Cours de biochimie

Chapitre : enzymologie
MI Génie de l’environnement
Mme. ARBIA
I. Les enzymes

Les enzymes sont les catalyseurs biologiques des réactions biochimiques :

- Ils augmentent les vitesses de réaction.

- Ils se retrouvent intacts à la fin de la réaction, bien qu’ils soient initialement liés aux
substrats et produits.
- Ils sont produits par la cellule : tous les enzymes sont des protéines (exception des
ribozymes sont des ARN doués d’activité catalytique).
- Ils sont spécifiques : ils transforment un substrat donné (spécificité de substrat) grâce à
une réaction donnée (spécificité d’action).
- Ils sont réglables : certains enzymes modifient leur activité catalytique en réponse à des
signaux métaboliques, ce qui permet l’ajustement de l’offre métabolique à la demande
cellulaire.

Classification des enzymes

Nomenclature des enzymes
Le catalogue publié par la commission chargée de la classification des enzymes contient environ
4000 enzymes classées en fonction des réactions qu’elles catalysent. Chaque enzyme est
reconnue par un code constitué des initiales E.C. suivies de quatre nombres :
E.C.a.b.c.d
Les nombres de ce code représentent successivement :
a : la classe à laquelle appartient la réaction (de 1 à 6)
b : la sous-classe
c : la sous-sous classe
d : le numéro d’ordre de cette réaction dans la sous-sous-classe considérée
Classe 1 : Oxydo-réductase
Il s’agit de réactions d’oxydation ou de réduction d’un substrat, au moyen d’un coenzyme, ou
d’un seconde substrat comme l’oxygène. Par exemple : E.C. 1.1.1.1 est le code de l’alcool
déshydrogénase qui catalyse la réaction :
R-CH(OH)-R’ + NAD+ → R-C(O)-R’ + NADH + H+
Cette reaction consiste dans l’oxydation d’une function alcool primaire ou secondaire,
l’accepteur d’électron est le NAD+

Classe 2 : Transférases

Ces enzymes catalysent le transfert d’un atome ou d’un groupe d’atomes d’une molécule
(donneur) vers une autre molécule (accepteur). L’hexokinase reçoit le code E.C.2.7.1.1 :

Hexose + ATP → Hexose -6-phosphate + ADP

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Cette enzyme transfère le groupe phosphate (sous-classe 7) sur une fonction alcool (sous-sous
classe 1), et cette réaction est la première de la liste.En général, les hexokinases phosphorylent
tous les hexoses, sans distinction, certaines hexokinases se révèlent très spécifiques, et on leur
attribue un numéro de code différent, comme la glucokinase spécifique du glucose : E.C. 2.7.1.2

Classe 3 : Hydrolases

Il s’agit d’enzymes catalysant des réactions d’hydrolyse, qui consistent dans la rupture d’une
liaison covalente à l’aide d’une molécule d’eau. La β-fructosidase, également appelée invertase,
E. C. 3.2.1.1, catalyse l’hydrolyse du saccharose.

Saccharose + H2O → Glucose + Fructose

Cette enzyme est une glycosidase (sous-classe 2) qui agit sur une liaison O-glycosidique (sous -
sous classe 1), et c’est la première de cette liste.

Classe 4 : Lyases

Les lyases sont des enzymes qui catalysent la coupure d’une liaison entre deux atomes sans
l’intervention d’une molécule d’eau ou d’un oxydant. Les décarboxylases font partie de cette
classe d’enzymes, par exemple l’histidine décarboxylase, E.C.4.1.1.22 :

L-Histidine → Histamine + CO2

Classe 5 : Isomérases

Les isomérases modifient l’arrangement des atomes dans une même molécule. Le substrat et le
produit auront la même formule brute, mais se distingueront l’un de l’autre par leur formule
développée. Par exemple, la phosphoglucomutase, E.C.5.4.2.2, transfère réversiblement le
groupe phosphate du glucose-1-phosphate sur la fonction alcool en 6 :

Glucose-1-phosphate ↔ Glucose-6-phosphate

Classe 6 : Ligases

Elles catalysent la réunion de deux molécules par une liaison covalente en utilisant l’énergie
d’une molécule d’ATP ou une molécule apparentée. La pyruvate carboxylase, E.C.6.4.1.1, utilise
le bicarbonate (HCO3-) comme deuxième substrat.

Pyruvate + HCO3- + ATP → Oxaloacétate + ADP + Pi

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Particularités des enzymes
Reaction enzymatique

𝑬 + 𝑺 ↔ 𝑬𝑺 → 𝑬 + 𝑷
- L’enzyme est activée à de très faible concentration
[𝐸 ] = 10−8 à 10−4 Moles/l
[𝑬] <<<<< [𝑺]

- L’enzyme accélère

Catalyse enzymatique
Les réactions qui se déroulent dans une cellule sont toutes catalysées par des enzymes.
Certaines réactions sont catalysées par des ARN, les ribozymes, mais l’immense majorité
des enzymes sont constituées de protéines.
- L’enthalpie libre d’activation mesure la différence entre l’enthalpie libre de l’état de
transition et celle du réactif : l’état de transition désigne un intermédiaire dans lequel on
reconnait une liaison du réactif sur le point de se rompre et une liaison du produit sur le
point de se former. Il s’agit d’un état passager, très fugace, en théorie impossible à isoler
et dont l’enthalpie libre est plus élevée que celle du réactif et plus élevée que celle du
produit. L’état de transition se situe au sommet de la barrière énergétique qui doit être
franchie pour que se forme le produit de la réaction. Dans une réaction non catalysée,
l’état de transition est constitué du réactif dans une configuration particulière ; dans la
catalyse enzymatique, il s’agit d’une configuration particulière du complexe enzyme-
substrat ES.
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Une réaction lente est caractérisée par une énergie d’activation élevée, cette énergie est réduite
quand la réaction devenue rapide. L’enzyme diminue l’énergie d’activation de la réaction
qu’elle catalyse, cette diminution est la conséquence de la formation du complexe ES.

Ce complexe a une énergie inférieure à la somme des deux énergies S et E.

Pour évaluer l’efficacité d’une enzyme on doit mesurer la vitesse de la réaction qu’elle catalyse.
Généralement cette efficacité est donnée par le nombre de turn over number ou l’activité
moléculaire de l’enzyme qui est le nombre de substrat transformé en produit par une molécule
d’enzyme et par minute.

L’unité internationale (U.I) correspond au nombre de µmole de S. transformé en P par minute.

L’activité spécifique est la quantité d’enzyme qui transforme une µmole de S par minute ramené
à 1 mg d’E.

𝑁𝑜𝑚𝑏𝑟𝑒 𝑈𝐼
𝐿′ 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑠𝑝é𝑐𝑖𝑓𝑖𝑞𝑢𝑒 =
𝑚𝑔 𝑑′𝐸
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Caractères particulier des enzymes

- Les enzymes reconnaissent spécifiquement leurs substrats : l’enzyme possède un site

spécifique- le site de fixation du substrat- dont la structure est complémentaire du
substrat.
- Le substrat modifie localement la conformation de l’enzyme : au cours de sa fixation,
le substrat induit localement des changements de conformation de l’enzyme, ces
modifications renforcent la stabilité du complexe ES et orientent les groupements réactifs
de l’enzyme vers la liaison covalente cible de la molécule de substrat. On qualifie ce
concept d’ajustement induit.
- Les enzymes sont des machines-outils miniatures : au cours de la réaction, le complexe
enzyme-substrat (ES) se transforme en complexe enzyme-produit (EP). C’est un
réarrangement interne, une réaction intramoléculaire puisque le substrat ne quitte pas
l’enzyme et subit l’action concertée des groupements catalytiques ici, les groupes X et Y.
L’enzyme fonctionne à la manière programmée sur la pièce à transformer.
- Les réactions enzymatiques ne forment aucun produit secondaire

La cinétique des réactions enzymatiques

1- Cinétique enzymatique homogène

- La vitesse initiale de réaction
Soit la réaction catalysée par l’enzyme E qui transforme le substrat S en produit P :
S → P
La vitesse instantanée est la quantité de S disparue par unité de temps ou la quantité de P
apparue par unité de temps : elle est proportionnelle à la concentration du substrat :
𝑑𝑆 𝑑𝑃
𝑉=− = =𝐾
𝑑𝑡 𝑑𝑡

Pour des concentrations de [E] et de [S] données, on mesure la quantité de P formé en

fonction du temps :
La courbe [P]=f(t) est : Dès que l’on met l’enzyme en contact avec une solution
contenant le substrat, on observe la formation du produit en fonction du temps.
- D’abord linéaire ascendante : l’enzyme est saturé par son substrat, la vitesse est constante
- Puis s’infléchit : l’enzyme n’est plus saturé par son substrat, la vitesse décroit
- Et enfin devient horizontale : l’équilibre de la réaction est atteint et la vitesse est nulle.
A l’instant t, v = tgα. A l’instant t0, v est maximale, c’est la vitesse initiale Vi de la
réaction : Vi=tgα.
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- Influence de la concentration du substrat sur la vitesse initiale :

A [E] constant, on répète la mesure de Vi à des concentrations croissantes de S. La
courbe Vi = f ([S]) est une hyperbole équilatère qui tend asymptotiquement vers une
valeur limite, la vitesse maximale ou Vmax.

- Le modèle de Michaelis-Menten
L’équation de Michaelis-Menten

La réaction 𝑆 → 𝑃 se décompose en 2 temps :

𝐸
1- La formation du complexe enzyme-substrat, étape rapide et réversible :

𝑉1,𝐾1
𝐸 + 𝑆↔ 𝐸𝑆
V2,K2
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V1 et K1 sont la vitesse et constante de formation du complexe ; V2 et K2 sont la vitesse et
constante de dissociation du complexe ES
2- Formation du produit P à partir du complexe enzyme-substrat, étape plus lente :

V3 et K3 sont la vitesse et la constante de formation du produit

𝑉3,𝐾3
𝐸𝑆 → 𝐸+𝑃
La réaction globale devient :

𝑉1,𝐾1 𝑉3,𝐾3
𝐸 +𝑆↔ 𝐸𝑆 → 𝐸+𝑃
V2,K2

𝑑𝑆 𝑑𝑃
La vitesse de disparition de S est égale à la vitesse d’apparition de 𝑃 = − 𝑑𝑡 = 𝑑𝑡

𝑑𝑆 𝑑𝑃
or : − 𝑑𝑡 = 𝑉1 − 𝑉2 = 𝐾1[𝐸 ][𝑆] − 𝐾2[𝐸𝑆] et = 𝑉3 = 𝐾3[𝐸𝑆]
𝑑𝑡

donc: 𝐾1[𝐸 ][𝑆] − 𝐾2[𝐸𝑆] = 𝐾3[𝐸𝑆]

[𝐸][𝑆] 𝐾2+𝐾3
D’où : = = 𝐾𝑀 est la constante de Michahélis
[𝐸𝑆] 𝐾1
L’enzyme est soit sous forme libre E, soit sous complexée au ES :

[𝐸] 𝑇 = [E] + [ES]

[E]T étant la concentration totale de l’enzyme

([𝐸𝑇 ]−[𝐸𝑆])[𝑆] [𝐸𝑇 ][𝑆]
Donc: 𝐾𝑀 = = − [𝑆]
[𝐸𝑆] [𝐸𝑆]

[𝐸𝑇 ][𝑆]
D’où : [𝐸𝑆] = 𝐾𝑀+[𝑆]

La vitesse de la réaction Vi est égale à V3, vitesse de l’étape la plus lente :

𝐾3 [𝐸𝑇 ][𝑆]
𝑉𝑖 = 𝑉3 = 𝐾3[𝐸𝑆] D’où : 𝑉𝑖 = 𝐾𝑀+[𝑆]

Or : Vmax = K3 [ET]
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
Donc : 𝑉𝑖 = 𝐾𝑀+[𝑆]
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C’est l’équation de Michahelis-Menten. La courbe Vi=f([S]) de l’équation de Michaelis-Menten
est une branche d’hyperbole équilatère qui passe par l’origine et dont l’asymptote, lorsque [S]
tend vers l’infini, vaut Vi=Vmax. On calcule que, pour Vi=Vmax/2, lorsque [S] = KM:
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑉𝑖 = = , 2[𝑆] = 𝐾𝑀 + [𝑆], [𝑆] = 𝐾𝑀
𝐾𝑀+[𝑆] 2
La constante de Michahelis- Menten, pour une réaction à un substrat, est égale à la concentration
de S correspondant à Vmax/2
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
- Quand [𝑆 ] ‹‹ KM, 𝑉𝑖 = = 𝐶𝑠𝑡𝑒 [𝑆]
𝐾𝑀

Vi est fonction linéaire de la concentration du substrat. C’est donc en excès d’enzyme que l’on
dose un substrat.

- Quand [S] ›› KM, Vi = Vmax = K3 [ET] Vi est fonction linéaire de la concentration de

l’enzyme. C’est donc en excès d’enzyme que l’on dose une enzyme.
- Signification des paramètres cinétiques
- La Vmax est la vitesse de la réaction lorsque l’enzyme est à saturation c’est-à-dire lorsque
la moitié des molécules de l’enzyme sont complexés au substrat. Quand K3 est très petit
devant K1.

𝐾2
𝐾𝑀 =
𝐾3
KM est donc inversement proportionnel à l’affinité de l’enzyme pour le substrat. Quand K3 n’est
pas négligeable, c’est moins simple, mais il reste que KM et affinité varient en sens inverse.

Le site actif des enzymes

Le site actif d’une enzyme est la région où se fixe les substrats et le coenzyme, et où lieu de
réaction. Il joue un double rôle : celui de site de fixation du substrat et celui de site catalytique.
Le site actif est localisé au fond d’une poche de la zone interne hydrophobe de la protéine.

Les liaisons entre enzyme et substrat ne sont pas de nature covalente. La spécificité de l’enzyme
pour son substrat est l’une des caractéristiques de la catalyse enzymatique.

Modèle de la clé et de la serrure : la forme du substrat (clé) est complémentaire de celle du site
actif de l’enzyme (serrure).
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Les facteurs influençant la réaction enzymatique

Les facteurs physicochimiques

- La température : elle a deux effets sur la réaction enzymatique : elle l’accélère comme
toutes réactions chimiques et elle entraine progressivement la dénaturation de la
protéine.

- Le pH : il a 2 effets sur la réaction enzymatique : aux valeurs extrêmes il dénature donc

désactive la protéine en modifiant l’état d’ionisation des chaines latérales des acides
aminés.
Aux valeurs intermédiaires, il influe sur l’activité en modifiant l’état d’ionisation des
chaines latérales des acides aminés du site actif et celui du substrat.
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Les effecteurs chimiques

On distingue les inhibiteurs, qui diminuent l’activité enzymatique, et les activateurs ; qui
l’augmentent.
- Les inhibiteurs
Les inhibiteurs spécifiques ralentissent la vitesse de la réaction enzymatique, jusqu’à la
stopper. Cette inhibition peut être levée dans des conditions réactionnelles particulières
(inhibiteurs réversibles) ou ne pas l’être (inhibiteurs réversibles).
Les inhibiteurs réversibles
On distingue 3 modes d’inhibition : compétitive, non compétitive et mixte.
Inhibiteurs compétitifs
Analogues structuraux du substrat, ils se fixent de façon non covalente au site actif de
l’enzyme à la place du substrat. Ils diminuent l’affinité de l’enzyme pour le substrat,
donc augmentent la KM, mais ne modifient pas la V max puisque l’inhibiteur peut être
déplacé du complexe ES par un excès de substrat.

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑉= [𝐼]
𝐾𝑀+(1+ )+1
𝐾𝐼

Inhibiteurs non compétitifs

Non analogues structuraux du substrat, les inhibiteurs non compétitifs se fixent de façon
non covalente en un site différent du site actif de l’enzyme, à la fois sur l’enzyme et sur le
complexe enzyme-substrat. Ils ne diminuent pas l’affinité de l’enzyme pour le substrat,
donc ne modifient pas la KM, mais diminuent la Vmax puisque l’inhibiteur ne peut être
déplacé du complexe ternaire ESI par un excès de substrat.

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑉=
[𝐼]
(1 + 𝐾 )(𝐾𝑀 + [𝑆]
𝐼

Inhibiteurs incompétitifs
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C’est un mode assez fréquent, combinant inhibitions compétitive et non compétitive. Il
en résulte que les KM et Vmax sont modifient.
Ils se fixent uniquement sur le complexe enzyme-substrat et n’ont aucune affinité pour
l’enzyme lui-même.
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑉= [𝐼]
𝐾𝑀+(1+ )[𝑆]
𝐾𝐼

Enfin une concentration élevée en substrat peut entrainer, pour certaines réactions, un
phénomène d’inhibition. Cette inhibition par le substrat conduit à la loi de vitesse

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑉= [𝑆]2
𝐾𝑀+[𝑆]+
𝐾𝑠

Les inhibiteurs irréversibles

Ils se lient de façon covalente à un groupement fonctionnel indispensable à l’activité
catalytique.

Les activateurs
Ils sont de natures diverses :
- Activation par les ions métalliques : ils peuvent favoriser une bonne conformation de
l’enzyme, la fixation du substrat sur l’enzyme ou participer directement à la catalyse, ex :
Mg2+.

Enzymes immobilisées

Pour séparer facilement les enzymes des milieux liquides après réactions, on peut les fixer soit à
la surface de particules non poreuses, soit à l’intérieure de particules poreuses.
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Les lois de vitesse sont de la même forme, mais les vitesses V et Vm s’expriment, lors d’une
fixation en surface, en mol/m2.s de surface de contact liquide-solide ou encore en mol/kg.s de
support.

Si l’enzyme est incluse dans des particules poreuses, les vitesses V et Vm s’expriment en
mol/m3.s de phase solide ou en mol/kg.s de support.

Les concentrations en substrat et produit à prendre en compte dans les équations cinétiques sont
alors les concentrations à l’interface liquide-solide, dans le cas d’une immobilisation en surface,
ou les concentrations dans la phase liquide qui imbibe les pores des particules solides, dans le cas
d’une inclusion.