BACHELIER EN CHIMIE

ORIENTATION : BIOTECHNOLOGIE
BA1

COURS DE BIOLOGIE/
BIOCHIMIE
UE BTB01 – 2023/2024
PARTIE THEORIQUE
Chargée de cours : S. AL BUSACLI

BIOLOGIE/BIOCHIMIE-2019/2020 1
 SEQUENCE 6
LES ACIDES NUCLEIQUES

2
GÉNÉRALITÉS

3
 Découverte des AN

▪ Le médecin suisse MIESCHER isola en 1869, à partir de leucocytes

de pus de plaies infectées, une substance organique
remarquablement riche en phosphore qu'il baptisa NUCLÉINE.

▪ Sa nature chimique fut élucidée par les travaux initiateurs de

KOSSEL à partir de 1882 jusqu'à ceux de LEVENE en 1927 : il
s'agissait de l'acide désoxyribonucléique dont l'abréviation est ADN
(DNA : anglo-saxon), polymère d'unités dénommées nucléotides.

4
Le dogme central

L’ADN dicte nos phénotypes

5
 Le dogme central

Language à 4 lettres : nucléotides

Language à 20 lettres : acides aminés

LE CODE GENETIQUE (1966)

TTT phe F TCT ser S TAT tyr Y TGT cys C

TTC phe F TCC ser S TAC tyr Y TGC cys C
TTA leu L TCA ser S TAA ochre TGA opale
TTG leu L TCG ser S TAG amber TGG trp W

CTT leu L CCT pro P CAT his H CGT arg R

CTC leu L CCC pro P CAC his H CGC arg R
CTA leu L CCA pro P CAA gln Q CGA arg R
CTG leu L CCG pro P CAG gln Q CGG arg R

ATT ile I ACT thr T AAT asn N AGT ser S

ATC ile I ACC thr T AAC asn N AGC ser S
ATA ile I ACA thr T AAA lys K AGA arg R
ATG met M ACG thr T AAG lys K AGG arg R

GTT val V GCT ala A GAT asp D GGT gly G

GTC val V GCC ala A GAC asp D GGC gly G
GTA val V GCA ala A GAA glu E GGA gly G
GTG val V GCG ala A GAG glu E GGG gly G

6
 Propriétés des AN
o Acides faibles du point de vue chimique.
o Isolés initialement du noyau des cellules.
o Présents, non seulement dans le noyau mais aussi dans le cytoplasme
des cellules.
o MACROMOLECULES constituées par la répétition d’une sous unité
appelée nucléotide
o 2 types d’AN : l’ADN et l'ARN.

7
 L’ADN et l’ARN
L’ADN
❑Molécule d’une grande importance biologique.
❑Support biochimique de l’information génétique.
❑Principal véhicule du phénomène de l’hérédité.
❑Localisé principalement dans le noyau + dans le cytoplasme ! ADN mitochondrial
responsable de l’hérédité mitochondriale.

L’ARN
❑Acteur de l’expression de l’information génétique.
❑Localisé essentiellement dans le cytoplasme, mais aussi dans le noyau.
❑Support biochimique de l’information génétique chez certains acellulaires (virus à ARN).
❑Nécessaire à l’expression des génomes chez tous les organismes.
❑Regroupé en trois classes : les ARN messagers (ARNm), les ARN de transfert (ARNt) et les
ARN ribosomaux (ARNr)

8
Localisation de l’ADN dans la cellule

9
Localisation de l’ADN dans la cellule

10
 Les bases azotés
❑ Cinq bases majeures entrent dans la composition des AN.
❑ Synonymes : bases azotées, base nucléiques ou de nucléobases.
❑ Trois d'entres elles sont communes aux ADN et aux ARN : l'Adénine (A), la Cytosine (C) et la Guanine
(G). La 4e est la Thymine (T) pour l'ADN et l'Uracile (U) pour l'ARN.
❑ On peut décomposer ces bases en deux familles : les bases « puriques » (A et G) qui sont construite sur
un motif purine et les bases pyrimidiques (C, T et U), basées sur un motif pyrimidine.

Les 4 bases de l’ADN

11
 Les bases azotées
ATTENTION
▪Les noms courants des différentes bases
n'ont aucun lien avec la nomenclature
classique de la chimie organique.
▪Certains noms de bases font référence à
leurs conditions de découverte.
Exemples
• thymine : thymus de veau.
• guano : fiente des oiseaux.

12
 Les bases modifiées dans les AN
LA METHYLATION DE LA CYTOSINE donne la 5-
méthylcytosine
❑Trouvée dans l'ADN des plantes et des animaux sauf les
insectes.
❑Signal négatif de la régulation de l'expression des gènes, le
groupe méthyle favorisant une conformation de l'ADN qui ne
peut fixer un facteur de transcription.

L A M E T H Y L AT I O N D E L’ A D E N I N E d o n n e l a N 6 -
méthyladénine
❑Présente dans les bactéries.
❑Cette méthylation permet aux enzymes de restriction de la
bactérie de reconnaître son propre ADN vis-à-vis d'ADN
étrangers (virus).
❑D'autres méthylations permettent le fonctionnement d'un
système de correction des éventuelles erreurs de réplication.

13
Les bases modifiées dans les AN

14
 Composition de base des AN
▪ Polymère de nucléotides.
▪ Nucléotide = base azotée (base purique ou pyrimidique) + un sucre
(ribose ou désoxyribose) + groupement phosphate.
! La base azotée : support de l’information génétique
! Sucre/groupement phosphate : squelette

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 Les sucres des AN
o Deux types de pentoses sont présents dans les AN : le ribose et le 2’-
désoxyribose.
o On les numérote avec des chiffres accompagnés de l’indication prime
pour éviter des confusions avec les numérotations des bases.
o Le 2’-désoxyribose est un ribose dans lequel il manque un OH en
2’ (remplacé par un H).

ARN

ADN

16
Les nucléosides

17
 La liaison glycosidique
• La liaison ose-base est une liaison glycosidique, appelée β-osidique.
- Elle se forme par élimination d’une molécule d’eau entre la base purique ou pyrimidique et l’OH
situé en C1 de l’ose.

• Les liaisons glycosidiques sont de deux types : soit une conformation anti, soit une
conformation syn.
- Dans le type anti, le sucre et la base sont éloignés l’un de l’autre.
- A l’opposé, dans le type syn, la base et l’ose sont proches l’un de l’autre.

18
Les nucléosides puriques

19
Les nucléosides pyrimidiques

20
 Les nucléosides

Désoxy Désoxy Désoxy

21
Les nucléosides

22
 Les nucléotides
Assemblage chimique composé d'un nucléoside (un sucre et une nucléobase) et de 1 à 3 groupements
phosphate.

23
Les nucléotides

24
 Les nucléotides

Base azotée

Groupement
phosphate

Sucre : ribose

BIOLOGIE/BIOCHIMIE-2019/2020 25
Nomenclature des nucléotides

26
 Connexions entre les nucléotides
• Les séquences nucléotidiques sont représentées comme une succession de bases
azotées, symbolisées par une lettre (A, G, C ou T pour l'ADN ou A, G, C ou U
pour l'ARN).
• Le sens de lecture se fait de l'extrémité 5' (extrémité du groupe phosphate
-PO32-) vers l'extrémité 3' (extrémité du groupe -OH). Le sens inverse est
appelé ‘antisens'.

27
Connexion entre les nucléotides

28
 Connexion entre les nucléotides
• Par convention, on lit toujours un acide nucléique dans le sens de l’extrémité
5’ (comportant en règle générale un groupement phosphate) vers l’extrémité 3’
qui possède un OH libre.
• La séquence des bases d’un ADN sera (par convention) écrite soit dans le sens
vertical ou dans le sens horizontal en précisant les extrémités 5’ et 3’ et on
indique seulement les bases correspondantes (A, T, G ou C).
Exemple : 5’ -ACGTAAC-3’

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 La liaison phosphodiester
❑ Lien entre un élément Phosphore d'un groupement
phosphate, avec 2 autres molécules via 2 liens ester.
❑ On appelle ces liens des liaisons phosphoester, et
comme il y en a deux, on dit qu'elles sont une liaison
phosphodiester.
Importance :
! Confère leur charge négative aux AN
! Oriente les polynucléotides

Au sein des cellules, les charges négatives des AN sont

habituellement neutralisées par des interactions avec des ions
métalliques tels que Mg2+ ou des protéines qui contiennent de
nombreux résidus basiques, tels que ceux de l’arginine ou de la
lysine, et sont donc chargées positivement.

30
Les 4 nucléotides de l’ADN

31
Les 4 nucléotides de l’ADN

32
Représentation schématique de l’ADN

33
Appariement des bases azotées dans l’ADN
▪ L'appariement des bases correspond à l'interaction entre les bases A et T d'un côté et entre les bases G et
C de l'autre.
▪ Les paires de bases interagissent à travers des interactions électrostatiques de type « liaison
hydrogène ».
❖ L'association entre A et T est stabilisée par 2 interactions de type liaison hydrogène.
❖ L'association entre G et C est stabilisée par 3 interactions de type liaison hydrogène.
▪ Cet appariement canonique s'appelle également appariement Watson-Crick, du nom des 2 biologistes
(James Dewey Watson et Francis Crick) lauréats du prix Nobel en 1962 pour la découverte de la
structure en double hélice de l'ADN.

34
Appariement des bases azotées dans l’ADN
■ L'appariement de base entre deux purines, deux pyrimidines ou des
bases non complémentaires A-C ou G-T est défavorisé
■ Les liaisons hydrogènes ne peuvent se former sous peine de
rompre la géométrie de l'hélice.
■ Une conséquence de cette règle d'appariement des bases est que la
séquence d'un brin définit la séquence des bases de l'autre brin.

35
 Appariement des bases azotées dans l’ADN
Bases reliées entre elles par des liaisons H :
-A – T (2 liaisons H)
-G – C (3 liaisons H)

36
 Appariement des bases azotées

❑ Dans toutes les espèces, les

pourcentages des bases A et T et
des bases C et G d’une molécule
d’ADN sont égaux :
%A = %T et %C = %G

❑ Le rapport (A+T)/(C+G) varie selon

les espèces.

❑ Le pourcentage molaire (%) d’une

base :
(C, G, A ou T) x100
C+G+A+T

❑ La fraction molaire d’une base :

(C, G, A ou T)
C+G+A+T

37
Stabilisation de la double hélice d'ADN

La stabilisation de la double hélice s'effectue par des liaisons

chimiques faibles et non covalentes à la fois internes et externes :

▪ Liaisons hydrogène entre les bases.

▪ Interactions hydrophobes et électroniques entre les bases.
▪ Interactions des groupements sucre et phosphate avec le milieu
aqueux (interactions hydrophiles).

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 Importance des nucléotides

Les nucléotides ont des fonctions variées et importantes :

❑ des composés à "haut potentiel énergétique" dont dépendent l'activation de
molécules : ATP ;
❑ des composés structuraux de coenzymes ;
❑ des seconds messagers intracellulaires de signaux et des médiateurs
extracellulaires, des régulateurs d'activité de protéines: AMPc.

39
Les types d’ARN

40
 Les types d’ARN
• Le groupement OH porté par le carbone 2 du ribofurannose rend les ARN plus
sensibles à l'hydrolyse de la liaison phosphodiester.
• Les ARN sont donc des molécules moins stables que l'ADN, raison pour laquelle
l'ADN est employé comme molécule de stockage.
• Parmi les ARN, l'ARN ribosomal est le plus abondant et le plus stable (temps de demi-
vie moyen : quelques jours) car il est très replié via de nombreux appariements
intramoléculaires et son association à un grand nombre de protéines.
• Les ARN de transfert sont assez stables car repliés via de nombreux appariements
intramoléculaires.
• Les ARN messagers sont les moins stables (temps de demi-vie moyen de quelques
jours).

41
Les ARN fonctionnels - ARNf

42
Structure de l’ARN

43
Propriétés de l’ARN

44
L’ARN est simple brin

45
Structure secondaire de l’ARN

46
STRUCTURE 3D DE L’ADN

47
 Structure de l’ADN en double hélice

• L'ADN possède une structure en forme de double

hélice (découverte en 1953 par James Dewey Watson,
Francis Crick et coll.).
• Le modèle décrit par Watson et Crick est celui du
DNA-B qui est la forme essentielle du DNA dans les
conditions physiologiques.
• Le squelette (en gris) pentose-phosphate forment les
bordures extérieures de l'hélice.
• A l'intérieur se trouvent les bases azotées qui sont
liées de manière complémentaires deux à deux.

48
 Propriétés de la double hélice d'ADN
• Séquence orientée : extrémités 5’ phosphate et 3’ hydroxyle
5’ 3’ ‘libres’
• Brins anti-parallèles : indispensable pour la formation des
liaisons H
• Brins complémentaires : importance du sens de la lecture
(convention) !

3’ 5’
49
Propriétés de la double hélice d'ADN
Par convention, seule la séquence 5’ -> 3’ du brin
codant de l’ADN est représentée.
ATGGCATGCAATAGCTCATCG...

Brin codant
Brin matrice

50
Propriétés de la double hélice d'ADN

Par convention, seule la séquence 5’ -> 3’ du brin codant de l’ADN est

représentée.

51
 Propriétés de la double hélice d'ADN
▪ Comporte de 2 sillons asymétriques : le sillon majeur et mineur ou encore grand et
petit sillon
▪ La forme majoritaire de la double hélice : la forme B ! appelée hélice droite.
▪ Chaque paire de base est orthogonale à l'axe de la double hélice (angle +/- 1.2°)
▪ Un tour d'hélice nécessite ~21 nucléotides (soit ~10.5 paires de base) et s'effectue sur 34 Å
▪ La distance entre deux bases est d'environ 3.4 Å
▪ Le diamètre de la double hélice fait 20 Å

52
Propriétés de la double hélice d'ADN

53
 Stabilisation de la double hélice
• Nombreuses liaisons : physiquement et chimiquement stable ;
de longues chaînes peuvent être conservées sans cassure
• Liaisons hydrogène (H) faibles : rupture facile (transcription ;
réplication)
• Double brin : information “redondante”
- Propriété essentielle :
❑ pour les processus de réparation de l’ADN (correction sur épreuve)
❑ pour la réplication de l’ADN et la transmission de l’information génétique
(réplication semi-conservative)

54
Les 3 formes d'ADN – A, B et Z
Pour la forme de l'hélice d'ADN, il existe
plusieurs enroulement de l'hélice. La plus
fréquente, celle qu'on retrouve dans nos
cellules est la B-DNA mais il en existe
pleins d'autres dont la conformation Z et A.

55
Les 3 formes d'ADN – A, B et Z

56
Positions anti et syn des sucres

57
Les formes d'ADN – la forme B
Les groupements chimiques des bases sont exposés au
solvant (projetés vers l'extérieur) dans la double hélice.

A : atomes accepteurs d'hydrogène,

D : atomes donneurs d'hydrogène,
H : hydrogène non polaire,
M : groupements méthyle.

58
PROPRIÉTÉS PHYSICO-
CHIMIQUES DE L’ADN
 Caractéristiques de l'ADN

• Solubilité,
• Taille,
• Densité,
• Nature fibreuse,
• Charge,
• Propriétés spectrales,
• Dénaturation et renaturation thermique,
• …

60
 Solubilité

L’ADN :
❑ chargé négativement en raison des groupements
phosphates ;
❑ soluble dans l’eau en présence de sels de sodium
(les charges négatives sont neutralisées par les
ions sodium) avec une viscosité élevée (méduse) ;
❑ précipite dans l’éthanol en présence de sels de
sodium.

61
Taille

62
Poids moléculaire

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 Densité
■ Fonction de la richesse en G/C
■ L’ARN est plus dense que l’ADN qui
est lui-même plus dense que les
protéines.
■ L’ADN chromosomique est moins
dense que l’ADN plasmidique.

Séparation d’ADN, d’ARN et protéines par centrifugation chlorure de césium (CsCl)

Ces macromolécules ont des densités très voisines comprises entre 1,25 et 1,3 g/mL.

La présence de ClCs va provoquer la fixation différentielle d'ions Cs+ sur ces

macromolécules.

Leur densité apparente est alors modifiée : protéine = 1,3g/mL ; ARN = 1,75-1,89g/mL ;
ADN = 1,6-1,79g/mL.

Ces macromolécules sont alors aisément séparées lors de la centrifugation.

64
65
La nature fibreuse

66
Charge

67
Propriétés spectrales

68
 Propriétés spectrales

Le spectre d’absorption d’une solution d’acides nucléiques pure est représenté par une
courbe caractéristique représenté par la figure 1. Un changement de profil de cette
courbe est un bon indicateur de l’impureté d’une solution y compris pour les solutions
d’acides nucléiques.
La figure 2 montre des décalages des courbes de spectre d’absorption d’un même ADN
en solution pure ou contenant des contaminants.
69
 Propriétés spectrales

Le spectre et les ratios A260/280, A260/230 pour un oligonucléotide ne sont pas les
mêmes que pour un ADN. La figure 3 compare les spectres d’absorption d’un
oligonucléotide pur et d’un ADN double brin pur. Il est important de noter que la lmax pour
chaque nucléotide (A, T, C, G) est différent et spécifique (comprises entre 255 – 280 nm)
et que chaque nucléotide contribue au spectre d’absorption.

70
 Propriétés spectrales

Etant donné que les oligonucléotides sont en simple brin et très courts, leur spectre
d’absorption varie significativement en fonction de leur séquence. Le spectre et les ratios
A260/280 et A260/230 des oligonucléotides sont décalés par rapport à l’ADN et donc les
ratios de pureté de référence pour les ADN ne sont pas applicables aux oligonucléotides.
Par exemple, la figure 3 montre que l’oligonucléotide pur n’a pas les mêmes ratios
A260/280 et A260/230 que ceux de l’ADN double brin pur.
71
 Propriétés spectrales

Une solution d’ADNdb à 50 ug/mL a une absorbance de 1,00 à 260 nm

72
Mesure de l’absorbance de l’ADN

73
Mesure de l’absorbance de l’ADN

74
 Température de fusion

❑ Température de fusion, appelée également Température de

demi dénaturation (Tm).
❑ Elle correspond à l’ouverture ou au déroulement de 50% de la
chaîne de l’ADN chauffé.
❑ Effet hyperchromique qui correspond à la rupture des liaisons
hydrogènes et la séparation des 2 chaînes entraîne une
augmentation dans l'absorption d'U.V. de 40% à 260 nm.

75
 Quantité de G-C et la Tm
Plus il y a de G-C, plus il y a de liaison Hydrogènes, plus la
dénaturation est difficile, plus il faut augmenter la Tm.

76
Calcul de la Tm

77
 Facteurs de variation de la Tm

La température de fusion est influencée par plusieurs facteurs :

▪ Composition en bases
▪ Longueur des brins
▪ Les mésappariements
▪ Milieu environnant l'ADN :
■ Une diminution de la force ionique diminue le Tm
■ La présence de formamide diminue le Tm

78
Facteurs de variation de la Tm
1) Tm et composition en bases de l’ADN

79
 Facteurs de variation de la Tm
2) Les mésappariements
De manière générale, l’abaissement de la Tm est de 1°C pour une valeur de 1%
de mésappariement (mismatch).

3) Nature du milieu de l’ADN

Les sels sous forme de cations monovalents, lorsqu’ils sont ajoutés en fortes
concentrations (>1M) n’influencent pas les valeurs de Tm. Par contre, aux faibles
concentrations, la Tm diminue. Cette diminution est de 15°C pour une unité
logarithmique de concentration ionique. Les cations divalents ont un effet encore
plus important. D’autres substances telles que le formamide peuvent abaisser la
Tm lors des hybridations. Dans ce cas, la Tm est estimée selon la formule
suivante (pour 100 pb) : ΔTm = - 0,6 x (% formamide).

80
 Facteurs de variation de la Tm
4) Longueur des fragments des ADN
•La Tm devient plus grande si la longueur de l’ADN l’est aussi: un ADN long
contient plus de liaisons à dissocier qu’un ADN plus court. La variation de
température de fusion est donnée par la relation suivante :
ΔTm = - 500/nombre de pb

•On constate tout de même que l’effet longueur est important pour les petits
fragments.

•On peut utiliser une formule empirique qui regroupe tous ces paramètres à la
fois pour des fragments de taille inférieure à 100 pb :
Tm = 16,6 log [M] + 0,41 (%G+C) + 18,5 – (% mismatch) – (675/
longueur en bases) – 0,65 (% de formamide)
Avec [M] = la concentration en ions Na+

81
Autres facteurs de variation de la Tm
La température

Elle favorise la rencontre des deux séquences

complémentaires, donc la vitesse d’hybridation.
On note que les meilleures vitesses d’association sont observées pour des
températures inférieures à 25% de la Tm
de la molécule considérée.

La taille du fragment nucléique

Dans le cas où les deux séquences complémentaires sont parfaitement

identiques, la vitesse de réassociation de ces deux brins augmente
proportionnellement avec la racine carrée de la longueur des fragments
considérés.

82
Autres facteurs de variation de la Tm
La nature des acides nucléiques

La vitesse de réassociation dépend à la fois de la nature de l’hybride et de

sa concentration. Si l’hybridation concerne un mélange ADN/ADN et si
l’ADN est en excès par rapport à l’ARN, la vitesse d’hybridation ARN/ADN
est 5 fois plus faible que la réassociation ADN/ADN. En revanche, si l’ARN
est en large excès, la vitesse de réassociation sera identique à celle de
ADN/ADN.

La force ionique

•La concentration en NaCl joue un rôle important dans les réassociations

des segments complémentaires.
•Pour une concentration de NaCl qui avoisine 1M, la vitesse de
réassociation peut être multipliée par un terme de 10.
•Jusqu’aux environs de 1,2M et au-delà, la force ionique sera sans effet.

83
Hybridation de l'ADN

84
Hybridation de l'ADN

85