12/01/2022

Objectifs généraux de l’ECUE Biologie Moléculaire

ECUE : Biologie Moléculaire
L2S3 Médecine et L2S3 Pharmacie
INSSA, Université NAZI BONI • Connaître les concepts fondamentaux de la biologie
2021-2022
moléculaire.

• Savoir interpréter des résultats expérimentaux obtenus par

des techniques courantes de biologie moléculaire
Enseignant: Pr Michel K. GOMGNIMBOU,
MCA en Biologie Moléculaire
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Qu’est-ce que la Biologie Moléculaire?

Introduction Générale à la Biologie Moléculaire:

Plusieurs définitions de la biologie moléculaire
Concepts de Base
rencontrées.

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Définitions de la Biologie Moléculaire

• Discipline biologique qui étudie la structure
• Étude des phénomènes biologiques au niveau
des gènes et leurs activités (fonctions) au
moléculaire

niveau moléculaire c’est-à-dire à l’échelle

• Confusions de la biologie moléculaire avec ses

propres outils comme la Polymerase Chain de la molécule.

Reaction (PCR)

5 6

Historique: Début de la Biologie Moléculaire. • Découverte de la structure de

• Ere de la biologie moléculaire après certains travaux de l’ADN : 1953 Watson et Crick
génétique : travaux de Gregor Mendel, ceux sur la • Données de cristallographie
théorie chromosomique (Thomas H. Morgan) de l’ADN de Franklin Rosalind
• Biologie moléculaire va vraiment commencer avec:
➢ découverte de la nature des gènes et des
chromosomes
➢ 1944, Avery et ses collègues ont démontré que les
gènes sont composés d'acides nucléiques

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Découverte de la Relation entre Gènes et Protéines

• Expériences montrant qu'un gène défectueux donne une Le Dogme Central de la Biologie
enzyme défectueuse ou absente
Moléculaire Moderne
• Proposition qu'un gène est responsable de la
production d’une enzyme : proposition pas
tout à fait correcte • Basé sur structure de l'ADN

➢ une enzyme peut avoir plusieurs polypeptides,
chaque polypeptide étant codé par un seul gène
➢ plusieurs gènes codent des protéines non-
enzymatiques
➢ les produits finis de certains gènes ne sont pas
des polypeptides.
• L’ADN contient les informations nécessaires pour
coder l'ARN et les protéines utilisées par une cellule ou
un virus, pour se répliquer et produire la prochaine
génération.
9 10

Au niveau cellulaire
Le dogme central de la biologie moléculaire
Au niveau des molécules
en 1960 en 2000

Transcription

Traduction
ADN ARN
Protéine
ARN viral

Rétro-virus
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Au niveau des organismes procaryotes et eucaryotes

Chapitre 1: Structures et
propriétés des acides nucléiques

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Objectifs

- Connaître la nature physico-chimique des gènes et la

structure des acides nucléiques.
- Connaître la structure des acides nucléiques, 1. Constitution chimique des acides
- Savoir reconnaître les molécules simples dont ils sont nucléiques: les nucléotides
constitués
- Classer ces molécules d’après leurs propriétés ou leurs
fonctions

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Molécules biologiques contenant • Beaucoup de similitudes au niveau

l’information génétique sont les acides
chimique entre l’ADN et l’ARN.
nucléiques.
• Acides nucléiques : l’ADN et l’ARN
Acides nucléiques sont composés de
source: Molecular Biology, Fifth Edition, Robert F Weaver sont des polymères de sous-unités. source: Molecular Biology, Fifth Edition, Robert F Weaver
molécules simples : comme l’acide
phosphorique (PO4H3), oses à 5 • Chaînes de molécules, composés de
carbones (pentoses) et bases azotées
sous-unités appelées nucléotides.
(purines ou pyrimidines).
17 18

Le phosphate fait la jonction des

Les nucléotides contiennent une sucres dans une chaîne d'ADN
base reliée à la position 1’ d'un ou d'ARN grâce à leurs groupes
sucre (ribose dans l'ARN et de source: Molecular Biology, Fifth Edition, Robert F Weaver
5 ' et 3'-hydroxyles par des source: Molecular Biology, Fifth Edition, Robert F Weaver

désoxyribose dans l'ADN) et un liaisons covalentes

groupe phosphate. phosphodiesters.
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3 formes de nucléotides: 1.1 Phosphates

mono-, di-, et triphosphates

Le phosphate inorganique (Pi) est un ion stable, formé à

partir de l’acide phosphorique PO4H3. Des esters de
phosphate peuvent se former entre un phosphate et un
21 groupement hydroxyle libre (alcool, énol, phénol…) 22

1.2 Les sucres

condensation phosphate - autre acide (par exemple un autre

phosphate) = un anhydride.
Anhydrides mixtes, par exemple avec les acides carboxyliques.
Le pyrophosphate est un ion dérivé de l’acide pyrophosphorique
(P2O7H4) = anhydride d’acide phosphorique.
23
Le ribose est un pentose de la série D, dont tous les
hydroxyles sont orientés à droite (représentation
de Fisher). Dans les acides ribonucléiques (RNA), il est
cyclisé en ribofuranose : anomère β spécifiquement
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Ribose, désoxyribose 1.3 Les bases

Ribose (pentose) pour

les acides
ribonucléiques
(RNA).

Désoxyribose pour
les acides
désoxyribonucléiques
(DNA) qui est dérivé du ribose
par une réduction de la fonction
alcool secondaire du carbone n°2. Le désoxyribose confère à
l’ADN une plus grande stabilité propre à sa fonction de
conservation de l’information génétique. 25 26

Purine, Pyrimidine

Le noyau purine est constitué de deux noyaux

Les bases azotées des acides nucléiques appartiennent à deux hétérocycliques accolés: un de six atomes et l’autre de cinq
classes de molécules selon le noyau aromatique qui en constitue le atomes, ayant deux carbones en commun au milieu.
squelette. Le noyau pyrimidine qui est le plus simple : c’est un Par rapport à ces carbones communs, les azotes occupent
noyau aromatique à six atomes, quatre carbones et deux azotes ; les
des positions symétriques (n° 1 et 3 à gauche, n° 7 et 9 à
deux azotes en position méta (n°1et3).
27 droite). 28

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1.3.1 Bases puriques

Les différentes bases naturelles rencontrées dans les acides

nucléiques en dérivent selon les substituants que portent les
atomes de ces noyaux. Les bases puriques sont au nombre de 2 : l’adénine et la

De nombreux médicaments appartiennent aussi à ces guanine. L’adénineest constituée d’un noyau purine dont

deux classes de bases azotées. l’hydrogène du carbone 6 est substitué par une fonction

29 amine. 30

1.3.2 Bases pyrimidiques

La guanine est constituée d’un noyau purine dont le

Les bases pyrimidiques sont au nombre de 3: la cytosine,
carbone 2 est substitué par une fonction amine et le carbone
l’uracile et la thymine. La cytosine est constituée d’un noyau
6 par une fonction cétone.
pyrimidine dont le carbone 4 porte une substitution par une

31
fonction amine et le carbone 2 par une fonction cétone. 32

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1.4 Nucléosides et nucléotides

L’uracile est constituée d’un noyau pyrimidine dont les carbones

2 et 4 portent des fonctions cétone.
La thymine est aussi constituée d’un noyau pyrimidine
Les sucres (ribose ou désoxyribose) se lient aux bases azotées par
dont les carbones 2 et 4 portent des fonctions cétone mais dont
des liaisons impliquant un des azotes de la base (azote n°1 des
le carbone 5 porte une substitution par un groupe méthyl.
pyrimidines ou azote n°9 des purines) et le carbone n°1 de l’ose.
33 34

La liaison d’une base azotée avec un des sucres donne
un nucléoside.
Un nucléoside est donc formé d’une base et d’un sucre
liés par une liaison N-osidique.
Dans un nucléoside, on numérote les atomes de la base
par des chiffres : 1, 2, 3, etc... et pour les distinguer, les
carbones du sucre sont numérotés 1’, 2’, 3’, etc…
La liaison d’un nucléoside avec un phosphate se fait par
une estérification de la fonction alcool primaire (carbone
n°5’) du sucre et une des trois fonctions acides du
phosphate.
L’ester obtenu est un nucléotide. Un nucléotide est donc
formé d’une base azotée, liée par une liaison osidique
avec un sucre, lui-même lié par une liaison ester avec un
phosphate.

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1.4.1 Nomenclature des unités nucléotidiques

Dans le métabolisme des acides nucléiques interviennent
des substrats riches en énergie, les nucléosides
triphosphates. Un nucléoside triphosphate est un
nucléotide dont le phosphate est lui-même lié à un ou
deux autres phosphates par des liaisons anhydride
d’acides.

Les bases azotées sont conventionnellement désignées par une initiale et

par une couleur : l’adénine par A et la couleur verte, la guanine par G et
la couleur jaune, la cytosine par C et la couleur bleue, la thymine par T
37 et la couleur rouge. 38

Chacune des bases peut entrer dans la structure de deux nucléosides,
selon que le sucre est un ribose ou un désoxyribose.
Chaque nucléoside peut être lié à un, deux ou trois phosphates.
On les désigne par des sigles conventionnels : GMP pour guanosine
monophosphate, CDP pour cytidine diphosphate, ATP pour adénosine
triphosphate, etc.
On désigne par nucléotides, les nucléosides monophosphates : AMP
ou acide adénylique, dTMP ou acide désoxythymidylique, etc.
Les nucléosides polyphosphates sont des diphosphates : ADP ou GDP...
ou encore des triphosphates, les plus riches en énergie : ATP ou GTP ;
etc.
Les acides nucléiques sont formés par une polycondensation de
nucléotides AMP, CMP, GMP et UMP pour les acides ribonucléiques,
dAMP, dCMP, dGMP et dTMP pour les acides désoxyribonucléiques.

39 40

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1.5. Adénosine
Le nucléoside est une molécule constituée d’un pentose (β-D-ribose
ou 2-désoxy-β-D-ribose) lié par une liaison N-osidique à la base
azotée.
Pour ce qui est des nucléotides, ce sont des esters phosphoriques des
nucléosides.
Les autres ribonucléosides sont : la guanosine, la cytidine et l’uridine
41
1.7. Uridine MonoPhosphate
Un nucléotide est une molécule composée d’un nucléoside
lié par une liaison ester à un acide phosphorique.
Les acides nucléiques sont des macromolécules résultant de
la condensation de très nombreux nucléotides, liés par des
liaisons phosphodiester. 43
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1.6. Désoxyguanosine
Le nucléoside est une molécule constituée d’un pentose (β-D-ribose
ou 2-désoxy-β-D-ribose) lié par une liaison N-osidique à la base
azotée.
Pour ce qui est des nucléotides, ce sont des esters phosphoriques des
nucléosides.
Les autres désoxyribonucléosides sont : la désoxyadénosine, la
désoxycytidine et la désoxythymidine, souvent appelée thymidine.
42
1.8. Désoxythymidine MonoPhosphate
La thymidine monophosphate (dTMP ou TMP) ou acide
thymidylique. La thymine étant toujours liée à un
désoxyribose on néglige souvent de préciser
désoxythymidine monophosphate ou dTMP.
44
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1.9. Adénosine Tri Phosphate 1.10. Désoxycytidine Tri Phosphate

L’adénosine triphosphate est un nucléotide avec 3 La désoxycytidine triphosphate est un nucléotide qui a une
phosphates. Les liaisons anhydrides structure comportant une base azotée, la cytosine,
unissant les acides liée par une liaison N-osidique au β-D-
phosphoriques désoxyribose et trois phosphates.
sont des liaisons riches Les liaisons anhydrides unissant
en énergie (ΔG ≥ 31 kJ/mol). les acides phosphoriques sont
L’ATP est un des substrats des liaisons riches en énergie
des RNA-polymérases. (ΔG ≥ 31 kJ/mol).
Le coenzyme ATP/ADP
est un coenzyme transporteur d’énergie universel.
Les autres nucléosides triphosphates sont en fonction du
sucre ou de la base qu’ils contiennent : le GTP, le CTP, La dCTP est un des substrats des DNA polymérases. Les
l’UTP, le dATP, le dGTP, le dCTP et le dTTP. DNA polymérases ont besoin du magnésium comme
45 cofacteur. 46

1.11. Liaisons hydrogène

1.12. Appariement des bases
La liaison hydrogène est une
liaison de faible énergie entre
deux atomes attirés l’un vers Une paire de bases
l’autre pour des raisons G-C = bp G-C
électrostatiques, l’un étant riche
en électrons donc
nucléophile et l’autre n’ayant
que les protons de son noyau donc
électrophile. L’atome
d’hydrogène est électrophile et
attiré par les atomes ayant des Une paire de bases
doublets électroniques libres A-T = bpA-T
comme les atomes d’azote et
d’oxygène. 47
48

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1.13. Hybridation des bases Hybridation A-T

Lorsqu’un acide nucléique est en solution, les molécules

forment des liaisons hydrogène, associant les nucléotides
deux à deux. Toujours de manière à associer un
nucléotide à adénine avec un nucléotide à thymine (ou à
uracile dans un ARN) et un nucléotide à guanine avec un
nucléotide à cytosine.
L’hybridation adénine-thymine est moins stable (2 liaisons
On désigne cette liaison sous le terme d’hybridation.
hydrogène, -21 kJ) que celle entre guanine et cytosine.

49 50

Hybridation G - C

L’hybridation entre un
nucléotide à guanine
avec un nucléotide
à cytosine.
2. Structures des acides nucléiques : DNA et RNA

Cette hybridation guanine-cytosine est plus stable que celle

entre adénine et thymine.
3 liaisons hydrogène: -63 kJ
51 52

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2.1. Acide RiboNucléique: ARN 2.1. Acide RiboNucléique

Pour former un acide ribonucléique, les nucléotides
(GMP, AMP, UMP, CMP), sont condensés les uns sur
les autres avec des liaisons phosphodiester entre le
carbone 3’ d’un premier nucléotide et le carbone 5’
du nucléotide suivant.
Ces liaisons définissent un sens à la molécule :
le début est le nucléotide dont le phosphate en 5’
n'est lié à aucun autre nucléotide et la fin correspond
au nucléotide dont la fonction alcool
53
en 3’n'est pas estérifiée. 54

Les extrémités 5’ et 3’ d’un acide nucléique Structure secondaire du RNA

Le premier nucléotide de la chaîne porte, par
une liaison ester sur le carbone 5’ de son
ribose, un phosphate dont les
deux autres fonctions acides
ne sont pas estérifiées.
C’est l’extrémité 5’ phosphate
terminale de l’acide nucléique,
qu’on désigne par convention
comme le début de la séquence ou
du fragment d’acide nucléique.

Le dernier nucléotide de la chaîne porte une fonction alcool sur le

carbone 3’ de son ribose. Cette fonction alcool n’est pas
estérifiée. C’est l’extrémité 3’-OH terminale de l’acide nucléique,
qu’on désigne par convention comme la fin de la séquence ou du Structure secondaire en épingle à cheveux
fragment d’acide nucléique. 55 56

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Structure secondaire du RNA 2.2. Acide DésoxyriboNucléique

Les RNA sont simple brin mais certaines régions sont

appariées sur une courte distance par leurs bases
complémentaires selon un ajustement aléatoire (épingles à
cheveux).
L’ARN diffère de l’ADN par plusieurs caractères: il est plus
court (70 à 10 000 nucléotides), le squelette de pentoses et de
phosphates contient du ribose à la place du désoxyribose,
parmi les bases azotées l’uracile (U) remplace la thymine (T)
57 58

Les molécules d’acide désoxyribonucléiques sont formées de deux

chaînes dont les nucléotides sont
double hélice (deux brins hybridés deux à deux sur
antiparallèles) avec toute la longueur.
squelettes constitués
par le sucre-phosphate
à l'extérieur Les deux chaînes sont antiparallèles,
et des l’extrémité 5’ de l’une est
bases alignées à du côté de l’extrémité 3’ de l’autre.
l'intérieur Pour que tous les nucléotides puissent
s’hybrider ; il faut que l’ordre
dans lequel ils sont liés ensemble soit
complémentaire de la chaîne opposée.

Les bases azotées liées par les liaisons

hydrogènes sont tournées vers l’intérieur,
tandis que les riboses et les acides phosphoriques, hydrophiles sont
tournés vers l’extérieur.
59 60

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Polarisation des brins d’ acides nucléiques La double hélice (modèle rubans)

Exemple d’un trinucléotide

avec une polarité:

haut de la molécule a un
groupe 5'-phosphate=
extrémité libre 5 '

bas a un groupe 3'-hydroxyle La structure secondaire du DNA est telle que les
libre = extrémité 3 ' deux brins sont enroulés l’un autour de l’autre.

61 62

La double hélice (axe)

La double hélice (travers)
Une représentation de la
double hélice selon son axe,
met en évidence deux
particularités:

-les désoxyriboses et les

Une vue perspective de la double hélice montre bien les bases
azotées parallèles entre elles, leurs noyaux empilés au centre
de la double hélice.
63
phosphates se trouvent
à l’extérieur de la molécule
et les fonctions acides des phosphates sont orientées vers
l’extérieur;
- les bases azotées sont tournées vers l’intérieur de la double
hélice et unies à la base complémentaire par des liaisons
hydrogène. Les nucléotides complémentaires n’étant pas tout
à fait diamétralement opposés, l’axe de l’hélice est vide. 64

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La torsion de la molécule d'ADN est normalement droite,

Torsions et formes de l’ADN
mais l'ADN à torsion gauche a été identifié en 1979.
L’ADN prend une forme B
dans des conditions
d’humidité élevée
(forme répandue in vivo).
Dans les conditions
cellulaires avec basse
humidité, à environ 75%,
l'ADN prend la forme A (forme avec moinsd’eau).

Lorsque l’ADN est enroulé en une hélice gauche, il est

Formes B et A = torsion droite appelé ADN-Z. Un gène nécessite la forme Z pour son
Forme Z = torsion gauche activation.
65 66

Variation de l’ADN entre différents organismes Fusion de l’ADN

Ratios de G à C et A à T sont
fixes dans n’importe quel
organisme spécifique.

Le pourcentage total de G + C
varie dans un intervalle de 22 • Par chauffage, les liaisons hydrogènes (non covalentes) reliant les deux
à 73%. brins d’ADN s’affaiblissent et se rompent.
• Lorsque les forces (liaisons hydrogènes) se brisent, les deux brins se
séparent, c’est la fusion moléculaire ou la dénaturation de l’ADN
Ces différences se traduisent entraînant une augmentation de l’absorbance (A) à 260 nm.
par des différences dans les • La température à laquelle l'ADN est dénaturé à 50% est appelée
température de fusion ou Tm (pour le terme anglais melting
propriétés physiques. temperature).
• La teneur en GC (bp G-C) de l'ADN a un effet significatif sur le Tm; plus
67 la teneur en GC est élevée plus Tm sera important. 68

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Facteurs de Dénaturation de l’ADN
• en plus de la température,
l'ADN peut être dénaturé par :
- solvants organiques
- pH élevé
- faible concentration en sel
• la teneur en GC affecte aussi
la densité de l'ADN
- relation linéaire directe
- en raison du volume molaire
très important d’une bp A-T
par rapport à une bp G-C
Tailles de l’ADN
La taille de l’ADN peut être exprimée de 3 manières
différentes:
– en nombre de paires de bases (base pairs, bp)
– poids moléculaire: 660 environ pour le poids moléculaire
d’une paire de bases
– la longueur: 33,2 Å par tour d’hélice de 10,4 paires de bases
La mesure de la taille de l'ADN peut se faire soit par
microscopie électronique (pour les ADN de petite taille)
ou par électrophorèse sur gel
La technique de microscopie peut également permettre de
révéler si un ADN est circulaire ou linéaire et s’il est
super enroulé
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Renaturation de l’ADN
• Après la séparation (dénaturation) de deux brins d'ADN,
ils peuvent se lier de nouveau dans des conditions
appropriées.
• Ce processus est appelé annealing ou renaturation.
• Les 3 facteurs les plus importants pour ce processus:
-Température : à une température d’environ Tm - 25 °C ( T
° en dessous du Tm d’environ 25°C), la renaturation sera
meilleure
- Concentration de l’ADN : les concentrations plus élevées
favorisent la rencontre des deux brins et donc offre une
probabilité élevée d’association des deux brins
complémentaires
- Temps: plus le temps augmente plus la renaturation des
69 deux brins est importante 70
Relation entre taille de l'ADN et capacité génétique
Comment pouvons nous savoir combien de gènes
sont contenus dans une séquence d’ADN?
– Impossible de déterminer le nombre de gènes à
partir seulement de la taille de l’ADN
– Implication de certains facteurs:
• Importance de l'ADN consacré à des gènes?
• Quel est l’espace entre les gènes?
– on peut néanmoins estimer le maximum de
gènes qu’une séquence d'ADN peut contenir.
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Taille de l’ADN et capacité génétique Capacité génétique de l’ADN

Combien de gènes sont dans une portion d'ADN ?
Commencer par des hypothèses de bases: Quelle taille pour une molécule de
• Le gène code pour une protéine chromosome?
• La taille moyenne d’une protéine est d’environ 40.000 D
combien d'acides aminés? – Chromosome de E. coli
• masse molaire moyenne d’un acide aminé est d’environ • 4,6 x 106 bp
110 D
• ~4200 protéines
• protéine de taille moyenne: 40.000 / 110 = 364 acides
aminés – Phage  (infecte E. coli)
• chaque acide aminé = 3 paires de bases d’ADN • 4,85 x 104 bp
• pour 364 acides aminés il faudra 1092 paires de bases
• ~44 protéines
73 74

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