipitation à l’alcool éthylique

Elle doit être effectuée à haute force ionique (en utilisant un
sel, le NaCl, qui augmente la dissolution des acides nucléiques
et leur agrégation : c à d que les ions Na+ (du NaCl)
neutralisent les groupements phosphates PO4- des acides
nucléiques les rendant moins hydrophiles et donc moins
solubles).
L’éthanol doit aussi être à haute concentration (2,5 volumes
d’éthanol à 95° par volume d’échantillon). Dans ces conditions
les acides nucléiques sont presque totalement précipités et
apparaissent sous une forme non soluble car la solution
d’éthanol permettra de pomper l’eau qui entoure la molécule
d’acide nucléique et qui la rendait soluble; sans eau, elle
précipite.
7
Préparation d'ADN plasmidique
La préparation d'ADN plasmidique à partir de

bactéries est l'une des techniques les plus courantes
de la biologie moléculaire, également connue sous
les noms abrégés de miniprep, midiprep et
maxiprep en fonction du volume de la culture
bactérienne utilisée.
Le principe de l'extraction est connu sous le nom de lyse alcaline.

Cette méthode permet de préparer sélectivement l'ADN du plasmide
contenu dans les bactéries, tout en éliminant l'ADN du chromosome
bactérien.
Le principe de cette méthode consiste à effectuer la lyse des cellules

au moyen d'un détergent (dodécyl sulfate de sodium) en présence
de soude, à pH 13.
À ce pH très alcalin, l'ADN est dénaturé, c’est-à-dire que les deux

brins de la double-hélice sont séparés.
8
On neutralise ensuite rapidement la solution, ce qui provoque la
renaturation brutale (réappariement des brins d'ADN).
L'ADN chromosomique, très long (~10⁶ paires de base), ne parvient pas à

se réapparier complètement et forme des enchevêtrements insolubles.
L'ADN plasmidique, court (~10³ paires de base), parvient à se réassocier
complètement et reste en solution.
On sépare alors les espèces par centrifugation. Les protéines précipitées,

sont également éliminées avec le détergent et l'ADN chromosomique.
L'ADN plasmidique, resté en solution, est alors concentré par
précipitation à l'alcool.
Différentes variantes ou améliorations de cette méthode existent

notamment dans un grand nombre de kits commerciaux.
Ces derniers contiennent souvent des petites colonnes de résine

chromatographique échangeuse d'ion, permettant d'améliorer la
pureté de l'ADN obtenu.
Pour éliminer les ARN, on ajoute fréquemment des ribonucléases

qui vont hydrolyser sélectivement ces acides nucléiques, en laissant
l'ADN intact.
9
Contrôle de l'extraction
Par électrophorèse sur gel d'agarose, on peut analyser la présence et la
taille des acides nucléiques contenus dans la préparation.
Ceux-ci sont révélés par le bromure d'éthidium, un colorant dont la

fluorescence augmente très sensiblement quand il interagit avec l'ADN.
Dans le cas d'une préparation d'ADN plasmidique, on observe sous UV une
ou plusieurs bandes colorées discretes dans le gel, correspondant à l'ADN
du plasmide.
Dans le cas d'ADN chromosomique, on observe un continuum de bandes,

correspondant aux fragments d'ADN issus de la coupure statistique du
chromosome résultant des traitements mécaniques lors de l'extraction de
L'ADN.
10
Contrôle de l'extraction
Par mesure de l'extinction dans l'UV au moyen d'un
spectrophotomètre.
L'ADN possède un maximum d'extinction à 254 nm.
1 unité d'absorbance à 254 nm correspond à environ 50 μg

d'ADN double-brin par millilitre.
 Remarque:
L'extraction des ARN est très différente de celle des ADN, car ils
sont beaucoup plus fragiles ( simple brin, —OH attaquable … ).
On utilise à peu près le même protocole qu'avec l’ADN sauf qu'il
faut ajouter un inhibiteur des RNases, des DNases ainsi qu'un agent
réducteur.
 Devenir des acides nucléiques extraits
 Exploitation directe avec ou sans amplification
 Quantification par dosage des acides nucléiques
Spectrophotomètre ( = 260 nm)
ADN double brin : 1 unité de DO <==> 50 g/ml
ADN simple brin : 1 unité de DO <==> 33 g/ml
ARN : 1 unité de DO <==> 40 g/ml
==> Détermination du rapport DO 260/DO 280 nm
 Si le rapport entre 1,7 et 2 ==> Extraction OK

 Si le rapport est < 1,7 ==> Refaire l’extraction OK
 Conservation :
 En solution, à 4°C : qq années
 Sous forme précipitée à -20°: plus long terme
11
12
13

Le Génie Génétique Agro

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Université Sultan Moulay Slimane

École Nationale des Sciences Appliquées

Année universitaire 2021-2022

 50% du poids sec de la plupart des cellules = protéines

 Protéine = polymère (chaîne) d'acides aminés

 Chaque protéine est caractérisée par sa séquence d'acides aminés.

 On connaît actuellement ~ 8000 protéines différentes.

Chromatine = protéines appelées histones et d'ADN

 Crick et Watson, 1953

 Découverte de la structure de la molécule

 ADN et ARN = acides nucléiques

 Les acides nucléiques = polymères de nucléotides

 NUCLÉOTIDE = ose + base azotée + acide phosphorique

 L’ose : pentose cyclique

 Les bases azotées : puriques ou pyrimidiques

 ADN = Acide DésoxyriboNucléique

 Polymères de nucléotides reliés entre eux par des fonctions esters

 Les bases : Adénine, Guanine, Cytosine et Thymine

 Si on sépare une molécule d'ADN en nucléotides, on obtient toujours :

 Hypothèse de Crick et Watson : A peut s'apparier avec T et

 Donc la molécule d’ADN est formée de 2 brins de nucléotides

 Ces deux brins ont trois propriétés essentielles :

 L'orientation entre les liaisons donne une

 10 paires de base par pas de l’hélice

 Dans tous les organismes :

 Virus : génomes les plus petits (quelques milliers de nucléotides) à

ADN des différents être vivants :

 Procaryotes : ADN dans le cytoplasme

 Eucaryotes : ADN dans le noyau

 ARN = Acide RiboNucléique

 Polymères de nucléotides reliés entre eux par des fonctions esters

 Les bases : Adénine, Guanine, Cytosine et Uracile

 ARN = un seul brin

 Appariement entre 2 ARN différents, entre un brin d’ADN et un brin

Les différents ARNs :

 ARNr = ARN ribosomique

 ARNt = ARN de transfert

 ARNm = ARN messagers

 ARNsn= ARN small nuclear

 Propriétés importantes pour l’isolation et l’étude des acides

 Stabilité : Liaisons H = spécificité de l’appariement des bases

 Solubilité : solubles dans phénol, solutions salines et alcalines

 Viscosité : ADN long et mince donc solution très visqueuse

 Densité : environ 1,7 g/cm3, isolation possible sur gradient de césium

 Dénaturation : chimique par l’urée ou le formamide

Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques :

 Propriétés importantes pour l’isolation et l’études des acides

 Absorption UV : Les bases absorbent dans l’UV avec un maximum

 Quantification : concentration déterminée par l’absorption à 260 nm

 Pureté de l’ADN : utilisation du rapport A260/A280

 ADN = Lieu de stockage de l’information génétique

 Pourquoi utiliser un code de trois nucléotides ?

Si 3 nucléotides = 1 acide aminé

 Or il existe 20 acides aminés différents

Le code génétique : (déchiffré entre 1960 et 1964)

AAA Phénylalanine AGA Sérine ATA Tyrosine ACA Cystéine

N.B. 64 combinaisons pour 20 acides aminés.

 Dégénéré : Un acide aminé est codé par plusieurs codons

 Universel : Identique chez tous les êtres vivants

 Non chevauchant : Les codons sont lus en série depuis un point de

 Un segment d'ADN portant toute l'information nécessaire pour la

 Gène de de la protéine Phé-Arg-Leu-Phé-Leu

 Les gènes chez les procaryotes contiennent :

 Une zone d’initiation de la transcription