UNIVERSITE MARIEN NGOUABI

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

DEPARTEMENT DES LICENCES
PARCOURS : BIOLOGIE
Section : Biologie Cellulaire et Moleculaire (BCM)

RAPPORT DE STAGE DE FIN DE

FORMATION

Effectué à l’institut National de Recherche en Sciences

Exactes et Naturelles, dans la période du 09 juillet 2023
au 10 Août 2023

Rédigé par PELELE MOUANDZA Yochida Mardelev

Sous la supervision du Pr Aimé Christian KAYATH

Année académique
2022-2023
Table des matières
REMERCIEMENTS ........................................................................................................................................................................ 3
I. INTRODUCTION..................................................................................................................................................................... 4
II. PRESENTATION DE LA STRUCTURE D’ACCEUIL .................................................................................................. 4
III. DESCRIPTION DES ACTICTIVITES REALISEES AU COURS DE STAGE ........................................................... 6
III.1. Isolement et la purification ................................................................................................................................................ 6
III.1.1. L’isolement .................................................................................................................................................................... 6
III.1.2. La purification ................................................................................................................................................................. 9
III.2. Caractérisation Macroscopique et Microscopique ........................................................................................................ 11
III.2.1. Caractérisation Macroscopique ................................................................................................................................ 11
III.2.2. Caractérisation Microscopique ................................................................................................................................. 11
III.3. Tests .................................................................................................................................................................................... 12
III.3.1. Test de catalase ........................................................................................................................................................... 12
III.3.2. Test de la potasse (KOH) ........................................................................................................................................... 12
III.3.3. Test d’émulsification .................................................................................................................................................. 13
.................................................................................................................................................................................................. 13
III.3.4. Extraction des biosurfactants .................................................................................................................................... 14
III.3.5. Antibiogramme ........................................................................................................................................................... 14
III.3.6. Le test de dispersion ................................................................................................................................................... 16
IV.CONCLUSION .......................................................................................................................................................................... 17
IV.1. Difficultés............................................................................................................................................................................ 17
IV.2. Perspectives ........................................................................................................................................................................ 17
. ..................................................................................................................................................................................................... 18
 REMERCIEMENTS

Nous remercions en premier lieu la faculté de science et techniques, particulièrement le Dr Nelly

LEKAKA épouse AWAH cheffe de parcours Biologie et Pr Raoul AMPA chef de bureau de stage à la
Faculté Des Sciences Et Techniques pour la confiance accordée.

Nos sincères remerciements au Directeur général de L’institut de Recherche en Sciences Exactes et

Naturelles, Pr Joseph GOMA TCHIMBAKALA pour nous avoir reçus au sein de son institut.

Nous remercions le Pr Etienne NGUIBI, chef du département des sciences biologiques et le Pr Aimé
Christian KAYATH, chef de laboratoire de microbiologie et de biologie moléculaire, de nous avoir reçus au
sein de son laboratoire et de nous avoir placés dans une équipe de travail dynamique et orientée.

Nos remerciements au Dr Stech Anomene Eckzechel NZAOU, Monsieur Yannick OKOUAKOUA,

Madame Ndélani NKALLA, Monsieur Christ BAYAKISSA, Monsieur Junior BISSOKO Monsieur
Rodinet NTSANA, pour leur suivi et encadrement, leur patience et persévérance à nous apprendre.

Nos remerciements à tous ceux qui nous ont supervisés sur paillasse et dans les conseils notamment : Madame
Rosane Lafleur LEBAKI, Monsieur Ted-Garvey MOUSSAKA, Monsieur John Olivier MIKALA,
Monsieur Djovel BANZOUZI, Monsieur Wilker-Vénya NGOULOU KOTOMA, Madame Alfrid Gloirdie
DIATOULOU, Monsieur Reich ELALE et Madame Guercia MOUNIANGA ainsi qu’à tous les autres
stagiaires
 I. INTRODUCTION

L’université MARIEN NGOUAMBI dans le souci de donner une formation de qualité à ses
étudiants, a instauré un stage pratique de fin de formation en vue de compléter les cours
théoriques. Notre stage de fin de formation s’est déroulé dans le laboratoire de microbiologie
de l’Institut National de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN) du 09 juillet au
10 aout 2023. Ce laboratoire est composé de quatre services à savoir : la salle de biologie
moléculaire, la salle d’ensemencement et la bioremédiation, salle de mesure et pesées, salle
d’incubation.

II. PRESENTATION DE LA STRUCTURE D’ACCEUIL

Le présent travail a été réalisé dans le laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire

de la FST (PM09) et le laboratoire de Biologie Moléculaire et Bio-informatique de l’Institut
National de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN) situé dans l’enceinte de la
Cité Scientifique de Brazzaville (Ex-Orstom) (Arrondissement 1 : Makélékélé).

CADRE INSTITUTIONNEL ET JURIDIQUE

Créé par la Loi N° 26-2012 du 24 septembre 2012, l’Institut national de Recherche en
Sciences Exactes et Naturelles est un établissement public administratif à caractère scientifique
et technique. Il a pour mission :
i D’organiser, conduire et exécuter toutes recherches fondamentales et appliquées visant
la promotion du développement national dans les champs disciplinaires constitutifs des
sciences exactes et naturelles ;
ii De mettre en œuvre une programmation scientifique autour des axes prioritaires pour le
développement du pays à partir des besoins réels des populations et des utilisateurs ;
iii De faire les inventaires de la flore, de la faune, de leur écosystème et des facteurs
météorologiques du Congo ;
iv D’étudier les propriétés des ressources animales, végétales en vue de la valorisation de
leur utilisation ;
v Contribuer à l’élaboration de la politique nationale de recherche dans les domaines
relevant de sa compétence ;
vi Publier et diffuser les résultats de ses travaux et concourir au développement des
connaissances et de l’information scientifique et technologique dans les domaines des
sciences exactes et naturelles ;
 vii Apporter son concours à la formation, à la recherche et par la recherche ; effectuer des
expertises scientifiques dans son champ de compétence.

L’institut national de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN) est organisé

selon les statuts approuvés par le Décret n° 2016-61 du 26 février 2016.
L’organigramme ci-dessus présente l’organisation de l’Institut national de Recherche en
Sciences Exactes et Naturelles.

Organigramme de l’Institut National de Recherche en Sciences Exactes et

Naturelles (IRSEN)
 III. DESCRIPTION DES ACTICTIVITES REALISEES AU COURS
DE STAGE

III.1. Isolement et la purification

III.1.1. L’isolement
C’est le fait d’isoler les microorganismes d’un échantillon quelconque. Il consiste donc à
ensemencer les microorganismes dans les milieux de culture qui peuvent être solide ou liquide.
-boites à pétri
-Tubes de dilution
-des étaloirs ou écouvillons
-bec bunsen
-Milieux de culture
Préparation des dilutions

La préparation des dilutions a été faite à l’aide d’un échantillon de selles. Le matériel utilisé
pour cela est :
-les longs tubes secs

-étaloirs, des anses

-des boites à pétri, des gants
-milieu de culture(solide)
-pipettes (de 200 et 1000)
-échantillon des selles, marqueurs
-l’eau distillée
Une fois nos échantillons des selles reçus ; nous avons eu à préparer tous ce matériel cité en
amant. Apres stérilisation, nous avons prélevé 9ml d’eau distillée que nous avons mise dans au-
moins cinq tubes à essai. Nous avons ensuite prélevé des selles que nous avons mis dans le
premier tube à essai, considéré comme la dilution mère. Apres cela nous avons fait des dilutions
en cascade en prélevant dans la solution mère 1ml de la suspension pour le mettre dans le tube
2 qui est la dilution 10-1, ainsi de suite jusqu’au cinquième tube qui est la dilution 10-4. 1 ml a
été retiré de la dernière dilution afin de garder le même volume dans tous les tubes.
 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

100ml

9ml 9ml 9ml 9ml

Dilution Dilution Dilution Dilution

-4
10-1 10-2
10 -3 10
Dilution mère
0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml

Incubation 24H à 35-37°C

Figure 1 : Dilutions en cascade

Préparation des milieux de culture

Un milieu de culture est un lieu favorable à la croissance des bactéries par sa composition en
azote, carbone, oxygène, hydrogène et bien d’autres nutriments exigeants comme des Un sels
minéraux. Pour préparer un milieu de culture nous avons besoin de :
-L’eau distillée
-Une bouteille ou un bocal
-Une éprouvette graduée
-Une balance à précision
-Le milieu sous forme de poudre
Pour se faire nous avons tout d‘abord mesuré un certain volume d’eau distillée à l’aide d’une
éprouvette que nous avons versé dans une bouteille. Ensuite nous avons pesé le milieu en
poudre à l’aide de la balance à une masse bien déterminée par rapport à notre volume d’eau. Le
milieu de culture pesé est ensuite versé dans notre eau distillée, homogénéisé et chauffer à
l’autoclave à 121⁰ pendant 15 min ; nous avons enfin couler celui-ci dans nos boites de pétri
après être refroidi.
Les différents milieux préparés au laboratoire
 Milieux de cultures Type de milieux Microorganismes cultivés
PCA(Plate Count Agar) Milieu ordinaire Bactéries , moisissures, levures
etc.
Columbia
TSA
EMB(Eosine Methyle Bleue) Milieu sélectif Entérobactéries (Escherichia
Coli, Shigella)
MRS(de Man Rogosa Sharpe) Milieu sélectif Lactobacillus
Hektoen Enteric Agar Milieu sélectif Shigella , klebsilla, Salmonella

Chapman Milieu spécifique Staphilocoques

SS(Shigella Salmonella) Milieu spécifique et Salmonella, Shigella

sélectif
Mossel Milieu sélectif Bacilles Cereus

CM(Mac Conkey) Milieu sélectif Enterobactéries

Ensemencement
C’est l’action d’étaler une suspension bactérienne diluée en amant, sur boite de pétri contenant
le milieu de culture.
Les techniques d’ensemencement
Il y a plusieurs techniques d’ensemencements parmi lesquelles :
- Ensemencement par écouvillonnage : On utilise un écouvillon pour
ensemencer ;
- Ensemencement par étalement : Se fait à l’aide d’une étaloir
- Ensemencement par stries : Se fait à l’aide d’une anse
Après avoir fait les dilutions en cascade, nous avons sélectionné trois d’entre elles pour
ensemencer sur boite de pétri, en prélevant 100µl (0,1 ml) de chaque tube retenu et les inoculer
sur différents milieux de culture préparés en amont. Ensuite nous avons étalé la suspension à
l’aide d’un étaloir proche du bec bunsen, afin d’obtenir des colonies isolées. Enfin, nous avons
incubé à 37°c pendant 24h. La lecture des boites incubées a consisté à faire un dénombrement
bactérien des dilutions ensemencées.
 Le dénombrement

En utilisant l’UFC (Unité Formant les Elle consiste à compter le nombre des colonies présentes
sur une boite de pétri. Colonies) par ladite formule :

∑ 𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑒𝑠
N=
V(n1+0,1×n2)d

N : nombre d’UFC par ml

N1 : nombre des boites retenues à la première dilution
N2 : nombre de boites retenues à la deuxième dilution
D : taux de dilution de première dilution
V : volume de l’inoculum
∑ 𝐶𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑒𝑠 : Somme des colonies sur toutes les boites retenues

Figure 2: Colonies isolées sur milieu SS

III.1.2. La purification
C’est l’action de prendre ou prélever une colonie isolée sur la boite et l’ensemencer dans une
boite unique pour n’avoir que cette souche (bactérie identifiée). Nous avons utilisé comme
matériels :
-boites de pétri
-anse d’ensemencement
-Bec bunsen
Nous avons prélevé à l’aide d’une anse d’ensemencement, une colonie isolée sur boite, que
nous avons ensemencé sur une autre boite de petri par la méthode de stries. Puis nous avons
incubé à 37⁰ pendant 24h.

Figure 3 : Purification d’un isolat sur milieu EMB

La conservation

C’est une méthode qui permet de conserver les bactéries à de basses températures. Pour se faire
nous avons eu besoin :
-des tubes à Eppendorf stériles
-glycérol
-milieu de culture liquide
-anse d’ensemencement
-bec bunsen
-portoir des tubes à Eppendorf
-Micropipette
-boite à pétri contenant les colonies bactériennes à conserver.
Nous avons prélevé un volume de 800µl du milieu liquide à l’aide d’une micropipette que nous
avons versé dans chaque tube à Eppendorf. Ensuite nous avons prélevé un volume de 200µl de
glycérol que nous avons ajouté dans les tubes à Eppendorf. Enfin nous avons racler à l’aide
d’une anse d’ensemencement, des colonies bactériennes sur boite de pétri que nous avons mis
dans les différents tubes à tour de rôle. Le volume du milieu liquide et du glycérol doit être égal
à 1000 µl.
 III.2. Caractérisation Macroscopique et Microscopique

III.2.1. Caractérisation Macroscopique

C’est observé des colonies bactériennes sur boite de pétri afin d’identifier les éléments comme :
la forme des colonies, le contour, le relief, la surface, l’opacité, la consistance, l’odeur.
Le matériel est :
-boites à pétri contenant des colonies bactériennes
-bec bunsen

III.2.2. Caractérisation Microscopique

Elle permet à l’aide d’un microscope optique, de visualiser les bactéries afin d’identifier leur
forme (batônnets, Cocci etc), leur mobilité et leur motilité. Nous avons fait des observations
microscopiques à l’état frais. Comme matériels nous avons :
-lame et lamelle
-microscope
-Colonie bactérienne avec de l’eau physiologique (entre lame et lamelle)
Pour se faire nous avons pris une lame stérile où nous avons mis une goutte d’eau
physiologique et une colonie isolée prélevé sur boite de pétri. Nous avons ensuite mélangé et
posé la lamelle dessus. Au final nous avons visualisé au microscope optique.

Figure 4 : microscope optique

 III.3. Tests

III.3.1. Test de catalase

Ce test permet de déduire le type de respiration des bactéries. Nous avons utilisé comme
matériels :
-lame et lamelle
-l’eau oxygénée
-Boite de pétri avec colonie bactérienne
Nous avons d’abord mis une goutte d’eau oxygénée sur notre lame. Ensuite nous prélevé une
colonie bactérienne que nous avons mis dans la goutte d’eau oxygénée. Nous avons laissé
reposer quelques instants afin d’observer l’apparition ou non des bulles.
Le test est positif lorsqu’il y a apparition des bulles et négative lorsqu’il n’y en a pas

III.3.2. Test de la potasse (KOH)

Ce test permet de connaitre le type bactérien, qui est soit gram positif soit négatif. On utilise
comme matériels :
-la lame et lamelle
-Boite de pétri avec colonie bactérienne
-la potasse (KOH)
Nous avons d’abord mis une goutte de KOH sur notre lame. Ensuite nous prélevé une colonie
bactérienne que nous avons mis dans la goutte de KOH. Nous avons laissé reposer quelques
instants afin d’observer l’apparition ou non d’une viscosité.
Le test est positif lorsqu’il y a apparition d’une viscosité et négative lorsqu’il n’y en a pas.

. Figure 5 : Observation de la viscosité d’un test de KOH positif

 III.3.3. Test d’émulsification

Le test d’émulsification est ce test qui permet d’observer la production ou pas des biosurfactants
par les bactéries. Pour réaliser ce test, nous avons besoin :
-Bouillon
-Essence ou gasoil
-Tube à essai
-Vortex
Nous avons ensemencé sur milieu liquide, et nous avons incubé à 37°c pendant 24h. Le jour
suivant nous avons prélevé 5ml de ce bouillon puis transvasé dans un tube à essai en y ajoutant
5ml d’essence. Nous avons vortexé pendant 4min et laissé reposer 24h sur la paillasse.
L’indice d’émulsification (IE) est calculé de la manière suivante :

He
IE = X 100
H𝑡

IE : indice d’émulsification
He : hauteur d’émulsification
Ht : hauteur totale

Figure 6 : Test d’émulsification

III.3.4. Extraction des biosurfactants
Les biosurfactants sont définis comme étant des composés organiques formés d’une partie
lipidique (acide gras) et d’une partie peptidique (acide aminés). Encore appelés tensioactifs ;
les biosurfactants abaissent la tension des membranes, ils sont capables d’émulsifier des
graisses. Les biosurfactants ont aussi une activité bactériostatique (inhibe la croissance des
bactéries) et une activité bactéricide (tuer d’autres bactéries ou les bactéries d’où ils provient).
Entre autres les biosurfactants ont divers rôles et actions dans plusieurs domaines comme :la
bioremédiation, la médecine, etc. Pour faire ce test on a utilisé comme matériel :
-l’acide chlorhydrique
-micropipette
-les tubes à Eppendorf
-la centrifugeuse
-les longs tubes secs
-le tampon PBS (Phosphate Buffer Saline)
Nous avons préparé 50ml du bouillon où nous avons ajouté 100ml d’isolat, puis nous avons
mis à l’incubateur à 37°c pendant 48h. Apres incubation, nous avons mis le bouillon dans les
tubes à Eppendorf. Nous avons ensuite centrifugé à 11000 tr /min pendant 11min et recueilli le
surnageant. Nous avons ajouté 2ml d’acide chlorhydrique dans ce surnageant puis nous avons
ajusté le pH afin qu’il soit inférieur ou égal à 2. Nous avons conservé cela à 4°c pendant 24h
afin de préciter le biosurfactant.
Le lendemain nous avons mis 1ml de la solution contenant l’HCl dans chaque tube à Eppendorf
jusqu’à épuisement de celle-ci. Nous avons ensuite placer les tubes Eppendorf dans la
centrifugeuse et centrifuger à 1100 tours par minute pendant 11minutes. Apres cela nous avons
jeté le surnageant et recueilli le culot contenu dans le tube, qui est le biosurfactant. Nous avons
ensuite ajouté 500µl de PBS (Phosphate Buffer Saline) qui est une solution tampon couramment
utilisée en biologie. Pour récupérer l’ensemble du biosurfactant et le tampon, nous avons
homogénéisé le tout et nous l’avons transféré dans un autre tube Eppendorf contenant le culot
à l’aide de la pipette. Nous avons refait cela plusieurs fois jusqu’à épuisement de la solution.
N.B : Tous les biosurfactants ne sont pas précipités par l’acide chlorhydrique concentré d’autres
le sont par l’action du chloroforme.

III.3.5. Antibiogramme

L’antibiogramme est un examen de laboratoire permettant d’évaluer la sensibilité d’une

bactérie pathogène aux antibiotiques. Pour faire ce test nous avons besoin de :
-boites de pétri
-milieu de culture (MH)
-tube à D.O
-portoir
-bec bunsen
-pipette
-anse d’ensemencement
-écouvillon
-disques d’antibiotiques
-vortex
-Spectrophotomètre
-Pince
Pour réaliser l’antibiogramme ; nous avons d’abord réactivé les souches bactériennes pour avoir
des colonies jeunes. Apres le lendemain nous poursuivi la manipulation par des dilution en
cascade des colonies jeunes obtenues par réactivation dans de l’eau physiologique ; puis nous
avons pris des densités optiques de ces dilutions suivant l’échelle de Mc FARLAND (0,05 à
0,1) à une longueur d’onde de 600nm. Seules les dilutions dont les densités optiques comprises
dans cette échelle ont été retenues pour la suite de la manipulation.
Les dilutions dont les densités optiques ont été retenues, ont été ensemencées par
écouvillonnage sur boites de pétri contenant le milieu Mueller Hinton (MH). Ensuite nous avons
laissé reposer 15 minutes avant de poser les disques d’antibiotiques. A l’aide d’une pince, nous
avons posé les disques d’antibiotiques sur les boites de pétri à une certaine distance les unes
des autres, suivant les recommandations du CA-SFM. Enfin, nous avons incubé à 37oc pendant
24 heures. La lecture des boites de pétri a été faite en mesurant les diamètres d’halo formés
autour des différents disques d’antibiotiques. La sensibilité ou la résistance des isolats vis-à-vis
des disques d’antibiotiques a été déduite suivant les recommandations du CA-SFM.

Figure 7 : Observation du résultat du test d’antibiogramme

 III.3.6. Le test de dispersion

Ce test permet de mettre en évidence l’action du biosurfactant sur le mélange eau et

hydrocarbure ; il vient disperser l’hydrocarbure contenu dans de l’eau de façon à pouvoir
distinguer l’eau et l’hydrocarbure. Comme matériels il y’a :
-eau distillée
-pétrole, essence, huile à moteur, gasoil
-micropipette
-biosurfactant
-boite à pétri
-pipette pasteur
Nous avons tout d’abord prélevé 10ml d’eau distillée qu’on a versé dans chaque boite de pétri.
Nous avons ensuite ajouté dans l’une de ces boites de pétri 1ml de pétrole, 1 ml d’essence dans
l’autre et 1 ml de gasoil dans une autre. Puis nous avons ajouté un indicateur coloré, le bleu de
bromo phénol aux mélanges eau distillée hydrocarbures, permettant le virage en bleu-violet de
ceux-ci. Enfin, nous avons déposé 1µl de biosurfactant dans chaque boite afin d’observer la
dispersion.

Figure 8 : Dispersion de l’hydrocarbure dans l’eau par le biosurfactant

IV.CONCLUSION

Ce stage au laboratoire IRSEN m’a permis d’approfondir mes connaissances notamment dans
le domaine de la recherche biologique et sur les technologies microbiologiques et biochimiques.
Il m’a permis également de mieux assimiler la théorie qui m’a été enseignée pendant les trois
ans de licence à l’Université Marien Ngouabi (Faculté des Sciences et Techniques). Tous ces
acquis vont me permettre d’aborder avec plus de sérénité les taches qui me seront attribuées
prochainement durant mon parcours.

IV.1. Difficultés

La toute première difficulté était de maitriser le fonctionnement du laboratoire dans toute sa

globalité c’est-à-dire le rôle de chaque appareil, faisant la différence de chaque service de par
les taches exécutées. Le temps de stage était réduit à cause des coupures répétées et à long terme
d’électricité. Le laboratoire est bien organisé avec des équipements de hauts niveaux dont la
majorité est fonctionnel comme les étuves, l’autoclave, le four, le bain marie, le sonicateur, la
centrifugeuse, la table à U.V, le spectrophotomètre, etc. Par contre certains ne sont plus
fonctionnels depuis un bon moment et d’autres au cours du stage comme les étuves, l’autoclave,
centrifugeuse…. Nous soulignons qu’il y’avait un nombre moindre des boites à pétri, une
mauvaise gérance du temps de travail qui empêchait la réalisation de certaines activités.

IV.2. Perspectives

Il est possible de se questionner si, dans les années à venir l’état en collaboration avec le
ministère de la recherche et de l’innovation technologique peuvent améliorer les conditions
dudit laboratoire sur le matériel en moins et abimé afin de ne pas retarder les activités ou
pénaliser les travailleurs et les apprenants sur le reportage au lendemain des activités de fois
prévues et au bout du temps non réalisées. Prolonger la durée du stage à au moins un mois et
demi afin de permettre aux apprenants de réaliser toutes les activités au programme de stage.
Nous ne pourrions peut-être pas assister aux améliorations suggérées mais nous supposons que
ces solutions répondront aux exigences de chaque partie.
 .

Centrifugeuse Cuve électrophorétique Plaque à UV

Spectrophotomètre Incubateur Autoclave