Faculte de Medecine: These

uü
+ FACULTE DE MEDECINE
UL
ms
THESE
PRESENTEE
A L'ECOLE DES GRADUES
DE L 'UNIVERSITE LAVAL
POUR L 'OBTENTION
DU GRADE DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph.D.)
PAR
MICHEL COUILLARD
MAITRE ES SCIENCES
DE L'UNIVERSITE LAVAL
RECHERCHE D'UNI ROLE PHYSIOLOGIQUE ESSENTIEL POUR LA BETA-

LACTAHASE ET CARACTERISATION D'UNE ACTIVITE BETA-LACTAHASE
DANS LES CELLULES DE FOIE DE RAT
NOVEMBRE 1985
AVANT- PROPOS
A l'automne 19 8 0, Robert De 1 age, alors étudiant gra
dué à la maîtrise en microbiologie médicale, soulignait la
ressemblance entre la structure de base des céphalosporines et
la molécule de nicotinamide adénine dinucléotide. Il s'inter
rogeait sur la possibilité que cette dernière puisse être un
substrat des 6-1actamases. Claude Asselin pour sa part complé
tait sa thèse de maîtrise qui portait sur l'influence de fac
teurs physico-chimiques sur la synthèse de deux g-lactamases
dans une souche d'Enterobacter. A cette époque, Claude Morin
et moi-même étions en quête d'un sujet de thèse qui puisse
combler nos aspirations et compétences en matière de recherche.
Les discussions que nous avons eues à l'époque avec Robert
Del age et Claude Asselin allaient nous motiver à proposer un
projet de recherche. Celui-ci visait à déterminer le rôle
physiologique essentiel des g-lactamases. Les hypothèses de
départ étaient tributaires de sept années de travaux qui eurent
lieu dans ce laboratoire sous la direction des professeurs
Roger Guay, Robert Letarte et Jean-Claude Pechère.
La présente thèse de doctorat comporte une revue de
la littérature ainsi que quatre chapitres de résultats expéri
mentaux. Les deux premiers constituent l'aboutissement de
travaux exécutés conjointement avec mon collègue et ami Claude
Morin. Au début de 1982, il fut décidé que mon travail se
concentrerait sur la mise en évidence et la caractérisation
d'une B-lactamase eucaryote. Les deux derniers chapitres abor
dent ces sujets.
La réalisation du projet de recherche et la prépara
tion de cette thèse n'auraient pas été possibles sans la colla
boration de plusieurs personnes.

Ill
De veux d'abord souligner la contribution de mon
directeur de thèse, le docteur Dean-Claude Pechère, de mon co
directeur, le docteur Roger G u a y, ainsi que des professeurs
Gilles Richer et Robert Letarte. De désire les remercier pour
m'avoir fourni un encadrement scientifique et des facilités
matériel les. Leurs conseils et leurs encouragements à des
moments parfois difficiles m'ont été précieux. De leur exprime
toute ma gratitude.
D'autres professeurs du Département de microbiologie
ont contribué à ma formation et m'ont fourni une aide à l'une
ou l'autre des étapes expérimentales de cette thèse. De veux
remercier les professeurs Hans W. Ackermann, Michel G. Berge
ron, Dean R. Do1 y et Roger Lévesque.
Des professeurs d'autres départements de l'Université
Laval ont également joué un rôle dans la réalisation de ce
projet de recherche en me fournissant une aide technique et
matériel le, ou en me prodiguant des conseils. C'est le cas de
Luc Bélanger, Claude Gagnon, Seymour Heisler, Dacques Huot,
Marcel Lalanne, Denis Mayrand, M.R.V. Murthy, Michel P a g é,
Robert Tanguay et Doan Willemot.
De suis également redevable aux nombreux collègues
étudiants et assistants de recherche qui m'ont fourni une aide
indispensable à certaines étapes expérimentales. De désire
souligner plus particulièrement la collaboration de Dean Berge
ron, Maurice Boissinot, Corinne Marlot, Marc Martin, Mario
Martin, Claude Morin, Darnel Rafrafi, Daniel le Ramsay, Docelyne
Tardif et Nancy Watt.
Enfin, je veux adresser mes remerciements au person
nel de la Faculté de médecine, dont Betty Boulet, Docelyne
Gagnon, Francine Garneau, Louiselle Garon, Dean-Marc Dacques,
Brigitte Roy et Amédée Tremblay du Département de microbiolo
gie, Françoise Boisvert du Laboratoire de virologie et Pierre
De Granpré du Département de biochimie.

IV
3'adresse mes remerciements à Gilles Mongrain qui a
préparé les photographies ainsi qu'à Nicole Cauchon et Maurice
Poulin qui ont réalisé les graphiques. 3e veux souligner le
travail remarquable de Diane Huot Blais qui a collaboré à la
réalisation de ce document et qui a eu la patience de dactylo
graphier le manuscrit.
Ces études de doctorat n'auraient pas été réalisées
sans la contribution financière du Fonds de la recherche en
santé du Québec qui m'a attribué une bourse de stagiaire de
recherche pendant la période 1980-1983, de même que du Fonds de
soutien du revenu des étudiants au doctorat de l'Université
Laval. Par 1 'intermédiaire de ces programmes, ce sont les
contribuables du Québec qui m'ont accordé ce support et je leur
dédie ma reconnaissance.
RESUME
Cette étude a eu pour but d'élucider le rôle physio

logique de l'enzyme 6-lactamase. Nous avons postulé que la 8-
lactamase n'est pas exclusivement de nature bactérienne,
qu'elle est reliée à une fonction physiologique importante et
que cette fonction peut se retrouver chez les mammifères.
Nous avons d'abord entrepris de vérifier le concept
d'universalité des g-lactamases. Des méthodes sensibles de
détection ont été appliquées afin de mesurer la capacité de
souches bactériennes, dites g-1actamases-négatives, de synthé
tiser cette enzyme. La présence de 8-1actamase a semblé être
une caractéristique commune aux bactéries grain-négatives. Une
souche de Mycoplasma pneumoniae n'a montré aucune activité de
ce type. Chez les micro-organismes à Gram positif, les actino
mycètes Bifidobacterium et Propionibacterium ont montré une
faible activité 6-lactamase. Deux Peptococcus anaerobius et un
Peptostreptococcus productus n'ont pas révélé d'activité 8-
lactamase décelable. Ces deux espèces sont des bactéries anaé
robies strictes. Cette observation suggère que la 6-1actamase
peut jouer un rôle dans le métabolisme aérobie des cellules
productrices.
Nous avons ensuite réalisé des expériences métaboli
ques avec des souches d'entérobactéries afin de vérifier si la
synthèse de B-lactamase est accrue en aérobiose. Nous avons
mesuré l'effet de l'oxygène sur la synthèse de B-lactamases
inductibles et constitutives, en présence ou non de cyanure de
potassium. De plus, l'influence de la pénicilline, de la
source d'énergie et de la composition du milieu de culture sur
le taux de synthèse de B-lactamase fut évaluée en présence et
en absence d'oxygène. L'aérobiose ainsi que le milieu minimal
V
VI
ont augmenté les niveaux des B-lactamases d'Enterobacter et de
Citrobacter. Le cyanure de potassium a freiné l'effet induc
teur de 1'oxygène en aérobiose. Ce résultat semble suggérer
que la synthèse de g-lactamase dépend davantage du fonctionne
ment normal de la chaîne des transporteurs d'électrons que de
l'influence directe de l'oxygène à d'autres niveaux métaboli
ques. Nous avons justifié la nécessité de réaliser ce type
d'expériences avec des souches microbiennes génétiquement défi
nies.
A la suite de ces observations, nous avons dirigé nos
efforts vers la mise en évidence et la caractérisation d'une
activité g-lactamase dans des cellules de mammifères. Les
méthodes d'études ont été basées sur 1 'interaction des pro
téines de rat avec une gamme d'antibiotiques appartenant aux
principaux groupes de 6-1actamines. Les résultats ont indiqué
que le surnageant 100,000 g d'un homogénat de foie de rat peut
dégrader les g-1actamines. L'activité a été jugée complexe.
L'inactivation de deux céphalosporines chromogéniques, le PADAC
(pyridinium-2-azo-p-diméthy 1-ani 1ine chromophore) et la nitro-
céfine, a semblé reposer sur deux mécanismes différents. Les
caractéristiques spectrophotométriques de ces deux substrats et
de leurs produits de dégradation ont rappelé une activité de
type g-lactamase. Nous avons déterminé l'absence de relation
avec d'autres protéines capables de réagir sur les g-lactamines
comme la peptidase rénale, l'albumine et l'acylase.
La présence d'une g-lactamase dans les cellules de
foie de rat pourrait contribuer à élucider son rôle physiologi
que essentiel. Dans cette perspective, nous avons entrepris de
purifier l'activité g-lactamase des cellules de foie de rat.
Les tentatives entreprises afin d'isoler la protéine
responsable de l'hydrolyse du PADAC ont échoué. Chaque étape
de purification a été caractérisée par une faible récupération
de l'activité enzymatique et, par conséquent, une perte d'acti
vité spécifique. Nous avons d'abord attribué ce résultat à
une grande instabilité de l'enzyme. La recherche des condi-

VII
tions optimales pour stabiliser cette protéine a permis de
déterminer qu'elle nécessite la présence d'un cofacteur, le
NADPH. Elle possède un poids moléculaire voisin de 25,000 et
un point isoélectrique d'environ 7.7. Elle a réagi aussi avec
quelques pénames et céphèmes. La protéine qui a dégradé la
nitrocéfine possède un poids moléculaire inférieur à celle qui
a hydro lysé le PADAC et un point isoélectrique près de 5.4.
Elle a réagi avec un pénème et un monobactame. Ces propriétés
n'écartent pas la possibilité qu'il s'agit de g-lactamases.
Cependant, l'appartenance définitive de ces protéines à la
famille des 6-lactamases devra attendre leur purification com
plète.
TABLE DES MATIERES
PAGE
AVANT-PROPOS ...................................................................................................... II
RESUME ..................................................................................................................................... V
TABLE DES MATIERES ................................................................................................... VIII
LISTE DES TABLEAUX ................................................................................................... XV
LISTE DES FIGURES ...................................................................................................... XVII
CHAPITRE I - REVUE DE LA LITTERATURE 1
1. INTRODUCTION ........................................................................................... 2
2. LES BETA-LACTAMINES ........................................................................ 4
2.1. Diversité .......................................................................................................... 4
2.2. Structure et classification ....................................................... 7
2.2.1. Les pénicillines ......................................................................................... 7
2.2.2. Les céphalosporines ................................................................................ 11
2.2.3. L'acide clavulanique ............................................................................. 11
2.2.4. Les carbapé nèmes ......................................................................................... 12
2.2.5. Les g-lactamines monocycliques .............................................. 12
2.3. Mode d'action .................................................................................................... 13
3. LA RESISTANCE BACTERIENNE AUX BETA-LACTAMINES . 16

3.1. Structure de la paroi .......................................................................... 16
3.1.1. Bactéries gram-né gatives ................................................................ 16
3.1.2. Bactéries gram-positives ................................................................ 18
3.2. Aspects génétiques ................................................................................... 18
3.3. Mécanismes de résistance ............................................. 20
3.3.1. Barrière de perméabilité ................................................................ 20
3.3.2. Modification de la cible ................................................................ 20
3.3.3. Tolérance .............................................................................................................. 21
3.3.4. Résistance enzymatique ...................................................................... 21
3.3.4.1. Les 6-lactamases .......................................................................................... 21
3.3.4.2. Les estérases .................................................................................................... 23
VIII
IX
3.3.4.3. Les acylases ....................................................................................................... 24
3.3.5. Conclusion ............................................................................................................. 25
4. LES BETA-LACTAMASES ................................................................................ 26
4.1. Définition ........................................................................................................... 26
4.2. Mécanisme d'action ................................................................................... 26
4.3. Propriétés générales ............................................................................. 27
4.4. Rôle dans la résistance .................................................................... 28
4.5. Classification ............................................................................................... 30
5. LE ROLE PHYSIOLOGIQUE DES BETA-LACTAMASES ............. 37
5.1. Introduction ..................................................................................................... 37
5.2. Les B-lactamases jouent un rôle comme agents
détoxiquants ............................................................ 38
5.3. Les g-lactamases jouent un rôle dans le métabo
lisme de la paroi ...................................................................................... 40
5.4. Evidences suggérant un rôle des B-lactamases
dans d'autres fonctions métaboliques ............................ 44
5.5. Origine des B-lactamases ................................................................ 46
5.5.1. Ressemblance avec les PB P ............................................................. 46
5.5.2. Ressemblance avec les protéases ........................................... 49
5.5.3. Modèle évolutif des B-lactamases ........................................ 50
6. LES CELLULES DE MAMMIFERES POSSEDENT-ELLES UNE

BETA-LACTAMASE? ............................................................................................ 53
6.1. Dégradation non-enzymatique ....................................................... 54
6.1.1. Réactions nucléophiles ...................................................................... 54
6.1.2. Réactions électrophiles ................................................................... 55
6.1.3. Conséquences biologiques ................................................................ 55
6.2. Liaison avec des protéines ............................................................ 56
6.2.1. Albumine ................................................................... 56
6.2.2. Ligandine .............................................................................................................. 56
6.2.3. Autres protéines ......................................................................................... 57
6.3. Biotransformation des B-lactamines .......................... 58
6.3.1. Dans le sérum .................................................................................................. 58
6.3.2. Dans le foie ..................................................................................................... 59
6.3.3. Dans d'autres sites de biotransformation ................ 60
6.4. Dégradation enzymatique ..................................................................... 60
6.4.1. Les B-lactamases ......................................................................................... 61
6.4.2. Les acylases ..................................................................................................... 61

X
6.4.3. Les estérases ........................................................................................ 64

6.4.4. La peptidase rénale ....................................................................... 64
7. MOTIFS ET OBJECTIFS DE CE TRAVAIL .................................... 67
CHAPITRE II - UNIVERSALITE DESBETA-LACTAMASES 69
1. INTRODUCTION ........................................................................................... 70
2. MATERIEL ET METHODES ..................................................................... 72
2.1. Souches bactériennes ............................................................................. 72
2.2. Détermination de la concentrationminimale in

hibitrice 72
2.3. Culture des bactéries et préparationde 1 1 ex
trait brut 72
2.3.1. Entérobactéries ............................................................................................ 72
2.3.2. Autres bactéries ......................................................................................... 73
2.4. Détermination de 11 activité enzymatique ................... 74
2.4.1. Hydrolyse de la nitrocé fine ....................................................... 74
2.4.2. Méthode microbiologique de diffusionsimple ... 74
2.4.3. Méthode microbiologique d'hydrolysepériphéri
que 75
3. RESULTATS .................................................................................................... 76
3.1. Les entérobactéries ................................................................................ 76
3.2. Les cocci gram-positifs ................................................................... 79
3.3. Les actinomycètes ...................................................................................... 79
3.4. Le mycoplasme .................................................................................................. 79
4. DISCUSSION ................................................................................................. 81
4.1. Méthodes d'études ...................................................................................... 81
4.2. Souches bactériennes ............................................................................. 83
4.3. Universalité ..................................................................................................... 86
CHAPITRE III - ROLE DE L'OXYGENE SUR LASYNTHESE DES

BETA-LACTAMASES 88
1. INTRODUCTION ........................................................................................... 89
XI
2. MATERIEL ET METHODES ............................................................................. 91
2.1. Souches bactériennes ............................................................................ 91
2.2. Caractéristiques morphologiques et biochimiques
des souches étudiées ............................................................................. 91
2.3. Composition des milieux de culture .................................. 91
2.4. Culture des bactéries .......................................................................... 92
2.5. Préparation des extraits bruts ................................. 92
2.6. Détermination de l'activité enzymatique ................... 92
2.7. Essais avec malate et fumarate .............................................. 93
3. RESULTATS .................................................................................................... 94
3.1. Expériences préliminaires ............................................................. 94
3.2. Influence des paramètres physico-chimiques sur
la synthèse de B-lactamase .......................................................... 94
3.3. Essai de 1'activité fumarase .................................................... 95
4. DISCUSSION ................................................................................................. 98
4.1. Expériences préliminaires ................................................... 98
4.2. Influence des paramètres physico-chimiques ....
4.3. Activité fumarase ............................................................................ 100
4.4. Conclusions ........................................................................................................ 101
CHAPITRE IV - INTERACTION DE PROTEINES SOLUBLES DU FOIE

DE RAT AVEC LES BETA-LACTAMINES 1041 2
1. INTRODUCTION ..................................................................................................... 105
2. MATERIEL ET METHODES ............................................................................. 107
2.1. Antibiotiques et autres produitschimiques .... 107
2.2. Animaux ..................................................................................................................... 107
2.3. Préparation des organes .................................................................... 108
2.4. Préparation du foie de rat .......................................................... 108
2.5. Localisation de la fraction la plus active de
1 1 homogénat ........................................................................................................ 109
2.6. Préparation des extraits enzymatiques ......................... 109
2.7. Chromatographie ............................................................................................ 109
2.8. Détection de l'activité enzymatique ............................... 111
2.9. Essais de 1 ' activité enzymatique ...................................... 111
2.10. Essais de compétition .......................................................................... 112

XII
2.11. Méthode iodomé trique ............................................................................. 113
2.12. Essais immunologiques .......................................................................... 113
3. RESULTATS .................................................................................................... 114
3.1. Détection d'une activité hydrolytique dans

différents organes du rat ............................................................. 114
3.2. Localisation de la fraction la plus active du

foie de rat ........................................................................................................ 114
3.3. Modification de céphalosporines chromogéniques 117
3.4. Essais biologiques ................................................................................... 117
3.5. Recherche d'une B-lactamase par la méthode
iodométrique ..................................................................................................... 120
3.6. Essais de compétition .......................................................................... 120
3.7. Mesure de 1'inhibitionpar lacéfotaxime ........................ 126
3.8. Détection de la peptidase rénale ........................................ 126
3.9. Effet de 1 ' albumine ................................................................................ 128
4. DISCUSSION ................................................................................................. 133
CHAPITRE V - CARACTERISATION DE L'ACTIVITE BETA-LACTAMA-

SE DES CELLULES DE FOIE DE RAT 1401 2
1. INTRODUCTION ........................................................................................... 141

2. MATERIEL ET METHODES ..................................................................... 142
2.1. Produits chimiques et antibiotiques ............................... 142
2.2. Préparation de 1'extrait enzymatique de foie .. 143
2.3. Purification de 1'activité de type B -lactamase 143
2.3.1. Précipitation avec le sulfate d'ammonium ................ 143
2.3.2. Chromatographie d'affinité .......................................................... 143
2.3.2.1. Préparation de la colonne ............................................................... 143
2.3.2.2. Déroulement de la chromatographie ...................................... 144
2.3.3. Chromatographie échangeuse d'ions ..................................... 145
2.3.4. Filtration sur gel ................................................................................... 145
2.3.5. Ultrafiltration ............................................................................................ 146
2.4. Essai de 1'activité de type B-lactamase ................... 146
2.5. Essai des protéases dans l'extrait brut ................... 147
2.6. Electrofocalisation ................................................................................ 147
2.6.1. Electrofocalisation en gel de polyacrylamide .. 147

XIII
2.6.2. Electrofocalisation en gradient de sucrose .... 148
2.6.2.1. Bande large de pH ..................................................................................... 148
2.6.2.2. Bande étroite de pH ............................................................................... 149
2.7. Electrophorèse en gel de polyacrylamide ................... 149
2.8. Estimation du poids moléculaire ........................................... 149
2.9. Détermination des protéines ....................................................... 150
3. RESULTATS ............................................................................................................. 151
3.1. Purification de l'activité de type 6-lactamase 151
3.1.1. Précipitation avec le sulfate d'ammonium ................ 151
3.1.2. Chromatographie d'affinité .......................................................... 151
3.1.3. Chromatographie échangeuse d'ions ..................................... 153
3.1.4. filtration sur gel ................................................................................... 153
3.2. Détermination des conditions de stabilisation
enzymatique ........................................................................................................ 156
3.2.1. Effet du tampon et de la force ionique ...................... 158
3.2.1.1. Influence de la nature et de la composition des
tampons .................................................................................................................... 158
3.2.1.2. Influence des ions sodique et potassique dans
la composition du tampon phosphate ................................ 158
3.2.1.3. Influence du NaCl ..................................................................................... 161
3.2.2. Effet du pH ....................................................................................................... 161
3.2.2.1. Gamme large ....................................................................................................... 161
3.2.2.2. Gamme étroite ................................................................................................. 165
3.2.3. Effet de la température .................................................................... 165
3.2.3.1. Effet de la température sur la cinétique de la
réaction .......................................................................................................... 165
3.2.3.2. Effet de la température sur la stabilité enzy
matique .................................................................................................................... 165
3.2.4. Effet du sucrose et du glycérol ........................................... 168
3.2.4.1. Effet du sucrose ....................................................................................... 168
3.2.4.2. Effet du glycérol .................................................................................... 170
3.2.5. Effets d'agents oxydants et réducteurs ...................... 170
3.2.5.1. Effet de l'oxygène ................................................................................. 170
3.2.5.2. Effet du pCMB ................................................................................................. 170
3.2.5.3. Effet d'agents réducteurs ............................................................ 173

3.2.6. Effet des protéases ................................................................................ 173
XIV
3.2.6.1. Détermination de 11 activité protéolytique de
1 1 extrait de foie ...................................................................................... 173
3.2.6.2. Influence des inhibiteurs de protéases ..................... 173
3.2.7. Effet des ions et de 1 1 ED T A ....................................................... 177
3.2.7.1. Influence des ions .................................................................................. 177
3.2.7.2. Influence de 1 'EDTA ............................................................................... 177
3.2.8. Effet de molécules organiques ................................................. 177
3.2.8.1. Influence de 1 1 ATR et de 5 coenzymes ........................... 177
3.2.8.2. Dé termination des concentrations optimales de
NAD et de NADP ............................................................................................... 190
3.2.8.3. Influence comparative du NAD, NADH, NADP et

N ADP H .......................................................................................................................... 193
3.3. Dé termination des caractéristiques.physico-chi

miques . 193
3.3.1. Poids moléculaires ................................................................................... 193
3.3.2. Electrofocalisation ................................................................................ 197
3.3.2.1. Electrofocalisation en gel de polyacrylamide .. 197
3.3.2.2. Electrofocalisation en gradient desucrose .... 197
4. DISCUSSION .......................................................................................................... 200
CHAPITRE VI - CONCLUSION 205
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................. 211
APPENDICE ............................................................................................................................ 254

LISTE DES TABLEAUX
CHAPITRE 1
Tableau 1. Les g-lactamases des bactéries à Gram posi
tif (actinomycètes exceptés) ........................................ 31
Tableau 2. Les g-lactamases des actinomycètes ....................... 33
Tableau 3. Les g - lactamases des bactéries à Gram néga
tif .................................................................................................................... 34
Tableau 4. La classification d1 Ambler ................................................ 36
Tableau 5. Substrats et inhibiteurs de B-lactamases
qui ne possèdent pas l'anneau 6-lactame ... 45
Tableau 6. Activité g-lactamase de PBP ............................................. 47
Tableau 7. Dégradation de pénicillines par une activi-
de type g-lactamase .................................................................... 62
Tableau 8. Principales propriétés des peptidases réna
les .................................................................................................................... 66
CHAPITRE II
Tableau 9. Activité g-lactamase des anaérobies, des
actinomycètes, du mycoplasme et des entéro
bactéries étudiées ....................................................................... 77
Tableau 10. Détermination des concentrations minimales
inhibitrices ......................................................................................... 78
Tableau 11. Activité g-lactamase de Bifidobacterium et
de Propionibacterium détectée par la mé
thode biologique ............................................................................. 80
XV
XVI
CHAPITRE III
Tableau 12. Effet de 11 oxygène, de 1 1 induction et de la
composition du milieu de culture sur la
synthèse de B-lactamase ............................................................... 96
Tableau 13. Effet du KCN sur la synthèse de 6-lactamase
en milieu minimal ................................................................................. 97
CHAPITRE IV
Tableau 14. Détermination d'une activité hydrolytique
envers les céphalosporines chromogéniques

(PADAC et nitrocéfine) dans différents
organes du rat .................................................................................. 115
Tableau 15. Activité d'échantillons de surnageants de
foie et d'acylase commerciale envers les
céphalosporines chromogéniques PADAC et
nitrocéfine ............................................................................................ 118
Tableau 16. Activité du surnageant de foie envers 9 (3-
1actamines évaluée par deux méthodes micro
biologiques ......................................................................................... 121
Tableau 17. Résultats de la méthode iodomé trique .................. 122
Tableau 18A. Résultats des essais de compétition ..................... 124
Tableau 18 B. Résultats des essais de compétition ..................... 125
Tableau 19. Activité de 1'extrait brut et du sérum de
rat envers les céphalosporines chromogéni
ques ........................................................................................................................ 129
CHAPITRE X
Tableau 20. Purification de 1'activité de type B-lac
tamase par filtration sur gel de Séphacryl
5-200 ..................................................................................................................... 154

LISTE DES FIGURES
CHAPITRE 1
Figure 1. L1 évolution des g-lactamines .......................................... 6
Figure 2. g-lactamines dont le cycle azétidinone est
accolé à un pentacycle .......................................................... 8
Figure 3. g-lactamines dont le cycle azétidinone est
accolé à un hexacycle insaturé ............................... .. 9
Figure 4. g-lactamines monocycliques ................................................ 10
Figure 3. Structure de la paroi bactérienne .......................... 17
Figure 6. Les enzymes hydrolytiques des g-lactamines 22
Figure 7. Modèles évolutifs des g-lactamases ...................... 51
CHAPITRE IV
Figure 8. Procédure expérimentale utilisée pour frac
tionner l'homogénat de foie ........................................... 110
Figure 9. Localisation de l'activité hydrolytique de
l'homogénat de foie envers le PADAC ................... 116
Figure 10. Analyse spectrophotométrique des céphalos
porines chromogéniques et de leur produit
d ' hydrolyse ............................................................................................ 119
Figure 11. Droites de Lineweaver-Burkreprésentant
1'inhibition de l'extrait de foie par la
céfotaxime ............................................................................................... 127
Figure 12. Déterminationspectrophotométrique de 1 ' ac
tivité avec un sérum de chèvre normal et un
sérum de chèvre anti-albumine de rat sur
1'activité enzymatique de l'extrait de foie
de rat ........................................................................................................... 130
Figure 13. Immunodiffusion sur lame ...................................................... 132
XVII
XVIII
CHAPITRE V.
Figure 14. Pourcentage cumulatif de protéines totales
précipitées et d'unités de 8-lactamases
précipitées en fonction du pourcentage de
saturation en sulfate d1 ammonium ............................ 152
Figure 15. Modèle d'élution de 11 extrait brut de foie
sur colonne de Séphacryl 5-200 .................................. 155
Figure 16. Electrophorèse analytique de la filtration
sur Séphacryl 5-200 ................................................................... 157
Figure 17. Influence de la nature et de la composition
des tampons en fonction du temps et de la
concentration en Na Cl ............................................................. 159
Figure 18. Influence du phosphate monosodique et mono
potassique en fonction du temps et de la
concentration en Na C 1 .............................................. .. 160
Figure 19. Influence de la concentration en N a C1 en
fonction du temps .............................................................. 162
Figure 20. Influence du pH sur l'activité enzymatique
restante après différents temps d'incuba
tion à 5 0 C....................................................................................... 163
Figure 21. Activité enzymatique en fonction du pH

(gamme large) ...................................................................................... 164
Figure 22. Activité enzymatique en fonction du pH

(gamme étroite) ................................................................................ 166
Figure 23. Effet de la température sur l'activité de
l'enzyme hépatique ....................................................................... 167
Figure 24. Effet de la température sur la stabilité de
1'activité enzymatique du foie en fonction
du temps ..................................................................................................... 169
Figure 25. Influence du glycérol sur la stabilité de
l'enzyme hépatique ....................................................... .. 171
Figure 26. Effet comparatif de l'azote et de l'oxygène
sur la stabilité de l'activité enzymatique

du foie ......................................................................................... ... 172
XIX
Figure 27. Influence du 2-mercaptoéthanol, du dithio-
thréitol et du pCMB sur 1 ' activité de 1 1 en-
zyme du foie en fonction du temps ......................... 174
C
Figure
C
Détermination de l'activité protéolytique
O
M
de l'extrait de foie ................................................................ 175
Figure 29 . Influence de 1'aprotinine et de la leupep-
tine sur l'activité de l'enzyme de foie en
fonction du temps ......................................................................... 176
Figure 30. Influence de l'ion magnésium sur 1'activité
de 1'enzyme de foie en fonction du temps .. 178
Figure 31 . Influence de l'ion manganèse sur 1'activité
de l'enzyme de foie en fonction du temps .. 179
Figure 32. Influence de l'ion potassium sur l'activité
Figure 33. Influence de l'ion calcium sur 1'activité
Figure 34 . Influence de l'ion molybdène sur 1’activité
Figure 33. Influence de l'ion cobalt sur l'activité de
l'enzyme de foie en fonction du temps ............. 183
Figure 36 . Influence de l'ion zinc sur 1'activité de
1'enzyme de foie en fonction du temps ............ 184
Figure 37. Influence de l'ion fer sur l'activité de
Figure 38. Influence de l'ion cuivre sur l'activité de
Figure 39. Influence de 1 ' EDTA sur 1'activité de l'en-
zyme de foie en fonction du temps ......................... 187
Figure 40 . Influence des cofacteurs cocarboxylase et
codécarboxylase ainsi que de l'ATP sur
1'activité de l'enzyme de foie .................................. 188
Figure 41 . Influence des cofacteurs NAD, NADP et F AD
sur l'activité de l'enzyme de foie en fonc
tion du temps ...................................................................................... 189
Figure 42 . Détermination de la concentration optimale
de NADP pour stabiliser l'enzyme de foie .. 191

Figure 43. Dé termination de la concentration optimale
de NAD pour stabiliser 11 enzyme de foie ... 192
Figure 44. Influence des cofacteurs N AD et NADP, N ADH
et NADR H sur 11 activité de l'enzyme de foie
en fonction du temps ................................................................ 194
Figure 45. Estimation du poids moléculaire de l'enzyme
hépatique qui dégrade le PADAC en HPLC sur
gel T S K G3000SW .................................................................. 195
Figure 46. Filtration de l'extrait brut de foie sur
gel de Séphacryl 5 -20 0 .............................................. 196
Figure 47. Electrofocalisation de l'extrait brut de
foie en gel de polyacrylamide ..................................... 198
Figure 48. Electrofocalisation en gradient de sucrose
d'un extrait de foie filtré sur Séphacryl
5-200 (gamme étroite d'ampholytes) ...................... 199

CHAPITRE I
Revue de la littérature
2
1. INTRODUCTION
Parmi les développements les plus remarquables en
science contemporaine, l'application clinique des antibiotiques
du groupe des B-lactamines apparaît comme un événement mar

quant. La découverte de la pénicilline par Fleming (112), puis
les travaux menés à Oxford par Florey, Chain, Abraham et leurs

collaborateurs ( 4., 6 8), ont conduit à l'utilisation de ce
composé à des fins thérapeutiques au cours de la seconde guerre
mondiale. L'effort de développement sans précédent qui a été
entrepris à cette époque a permis une production sur grande
échelle de la pénicilline. Les résultats encourageants obtenus
c1 iniquement avec la pénicilline ont stimulé la recherche d'au
tres antibiotiques.
Quelques décennies plus tard, on peut évaluer l'im
pact de cette découverte en réalisant ce qu'elle représente
pour la société d'aujourd'hui. D'un point de vue économique,
l'industrie pharmaceutique emploie des dizaines de milliers de
personnes et réalise un chiffre d'affaire dépassant le milliard
de dollars (192). D'ailleurs, les agents antimicrobiens cons
tituent un des groupes de médicaments le plus utilisé en méde
cine aujourd'hui.
Au niveau scientifique, l'étude des antibiotiques a
permis d'acquérir des connaissances considérables en chimie
(363) et en physiologie bactérienne (314). L'étude des mécanis
mes de résistance des bactéries aux antibiotiques a contribué à
paver la voie à des techniques nouvelles en génétique molécu
laire en plus d'intensifier les recherches quant au développe
ment de nouveaux antibiotiques mieux conçus pour contrer les
moyens de défense des micro-organismes.
Cette découverte a eu un impact incommensurable pour
la société lorsque l'on considère les millions d'individus dont
la vie a été sauvée, ou qui se sont vus épargnés de longues
périodes de douleur, de souffrance ou d'inconfort causées par

l'infection. Les antibiotiques ont également permis de raccour
cir ou d'éliminer le séjour à l'hôpital. En somme, l'avènement
de l'antib,iothérapie a contribué à l'amélioration des condi
tions de vie ainsi qu'à l'augmentation de l'espérance de vie
(314) .
4
2. LES BETA-LACTAMINES
2.1. Diversité
Les 3-lactamines constituent une des plus anciennes,
la plus importante et la mieux étudiée des classes d'antibioti

ques (1_7_). Elles sont uniques parmi les agents antimicrobiens
pour leur activité hautement sélective contre les cellules
bactériennes, leur spectre d'activité et leur faible toxicité
pour l'homme et l'animal (3_3, 288).
Les (3-lactamines sont des molécules qui réagissent
avec deux catégories principales d'enzymes bactériennes (59).
Les premières, certaines des enzymes de la paroi cellulaire,
sont inactivées par les 3-lactamines et représentent les cibles
létales de ces composés. Au contraire les secondes, appelées
3-lactamases, inactivent les 3-lactamines et jouent un rôle
dans la protection de la cellule contre l'attaque des 3-lacta
mines. Nous étudierons ces deux types d'enzymes un peu plus
loin .
Le dépistage de micro-organismes producteurs d'anti
biotiques a été la pierre angulaire des programmes de recherche
de l'industrie pharmaceutique (405). La grande majorité de ces
études a porté sur des champignons et des actinomycètes capa
bles de produire des substances naturelles avec des structures
chimiques parfois très divergentes. Ces travaux ont permis
d'acquérir une bonne connaissance des processus métaboliques
menant à leur synthèse biologique (149, 387 ). Par ailleurs,
depuis les premières recherches sur la pénicilline, on a cons
tamment tenté d'accroître la productivité des fermentations

d'antibiotiques (218) en utilisant le plus souvent des appro
ches génétiques pour améliorer les souches productrices (15).
Ousqu'à 1970, seulement deux groupes de 3-lactamines
étaient connus: les pénicillines et les céphalosporines. Pen
dant les 10 années suivantes, en plus de nouvelles pénicillines

5
et céphalosporines, une variété de composés produits par des
actinomycètes ont été découverts dont les cépham yci nés, l'acide
c1 avu1 aniqbe et la thiénamycine. Toutes ces substances portent
un cycle g-lactame et des analogues ont été développés pour
donner une variété de substances antibactériennes avec des
propriétés thérapeutiques intéressantes (109). Plus récemment,
on a isolé des molécules possédant un anneau g-lactame chez des

bactéries (154, 271, 365, 405).
La synthèse de nouvelles (3-lactamines a soulevé un
intérêt considérable, particulièrement ces dernières années, et
plusieurs méthodes synthétiques ont été employées afin d'obte
nir des molécules qui n' auraient pu être isolées par fermenta
tion (151, 340, 418). D'autre part, les découvertes de g-
1actamines non-classiques comme la thiénamycine et la nocardi-
cine ont constitué autant de stimuli auprès des chimistes pour
qu'ils synthétisent de nouveaux analogues de composés à cycle
g-lactame que l'on n'a pas retrouvés en nature ( 2_4, 6_1, 324,
420). L'importance croissante et la distribution des bactéries
résistantes ont accéléré les recherches afin de découvrir des
antibiotiques plus efficaces (279, 297, 329). Ainsi la struc
ture des nouvelles g-1actamines n'a plus, dans certains cas,
beaucoup de ressemblance avec la molécule de Florey et Chain.
Alors que les premières pénicillines étaient utilisées pour
leur pouvoir bactéricide, les molécules brevetées récemment ont
la même capacité, mais ont d'abord été conçues afin d'être
insensibles à l'action des g-lactamases (88, 109). D'autres
molécules, appelées "inhibiteurs" ont pour rôle premier de
bloquer l'activité de ces enzymes (7)9, 8_0, 413); l'inhibiteur,
utilisé en conjonction avec une g-laetamine pourtant sensible à
l'action de la g-lactamase, permet de réaliser un traitement

adéquat (47 , 269 , 292) .
Le résultat de tous ces efforts constitue un vaste
ensemble d'antibiotiques dont chaque branche se distingue par
sa pharmacodynamie, par son spectre d'activité, ainsi que par

sa résistance aux g-lactamases (figure 1).
1985 -ŒFFÉTAZOLE CHLOROCARD1CINE
CEFTRIAXONE - -CÉFODIZIME
CÉFOPÉRAZONE - - CEFTAZIDIME
1980 -CEFSULODINE
CÉFOTAX1ME -
- CÉFOTI AM
CÉFADROXIL- NOCARD1CINE
CÉFACLOR- - CÉFUROXIME
1975 y-TALWPI CILLI NE
CÉFAMANDOLE-
■BACAMP1C1LLINE
-CÉPERADINE
CÉPHAPIRINE -
CARIIBACILLINE
- CÉPHACÉTRILE
CÉFAZOLINE-
1970 •SULBÉNICILLINE
FLUCLOXACILLINE
SÇT1CARC1LLINE-' ■CYCLOCILLINE
rPIVAMPlCILLINE
AZI DOC ILLINE CÉPHALEXINE
r AM0XYC1LLINE
1965 CÉPHALORIDINE-
CLOXACILLIIt V. •CÉPHALOTHINE
—OXAC1LL1NE V\
-NAFCILLIIC \
7-ACA
1960 NtMÉTVIICILLINE
PHÉNÉTHICILLINE
CÉPHALOSPORINE C
1955
PÉNICILLINE V
1950
1945 PÉNICILLINE 6
Penifii 11 h un chryvoqenum Cepha lor.porium Bactéries
Figure 1. L'évolution des (3-1 actamines (figure

adaptée de G.N. R0LINS0N, référence 305).
7
2.2. Structure et classification
Les B-lactamines ont toutes en commun un hétérocycle
azétidinone qui comprend une fonction lac tame (amide intra-
cyclique). Ce cycle peut être accolé à d'autres cycles et
porter une variété de radicaux. Des nomenclatures ont été
proposées afin de classer les B-lactamines utilisées c1 inique

ment ou présentement à l'étude ( 4^9, 3_S_). Les figures 2,3 et 4
illustrent les molécules caractéristiques de cette famille
d'antibiotiques. Les paragraphes suivants ont pour but de
mettre en évidence les principaux groupes de B-lactamines et
quelques membres représentatifs. Le lecteur peut consulter des

volumes spécialisés (9_7, 236 , 237 , 238 , 320) s'il désire des
informations plus complètes sur le sujet.
2.2.1. keiL n.iç.i 1.1 i.n e.s_
Le groupe des pénicillines a été étudié intensivement

(336, 339). La molécule de pénicilline est un produit de
condensation de la L-cystéine, de la D-valine et d'une chaîne
latérale acyle. Les résidus des deux acides aminés constituent
le noyau de toutes les pénicillines, l'acide 6-aminopénicilla-
nique (6-A PA). Sa structure de base est constituée d'un double
anneau azétidinone-thiazo1idine (figure 2-A). Le 6-APA est le
point de départ pour la synthèse de la plupart des pénicillines

(305). Les différences dans les propriétés biologiques et
pharmacologiques des diverses pénicillines sont principalement
tributaires de la chaîne latérale en position 6. Celle-ci peut
par exemple rendre la pénicilline résistante à la dégradation
par une B-lactamase, tolérante à l'acidité gastrique ou capable
de pénétrer l'enveloppe externe des bactéries à Gram négatif

(33, 38). Théoriquement, n'importe quelle chaîne peut être
liée par des moyens chimiques avec le noyau 6-APA pour former
une nouvelle pénicilline (336).
8
PÉNICILLINES
Pénici 11 i ne G
Méthicilli ne
Ampicilline
COOH Cloxaci11ine
Péname Méci11inam
Acide 6-amino-
pënicillanique
COOH
Témocilline
COOH
Sch 29482
Pénème COOH
Acide clavulanique
Clavame ou oxapéname COOH
Peu de molécules
de ce type ont été
décri tes
Clavème ou oxapénème
Peu de molécules
décri tes
Carbapéname
R,-OCH SCH=CHNH-R
Acide olivanique
Epithiénamycine
Carbapénème COOH
CH 3 CH
Thiénamycine
Imipénème
COOH
Figure 2. (3-lactamines dont le cycle azétidinone

est accolé à un pentacycle.
9
CÉPHALOSPORINES
Acide 7-amino-
céphalosporanique
COOH
Céphème
RrCHCONH
Céfamandole
Cefsulodine
COOH
R.-CONH a non-substituées
Cëphalothine
Cëfotiam
COOH
et aminées
Groupe 3 de
COOH
RrC-CONH
Ceftazidime
Cëfotaxime
Ceftriaxone
COOH
R,- CONH CÉPHAMYCINES

Cëphamycine C
Céfoxitine
CH,-R Cefmëtazole
COOH
,CHÇONH
COOH Moxalactam
Oxacéphème COOH
Peu de molécules
décrites
Carbacéphème
Figure 3. 6-1actaminés dont le cycle azëtidinone

est accolé à un hexacycle insaturé.
10
3 4
NOCARDICINES
Nocardicine A
COOH
Azétidlne-2-one
RrNH.
MONOPHOSPHAMES
OH
O-R,
RrNH,
MONOCARBAMES
conhso2-r3
MONOSULFACTAMES
MONOBACTAMES
NH2
Acide 3-amino-
bactamique
nso3h
Azthréonam
ch3ccooh
CH,
NH2 ch3
HOOC-CHCH CH,CONHCHCONH-
j—N
r
\
H
Suifazécine
so3h
Figure 4. 3-lactamines monocycliques.

11
2.2.2. _Lej3 céjghjîlosjsoj?ijies
De nombreuses molécules appartiennent à cette famille
des g-1actamines (262, 384). Les céphalosporines sont le pro
duit d'une condensation oxydative d'acétate, de L-cystéine, de
D-valine et d'acide a-aminoadipique. Leur noyau, composé de
l'anneau à fonction g-lactame fusionné avec un anneau dihydro-
thiazine, s'appelle l'acide 7-aminocépha 1osporanique (7 -A CA)
(figure 3-A). En général , des substitutions et des modifica
tions en position 7 altèrent l'activité antimicrobienne et le
spectre d'activité, alors que des modifications en position 3
résultent d'abord en un changement des propriétés pharmacociné

tiques et métaboliques (384).
Contrairement aux plus anciennes céphalosporines,
comme la majorité des céphèmes, les nouvelles molécules ont un
spectre d'activité élargi. Les propriétés de certains de ces
antibiotiques comme la ceftazidime, la ceftriaxone et la moxa-
lactame, leur permettent d'atteindre une proportion importante
de la flore y compris, bien sûr, les micro-organismes patho
gènes résistants aux molécules plus anciennes (34).
2.2.3. k'.âc_i.de. c:lavjjl_an_iq_ue_
L'acide clavulanique a été découverte alors que l'on
étudiait les produits de fermentation d'actinomycètes (290).
La structure chimique de ce composé ressemble à celle d'un
péname, à la différence qu'un atome d'oxygène remplace l'atome
de soufre sur l'anneau thiazolidine d'où le nom d'oxapéname

(figure 2-C). L'acide clavulanique ne possède qu'une faible
activité antibactérienne, mais il peut être un puissant inhibi

teur des g-1actamases (2 91, 416).
12
2.2.4. Les. ç.aj^fcmpj|nènms_
On compte plus d'une trentaine de molécules qui ap
partiennent à cette branche. Elles possèdent toutes un penta-
cycle insaturé avec un carbone en position 1 (figure 2- D ) . On
peut les diviser en quatre groupes selon la nature chimique de
leur chaîne latérale en position 6: isopropy1 e, isopropy1idène,
éthyle et thiénamycine. La thiénamycine fut le premier repré
sentant des carbapénèmes. Cette substance n'était pas adéquate
cliniquement à cause de son instabilité en solution concentrée
et à l'état solide. La synthèse du dérivé amidine, la N-

formimidoy1 -thiénamycine (imipénème) a permis l'utilisation à
des fins thérapeutiques d'un composé plus stable et avec des
propriétés antibactériennes supérieures à la thiénamycine

(171). On retrouve également dans cette branche les acides
olivaniques, chez lesquels on a mis en évidence des propriétés

inhibitrices des g -1ac tamases (80).
2.2.5. J.ejs J3-^la_ctjJmjinjis_moinocj£C_l i_gues_
Les g-lactamines monocycliques, aussi appelées mono-

lactames (_5J5) comprennent les nocardicines, les monophosphames,
les monocarbames, les monosu 1factames et les monobactames (fi
gure 4). La première molécule à appartenir à cette branche fut
la nocardicine A (12). Par ailleurs, les monobactames, pro
duits par des bactéries saprophytes (154, 365) et des actinomy
cètes (254), représentent un développement récent dans le champ
de recherche des nouvelles g-lactamines. Contrairement aux
pénicillines et aux céphalosporines, les monobactames naturels
possèdent une faible activité antibactérienne. On a ainsi dû
procéder à des modifications chimiques de leur structure afin
d'améliorer leur potentiel antibactérien (3_8, 71).

13
2.3. Mode d'action
L'étude des mécanismes d'action des 6-lactamines est
un vaste champ de recherches que nous tenterons de résumer
brièvement. Des revues détaillées sur le sujet ont été pu

bliées récemment (288, 357, 400).
Les g-lactamines exercent leur action antibactérienne
en interférant dans les stades finaux de la biosynthèse du
peptidog 1 ycan. Le peptidog1ycan est une molécule en forme de
filet (288) et un constituant important de la paroi cellulaire
de la plupart des bactéries (l_8_, 33). Il fournit une rigidité
à la paroi tout en protégeant le micro-organisme contre les
hautes pressions osmotiques à 1'intérieur de la cellule. Toute
interférence avec la synthèse ou l'hydrolyse du peptidog1ycan
conduit à la formation d'un réseau fragile qui échoue à fournir

le support nécessaire à la cellule (288).
Chez toutes les bactéries, à l'exception des myco

plasmes (217b), on retrouve sur la membrane cytoplasmique un
ensemble de 3 à 10 protéines différentes, de poids moléculaire
variant de 30,000 à 100,000. Ces protéines lient la péni
cilline de façon covalente (380). Quelques auteurs franco
phones les appellent PLP (protéines liant les pénicillines)
mais elles sont mieux connues sous le nom de PBP (penicillin
binding proteins).
Elles peuvent être séparées par électrophorèse et

détectées par des techniques autoradiographiques (356). Les
PBP sont impliquées dans la synthèse du peptidoglycan, la
régulation de la croissance cellulaire et la division cellu

laire (410). Elles catalysent principalement des réactions de
transglycosylation et de transpeptidation (7_) avec les enzymes
D-carboxypeptida ses et transpeptidases. On a même identifié

des PBP qui pourraient jouer un rôle bifonctionnel (193, 241).
Les PBP constituent la cible des effets des B-lactamines qui
varient de l'inhibition pure et simple de la croissance ce 11u-

14
1 ai re (incluant des altérations morphologiques comme la produc
tion de formes rondes ou de filaments (219)) à la mort et la
lyse de la cellule bactérienne (245). L'effet létal ou lytique
est une conséquence secondaire de l'inhibition de l'assemblage
de la paroi cellulaire et il implique un groupe de protéines
appelées autolysines (347).
Le mécanisme d'action des g-lactamines implique l'a
cylation d'un résidu sérine du site actif des peptidases (117 )
pour former un intermédiaire enzyme-antibiotique relativement
stable, et qui empêche l'accès du substrat naturel au site

actif (407). Tipper et Strominger (378) ont suggéré que la
pénicilline serait un analogue de structure du substrat des
transpeptidases et des carboxypeptidases, le dipeptide D-
a 1 any 1-D-a 1 an i ne. La comparaison des modèles moléculaires
tridimensionnels de la pénicilline et du constituant dipeptidi-
que du peptidoglycan a montré des similitudes significatives

entre les deux (401). Bien que l'hypothèse précédente ait été
vérifiée pour les D-carboxypeptidases de faible poids molécu
laire, on n'a pas encore prouvé sa validité pour les PBP à
poids moléculaire élevé qui sont les cibles létales de la
pénicilline (357).
Des études de la conformation spatiale des atomes ont
démontré que le lien g - 1ac tame des pénicillines et des céphalo
sporines doit être intact pour manifester une activité antibac
térienne (288). La découverte récente des g-lactamines monocy
cliques a permis de confirmer l'affirmation précédente et
d'infirmer le pré requis qu'une structure bicyclique est essen

tielle pour obtenir une activité biologique (3JL, _LL> 122, 407 ).
L'activité d'une B-laetamine particulière pour chaque PBP
dépend de sa taille, de la distribution spatiale des atomes qui
la constituent, ainsi que de la charge des chaînes latérales
sur le noyau g -lactame (277).
On a entrepris récemment des études crystallographi-
ques aux rayons X de la structure moléculaire des g-1actamases

15
(57., 69., 99., 239) , des B- lactamines (288) et des PBP (178).
Les connaissances acquises dans ce domaine permettront de des
siner de nouveaux antibiotiques qui pourront inactiver des PBP
essentielles sans être reconnus et détruits par les B-lacta

mases ( TjS ).
16
3. LA RESISTANCE BACTERIENNE AUX BETA-LACT AM I NE5
Dans les dernières décennies, les multiples efforts
déployés pour combattre les bactéries pathogènes ont permis au
corps médical de compter sur une variété d'antibiotiques pour
traiter les infections. Néanmoins, l'incidence des micro
organismes résistants n'a cessé de croître depuis l'avènement
des antibiotiques (92). On a notamment impliqué l'usage répan
du et parfois irrationnel des antibiotiques pour expliquer
l'augmentation des bactéries résistantes (200, 203, 297).
D'une façon générale, un antibiotique doit, pour être
efficace, agir sur une ou plusieurs cibles dans la cellule
bactérienne, atteindre des cibles en concentration suffisante
et éviter l'inactivation due à des substances produites par la

cellule (296). Pour affecter les bactéries, les 3-1 actamines
doivent traverser les enveloppes externes à la surface de la
cellule, doivent posséder une affinité pour les protéines im
pliquées dans la synthèse de la paroi cellulaire et enfin,
éviter la destruction par les B-lactamases (243).
3.1. Structure de 1a paroi
Afin de mieux comprendre les mécanismes responsables
de la résistance bactérienne aux g-lactamines, il apparaît
important de décrire succintement la structure de la paroi
cellulaire bactérienne.
3.1.1. j3 ajc tj| r^Leja Çjr a/n^n^gja M ve^s_
Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi est
composée de plusieurs couches superposées (figure 5-A). Un
antibiotique doit d'abord traverser la membrane externe compo
sée de lipoprotéines, de lipopolysaccharides, de phospholipides
et de protéines. La membrane externe peut être considérée
comme une double couche hydrophobe parsemée de canaux (porines)

17
A- Bactéries gram-négatives
PROTÉINE
PORINE
PHOSPHOLIPIDS
MEMBRANE
EXTERNE LIPOPOLYSACCHARIDE
LIPOPROTÉINE
ESPACE
PÉRIPLASMIQUE PEPTIDOGLYCAN
BÊTA-LACTAMASE
hEMBRANE
CYTOPLASMIQUE
m ? ? fi ? « PBP
PROTÉINE DE
TRANSPORT
B- Bactéries gram-positives
BÊTA-LACTAMASE
HYDRATE DE CARBONE
CAPSULE PROTÉINE
PEPTIDOGLYCAN
MEMBRANE
CYTOPLASMIQUE mnRRmmmfljam— PHOSPHOLIPIDS
6 6 U ü> & b otf o o o o o o olf o 0 <>

PROTÉINE
Figure 5. Structure de la paroi bactérienne.

18
et de polysaccharides hydrophiles. La double couche est ancrée
à des points spécifiques au peptidoglycan sous-jacent. Une
molécule d'antibiotique, ou toute autre molécule n'utilisant
pas un système de transport spécifique, est forcée d'ouvrir une
brèche dans cette barrière pour atteindre sa cible. Deux voies
sont possibles. La première est hydrophile: on pense que la
majorité des g-lactamines empruntent les porines constituées
d'un canal rempli d'eau et qui donne accès à l'espace périplas-

mique (253, 325, 426). La seconde, utilisée par des antibioti
ques hydrophobes, emprunte la double couche de phospholipides
hydrophobes. On a démontré que certaines pénicillines, dont

l'ampicilline, préfèrent cette route (420, 421). Les deux
voies présentent cependant des contraintes à la perméabilité
des molécules. Des facteurs comme la taille et la conformation
des molécules d'antibiotiques, ou la distribution des charges
sur les couches externes de la membrane, peuvent limiter
l'accès à une quantité suffisante d'antibiotique vers les
cibles (126, 148, 253). Dans l'espace périplasmique, on
retrouve les protéines cibles (PBP) et les g-lactamases. Ces
dernières peuvent inactiver les g-lactamines qui sont parvenues
dans l'espace périplasmique, avant même qu'elles ne puissent se
fixer sur les PB P.
3.1.2. B.a.£tj|r-!e_s Hra.m^po^s_i t_ivj3S
Le problème de perméabilité est presqu'inexistant
chez les bactéries à Gram positif, puisqu'il n'y a pas de

membrane externe (figure 5-B). La couche de peptidoglycan est
cependant plus épaisse, mais elle n'empêche pas la diffusion de
l'antibiotique vers les protéines cibles sur la membrane cyto
plasmique (300). La g-lactamase peut quitter la cellule et
détruire l'antibiotique dans le milieu extracellulaire.
3.2. Aspects génétiques
D'un point de vue strictement génétique, les mécanis
mes de résistance peuvent être soit naturels, soit acquis. La

résistance naturelle, aussi appelée résistance intrinsèque, est
commune à une majorité de souches d'un même groupe de bactéries

(125, 300). Par exemple, la résistance naturelle des bactéries
à Gram négatif est due à la présence d'une g-lactamase, mais
surtout à la structure relativement imperméable de leur paroi
cellulaire qui ralentit la diffusion des molécules d'antibioti
ques vers leurs cibles (300). C'est le cas notamment de Pseu
domonas aeruginosa chez qui la faible pénétration à travers la
membrane externe le rend hautement résistant à la plupart des
g-lactamines (11, 126, 196). On a également invoqué chez cette
espèce une faible affinité de PBP pour les g-lactamines (304)
quoique d'autres travaux soutiennent le contraire (357, 428).
Au contraire, chez les micro-organismes gram-positifs, les g -
1actamines n'ont généralement qu'à traverser la couche du pep
tidoglycan pour atteindre les PBP. Cette couche ne semble pas
barrer l'accès à des molécules de la taille des antibiotiques,
à moins qu'il n'y ait du matériel capsulaire (glycocalyx) (277)
qui de toute façon n'influencerait que marginalement leur dif
fusion. Baci1 lus meqaterium échappe cependant à la règle (70).
Néanmoins, la présence d'une g-lactamase chez les Staphylococ

cus (203) ou le manque d'affinité des PBP pour les g-lacta
mines chez les entérocoques (114, 412) constituent des exemples
de résistance naturelle des bactéries gram-positives.
La résistance acquise est une conséquence de la sé
lection sous la pression des antibiotiques. Une bactérie peut
acquérir une résistance par mutation qui affectera par exemple
un facteur intrinsèque (35, 106). On verra plus loin que
plusieurs mécanismes de résistance sont tributaires des muta
tions. L'acquisition par une bactérie d'une information géné
tique nouvelle sous forme de plasmides de résistance constitue
de loin le facteur primordial (245). Les plasmides sont pré
sents chez presque toutes les espèces de bactéries et sont
largement distribués dans la nature (246). La résistance p 1 as-
mi d i q u e peut s'illustrer par la synthèse d'une g-lactamase

( 301), quoiqu'elle puisse également entraîner une modifie
de la perméabilité de la paroi (152, 153).

20
3.3. Mécanismes de résistance
La résistance des bactéries aux g-lactamines est

connue depuis 1940 ( 3_) • Cependant, la découverte de bactéries
porteuses de résistances multiples au Japon à la fin des années

cinquante (393) a pour ainsi dire ouvert la voie à l'étude des
mécanismes de résistance. Les facteurs qui déterminent la
résistance des bactéries sont multiples, si bien que l'on
reconnaît aujourd'hui quatre mécanismes distincts de résistance

bactérienne aux g-1actamines (125).
3.3.1. B.aJLriè.re_de per_mj|ajDi_li_té_
On a vu auparavant que cette barrière peut prévenir
l'accès d'une quantité suffisante d'antibiotique vers les PB P.

Des souches mutantes déficientes en porines (158, 159, 228) ou
dont le contenu en lipides de la paroi est modifié (205, 326)
atteignent des niveaux de résistance accrus.
3.3.2. üojliJLi-CaJLio.ns. de_lji ç.i.ble.
Ce mécanisme de résistance implique généralement une
réduction de l'affinité des molécules cibles pour l'antibioti
que. On peut mentionner à titre d'exemple les souches de
Staphylococcus aureus où la méthicilline peut induire la syn
thèse d'une PBP supplémentaire qui possède peu d'affinité pour
les 6-lactamines et qui rend les cellules résistantes à ces

antibiotiques ( 313, 3 8 5 b). Des altérations de PBP ont été
observées tant pour les bactéries à Gram positif (121, 243,
411) que pour les bactéries à Gram négatif (_8_9_, 228, 355).
L'émergence de ce type de résistance chez des souches cliniques
qui sécrètent peu ou pas de g-lactamase illustre bien la facul
té d'adaptation des bactéries et il pourrait bien être une

cause commune de résistance dans le futur (357).
21
3.3.3. To_léra_nce^
Parmi les propriétés remarquables des g-lactamines,
le pouvoir bactéricide est l'une des plus importants. Des
concentrations voisines de g-lactamines permettent d'inhiber la

croissance d'une bactérie ou de la tuer in vitro (179). Les
auto lysines du peptidog1ycan agissent comme médiatrices de la

mort cellulaire après exposition aux g-lactamines (379). Les
bactéries dont la fonction autolytique est déficiente demeurent
sensibles à l'antibiotique, mais peuvent néanmoins survivre en
sa présence. Tomasz et ses collègues ont appelé ce phénomène

tolérance (381).
Par définition, une souche tolérante montre une di
vergence entre l'activité inhibitrice et l'activité bactéricide
de l'antibiotique, de telle sorte que la concentration minimale

bactéricide (CMB) divisée par la concentration minimale inhibi
trice (CM I ) est plus grande ou égale à 32 (247, 313). Cepen
dant, dans une publication récente sur le sujet (277), on
reconnaît que cette définition ne fait pas 1 'unanimité et que
le rapport CMB/CMI peut varier de 8 à plus de 64. La tolérance
se manifeste de plus en plus fréquemment en clinique, particu
lièrement chez des bactéries à Gram positif dont les staphylo
coques (313) et les streptocoques (134, 179). Elle s'illustre
par des infections prolongées lorsqu'une thérapie à dose nor

male, mais trop faible, est utilisée (213).
3.3.4. üé_si.st _ance_ejnzxroa.t i.qHe_
Trois catégories d'enzymes bactériennes peuvent réa
gir avec les g-lactamines avant qu'elles puissent accéder aux
protéines cibles.
3.3.4.1. Les g-lactamases
Elles catalysent l'hydrolyse du lien g-lacta me des

pénicillines et des céphalosporines (figure 6). Cette réaction
22
Céphalosporines
O
11
COOH
ACYLASE
ESTERASE
B-LACTAMASE
COOH
R-C-NH
O
Pénicillines
Figure 6. Les enzymes hydrolytiques des 3-1actamines.

23
irréversible détruit le site de l'activité antibactérienne.
Ainsi jouent-elles un rôle très important dans la résistance
clinique aux antibiotiques (267, 301, 367). Nous les étudie
rons plus en détail au point 4. Il est cependant opportun de
mentionner qu'en plus de leur fonction hydrolytique, des au
teurs ont postulé que les g - 1ac tamases peuvent bloquer l'accès
des R BP à certaines g-1actamines par un mécanisme appelé bar

rière non-hydrolytique (367) ou "trapping" (374). Ce type de
résistance affecterait principalement les céphalosporines

stables aux g-lactamases ( .5 _3 , 270 , 2 80 , 3_21_, 323 ) . On
l'observe particulièrement chez les bactéries à Gram négatif

qui possèdent une g -1actamase inductible (12 8, 129). Celle-ci
est déréprimée de façon stable par mutation ou de façon réver

sible par l'antibiotique qui agit comme un inducteur (130, 204,
321). La résistance aux nouvelles céphalosporines serait ainsi
causée par une production accrue de g - lactamases qui vont lier

les molécules d'antibiotiques en un complexe stable (270). En
condition d'excès d'enzymes, il serait peu probable que l'anti
biotique puisse atteindre les P BP en quantité suffisante (322).
Vu et Nikaido (393) ont récemment mis en doute la théorie du
"trapping". D'après eux, la résistance des bactéries aux 6 -
lactamines à spectre large s'expliquerait davantage par un
mécanisme hydrolytique: la g -1ac t amase qu'ils ont étudiée peut
inactiver, quoique lentement, les molécules d'antibiotiques
ayant franchi la barrière de perméabilité.
3.3.4.2. Les estérases
Les estérases (364), aussi appelées acylesté rases
(2 33), acéty1 esté rases (2 67) ou hydrolases d'ester carbox y 1i-
ques (84), hydro 1ysent le groupement acétoxyméthyle en position
3 de l'anneau dihydrothiazine de certaines céphalosporines
comme la céphalosporine C (37) (figure 6). Une fois transformé
en désacéty1-cépha1osporine, l'antibiotique possède une activi
té antibactérienne réduite (364). Les estérases sont largement
distribuées dans la nature (387). Elles ont été isolées chez
des bactéries (1^, 3J7 , 2 3 3), des actinomycètes ( 9_8_) et des

24
champignons (260). Ces enzymes ne constituent pas un facteur
important dans la résistance aux g-lactamines des bactéries

pathogènes (267).
3.3.4.3. Les acylases
Cette classe d'enzymes a été particulièrement bien
étudiée à cause du rôle qu'elle joue dans la fabrication de 6 -
lactamines semisynthétiques (212, 388). Les acylases sont
connues sous une variété d'appellations: pénicilline amidase,
pénamidase, pénicilline G acylase, "penicillin splitting and
synthesizing enzyme" , acy11ransférase , pénicilline déacylase,
pénicilline acylase, pénicilline G amidohydro1ase (138); amido-
hydrolase (296); amidase (364). Elles ont la propriété de
rompre par hydrolyse le lien peptidique par lequel le groupe
ment latéral acy1e en position 6 de la molécule de pénicilline
est relié au noyau 6-APA (figure 6). Pour les céphalosporines,
l'enzyme agit en position 7. Dans un cas ou dans l'autre,
1 ' acy1ase réduit l'activité biologique de l'antibiotique sans

complètement l'inactiver (9_i, 10 3, 137, 296). Dans certaines
conditions, l'action de l'enzyme est réversible (387).
Les micro-organismes capables de synthétiser une acy
lase sont nombreux et se distribuent tant chez les bactéries et

les actinomycètes, que chez les levures et moisissures (387).
Une des premières classifications considérait les acylases

fongiques (type I) et les acylases bactériennes (type II)
séparément (138). Aujourd'hui, on distingue les acylases selon
leur origine et la spécificité de leur(s) substrat(s): les
pénicillines acylases microbiennes (3 types), les céphalospo
rines acylases microbiennes et les pénicillines acylases non-

microbiennes (389).
Les propriétés biochimiques particulières des acy
lases, comme une faible affinité pour leurs substrats, une
activité optimale à pH alcalin et un pouvoir antibactérien du
produit de la réaction expliquent en partie le rôle négligeable

25
de ces enzymes dans la résistance bactérienne (138, 267, 296).
3.3.5. Conclusion
En résumé, 1'émergence de la résistance aux g-lacta-
mines a considérablement réduit la valeur d'antibiotiques qui
étaient auparavant efficaces contre des espèces comme Entero-
bacter, Serratia, Citrobacter, Pseudomonas ou Staphylococcus.
Ces micro-organismes comme d'autres, réussissent à tenir en
échec les moyens entrepris pour les contrôler afin d'assurer
leur survivance. Il est possible que des mécanismes d'adapta
tion encore inconnus puissent apparaître dans l'avenir en ré
ponse à l'introduction de nouvelles molécules (187).

26
4. LES BETA-LACTAMASES
4.1. Définition
Ainsi que nous l'avons vu précédemment, les B -lacta

mase s [pénicilline (céphalosporine) g - 1actame amidohydrolases,
EC 3.5.2.6 3 hydrolysent le lien g- lactame des pénicillines et
des céphalosporines susceptibles pour donner un produit biolo
giquement inactif (figure 6). Les produits d'hydrolyse des
pénicillines, les pénici11oates, sont stables et peuvent être
facilement détectés (364, 361), Puisqu'ils portent un groupe
ment acide de plus que la molécule mère, on les retrouve par

fois sous l'appellation d'acides pénicil lo'iques. Par contre,
les cépha1osporoates issus de l'hydrolyse des céphalosporines

sont des intermédiaires instables (142). Ils subissent par
conséquent d'autres étapes de dégradation en fonction de la
nature du radical chimique en position 3 (249). Il est par
conséquent difficile de les détecter. Quant aux autres molé
cules qui contiennent un anneau g -1actame (comme les céphamy-
cines, les clavames, les oxacéphèmes, les carbapénèmes et les
monobactames), la plupart sont considérés comme des substrats
potentiels pour les g-lactamases. En outre, certaines de ces
nouvelles molécules semblent être hydro 1ysées par une variété

de g-lactamases (225), mais l'identification des produits d'hy
drolyse n'a pas encore été réalisée (366).
4.2. Mécanisme d'action
A l'aide de dérivés halogénés de la pénicilline comme
l'acide 6-g-bromopénicillanique, on a démontré qu'une sérine
était responsable de l'attaque du cycle g-lactame ((7(7, 186).
Cette attaque provoque l'ouverture de l'anneau pour former une
acy1-enzyme. Chimiquement, 1'acy1-enzyme est dérivée du grou
pement a-carboxyle de l'acide pénicilloïque et du groupement
hydroxyle de la sérine. C'est l'hydrolyse de l'ester de sérine
et non l'ouverture du cycle g-lactame qui constituerait l'étape

limitative de la réaction (18 5). En outre, malgré leur re 1 a
27
ti v e spécificité envers des composés à cycle g-lactame, les
g-lactamases possèdent un site actif assez souple leur permet
tant de s'adapter à une vaste gamme de substrats (5_9, 12).
Les B-lactamases de Staphylococcus aureus (6_4) , de
Bacillus cereus type I (186) et TEM (110 ) possèdent toutes un
site actif où la sérine joue un rôle prédominant. Par exemple,
la substitution de la sérine du site actif par la thréonine
rend l'enzyme TEM totalement inactive ( 90). Ces B-lactamases
montrent aussi une homologie de la séquence des acides aminés

(_8). Par ailleurs, on a isolé des acy 1-enzymes chez Enterobac-
ter c 1 oacae P99 (4_0, 168), Pseudomonas aeruginosa et Escheri
chia coli K12 (184, 186). La séquence peptidique de ces B-
lactamases chromosomiques est voisine mais elle diffère consi
dérablement des trois premières (4JD, 185). S'il semble que les
g-lactamases soient toutes des sérine-enzymes, la B-lactamase
II de Bacillus cereus échappe néanmoins à la règle. En plus,

elle diffère des autres par un besoin d'ion Zn++ et par une
absence d'homologie de la séquence d'ADN (144).
4.3. Propriétés générales
Les B-lactamases sont présentes dans une grande di
versité de familles et d'espèces microbiennes, notamment chez
les bactéries à Gram positif (_5, ^2, 101), les bactéries à Gram
négatif (119, 369), les actinomycètes (100, 267, 394), les
mycobactéries (176), les levures (227) et les cyanobactéries
(201). Elles possèdent des poids moléculaires variant de
12,000 (223) à 186,000 (391). En dépit de leur spécificité
pour les composés à cycle B-lactame, les profils d'activité
mesurés sur les pénicillines et les céphalosporines montrent
une certaine diversité. Les profils enzymatiques varient de la
"pénici11inase" à la "cépha1osporinase", avec toute une gamme
d'intermédiaires (301).
L'information génétique peut être portée par le chro
mosome, par un plasmide ou un transposon (225). La synthèse de

28
la protéine est généralement constitutive pour les g-lactamases
plasmidiques et peut être inductible pour plusieurs g-lacta

mases chromosomiques (301, 367). Les études des mécanismes
génétiques de régulation de la synthèse ont porté surtout sur
les espèces Staphy1ococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus
1 ichenif ormis (133) et chez les entérobactéries, sur Escheri
chia coli (161), Enterobacter cloacae (129) et Citrobacter
freundii (328, 422 ). Depuis les travaux d'Ambler ( 9_) sur la
séquence en acides aminés des g-lactamases, on a récolté de
nombreuses informations sur la structure du gène actif, 11 homo
logie des séquences et la nature de la séquence "signal". La
présence de celle-ci, aussi appelée peptide de tête, a été
remarquée chez toutes les g-lactamases étudiées jusqu'à présent

(230). De nature hydrophobique et comportant environ 25 acides
aminés (16), elle facilite l'exportation de la protéine vers la
membrane (93). La séquence est coupée avant ou juste après le
passage de la protéine à travers la membrane (215). La g -
lactamase est une enzyme périp 1 asmique chez les bactéries grain-
négatives. Quant aux micro-organismes gram-positifs, on peut
retrouver une forme de g-lactamase hydrophobe liée à la mem
brane ainsi qu'une exoenzyme hydrosoluble, toutes les deux
produites par le même gène (250).
4.4. Rôle dans 1a résistance
Le rôle des g-lactamases dans la résistance des bac
téries pathogènes aux g-1actamines est un sujet très controver
sé et qui doit être réévalué très souvent à cause de l'évolu
tion rapide des connaissances. Par ailleurs, l'activité d'une
g-laetamine particulière sur une souche bactérienne donnée est
souvent le résultat d'une combinaison complexe de facteurs

(voir point 3) dans lesquels la g-lactamase peut jouer une
variété de rôles (225, 298). Sabath (315) a proposé une vision
simplifiée de ce sujet; un micro-organisme produit une g-
lactamase qui inactive l'antibiotique avant que l'antibiotique
n'ait causé des changements irréversibles dans la cellule bac
térienne .
29
Les 6-lactamases des bactéries à Gram positif sont
principalement extracellulaires (267) et peuvent être produites
en grande quantité (73). Par exemple, des souches de 5 taphy1o-
coccus aureus isolées en clinique peuvent synthétiser jusqu'à
0.3% de leur poids sec en pénicillinase et davantage chez
Bacillus cereus et Bacillus licheni formis. Ces deux caracté
ristiques combinées expliquent que la résistance dans leur cas

est un phénomène de population (367): les g-lactamases sont
excrétées dans l'environnement extérieur où elles vont détruire
les 6-1 actamines à des niveaux en deçà d'une concentration
critique. Cette action permettra la croissance des cellules
bactériennes du milieu, qu'elles sécrètent ou non des 6-lacta

mases (123). Cependant, si la quantité d'enzyme sécrétée est
trop faible ou que le facteur de dilution est trop grand, les
cellules sensibles risquent fort de subir des modifications
irréversibles causées par l'antibiotique (296, 313). Dans ce
contexte, les 6-lactamases membranaires pourraient constituer
une deuxième ligne de défense contre les 6-lactamines qui
auraient traversé la paroi (39).
La résistance due aux 6-lactamases chez les bactéries
à Gram négatif est plutôt un phénomène propre à chaque cellule

(123). L'enzyme est localisée dans l'espace périplasmique
entre les membranes interne et externe (300, 367), et l'inacti
vation survient à ce site. Cette localisation est stratégique
puisque la 6-lactamase est placée sur le chemin que les anti
biotiques doivent emprunter à partir de 1'extérieur de la
cellule, vers les protéines cibles (2 96). En outre, les bacté
ries gram-négatives produisent en général moins de 6-lactamase
par cellule (moins de 0.005% du poids sec) que les gram-posi
tives (301). L'inactivation des 6-lactamines est fonction des
caractéristiques enzymatiques des 6-lactamases concernées (Km,
Vmax) aussi bien que de la concentration relative de l'enzyme
et du substrat (140). La plupart des micro-organismes à Gram
négatif qui montrent une résistance clinique significative la
doivent à la production d'une deuxième B-lactamase (301) à
partir d'un gène plasmidique ou d'un transposon (245 , 246) .

30
Ces deux éléments jouent un rôle considérable dans l'épidémio
logie de la résistance. Les plasmides peuvent être transmis
d'une souche bactérienne résistante à une souche sensible. La
transmission peut être tant intra-spécifique qu'inter-spécifi-
que (293). Les transposons sont tout aussi infectieux puis
qu'ils peuvent faciliter le transfert de matériel génétique
d'un plasmide à un autre, entre plasmides et chromosomes, ou
bien entre plasmides et bactériophages (225, 299).
4.5. Classification
La classification des B-lactamases a été rendue
nécessaire lorsqu'on s'est aperçu de la diversité des protéines
appartenant à cette famille d'enzymes. Matthew et Harris (224)
ont reconnu que les B- lactamases sont spécifiques de genres,
d'espèces et de sous-espèces bactériennes. A ce niveau, une
distinction précise ne peut être obtenue qu'en comparant le
plus de paramètres biochimiques et biologiques possibles (85),
et impliquerait des subdivisions basées sur la taxonomie bacté
rienne. Les classifications actuelles tendent au contraire à
regrouper des enzymes possédant un certain nombre de critères
communs. Les principales propriétés utilisées pour classifier
et différencier les B-lactamases comprennent le profil de sub
strat (l'activité relative envers les B-1actamines), 1'interac
tion avec des inhibiteurs, la nature du gène codant pour la G-
lactamase (chromosomique, plasmidique, transposon), le point
isoélectrique, le poids moléculaire, la parenté immunologique,
la séquence en acide aminés et la nature du site actif.
Historiquement, on a considéré séparément les B-

lactamases des bactéries gram-positives et gram-négatives.
Cette distinction s'explique en partie par la moindre diversité
des B-lactamases du premier groupe par rapport au second. Le
tableau 1 illustre les B-lactamases des bactéries à Gram posi
tif. Les B-lactamases de Staphylococcus aureus sont identiques
bien que l'on distingue quatre types sérologiquement diffé
rents. Les caractéristiques enzymatiques et génétiques des B-

ORIGINE PROFIL DE SUBSTRAT Km Pour
BETA-LACTAMASE SYNTHESE PENI (M) Pi P.M. REMARQUES RCF.
GENETIQUE
PENI AMPI METH COIN
6 x 10'5
Bacillus cereus type I C I 100 194 4 1 -9.5 28,000 372
3.3 x 10""3
Bacillus cereus type II C I 100 47 120 18 -8.7 22,500 requiert du zinc 372
1.8x 10"4
Bacillus cereus type III C - 100 71 66 12 -6.8 31,500 2 formes : lipoprotéine mem 83, 251
branaire et exopénici 11inase
4.9 x 10"5
Bacillus licheni formis C I 100 68 0.5 36 5.0 29,500 156, 283
749/C 373
9.5 x 10"6
Bacillus licheni formis C I 100 12 1 165 28,000 283, 373
6346/C
5 x 10"6
Staphylococcus aureus type A P I 100 185 1.5 10 8.9 29,600 294, 295
12 x 10"6
Staphylococcus aureus type B P I 100 - 1.5 - 8.9 29,600 294, 295
7.5 x 10"6
Staphylococcus aureus type C P I 100 - 0.6 - 8.9 29,600 294, 295
Staphylococcus aureus type D P NI 100 - - - - 8.9 29,600 309
Clostridium Clostridii forme C ? ~I 100 88 - 2 - - ~21,000 inhibée par le pCMB 94, 402
Clostridium ramosum C + P ? I 100 255 - 100 - - inhibée par le pCMB; pi : 94, 402
a) 7.0 - 8.0, b) 5.7
Clostridium butyri cum C ? ~I 100 150 21 4 - -4.1 214

- 91 40 20 - -82,500 inhibée par le pCMB 145
Streptococcus faecalis P - - - - - - - - 240
LEGENDE: C = chromosomique PENI = pénicilline Pi = point isoélectrique

P = plasmidique AMPI = ampicilline P.H. = poids moléculaire
I = inductible METH = méthici 11 ine REF. = références
-I = légèrement inductible COIN = céphaloridine
NI = non inductible
Tableau 1. Les B-lactamases des bactéries à Gram positif

(actinomycètes exceptés ). CO
32
lactamases de Clostridium et 5 treptococcus sont vagues et in
complètes. Les 3-lactamases de Baci1 lus ont peu ou pas d'impor
tance clinique. Les 3 - lactamases des actinomycètes sont dé
crites au tableau 2. La classification des 3-lactamases de
5 treptomyces est tirée de la revue d'Ogawara (2 67).
La classification des 3-lactamases des bactéries
gram-négatives comporte une grande variété d'enzymes avec des
spectres d'activité très variables. D'ailleurs, l'importance
médicale et la fréquence élevée des infections causées par ces
bactéries justifient le nombre important de travaux qui leur
ont été consacrés. Les premières tentatives de classification
(14, 157, 327) reposaient surtout sur le profil de substrat.
La classification de Richmond et Sykes publiée en 1973 (301)
constitue, encore aujourd'hui, la classification de référence

des 3-lactamases des espèces bactériennes à Gram négatif (59,
364). On y retrouve 15 types enzymatiques répartis en 5 classes
basées sur le profil d'activité et la nature des inhibiteurs.
La classification de Sykes et Matthew (367) est une version
simplifiée de la précédente fondée sur les caractéristiques
génétiques et l'affinité des 3-lactamases envers les deux prin
cipales familles de 3-lactamines. D'autres revues ont par la
suite proposé des mises à jour des connaissances comme celles

de Sykes et Smith (369), de Mitsuhashi e_t a_l. (23 3), de Matthew
(223), et plus récemment de Medeiros (225). Cette dernière est
particulièrement utile puisqu'elle fait le point des connais
sances actuelles sur les 3-lactamases extrachromosomiques.
L'auteur y évalue plusieurs 3-lactamases de plasmides et de
transposons récemment décrites. Le tableau 3 résume les prin
cipales caractéristiques des 3-lactamases des bactéries gram-
négatives. Il a été établi à partir des revues précédentes
(225, 301, 367, 369) et complété avec des travaux récents (31,
85, 102, 108, 118, 146, 207 . 208, 217 , 226 , 231, 256. 318, 319,
338. 350).
Une nouvelle classification a été proposée en 1980.
Basée sur la taille, le profil de substrat, mais surtout l'ho-

PROFIL DE SUBSTRAT P°ur
BETA-LACTAMASE Pi P.M. REMARQUES REF.
PENI (pM)
PENI AMP1 CARB CL0X METH COIN CFIN CZ0L
Streptomyces sp. Y-74 100 31 20 0 14 3 2 2 8.6 m 22,000 classe 1 267

S. cellulosae S-127 100 43 28 3 4 1 1 0 8.2 8.7 m 25,000 h
S. rimosus Y-114 100 53 15 1 9 2 0 3 - 8.8 m 25,000 »

Streptomyces E 750-3 100 28 13 5 0 2 - - 1.9 8.3 m 20,000 "
S. thioluteus Y-29 100 49 25 19 13 0 0 2 0.37 7.4, 8.1 m - M
S. phaechromoqenes 100 21 26 2 6 6 4 0 - 6.4 m 32,000 classe 2

S. 1avendulae S-55 100 27 3 0 2 0 0 0 5.5, 7.0 25,000
S. fradiae Y-59 100 51 14 3 3 0 0 0 - 5.5, 7.0 22,000 M
S. qouqeroti S-136 100 43 26 1 3 5 8 19 - 5.7 m 24,000 classe 3

S. di astati eus S-128 100 33 27 10 11 5 6 24 3.1 6.2 24,000 il
S. coeli col or S-6 100 119 7 0 0 2 0 24 4.3 5.1 25,000 classe 4

S. cacaoi S-352 100 23 54 33 100 4 0 2 0.62 5.1 32,000 classe 5
Actinomadura R-39 100 525 40 30 28 - 56 - 0.065 5.0 15,200 100
Rothia dentocariosa 100 73 41 - - - - - - - - céphalosporinase plasmidique 232
Mycobacterium phlei 100 - - - >1 285 47 - intrace1lulaire 176

M. fortuitum 100 - - - >1 156 116 - 570 - - il
M. kansasii 100 - - - 32 65 16 - - - - „
M. smeqmatis 100 92 42 - - 128 46 250 71 - 29,000 synthèse constitutive 173

M. tuberculosi s 100 - - " >1 187 67 - 2500 - - 176
LEGENDE: PENI = pénici 11ine G CARB = carbénicilli ne pi = point isoélectrique

AMPI = ampicilline COIN = céphaloridine P.M. - poids moléculaire
CLOX = cloxacilline CFIN = céphalothine REF. = références
METH = méthici 11ine CZOL = céfazoline m = bande majeure
Tableau 2. Les 6-1actamases des actinomycètes.

INHIBITION CLASSIFICATION
NATURE DU GENE PROFIL D'ACTIVITE SYNTHESE Ri P.M. DISTRIBUTION DE
pCMB CLOX RICHMOND & SYKES
Céphalosporinase I ou C R S 3.9 a 9.9 20,000 a Cette classe regroupe la grande majorité I

des bêta-lactamases chromosomiques que
44,000
l'on retrouve chez la plupart des espè
ces gram-négatives étudiées (1).
Chromosomique Pënici 11inase I ou C R S ou R 6.8 â 8.4 15,000 a Proteus; Pseudomonas thomasii et Pseudo- II
118,000 monas mal tophi lia LI ; Legionella; Aero-
monas hydrophi lia et Aeromonas lique-
faciens.
Spectre large C S ou R S ou R 4.8 à 7.5 17,000 a Klebsiella sp.; Bacteroides fragilis; IV

Branhamella catarrhal is.
26,000
Pénici11inase C S ou R S 5.4 à 8.1 17,000 a TEM-1; TEM-2; SHV-1 ; HMS-1; ROB-1 ; III
(spectre large) 44,000 LCR-1 ; BRO-1 ; TLE-1 ; "TEM-1ike".
Oxaci11inase C S ou R R 7.1 â 7.8 23,000 a OXA-1; OXA-2; OXA-3; OXA-4; OXA-5; V

Plasmidique
44,600 OXA-6; OXA-7; "OXA-1ike".
ou
Transférable
Carbénicillinase C S ou R R 5.7 à 6.9 12,000 à PSE-1; PSE-2 ; PSE-3; PSE-4; AER-1. V
32,000
Céphalosporinase C R R 8.1 36,200 CEP-2 ?
LEGENDE: I = inductible R = résistant pCMB = p-chloromercuri benzoate

C = constitutive S = sensible CLOX = cloxaci11ine
Tableau 3. Les B-lactamases des bactéries à Gram négatif.

CO
35
mologie des séquences d'acides aminés, les travaux d'Ambler (8_)
puis de Oaurin et ses collègues (3_0, 160) ont permis de regrou
per les B-lactamases en trois classes moléculaires. Elle fut
précisée davantage à la lumière du mécanisme d'action de la
protéine enzymatique (185). Cette classification, illustrée au
tableau 4 ne fait pas de distinction entre les B-lactamases des
micro-organismes à Gram positif et à Gram négatif.
La classe A comprend des enzymes qui partagent beau
coup d'homologie entre elles. Les B-lactamases chromosomiques
d e Bacillus licheni formis 749/C et de Bacillus cereus type I
ont 60% d'homologie et possèdent une certaine parenté immunolo
gique (5_); les deux ont environ 40% d'homologie et aucune
parenté immunologique avec la B-lactamase plasmidique de Sta

phylococcus aureus PCI (368). La B~lactamase plasmidique TEM-1
des espèces à Gram négatif possède une homologie de 30 à 35%

avec les enzymes précédentes. Ambler (j^) a proposé que ces
enzymes dérivent probablement d'un même gène ancestral. La
classe B est représentée par une seule espèce, Bacillus cereus
type II, qui ne partage pas d'homologie avec les gènes des
autres classes ( 8_). Enfin, la classe C appartient aux céphalo-
sporinases chromosomiques des bactéries gram-négatives (160).
Il n'y a pas d'homologie entre les séquences de ces enzymes et
celles des membres des autres classes. Les séquences étudiées
comprennent celles d'Escherichia coli et de Shigella qui parta
gent une grande homologie de séquence, et celles de Klebsiella,
Salmonella, Serratia et Pseudomonas, toutes des sérine-enzymes
(30, 160, 184) .
En plus de sa valeur taxonomique, la division des B -
lactamases en trois groupes permet de s'interroger sur l'ori
gine de cette protéine: comment trois classes de protéines
génétiquement si différentes peuvent-elles posséder une même
fonction biologique, c'est-à-dire hydro lyser le cycle B-lac-
tame?
BÊTA-LACTAMASES
MÉTALLOENZYME SÉRINE-ENZYMES
CLASSE B CLASSE A CLASSE C
P.M. - 22,500 P.M. ~ 30,000 P.M. ~ 39,000

I I
Bacillus cereus II Pénici 11inases Cephalosporinases
chromosomiques
I
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Gram-positives Gram-négatives
I I Enterobacter cloacae
Shigella sonnei
Staphylococcus aureus TEM
Shigella flexneri
Bacillus cereus I et III
Salmonella typhimurium
Bad l lus licheni formis
Serratia marcescens
Klebsiella pneumoniae
Tableau 4. La classification d'Ambler.

GO
CTi
37
5. LE ROLE PHYSIOLOGIQUE DES BETA-LACTAMASES
5.1. Introduction
La capacité des cellules bactériennes de synthétiser
une B-lactamase existait bien avant l'ère des antibiotiques.
Une souche de Staphylococcus aureus, isolée en 1933, produit

une B-lactamase (337). Un Bacillus 1 icheniformis, prélevé sur
une racine de plante qui était conservée au British Museum
depuis 1680, produit une B-lactamase semblable à celle isolée
d'un autre B_^ 1 icheniformis, près de trois siècles plus tard
(284). Ces observations indiquent donc que les gènes B-lacta-
mases étaient présents chez les bactéries avant l'utilisation
de la pénicilline. On a même retrouvé des B-lactamases dans
des bactéries isolées de populations qui n'ont jamais été

traitées avec des antibiotiques (120).
Il y a 45 ans, Abraham et Chain (3.) décrivaient la
première B-lactamase. Par la même occasion, ils étaient les
premiers à proposer la possibilité que cette enzyme puisse
avoir une fonction dans le métabolisme des bactéries produc
trices. Il fallut attendre une trentaine d'années avant que
l'on s'intéresse vraiment à cette question. Les revues de 5az

(330) en 1970 et de Pollock (285) en 1971 ont successivement
présenté deux visions divergentes concernant le rôle des 8-
lactamases. Richmond et Sykes (301) en 1973 appuyaient l'hypo
thèse de Pollock selon laquelle les B-lactamases jouent un rôle
d'agent détoxiquant contre les pénicillines et les céphalospo

rines, alors que Sykes et Matthew (367 ) en 1976 se rangeaient
du côté de Saz en affirmant que les B-lactamases joueraient un
rôle d'intermédiaire dans la synthèse de la paroi bactérienne.
En 1979, un chapitre entier du volume "Beta-lactamases" (333)
était consacré à ce sujet: "Do B-lactamases have a biological
function?". On y reprenait essentiellement les idées avancées

par l'un de ses auteurs (S a z) une décennie plus tôt. Depuis
lors, très peu de connaissances nouvelles sont venues éclairer
ou soutenir cette question. Bien que l'on n'ait jamais pu

38
prouver de façon absolue un rôle physiologique pour la g -
lactamase, la littérature récente semble reconnaître d'une
part, le rôle important de la 6-lactamase dans la résistance
des bactéries pathogènes aux antibiotiques, et d'autre part, la
possibilité que la g-lactamase puisse jouer un rôle essentiel
dans le métabolisme de la cellule bactérienne (140, 267).
La question du rôle physiologique des g-lactamases
fera l'objet des paragraphes suivants. Les arguments avancés
par les diverses écoles de pensée y seront présentés à tour de
rôle, de même que les hypothèses actuelles concernant l'origine
et l'évolution des g - 1 act amases.
5.2. Les g-lactamases j ou ent u n rôle comme agents
détoxiquants
Les antibiotiques sont fabriqués par des micro-orga
nismes que l'on retrouve dans l'environnement. Mais le rôle
précis que jouent ces molécules dans les cellules productrices
est inconnu (9J[, 187). Pour certains, la synthèse d'antibioti
ques représente un avantage compétitif et un facteur de survi
vance pour les espèces qui les sécrètent dans l'environnement

(218). A l'inverse, les g-lactamases auraient comme unique
rôle de protéger les bactéries contre les g-lactamines, leur
évolution ayant été marquée par la sélection dans des milieux
naturels où ces composés agissent comme inhibiteurs spécifiques
de la croissance bactérienne (285, 301).
Cette hypothèse est basée sur les arguments suivants:
a) Les g-lactamases sont hautement spécifiques aux substrats de
type pénicillines et céphalosporines (285).
b) Toute modification génétique de la g-lactamase n'affecte pas
la vie de la cellule à moins qu'il y ait des g-lactamines

dans l'environnement (285). Par exemple, l'insertion d'un
gène g-1actamase dans des souches sensibles de Staphylococ-

39
eus aureus semble n'avoir aucun effet détectable sur la
cellule, sauf ceux qui concernent la synthèse de l'enzyme

(301) .
c) Chez certaines souches bactériennes, il existe une relation
directe entre la résistance et l'activité g -1actamase (2 83).
d) Tous les organismes producteurs de g-lactamase possèdent une
paroi cellulaire dont la synthèse peut être très sensible à
l'inhibition par les g-lactamines (283).
e) Certaines espèces de bactéries ne synthétisent pas de g-
lactamase. Chez ces espèces, le rôle secondaire de l'en
zyme n'aurait pas été important pour la survivance des

ce 1 Iules (301).
f) Certaines g-lactamases sont inductibles, parfois à partir
d'un niveau de base à peine décelable. Des variations
importantes dans les niveaux d'expression sont difficiles à
réconcilier avec un rôle physiologique secondaire (301),
d'autant plus qu'un mécanisme génétique inductible réduit le
fardeau métabolique d'un micro-organisme en lui permettant
de fabriquer une protéine seulement lorsque c'est nécessaire

(133, 187).
Même si certains de ces arguments apparaissent discu
tables à la lumière des connaissances actuelles, quelques exem
ples sont consistants avec cette hypothèse. Premièrement, la
production de g-lactamase par S treptomyces est justifiée d'une
part parce qu'il est lui-même producteur d'antibiotiques, et
d'autre part par la niche écologique dans laquelle on peut le
retrouver, c'est-à-dire avec d'autres micro-organismes du sol.
La g-lactamase lui assure une protection contre ses propres
métabolites et un avantage sélectif dans l'environnement natu
rel où des g-lactamines sont produites par les champignons et

les actinomycètes (266). Le même argument peut être appliqué à
d'autres micro-organismes du sol producteurs de g-lactamase

40
comme M yxococcus xanthus (391). Deuxièmement, la g-1actamase
peut détoxiquer la pénicilline avant qu'elle ne soit utilisée
comme source de carbone pour le métabolisme cellulaire. Cette
possibilité a été remarquée _in vitro chez Pseudomonas fluorés-

cens (163). Troisièmement, la distribution des B-lactamases
plasmidiques, chez un grand nombre d'espèces de bactéries à
Gram négatif qui possèdent déjà une g - lactamase chromosomique,
et leur synthèse à des niveaux parfois importants, permettent
de penser que ces enzymes ont évolué et se sont répandues pour
protéger les bactéries contre les antibiotiques utilisés à des

fins thérapeutiques ou autres (296). Le même phénomène a pu
survenir chez S taphy1ococcus aureus depuis 1 ' avènement de la

pénicilline (239).
5.3. Les g-lactamases jouent un rôle dans 1e mé tabolisme
de 1a paroi
Pendant près de 15 ans, Arthur 5 a z et son équipe ont
étudié le rôle possible de la g-lactamase dans les cellules
productrices. Dans une revue extensive et bien documentée
mentionnée précédemment (333), Saz et Lowery font le procès de
1 'hypothèse précédente et présentent des résultats laissant
entrevoir un rôle physiologique essentiel pour la g-lactamase
autre que celui de protéger la cellule contre les g-1actam in es.
Les arguments énoncés à l'encontre de cette dernière
portent sur trois constatations principales. Premièrement, on
n'a pas retrouvé de pénicilline active dans les sols où il y a
des micro-organismes producteurs de g-lactamases. Deuxième
ment, si la pénicilline était produite, elle serait rapidement
inactivée par le pH acide du sol. Enfin, la B -1actamase n'est
pas toujours responsable de la résistance aux pénicillines et
aux céphalosporines. Par exemple, des souches gram-positives
productrices de g-lactamases peuvent être sensibles à de très
faibles concentrations d'antibiotiques. Comparativement à ces
dernières, les barrières de perméabilité des bactéries g ram-
né ga t i v es rendent le rôle des g-lactamases encore moins impor-

41
tant.
D'un autre côté, la rationnelle des expériences ef
fectuées pour infirmer l'hypothèse de Pollock repose sur la
question suivante: "L'activité enzymatique de la g-lactamase
peut-elle atteindre des taux plus élevés sous l'effet d'autres
inducteurs que la pénicilline"? Cette interrogation est issue
de deux constatations: dans d'autres opérons, il est rare que

le substrat de l'enzyme (la pénicilline) puisse agir en tant
qu'inducteur et que le produit (l'acide pénicilloi'que) soit
totalement inactif comme inducteur. De plus, la cinétique
d'induction de la pénicilline diffère sensiblement d'autres

systèmes enzymatiques (276). Conséquemment, la pénicilline ne
servirait qu'à titre d'inhibiteur de la synthèse de la paroi,
l'inhibition favorisant la formation de fragments de paroi qui
agiraient à leur tour en tant qu' inducteurs de la B-lactamase
(257).
Les observations suivantes sont tirées d'études qui
ont porté sur les B-lactamases de bactéries à Gram positif,
notamment Baci1 lus et Staphy1ococcus aureus:
a) Des peptides synthétiques circulaires peuvent servir d'in
ducteurs des pénici11inases de Bacillus cereus et de Staphy
lococcus aureus. Un traitement de ces substrats avec une
préparation de B-lactamase purifiée fait perdre la capacité
d'induction (331, 332).
b) Des peptides circulaires sont produits au moment de la
sporulation chez Bacillus et ils ont la capacité d'induire
la formation de B-lactamase qu'ils soient ou non traités
avec une B-lactamase exogène (333).
c) Des peptidoglycans isolés de Bacillus cereus,dont les poids
moléculaire s'échelonnent de 8,000 à 12,000, induisent la
production de B-lactamase. Ces inducteurs sont 3 à 20 fois
plus actifs que la benzylpénicilline (333).

42
d) La production de 3-lactamase chez BaciIlus cereus augmente
de façon importante au moment de la sporulation, à la fin de
la phase exponentielle de croissance, ainsi que dans les
spores en germination. Un inducteur endogène semblable à un
peptidoglycan est également présent aux mêmes phases de

croissance (274).
e) Chez un mutant de Bacillus cereus (pénicil linase négatif)
incapable de compléter les étapes de sporulation normales,
l'ajout de g-lactamase exogène permet de compléter la for
mation et la libération des spores (273).
f) Un inducteur endogène possédant une structure de peptidogly
can provoque l'apparition spontanée de g-lactamase, en ab
sence d'inducteur exogène chez Staphylococcus aureus. Les
taux les plus importants de 3-lactamase apparaissent vers le

début de la phase exponentielle de croissance (316).
g) On accepte généralement que les souches de Staphylococcus
aureus sensibles à la pénicilline ne produisent pas de 6 -
lactamase. Or, une souche de S_^_ aureus sensible à 0.06
yg/ml de benzylpénicilline produit une g-lactamase non-
inductible et liée è la cellule. L'enzyme est synthétisée
de façon significative seulement au début de la phase expo

nentielle de croissance (317).
Ces résultats appuient fortement l'hypothèse selon
laquelle l'inducteur réel de la g-lactamase pourrait être un
précurseur ou un métabolite de la paroi formé après l'addition
de la pénicilline. En outre, chez Bacillus, la g-lactamase
semble impliquée dans certains processus liés au métabolisme de
la paroi et de la sporulation, alors que chez Staphylococcus
aureus, il est concevable qu'elle puisse jouer un rôle simi
laire à l'exception de la sporulation. La synthèse active de
g-lactamase au début de la phase exponentielle de croissance
correspondrait à une période d'activité métabolique intense,
cette enzyme pouvant être formée pour préparer la cellule à une

43
synthèse active de la paroi (317). En conséquence, bien qu'el-
les ne constituent pas une preuve définitive (333), ces données
suggèrent que la g-lactamase joue un rôle important sinon
essentiel dans la survie de la cellule chez ces bactéries à
Gram positif.
Il faut toutefois mentionner que Richmond et Sykes

(301) ont jugé plusieurs des résultats précédents, circonstan
ciels et indirects. Au contraire, Sykes et Matthew (367)
apportent des arguments supplémentaires à l'appui de cette
hypothèse. Ils constatent les tentatives infructueuses de
divers laboratoires de produire des micro-organismes viables
qui n'ont pas de g-lactamase, ainsi que l'emplacement périplas-
mique des g-lactamases chez les bactéries gram-négatives. Ils
n'écartent pas la possibilité que le rôle physiologique normal
de l'enzyme soit relié au métabolisme de la paroi cellulaire.
De plus, Matthew et Harris (224) affirment que la g-1actamase
pourrait être présente chez toutes les bactéries, et conséquem
ment, qu'elle semble avoir été conservée au cours du processus
évolutif de la différenciation des espèces. A la lumière de
ces observations et des résultats de 5az, les auteurs proposent
que la fonction normale de la g-lactamase serait de briser un
intermédiaire transitoire du métabolisme de la paroi, lequel
posséderait une structure g-lactame.
Lindstrom et collaborateurs, qui ont étudié la g -
lactamase chromosomique d'Escherichia coli, ont également avan
cé 1 ' hypothèse que l'enzyme puisse être une protéine al1 os té ri-
que impliquée dans la synthèse de la paroi (210). Quelques
années plus tard, la même équipe étudiait sans succès l'effet
d'une g-lactamase purifiée sur des liens glycopeptidiques, sur
des intermédiaires de la paroi cellulaire ainsi que sur des

mucopeptides induits par le lysozyme (_58_). Ils devaient con
clure par la suite qu'aucun indice ne permettait d'affirmer une
autre fonction que celle de détruire les pénicillines (36).

44
5.4. Evidences suggérant un rôle des B-lactamases dans
d'autres fonctions métaboligues
La littérature fournit des indications qui tendent à
démontrer que la capacité des B-lactamases à dégrader les
substrats de type B-laetamine est un rôle fortuit. Par exem
ple, certaines B-lactamases ne sont pas aussi spécifiques que
l'on pourrait le croire puisqu'elles peuvent agir sur d'autres
substrats et sont inhibées par des substances qui n'ont aucune
parenté structurale avec les 3-lactamines (tableau 5). La
synthèse de la B-lactamase plasmidique TEK est inhibée par la

caféine et la théophylline (406). On n'explique pas cependant
si ces dérivés des purines affectent spécifiquement l'expres
sion du gène B-lactamase ou la stabilité du plasmide entier.
Une autre étude (136) propose qu'un gène de résistance aux
sulfamidés peut supprimer l'expression d'une B - lactamase plas
midique. La nature de cette interaction est cependant incon
nue.
La possession d'une B-lactamase par les bactéries
n'est pas sans conséquences pour la cellule productrice. Quel
ques exemples peuvent illustrer les interactions entre une B-
lactamase et les constituants de la paroi ou de la membrane
cellulaire. On a découvert qu'environ 2% des B-lactamases
plasmidiques TEM et PSE-1 forment un complexe avec l'acide
sialique. Ce complexe est sensible à la neuraminidase et
pourrait être impliqué dans la sécrétion de la B-lactamase

(170). La B-lactamase intracellulaire de Staphylococcus aureus
potentialiserait les propriétés perméabilisantes de l'acide
linoléique sur la membrane cellulaire (132) , alors que la B -
lactamase extracellulaire rendrait la cellule plus résistante
au lysozyme (230). On ne connaît pas cependant le mécanisme
précis de ces effets. Par ailleurs, des études portant sur des
plasmides sécréteurs de B-lactamases montrent qu'ils diminuent
la perméabilité de la membrane externe à quelques pénicillines

(423), aux céphalosporines (153) ou aux enzymes cellulaires
(198). On ne sait pas si la B-lactamase joue un rôle de média-

45
A - SUBSTRATS BÊTA-LACTAMASE RÉFÉRENCE
Peptides cycliques synthétiques Staphylococcus aureus 331

(C-décapeptide homogrami-
ci dine S et C-hexapeptide) Bacillus cereus 332
Depsipeptides acycliques Classe C > B > A 287
Esters cycliques (a-mëthyl

benzylpénici 11oate et a- Classe C 185
éthyl benzylpënici 11oate)
Esters acycliques ? Cité dans

(Ar.CH2.C0.NH.CH2.C00R) 86
R - INHIBITEURS BETA-LACTAMASE RÉFÉRENCE
Substances a propriétés
TEM 109
détergentes
Colorants de type anthra-

quinone
OXA 109
Acides boroniques Classe C 109
Acides gras Classe C 354
Acide 1inoléique iStapTzz/Zococcws (zwrewg 132
Tableau 5. Substrats et inhibiteurs de g-lactamases qui

qui ne possèdent pas l'anneau B-lactame.
46
teur ou si le plasmide contient d'autres gènes directement
responsables des effets observés. Dans le même ordre d'idées,
on impliquerait des différences dans la composition en lipides
des cellules d'Escherichia coli à une mutation du gène 8-

lactamase (205). Le rôle exact joué par ce dernier n'est
cependant pas clair. Une autre étude a démontré une relation
entre l'inhibition partielle de la synthèse des lipides et
l'inhibition de la synthèse de 6-lactamase chez Bacillus liche-
niformis (ill). En conclusion, tous ces résultats sont plus
compatibles avec l'idée d'un rôle physiologique essentiel qu'a
vec l'hypothèse d'une simple fonction de protection.
5.5. Origine des 8-lactamases
La détermination de la fonction physiologique d'une
enzyme contribue généralement à favoriser l'étude de son évolu
tion. Ce n'est cependant pas ce critère qui a permis d'élabo
rer des hypothèses sur l'origine évolutive des 8-lactamases.
5.5.1. Ressemblance avec les PBP
Il y a plusieurs années, Tipper et Strominger (378)
ont proposé une relation entre les enzymes de la paroi cellu
laire et les 8-lactamases: les 8-lactamases dériveraient d'un
même gène ancestral que les transpeptidases parce que ces
dernières peuvent reconnaître des 8-1actamines. Ils ont égale
ment remarqué l'analogie de structure entre le substrat des
transpeptidases, le dipeptide D-a 1 any 1-D-a 1 anine et un substrat
des 8-lactamases, la pénicilline. D'autres évidences obtenues
par la suite sont venues appuyer cette hypothèse (357, 400):
a) Certaines PBP possèdent une faible activité 8-lactamase:
lorsque des D,D-carboxypeptidases inhibées par la pénicil
line deviennent réactivées, elles libèrent l'acide péni-

cilloi'que (tableau 6).
PBP ESPECE BACTERIENNE REFERENCE
D,D-carboxypeptidase IA Escherichia coli 370

(PBP 5 et 6)
D,D-carboxypeptidase Actinomadura R39 124
Transpeptidase Stveptomyces R61 116, 124
PBP 4 194
PBP SI et S2 OzwZobacter cregoeMtws 193
D,D-carboxypeptidase Bacillus stearothermophilus 143
Tableau 6. Activité 3-1actamase de PBP.
4^
-4
48
b) Les g-lactamases des classes A et C, de même que certaines
carboxypeptidases de faible poids moléculaire, possèdent un
site actif où la sérine joue un rôle prédominant. L'analyse
des séquences d'acides aminés autour de ce site actif révèle
une homologie entre les g-lactamases de la classe A et deux
carboxypeptidases de Bacillus sp. (j^, 399, 425). Un résidu
lysine commun aux classes A et C est également présent chez
plusieurs carboxypeptidases (399).
c) L'analyse de la structure primaire dans la région terminale
N Hz des PB P 5 et 6 d'Escherichia coli et des PBP 5 de
Bacillus stearothermophilus et Bacillus subtilis révèle une
certaine similitude avec la séquence des g-lactamases de la

classe A (398, 399). D'autres ressemblances ont aussi été
signalées au moment de l'analyse des structures secondaires
(235).
d) Les deux sont des acyl-enzymes où l'intermédiaire enzyme-
substrat est lié de façon covalente (6_5, 100). Pour les B-
lactamases, 1'acy 1-enzy me est hydro lysée rapidement pour
régénérer l'enzyme et produire une molécule sans activité
antibactérienne, alors qu'avec les carboxypeptidases, l'hy
drolyse de l'acyl-enzyme est beaucoup plus lente (194).
D'autres similitudes dans le mode d'action des deux enzymes
ont été notées pour des substrats comme la céfoxitine (398)
ou des inhibiteurs comme le phénylglyoxal (,39.). Des études
cinétiques sur la réactivité intrinsèque de g-lactamines ont
permis de démontrer que ce sont les caractéristiques de la
structure des substrats au niveau du site actif des enzymes
qui vont déterminer la demi-vie des intermédiaires avec
chaque type d'enzyme (117). Or, les propriétés antibacté
riennes des g-lactamines étant dépendantes de leur conforma
tion et de la nature du lien g-lactame, il est intéressant
de mentionner que les exigences de fixation des transpepti-
dases et des g-lactamases soient si rapprochées. Cependant,
si l'on considère que la résistance aux g-lactamines peut
être due à la baisse d'affinité d'une seule PBP (411), les

49
transpeptidases semblent posséder une structure moins

flexible que celle des B-lactamases (288). On a cru que les
g-lactamases étaient incapables d'hydre lyser des peptides

linéaires, analogues structuraux des substrats des transpep-
tidases (286), jusqu'à ce qu'une étude récente démontre que
les g-lactamases peuvent hydrolyser des depsipeptides acy-

cliques (287). Ces molécules sont néanmoins de pauvres
substrats, particulièrement pour les g-lactamases de la

classe A.
En somme, les analogies au niveau de la séquence en
acides aminés, de la nature et de la fonction du site actif, de
même que des similitudes avec les inhibiteurs et les substrats
tendent à appuyer l'origine évolutive commune des g-lactamases
et des PBP. Dans l'état actuel des connaissances, toutes ces
similitudes sont cependant basées sur des comparaisons entre
les carboxypeptidases et des g-lactamases de certaines espèces.

Plusieurs des ressemblances observées sont non-exclusives et il
est possible que certaines d'entre elles soient fortuites. On
est par conséquent loin d'avoir prouvé qu'il existait une
lignée évolutive commune entre ces deux familles d'enzymes.
Par exemple, la D,D-carboxypeptidase de Streptomyces albus est
une métallo-enzyme qui hydrolyse lentement la benzylpénicilline

en benzylpénicilloate (177). Elle n'est cependant pas homolo
gue avec la métallo-g-lactamase II de Bacillus cereus (169).
D'ailleurs, les PBP ont généralement des poids moléculaires
plus grands que la majorité des g-lactamases ce qui rend impos

sible d'obtenir une homologie complète de la structure ( 8_).
D'un autre côté, l'existence de g-lactamases de poids molécu

laire élevé suggère que ces enzymes ont été sélectionnées pour
accepter plus d'un substrat ou qu'elles descendent des carboxy

peptidases ( 5_7_).
5.5.2. Ressemblançe_a\êc^ les^ j^rc^té^sejB
Quelques auteurs ont proposé que les g-lactamases

pourraient être des descendants de protéases (59, 186, 234,
50
285). Plusieurs protéases comme la trypsine et la chymotryp-
sine sont des sérine-enzymes (377) et elles forment des inter
médiaires acy1-enzymes (5^). La thermo lysine et les carboxy

peptidases pancréatiques sont des métallo-enzymes (Zn++ ) comme
la g-lactamase classe B ( 8_). La papaïne et d'autres thiol-
protéases sont sensibles au p-chloromercuribenzoate (pCHB)
comme quelques B-lactamases (8). La pénicilline inhibe l'acti
vité du lysozyme en s'attachant près du site actif et elle
partage des similitudes avec un substrat de cette enzyme (234).
Bien que l'on ne puisse éliminer la possibilité d'une
origine lointaine commune, une analyse des séquences en acides
aminés n'a révélé aucune homologie entre des carboxypeptidases

et des sérine-protéases (399). Des chercheurs ont étudié les
ressemblances de carboxypeptidases, de 6-lactamases, d'a-chymo-
trypsine bovine et d'élastase sans trouver d'homologie de la
séquence primaire (235). Ils ont néanmoins déterminé quelques
similitudes de la structure secondaire des B-lactamases de la
classe A avec le lysozyme du blanc d'oeuf de poule, mais sur
tout avec le lysozyme du bactériophage T4 (234). Ils préten
dent en outre que la structure tridimensionnelle des molécules
permet d'établir une meilleure connexion entre des familles
éloignées de protéines que ne peut le faire l'analyse de la
séquence primaire.
5.5.3. ü°d.èle_évol.ut_i_f des J3-_lac_tamasj2s_
L'ensemble des résultats obtenus jusqu'à présent
apporte quelques suggestions quant à l'origine évolutive des B -
lactamases, mais ils sont loin de permettre de tracer un ta
bleau précis et définitif. Il semble acquis que les B-lacta
mases sont constituées de trois branches distinctes ( 8_, 30,
160). Tipper (377) a proposé un modèle évolutif où les B -
lactamases descendent d'une transpeptidase primitive et ont

évolué de façon divergente (figure 7-A). Pechère et Levesque
(280) ont par la suite élaboré un modèle analogue pour les
bactéries gram-négatives dans lequel les B-lactamases auraient

51
A- SELON TIPPER
D, D-TRANSPEPTIDASES ACTUELLES
D, D-CARBOXYPEPTIDASES ACTUELLES
BÊTA-LACTAmSES DES
BACTÉRIES GRAM-POSITIVES
ET GRAM-NÉGATIVES
B- SELON PECHÈRE ET LEVESQUE
ILASES
évolution
\ convergente
ENDOPEPTIDASE
PRIMITIVE ENDOPEPTIBASES
ACTUELLES BÉTA-LACTAMASES
COMMUNE
XJPEPTIDASES
INCONNUES
-PBPla, pbp3 (transpeptidases)

PBP2 (ENDOPEPTIDASE)
_PBP5, pbp6 (carboxypeptidases)
Figure 7. Modèles évolutifs des (3-lactamases.

52
pu évoluer de façon convergente (figure 7-B). A la lumière des
données actuelles, il n'est pas encore permis de déterminer
comment les trois classes de g-lactamases sont reliées entre
elles. La découverte du rôle physiologique essentiel des S-
lactamases devrait contribuer à résoudre ce problème.

53
6. LES CELLULES DE MAMMIFERES POSSEDENT-ELLES UNE BETA-
LACTAMASE?
Si l'on accepte a_ priori le principe que des g-
lactamases puissent jouer un rôle essentiel dans le métabolisme
de la cellule procaryote, on peut supposer qu'elles aient été
conservées dans le processus évolutif pour se retrouver dans
des cellules eucaryotes. Or précisément, une activité g-lacta-
mase a été observée chez une algue (66) et dans des cellules de
levure (227). La parenté phylogénétique de ces enzymes avec
les g-lactamases bactériennes n'est cependant pas connue.
Malgré l'utilisation répandue des g-lactamines à des fins médi
cales et vétérinaires, très peu de publications ont mentionné
la présence de B-lactamases dans les tissus animaux. D'ail
leurs, les premiers travaux sur la pénicilline signalaient
l'étonnante stabilité de ce composé dans les tissus animaux (4_,
67). Les 3-lactamines sont généralement peu toxiques pour les
cellules animales et bloquent un processus métabolique exclusi
vement bactérien. C'est pourquoi les chercheurs se sont inté
ressés bien plus à la vitesse d'élimination et aux voies d'ex
crétion de ces substances dans 1'organisme, qu'à la nature des
mécanismes de biotransformation. Il faut préciser que les
études de ce genre touchent davantage les médicaments présen
tant un risque de toxicité pour l'organisme, comme les psycho
tropes. Depuis quelques années cependant quelques chercheurs
semblent porter une attention plus grande à la dégradation des
B-1actamines dans les tissus animaux.
La revue de la littérature qui suit fait l'inventaire
des interactions de toutes natures auxquelles sont confrontées
les antibiotiques de la famille des g-lactamines lorsqu'un 1i-
sées à des fins thérapeutiques. Ce sujet est vaste et comporte
de multiples facettes. Les g-lactamines réagissent-elles ex
clusivement avec des composantes bactériennes? On doit répon
dre à cette question par la négative puisqu'elles peuvent subir
une variété d'interactions dans l'organisme allant de la liai
son simple et réversible avec des protéines, à la dégradation

54
par des enzymes. Certaines g-lactamines peuvent même aller
jusqu'à produire des effets défavorables chez l'hôte, bien
qu'elles appartiennent à la famille d'antibiotiques causant le

moins d'effets secondaires chez l'homme (50 ).
6.1. Dégradation non-enzymatique
Les 6-lactamines peuvent réagir spontanément avec des
ions et des molécules en solution et subir des modifications
irréversibles de leur structure chimique les rendant biologi
quement inactives. La structure bicyclique serait responsable

de l'instabilité des molécules (335). Deux voies principales
de dégradation sont connues et elles dépendent de la tempéra
ture, de la nature des groupements chimiques impliqués, mais
surtout du pH du milieu.
6.1.1. R^é_ac_t i cm s^ üuç_lj§ oj] h_i Ije s
Les réactions nucléophiles concernent autant les
pénicillines que les céphalosporines qui sont hydrolysées en
milieu neutre ou alcalin par réaction chimique avec des ions
hydroxyles et des amines. Cette interaction amène la rupture
du cycle g-lactame. Le produit d'hydrolyse des pénicillines

est l'acide pénicilloique ou des esters de pénicilloate lors
qu'elles réagissent avec des alcools ou des sucres (151).
Quant aux céphalosporines, les céphalosporoates produits sont

très instables ( 2_, 107, 142). D'autres molécules ont la pro
priété de réagir avec le lien g-lactame, comme les aminoéthyl-
thiols, l'imidazole, les aminoéthylcatéchols, le cycloheptaamy-

lose et les métaux lourds (335). Des agents réducteurs comme
la L-cystéine sont également des antagonistes des pénicillines

(216) et de la thiénamycine (172). Enfin, le cycle g-lactame
des pénicillines peut réagir avec un groupement aminé des
aminosides provoquant ainsi l'inactivation des deux composés
(302).
55
6.1.2. F[éjacy cmj3 j|l.e cjt r£pjh iJL e s.
En milieu neutre ou faiblement acide, les pénicil
lines réagissent avec l'ion hydrogène pour former l'acide péni-
cillénique (424). Ce produit, par ailleurs instable, se trans
forme en acide pénicil loi'que ou en acide pénillique. En milieu
fortement acide, c'est ce dernier qui est formé. Quant aux
céphalosporines, elles seraient davantage stables en milieu

acide (151).
6.1.3. Conséquences bioloqiques
Parmi les implications tributaires des propriétés
physico-chimiques énoncées précédemment, la littérature men

tionne l'instabilité des solutions d'antibiotiques (particu
lièrement de pénicilline) à utilisation parentérale (336, 341,
419) ou à des fins de dialyse péritonéale (341). La présence
de produits de dégradation de pénicilline dans les solutions
injectables seraient responsables des réactions d'hypersensibi
lité induites au moment de l'administration (244). D'autres
chercheurs ont proposé que l'aminolyse de céphalosporines (275)
et de la pénicilline (244) peut entraîner la formation, avec
une protéine, d'un conjugué doué d'un potentiel d'allergénici
té. Il est possible que la grande réactivité du lien g-lactame
le rend susceptible à une attaque nucléophile par des groupe
ments hydroxy les ou amines libres des protéines (141). C'est
pour cette raison que plusieurs protéines de l'organisme peu
vent réagir avec des pénicillines et des céphalosporines et
servir d'haptènes, permettant ainsi la production d'anticorps
contre ces molécules.
Finalement, à part la dégradation d'antibiotiques
absorbés oralement, la majorité des interactions non-enzymati
ques entre les 6 -1actamines et les fluides biologiques concer
nent des réactions réversibles. Ce sujet fera l'objet des
paragraphes suivants.
56
6.2. Liaison avec des protéines
La liaison avec les protéines sériques et tissulaires
est un paramètre important de l'activité antibactérienne et de
la pharmacocinétique des antibiotiques (414, 415). Ce phéno
mène a pour effet de séquestrer temporairement l'agent antimi
crobien dans le compartiment extravasculaire. Il en résulte

deux conséquences cliniquement importantes (2J2 ). La première a
pour objet de neutraliser temporairement les propriétés biolo
giques de l'antibiotique puisque seule la fraction libre de ce
dernier peut manifester une activité antibactérienne. La deu
xième affecte directement la distribution des molécules dans
l'organisme car l'antibiotique lié ne peut pas traverser la
barrière vasculaire.
6.2.1. A_lj3ujnijie_
Les B-1actamines se lient avec les protéines séri
ques, principalement l'albumine, de façon réversible (307). Le
taux de liaison dépend de nombreux facteurs dont l'espèce
animale, la nature chimique de l'antibiotique, le pH et la
température du milieu, la concentration respective des molé
cules et la présence de substances capables de corn pétitionner

pour les sites de liaison (4^3, 383. 414). Des études portant
sur l'affinité de céphalosporines (4J.) et de pénèmes (_5lJ pour
l'albumine ont révélé que celle-ci possède deux sites indépen
dants de liaison.
6.2.2. ki.9.a n d jji_e
Plusieurs pénicillines et céphalosporines peuvent se
lier in vitro à une protéine présente dans le surnageant

100,000 g d'homogénats de foie (190) et de rein (183) de rat.
Cette protéine, appelée 1igandine, est abondante dans le foie
où elle constitue plus de 4% du total des protéines cytoplasmi
ques (211). On la retrouve également au niveau du petit intes
tin, mais elle n'a pas été détectée dans le plasma, la bile et
57
le cerveau. Le rôle exact que joue cette protéine dans l'en
trée et le transport des antibiotiques au niveau du foie est

inconnu (190). Il semble que la liaison des B-lactamines à la
fraction soluble 100,000 g d'homogénats de foies de lapin (396)
et humains (346) contribue de façon non-négligeable à influen
cer leur comportement pharmacologique, en particulier l'excré
tion urinaire. Dans cette perspective, la 1igandine pourrait
influencer la libération des molécules du foie vers la bile
(211).
6.2.3. _A u_t r -Ë.s_PH°JLé jjn _e s_
Le foie humain contient une autre protéine, plus
petite que la 1igandine, qui peut lier les pénicillines et
l'acide oléique (191).
On retrouve d'autres exemples, dans la littérature,
d'interactions entre les B-lactamines et certaines fonctions
physiologiques. Des pénicillines peuvent inhiber la chimiota
xie des leucocytes po1 ymorphonuc1éai res ou affecter le complé
ment chez l'homme (392). L'interférence avec le complément
peut prendre deux formes, soit par inactivation d'une ou de
plusieurs fractions, soit par activation de la voie alternative
avec transformation parallèle des facteurs B et C 3. Trois
céphalosporines dont la céfotaxime stimulent la croissance de
certaines populations lymphocytaires (209). Les auteurs n'ont
pas déterminé le mécanisme responsable de cet effet. Certaines
céphalosporines avec un radical N-méthy1-thiotétrazo1e dont la
moxalactame, la céfopérazone et la céfamando le altèrent le
métabolisme de la vitamine Ki, provoquant une hypothrombinémie

chez les patients (26). La nature de cette interaction n'est
pas connue. La toxicité de la pénicilline a été évaluée sur
des hépatocytes de rat (390). Les résultats obtenus démontrent
une diminution de l'incorporation de valine marquée dans les
protéines (90% d'inhibition à une concentration de 14 m H), ce
qui indique soit une diminution de la synthèse protéique, soit
une augmentation de la dégradation des protéines, ou les deux.

58
La viabilité cellulaire n'est pas modifiée.
A partir de ces seules observations, on peut conclure
que les 3 -lactamines ont une affinité pour d'autres structures
que les PBP et les g-lactamases bactériennes.
6.3. Biotransformation des g-lactamines
Les analyses pharmacologiques concernant le comporte
ment _i_n vivo des antibiotiques suggèrent la capacité des tissus
de les dégrader. Elles mentionnent en effet, en plus des
données pharmacocinétiques usuelles (pourcentage de liaison
avec les protéines sériques, demi-vie, volume de distribution),
la présence de métabolites et le pourcentage d'antibiotique
inchangé, excrétés dans l'urine. On peut parfois déduire de ce
dernier paramètre que la différence, s'il y en a une avec la
quantité administrée, ait pu être métabolisée dans
que 1qu'organe et excrété dans les voies biliaires.
Malgré leur structure de base commune, les 6-laeta
mine s ne subissent pas toutes le même sort i n vivo. Des études
ont clairement établi qu'au cours de leur passage à travers
l'organisme, plusieurs pénicillines subissent des conversions

métaboliques ( &1, 306, 375). Certains des métabolites produits
possèdent une activité biologique ce qui ne permet pas toujours
de distinguer leur effet de celui des composés non-métabo1isés.
Les caractéristiques pharmacocinétiques des pénicillines ont

été revues et comparées (2_8^, 308). Les céphalosporines de leur
côté semblent dotées d'une plus grande stabilité, quoique cer

taines d'entre elles soient susceptibles d'être modifiées (44,
45, 252).
6.3.1. D_an.s_le_ üéjluül
En plus de se lier de façon réversible avec
l'albumine sérique, les antibiotiques peuvent être dégradés par
des protéines plasmatiques. Par exemple, plusieurs g-

59
lactamines sont instables dans le sérum humain : la carbénicil-
line, la ticarcilline, la pénicilline, l'oxacilline, la mé-
thicilline, 1'ampicilline et la céphalothine perdent 35 à 76%
de leur pouvoir antibactérien en 24 heures et 76 à 98% en 48
heures à 37 °C (302). La céfazoline, la céfoxitine et la cépha-
lothine se dégradent dans le sérum utilisé à des fins d'ana
lyses microbiologiques (348). O'Callaghan et collaborateurs
(261, 263) ont également signalé la dégradation irréversible de
pénicillines et de céphalosporines (dont la nitrocéfine) par la
fraction albumine du sérum. La dé gradation semble ne pas être
de nature enzymatique puisque la molécule conserve son pouvoir
destructeur après chauffage à 10 00 C pendant 15 minutes. Une

autre étude (48) mentionne également ce phénomène avec la
céfatrizine; un chauffage à 6 00 C pendant 45 minutes n'a pas
d'effet, alors qu'un traitement avec 1% de dodécylsulfate de

sodium (SDS) permet de stabiliser l'antibiotique. Bruder1ein
et a 1. (51) ont indiqué que le groupement e-N H 3+ d'un résidu
lysine de l'albumine pouvait être responsable de la destruction
de pénèmes. Il est possible que le mécanisme de cette dé grada

tion soit semblable à l'aminolyse observée précédemment (voir
le point 6.1.).
6.3.2. D_an.s_le. _foi_e_
Le foie contient une foule d'enzymes capables de
détoxiquer les xénobiotiques et favoriser leur élimination par
voie biliaire ou rénale. Il ne serait donc pas surprenant que
des antibiotiques y soient transformés. D'ailleurs quelques
publications ont souligné le rôle de cet organe dans le métabo
lisme des g -lactamines.
L'urine est la voie majeure d'élimination des péni
cillines et des céphalosporines quoique certaines peuvent habi
tuellement atteindre des niveaux biliaires thérapeutiques (21).
En cas d1insuffisance rénale, le foie doit assumer une respon
sabilité plus grande quant à l'élimination de ces antibioti
ques. Dans une expérience avec des chiens, les taux sériques
60
de pénicilline G ont diminué plus rapidement chez les animaux à
qui l'on a enlevé les reins et ligaturé les voies biliaires,
que chez ceux à qui l'on a enlevé le foie et les reins (10).
Les auteurs concluent que le foie est responsable de l'élimina
tion extra-rénale de pénicilline. Des expériences avec des

organes isolés ont démontré la capacité du foie de rat (182) et
du foie de lapin (4_6_) d'inactiver la pénicilline G. Rosenblatt
et a 1. (310 ) pensent que le foie a un rôle important à jouer
dans le métabolisme d'isoxazolylpénicil lines. Cole _e_t a 1.
(81), qui ont remarqué l'inactivation de plusieurs pénicillines
in vivo chez l'homme, abondent dans le même sens.
6.3.3. Dans d'autres sites de biotransformation
L'inactivation des pénèmes et carbapénèmes par une

enzyme rénale a été bien étudiée (voir peptidase rénale au
point 6.4.4.). Des auteurs ont rapporté la présence d'une
enzyme dans des exsuda ts capable d'hydrolyser la pénicilline,
l'ampicilline et la cépha1oridine. Leurs résultats indiquent
que l'activité enzymatique provient de la membrane cellulaire
des leucocytes (20) et de la fraction solide du pus (93). Il
faut souligner toutefois que d'autres travaux ont également
mentionné la dégradation de pénicilline dans des exsudais puru
lents. Il semblerait que cette activité soit due à la présence

de micro-organismes producteurs de g- lactamases (5_4, 221).
6.4. Dégradation enzymatique
L'interaction des g-lactamines avec des enzymes de
mammifères est un domaine mal connu, malgré que l'on ait cons
taté la capacité de l'organisme humain ou animal d'inactiver
plusieurs d'entre elles. La littérature rapporte pourtant
quatre types d'enzymes susceptibles de métaboliser les g-lacta
mines.
61
6.4.1. L _es_gj^la_c_t arnasê^
Hami 1 ton-Mi 11 er (139) affirme en 19 82 dans un édito
rial que les g-lactamases sont présentes dans les tissus de
mammifères. Il cite en outre les travaux de Koch et a 1. (188)
qui rapporte que le cerveau de rat, de même que le foie de rat

et de cobaye contiennent une pénicillinase. Snow (353) pour sa
part a montré la présence d'une g-lactamase spécifique à un
ester de pénicilline G dans des homogénats de foie de cobaye,
de souris et de lapin. Cette enzyme hydrolyse l'ester méthyli-
que de la pénicilline G en l'ester méthylique de l'acide péni-
cillo'ique. Cependant, la possibilité que les cellules de mam
mifères puissent synthétiser une g-lactamase s'appuie sur des
données pharmacocinétiques qui démontrent que plusieurs g -
lactamines, notamment les pénicillines, sont excrétées sous

forme de pénici1loates (tableau 7). Par exemple, des expérien
ces réalisées chez l'humain sur le métabolisme des pénicillines

révèlent que l'acide pénici1loïque constitue le métabolite
principal (_8_1, 131). Quant aux céphalosporines, on a mentionné
précédemment leur instabilité lorsque le lien B-lactame est
rompu. Il semble donc _a priori difficile de démontrer la
présence d'une activité de type g-lactamase contre ces molé
cules. Toutefois, lorsque les essais pharmacocinétiques sont
réalisés avec des molécules marquées, il est possible de
retrouver des métabolites ne possédant aucune activité biologi
que. C'est le cas de la céphalothine pour laquelle deux des

quatre métabolites produits, l'acide thiophène acétique (0.9%
de la dose excrétée dans l'urine de rat) et la thiénylacéty 1 -
glycine (7.6%) suggèrent une dégradation avancée de la molécule
(362). La céfotaxime est également dégradée par le foie de rat
en plusieurs métabolites dont deux ont un cycle g-lactame
ouvert (840 .
6.4.2. kes. a.c%la.sj3s
La présence d'acylases capables d'hydrolyser les 8-
1 act amines dans les tissus animaux semble aussi mal étudiée que
% EXCRÉTÉ SOUS FOR
ANTIBIOTIQUE ADMINISTRATION ME DE PÉNICILLOATE RÉFÉRENCES
(en 12 heures)
Phénoxyméthyl-
pénicilline
Orale 56.6 8]_
Phênéthici 1 -
1 ine
n
30.9
Propi ci 11ine il
32.2 U
Oxaci11ine n
48.7 II
n
16.0 131
Cloxaci11ine n
21.6 81
Dicloxaci1- u
10.2
line
Flucloxaci1- II
1 i ne
n
9.6
II
Ampi ci 11ine n
20.9
n
10.1 131
Amoxyci11ine H
33.4 81
n
19.0 131
Pénicilline G I.M. 19.0 81

Il II
Méthici 11ine 8.1
II
Ampici 11ine II
12.2
Carbénici 1 line 2.1
LÉGENDE : I.M. = intra-musculai re
Tableau 7. Dégradation de pénicillines par une

activité de type G-lactamase.
63
celle des B-lactamases. Une activité pénicilline acylase a été
détectée dans des homogénats de rein, de foie, de rate et de
poumon chez le boeuf et le porc (138). Cependant, English e t
a 1. (104) n'ont pas détecté d'activité analogue dans des ex
traits broyés de tissus provenant de souris, de rat, de lapin
ou de cobaye incubés avec de la pénicilline G. Chez l’humain,
l'excrétion de pénicilline sous forme de 6-APA représenterait

moins de 1% de la dose administrée ( 8_0. L'hydrolyse de la
chaîne latérale formant le lien amide de la céphaloglycine est
une voie importante de biodégradation de cette céphalosporine

chez le rat et la souris (360). Au contraire, la céphalexine
n'est pas métabolisée par ces animaux, bien qu'elle possède une
structure analogue à la céphaloglycine (361). L'enzyme impli
quée démontre une spécificité de substrats remarquable.
Deux raisons peuvent expliquer la pénurie relative
d'informations concernant ces enzymes. D'une part, il semble
que les acylases de mammifères, possédant la capacité d'agir
sur une B-lactamine, peuvent également transformer d'autres
types de molécules non-apparentées. On a indiqué par exemple
que la pénicilline acylase d'extrait de rein de porc peut aussi
hydro 1yser la phénoxyacéty1 g 1 ycine (78). Une autre étude (130)
décrit un extrait brut d'aminopeptidase, obtenue à partir de la
muqueuse gastrique du porc, qui peut transformer la pénicilline
G en 6 -A P A. Ces données suggèrent que les acylases de mammi
fères ne sont pas spécifiques aux pénicillines, mais qu'il

s'agit plutôt d'amidases à spectre large (7J3, 13 8). D'autre
part, il n'est pas possible d'établir, d'après la littérature,
si toutes les acylases de mammifères sont capables de transfor
mer les pénicillines et les céphalosporines en 6-APA et 7-ACA,
respectivement. Par exemple, les travaux sur les acylases

activées par le cobalt, chez l'homme (430) ou le hamster (429),
n'ont pas déterminé leur capacité de couper la chaîne latérale
des B-lactamines.
6.4.3. Les es té rases
Le sérum ( 3J2, 38 2, 383), les globules rouges ( 84) , le
foie et les reins (84, 264 ) des animaux possèdent des es té-
rases. Les études pharmacocinétiques réalisées chez l'homme ou
les animaux ont révélé que des céphalosporines possédant un
radical acétoxyméthyle en position 3 comme la céphalothine
(113, 362), la céphaloglycine (281), la céphacétrile (242), la

céphapirine ( 6J2) et la céfotaxime ( 8_4) , sont métabolisées en
désacéty 1-cépha 1osporines. La céfoxitine, qui possède un radi
cal différent, serait également désacétylée mais très faible

ment ( 5_6_) . Au cours de tous ces travaux, on n'a jamais isolé
ou caractérisé le mécanisme responsable de la transformation,
mais tout laisse croire qu'il s'agit d'une estérase.
La présence d'une estérase dans les tissus de mammi
fères est par ailleurs exploitée pour rendre actives certaines
g-lactamines administrées par voie orale comme la car bé niei1-
line ((74) ou des céphalosporines (408). Les esters de g-
lactamines, microbio logiquement inactifs, échappent à la des
truction par les sels gastriques et favorisent 1 'absorption
intestinale. Une fois absorbées, ces molécules se distribuent
dans l'organisme où elles seront hydrolysées par des estérases,

libérant ainsi le composé actif (382).
6.4.4. L.a_PJÈ.P_!iiâajie_r.É.r,a.le.
Les essais pharmacocinétiques de la thiénamycine, de
la N-formimidoy1-thiénam ycine et d'autres molécules apparentées
ont révélé que les carbapénèmes sont rapidement métabolisés in
vivo et que leur taux de récupération urinaire est faible chez

la plupart des espèces animales étudiées (197). Une enzyme, la
dipeptidase rénale ou déshydropeptidase I, fut soupçonnée de
les dégrader. L'identité de cette enzyme avec la dipeptidase

membranaire rénale est maintenant démontrée (180, 197, 343).
L'enzyme est située sur la bordure en brosse des cellules
des tubules proxima les (197). La dipeptidase rénale est dis

65
tribuée chez plusieurs espèces de mammifères (229). Elle a été
purifiée notamment du rein humain (6_2, 359) et du rein de porc
( 63 , 2 29 , 404 ) (tableau 8). Les carbapénèmes ( 2_3 , 181 , 229 ,
343, 3 44) et les pénèmes (2_3 , 2 2 9) sont des substrats de
l'enzyme. Au contraire, les pénicillines (229, 343), les
céphalosporines (197, 229, 343) et les monobactames (229) y
sont insensibles. La peptidase rénale provoque l'ouverture du
cycle g-lac tame entre l'azote en position 1 et le carbone en

position 7 (345) ce qui a motivé quelques chercheurs à affir
mer qu'il s'agit d'une g-lactamase de mammifère (180, 197,
345). On sait cependant peu de choses sur son mode d'action et
sa relation, s'il y en a une, avec les g-lactamases bactérien
nes.
66
PEPTIDASE RÉNALE
PORCINE HUMAINE DE RAT
Activité sur les:
RENAMES NON 1 - NON
CÉPHÈMES NON 2 - NON

PÉNÈMES OUI OUI OUI
CARBAPÉNÊMES OUI OUI OUI
M0N0BACTAMES NON 5 - -
Inhibée par le
CILASTATIN OUI OUI -
Glycoprotéine OUI NON -
fiÉTALLOENZYME (Zn++) OUI

OUI OUI
Point isoélectrique 5.5 - -
47,000 59,000 ^
Poids moléculaire
62, 229,
Références 62 197, 343
258
LEGENDE : 1- activité mesurée avec la pénicilline G

2 - activité mesurée avec la cëphaloridine
3 - activité mesurée avec 1'azthrëonam
4 - tétramére de 220,000 daltons
Tableau 8. Principales propriétés des peptidases rénales.

67
7. MOTIFS ET OBJECTIFS DE CE TRAVAIL
Nous avons présenté des observations au point 5 qui
nous permettent d'afficher un certain scepticisme à la sugges
tion que le seul rôle physiologique des g-lactamases soit de
détruire les g-1 actamines. Il est évident qu'elles semblent
communément montrer cette propriété et jouent conséquemment un
rôle important dans la résistance aux g-lactamines. Cependant,
nous proposons que c'est un rôle secondaire imposé à ces en
zymes par l'utilisation à grande échelle des pénicillines et
céphalosporines à des fins thérapeutiques. Selon cette hypo
thèse, le rôle physiologique des g-lactamases serait à décou
vrir. Quelques explications, citées précédemment, ont été
avancées dans ce but, sans qu'il soit possible de les appliquer
avec certitude à l'ensemble des micro-organismes qui les
synthétisent.
Face à cette situation, nous avons entrepris d'éluci
der le rôle physiologique essentiel des g-1actamases sous un
nouvel éclairage. Compte tenu que i) l'on retrouve une g -
lactamase chez la plupart des bactéries à Gram négatif et chez
les bactéries à Gram positif aérobies strictes, ii) la présen
ce de g-1actamase chez les bactéries anaérobies strictes semble

être un phénomène rare et peut être accidentel et iii) les g-
1 actamases ont été signalées dans des cellules eucaryotes, nous

avons postulé que i) la g-lactamase n'est pas exclusivement
une enzyme bactérienne, ii) elle est associée à une fonction
physiologique importante et peut être même vitale, iii) que
cette fonction essentielle est liée à un processus métabolique
aérobique et iv) que ce processus vital est commun aux êtres
vivants y compris les mammifères.
Ce travail est divisé en quatre chapitres de résul
tats qui représentent les grandes lignes de la démarche expéri
mentale. Le chapitre II étudie la question de l'universalité
des g-lactamases par le dépistage d'une activité g-lactamase
chez des bactéries reconnues pour ne pas en posséder ou qui

68
n'avaient pas été investigué es au moment de l'étude. Les
résultats obtenus nous ont amenés au cours du chapitre III à
déterminer l'influence de l'oxygène sur la synthèse de 8-
1actamase chez des entérobactéries. Les résultats expérimen
taux qui constituent ces deux chapitres ont été obtenus en
collaboration avec Claude Morin, étudiant au doctorat. Les
chapitres suivants rapportent les expériences effectuées afin
d'isoler et de caractériser une 8-1actamase dans des tissus de
mammifères. Le chapitre IV s'attache à décrire la capacité des
cellules de foie de rat de dégrader des B-lactamines. Le
chapitre V relate la démarche visant à stabiliser, purifier et
caractériser une protéine hépatique qui possède une activité de
type 8-lactamase.
CHAPITRE II
Universalité des B-lactamases
69
70
1. INTRODUCTION
Abraham et Chain, qui ont décrit la première enzyme
bactérienne capable de détruire la pénicilline, furent égale
ment les premiers à s'interroger sur le rôle physiologique de
cette enzyme ( 3_). Depuis, trois hypothèses ont été proposées
afin d'expliquer la présence de 0-1actamases chez les bactéries
soit i) comme moyen de défense contre les 0-lactamines (285,
301) ; il) dans le processus de la sporulation (273); iii) dans
la biosynthèse du peptidoglycan (333, 367).
L'argument invoqué le plus fréquemment à l'appui d'un
second rôle physiologique pour les 0-lactamases repose sur les
observations de Matthew et Harris selon lesquelles la produc
tion de 0-lactamase serait un caractère commun aux bactéries
gram-négatives aérobies et anaérobies facultatives (224). Ils
en concluent que la 0-lactamase pourrait se retrouver chez
toutes les bactéries. On a par exemple isolé des 0-1actamases

dans des souches de Bacillus subtilis (273) et de Staphylococ
cus aureus (317) très sensibles aux pénicillines. Leur argu
ment est également supporté par des tentatives de sélectionner
des souches 0-1 actamases-négatives par mutagénèse chez Pseudo
monas aeruginosa (312) et Escherichia coli (36). L'impossibi
lité d'isoler des mutants totalement dépourvus de 0 -lactamase
suggère que cette enzyme puisse jouer un rôle vital en plus de
sa fonction de protection contre les antibiotiques du groupe
des 0-lactamines.
D'autre part, il existe un certain nombre d'espèces
de micro-organismes où l'on n'a jamais mis en évidence une 0-
1actamase. La plupart des anaérobies strictes sont au nombre
des espèces bactériennes qui n'ont pas de 0-1ac tamase. Les
exceptions les mieux connues appartiennent au groupe des bacté

ries gram-négatives comme Bacteroides (123) et Veillonella
(386). Du côté des gram-positives, la présence de 0-lactamase
chez Clostridium est peu fréquente ce qui permet de supposer
qu'il puisse s'agir d'une propriété acquise. Par exemple, il

71
n'y a pas de travaux affirmant la présence de g-lactamase chez

Clostridium perfringens (411), pas plus que chez Clostridium
difficile (216) ♦ Une étude, portant sur 361 souches cliniques
de Clostridium représentant 28 espèces, a mis en évidence une
g -1 actamase chez seulement 4 des 20 Clostridium bei.jerinckii/
butyricum (42). La production de g -1actamase chez Clostridium
butyricum n'est pas une propriété universelle d'après Hart et
a 1. (143) qui ont dénombré une souche positive sur 8. Aldridge
et collaborateurs (6_) ont étudié la présence de g-lactamase
chez plusieurs espèces de bactéries anaérobies. Ils ont déter
miné qu'en plus de la majorité des Bacteroides, quelques unes
des autres souches étudiées sécrètent une g-1actamase: Fusobac-

terium (1/19), Clostridium (1/20) et Eubacterium (1/5). Ils
n'ont détecté aucune activité g-lactamase chez les souches de
Bifidobacterium (0/3), Propionibacterium (0/9), Peptococcus
(0/25) et Peptostreptococcus (0/20).Il
Il nous est apparu important de vérifier le concept
d'universalité des g-lactamases dans le but d'orienter des
travaux sur leur rôle physiologique. Nous avons appliqué des
méthodes de détection sensibles afin de mesurer la capacité de
souches bactériennes reconnues g-lactamases-négatives, de syn
thétiser cette enzyme. Dans un premier temps, nous avons
évalué l'efficacité de ces méthodes sur des souches de Proteus
et d'Enterobacter sensibles aux g-lactamines qui, selon la
thèse de l'universalité, devraient posséder une g-lactamase.
Deuxièmement, nous avons recherché la présence de g-lactamase
dans des souches bactériennes où on ne l'a jamais isolé. C'est
le cas notamment de bactéries anaérobies comme Bifidobacterium,
Propionibacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus et Strepto
coccus pyogenes. Enfin, il est bien connu que l'absence de
paroi rend les mycoplasmes résistants aux g-lactamines. Nous
avons néanmoins étudié leur capacité de fabriquer une g-lacta
mase afin de vérifier l'hypothèse d'un rôle dans la synthèse de
la paroi.
72
2. MATERIEL ET METHODES
2.1. Souches bactériennes
La souche d'Enterobacter cloacae 1321E a été fournie
par les laboratoires de recherche Glaxo (Greenford, Middlesex,
U.K.). Les souches de Proteus mirabilis ainsi que les souches
de cocci gram-positifs Peptococcus anaerobius P3 et P7, P eptos-
treptococcus productus P9 et Streptococcus pyogenes ont été
isolées de patients à l'hôpital 1'Hôtel-Dieu de Québec (Qué
bec). Les actinomycètes Propionibacterium acnes 1.1 et 1.2
ainsi que Bifidobacterium sp. ont été obtenus de l'Institut

Pasteur (Paris, France). Enfin, la souche de Mycoplasma pneu
moniae provient du Centre Hospitalier de 1 'Université Laval

(Ste-Foy ) .
2.2. Détermination d e _l_a concentration minimale inhibi-
trice
La concentration minimale inhibitrice des entérobac
téries a été mesurée par la méthode suivante de dilution en
tube. La pénicilline G (Ayerst), l'ampicilline (Ayerst) et la
cépha1othine (Eli Lilly & Co.) ont été préparées dans du bouil
lon Mue 1ler-Hinton (Difco) à des concentrations variant de 1.25
à 5120 yg/ml (progression géométrique de raison 2) et mélangées
avec un volume égal d'inoculum. Ce dernier était constitué
d'une culture bactérienne de 18 heures diluée dans du bouillon

Mue11er-Hin ton à une concentration d'environ 106 bactéries/ml.
La lecture des résultats a été réalisée à l'oeil nu après 18
heures d1incubation à 37 0C.
2.3. Culture des bactéries et préparation de l'extrait
brut
2.3.1. En té ro Ibajc t é_r_i e js
Proteus mirabilis et Enterobacter cloacae ont été

73
cultivés dans du bouillon coeur-cervelle (Difco) pendant 18
heures à 3 70 C sous agitation. Les bouillons de culture ont
d'abord été centrifugés à 17,000 g pendant 20 minutes. Les
culots cellulaires furent lavés dans une solution de N a 01
[0.1 M ] stérile à raison de 3 ml par 100 ml de culture, puis
recentrifugés à 20,000 g pendant 10 minutes. Les culots ont

été resuspendus ensuite dans la solution saline (1 ml/100 ml de
culture) avant d'être soumis aux ultrasons (Artek 300, 180 W de
puissance) pendant 3 minutes. Une dernière centrifugation à
80,000 g pendant 20 minutes a permis d'enlever les débris
cellulaires.
2.3.2. Autres bactéries
Bifidobacterium et Propionibacterium ont poussé dans
du bouillon coeur-cervelle auquel on a ajouté du glucose [1%],
de l'extrait de levure [0.585] et du lactate de sodium [ 485]. La
croissance a duré 50 heures à 37 0 C, dans une bouteille à hémo
culture. Streptococcus pyogenes a été cultivé dans un bouillon

Todd Hewitt (Difco) à 37 0C pendant 24 heures. Mycoplasma
pneumoniae a été ensemencé dans le milieu S P 4 qui contient du
sérum de cheval, du (3-ga 1 actose, ainsi que 500 U de pénicilline
G par ml de culture. La période de croissance a duré 3 se
maines à 3 7 0 C. Peptococcus et Peptostreptococcus ont été
cultivés dans du bouillon Columbia (Difco) contenant du sang de
mouton, pendant 24 heures à 37 0C en anaérobiose (Gas Pak, BBL).
Après la croissance des bactéries, les globules de mouton
furent retirés de la culture par centrifugation à 1000 g pen
dant 10 minutes.
Les suspensions de cellules bactériennes ont été

centrifugées (20,000 g, 15 minutes), resuspendues dans la solu
tion saline stérile, soumises aux ultrasons (180 W de puissance
pendant 6 minutes) puis recentrifugées (20,000 g, 15 minutes)
pour enlever les débris cellulaires. L'extrait brut ainsi que
le surnageant de culture ont été mis à l'épreuve afin de mesu
rer une activité g - lactamase.

2.4. Détermination de l'activité enzymatique
L'activité g-lactamase a été recherchée par des mé
thodes reconnues pour leur sensibilité. La spécificité de la
réaction a été confirmée en mesurant l'hydrolyse des 6-lacta-
minés par la perte d'activité antibiotique.
2.4.1. ÜYdro.l_y.sj3 de_la_ nit.rjacé/_inj3
Cette méthode a été décrite par O'Callaghan et a 1.

(263). Cinquante yl d'extrait brut ou de surnageant de culture
ont été mélangés avec 30 yl de nitrocéfine (Glaxo Research

Laboratories) préparée à une concentration de 10 3 M dans du
tampon phosphate [0.1 M , p H 7.0]. Le changement de couleur du
jaune au rouge a été noté au cours d'une période d'incubation
n'excédant pas 24 heures à 3 7° C.
2.4.2. Mé_thcjde^ JHi_çr_ob_io^Lojgi£ue_ jde_dji1fjfu_sij3n_sjlitijd ljî
La procédure consiste à mélanger un volume égal d'an
tibiotique et d'échantillon à analyser. Après une période de
pré-incubation variant de 30 minutes à 24 heures, l'activité
antibiotique résiduelle dans le mélange a été mesurée par une
technique de diffusion à partir de puits creusés dans l'agar
(27). La gélose Muel ler-Hinton (Difco) a été utilisée dans
cette technique. Une souche de Staphylococcus aureus FDA 209P
a permis la révélation des résultats. Elle a été inoculée dans

la gélose à une concentration d'environ 105 cellules/ml. Des
solutions aqueuses de pénicilline G (Ayerst) [6.13 x 10 3 M],
de céphalothine (Eli Lilly & Go.) [2.5 x 10 4 M] , de céphalori-
dine (Eli Lilly & Go.) [1.25 x 10"4 M], de nitrocéfine [10 3 M]
et d'acide 6-aminopénici11anique (Sigma) [10 1 M] ont été étu
diées. Les résultats sont interprétés en comparant les échan
tillons étudiés et les témoins composés d'un antibiotique mé
langé à un volume égal de solution saline. Lorsqu'une fraction
contient une B - lactamase, l'antibiotique est hydro 1 ysé. Il en
résulte alors une diminution de la zone d'inhibition par rap

75
port aux témoins sans B - lactamase.
2.4.3. Méthode microbiologique d1 hydrolyse périphérique
Cette méthode qualitative a été adaptée des techni

ques décrites par Masuda e_t a1 . (222 ) et par Labia et Guionie
(202). Elle a été réalisée dans une gélose Muel ler-Hinton
(Difco) qui contient d'une part l'antibiotique placé dans un
puits ou sur un disque de papier buvard, et d'autre part, la
préparation enzymatique déposée dans un puits situé exactement
sur la périphérie de la zone d'inhibition anticipée. La nitro-

céfine [10 3 M] ainsi que des disques de pénicilline G, de
cloxacilline, de cépha1oridine et de céphalothine (BBL) ont été
utilisés. Un résultat positif est obtenu lorsqu'une altération
de forme concave de la zone d'inhibition est notée après incu
bation de la souche bactérienne révélatrice Staphylococcus
aureus FDA 209P. Des échantillons témoins constitués de milieu
de culture et de solution saline ont également été analysés.

76
3. RESULTATS
La première tentative de détection a été exécutée à
l'aide de la nitrocéfine pour chacune des souches. Dans une
deuxième étape, une confirmation de ce résultat fut entreprise
avec une méthode biologique de diffusion simple ou par la
technique d'hydrolyse périphérique. Compte tenu du caractère
qualitatif des analyses effectuées, les résultats difficiles à
interpréter ont été décrits comme indéterminés (±). Les résul
tats illustrés au tableau 9 résument l'ensemble des expériences
réalisées sur les espèces bactériennes étudiées.
3.1. Les entérobactéries
Les concentrations minimales inhibitrices des souches
de Proteus mirabilis et d'Enterobacter cloacae 1321E sont pré
sentées au tableau 10. Ces valeurs ont permis de fixer la
concentration sub-inhibitrice de pénicilline susceptible d'in
duire une g-lactamase le cas échéant. Les milieux de culture
d'Enterobacter cloacae et de Proteus mirabilis en contenaient
respectivement 30 pg/ml et 1 yg/ml. De plus, l'extrait brut
préparé avec les souches induites avait été repiqué à deux
reprises dans le milieu avec antibiotique. L'hydrolyse de la
nitrocéfine, tant pour les souches induites que non-induites a
pu être observée après une période d'incubation de plus de 3
heures, sauf pour Proteus mirabilis P2 où le changement de
coloration survenait en moins de 10 minutes. L'activité plus
grande de ce dernier a d'ailleurs été observée en hydrolyse
périphérique, quoiqu'aucune des souches n'ait pu modifier la
zone d'inhibition de la cloxaci11ine, de la cépha1 oridine et de
la céphalothine. Nous n'avons remarqué aucune diminution des
zones d'inhibition après 2 heures de pré-incubation. Les ré
sultats obtenus après 24 heures de pré-incubation ont montré
une hydrolyse totale de la pénicilline G pour toutes les sou
ches et une hydrolyse à des degrés variables pour les céphalos
porines. Le 6-APA a été dégradé totalement par Proteus mirabi-
1 is P 2 .
77
HYDROLYSE DE DIFFUSION HYDROLYSE

SOUCHES
LA NITROCÉFINE SIMPLE PÉRIPHÉRIQUE
ANAÉROBIES
Peptococcus
- N.D. -
anaerobius P3
Peptoaoocus
anaerobius P7 - N.D. -
Peptostreptococcus
productus P9
- N.D. -
Streptococcus
- N.D. -
pyoggMgs
ACTINOMYCÈTES
Propionibacterivan
± + ±
acnes 1.1
Propionibacterium
± + -
acnes 1.2
Bifidobacterium sp. ± + -
MYCOPLASME
Mycoplasma
± - -
pneumoniae
ENTÉROBACTÉRIES
Proteus mirabilis
+ + +
PI
Proteus mirabilis
+ + +
P2
Enterobacter
+ + +
cloacae 1321E
Légende: N.D.: non déterminé + : activité 6-1actamase

± : difficile à établir - : pas d'activité
Tableau 9. Activité 3-lactamase des anaérobies, des actinomycètes,

du mycoplasme et des entérobactéries étudiées.
SOUCHES BACTÉRIENNES PÉNICILLINE G AMPICILLINE CÉPHALOTHINE
Enterobacter cloacae 1321E 80 5 40
Proteus mirabilis PI 1.25 1 .25 5
Proteus mirabilis P2 5 1.25 10
Tableau 10. Détermination des concentrations minimales inhibitrices (yg/ml).
00
79
3.2. Les cocci gram-positifs
Les cocci gram-positifs Peptococcus, Peptostreptococ-
cus et Streptococcus ont été sélectionnés sur la base de leur
sensibilité à la pénicilline et à la céphaloridine. Le test
d'hydrolyse de la nitrocéfine s'est révélé négatif pour toutes
les souches étudiées. Ce résultat a été noté après 24 heures
d'incubation, tant pour l'extrait brut que pour le surnageant
de culture. Le milieu Columbia, utilisé comme témoin négatif,
a légèrement modifié la couleur de la nitrocéfine.
3.3. Les actinomycètes
Le test d'hydrolyse de la nitrocéfine n'a pas été
concluant puisque le témoin du milieu de culture a changé de
couleur. Le test d'hydrolyse périphérique a été réalisé avec
des disques de pénicilline G seulement. La méthode biologique,
quant à elle, a permis d'obtenir des résultats positifs (ta
bleau 11).
3.4. L_e mycoplasme
Un dosage d'antibiotique dans le milieu de culture,
le surnageant de culture ainsi que l'extrait brut a permis de
démontrer qu'il y avait une quantité résiduelle d'antibiotique
dans ces échantillons ce qui, par conséquent, pouvait fausser
les résultats de la méthode biologique. Le résultat avec la
nitrocéfine peut s'expliquer par la présence de sérum dans le
milieu de culture. Le sérum de cheval fait tourner la nitrocé

fine en 3 minutes. Pour cette raison, O'Callaghan (262) ne
recommande pas l'utilisation de cette substance pour la détec
tion de B-lactamases chez des micro-organismes qui poussent
dans des milieux contenant du sérum.

ACTINOMYCÈTES FRACTION 6-APA PENI COIN CTIN NFIN
S T T 0 0 0
Bifidobacterium s p.
EB F M 0 0 0
*
S T T T 0 0
Propionibacterium acnes 1.1 * *
EB M T T T F
S M T 0 T T
Propionibacterium acnes 1.2
EB M T 0 0 0
Légende: S = surnageant de culture PENI pénicilline G T hydrolyse totale

EB = extrait brut COIN céphaloridine M hydrolyse intermédiaire
* = hydrolyse totale après 3 CTIN cëphalothine F hydrolyse faible
heures de pré-incubation N FI N nitrocéfine 0 aucune hydrolyse
6-APA - acide 6-aminopënici 11anique
Tableau 11. Activité B-lactamase de Bifidobacterium et de Propioni-

bacterium détectée par la méthode biologique.
81
4. DISCUSSION
4.1. Méthodes d'études
L'analyse des méthodes de détection des 6-1actamases
constituait un des objectifs de ce travail. Il est vraisembla
ble de postuler que les souches bactériennes pour lesquelles il
a été impossible de révéler une 3-lactamase, aient pu être
étudiées avec des méthodes qui n'étaient pas suffisamment sen
sibles. Trois méthodes de détection des 6-lactamases ont été
utilisées au cours de cette étude. Aucune d'entre elles ne
constitue la méthode parfaite quoiqu'elles aient toutes été
choisies pour leur sensibilité par rapport aux autres méthodes
disponibles.
Le test à la nitrocéfine est une technique simple,

rapide et qui possède une grande sensibilité (342). Elle
permet aussi d'analyser tant l'extrait brut que le surnageant
de culture. Ce dernier avantage est particulièrement important
pour la recherche de 6-lactamases extracellulaires, notamment
chez les bactéries à Gram positif, et surpasse par le fait même
la technique d'électrofocalisation où l'on ne peut analyser que

les extraits intracellulaires (224, 367). Cependant, cette
méthode ne donne pas toujours de bons résultats avec les surna
geants de culture. Dans le cas de Mycoplasma par exemple,
l'analyse du milieu de culture était peu réalisable puisqu'il
était jaune tout comme la nitrocéfine. Ce milieu ne permettait
donc pas de faire une lecture adéquate. Néanmoins, le désavan
tage majeur de la nitrocéfine est un manque de spécificité. En
effet, au cours de nombreux essais et conformément aux observa

tions de 0'Callaghan e_t a 1 . (2 63 ) , la nitrocéfine a donné des
réactions positives pour des solutions où il n'y avait pas de

6-1actamase (albumine sérique bovine, sérum de cheval) et pour
des extraits où les protéines étaient dénaturées par la chaleur
(extrait brut chauffé à 100 0 C pendant 15 minutes). Dans la
publication qui décrit les propriétés de la nitrocéfine, O'Cal-
1 a g h an _e_t a1 ♦ (263) précisent que le changement de couleur est

82
presqu' immédiat avec les producteurs puissants de g-lactamases
et requiert une incubation d'environ 30 minutes pour les plus
faibles. Le temps d'incubation qui précède la lecture du
résultat varie cependant d'un auteur à l'autre entre 3 à 10

minutes ( 8_8 , 126) et 1 heure (6^ 164, 263). Pour notre part,
l'incubation a été poursuivie pendant 24 heures dans le but de
mettre en évidence de très faibles quantités d'enzymes, qui
après ce temps donneraient un effet visible et mesurable. Un
résultat positif apparaissant après 1 heure d'incubation est
cependant considéré avec réserves et devrait être corroboré par
d'autres méthodes. D'ailleurs, on pourrait postuler qu'une
autre enzyme soit responsable du changement de coloration lors
qu'un extrait brut prend plusieurs heures pour hydro lyser la
nitrocé fine. O'Callaghan (262) mentionne que la nitrocéfine
peut être hydro lysée par les PBP. Tipper (377) pense qu'il est
possible que le faible niveau d'activité g-1actamase dans les
bactéries soit causé par les transpeptidases et les carboxypep
tidases. Richmond (296) partage la même opinion puisqu'il
n'écarte pas la possibilité que les PBP soient la source de la
faible activité g -1actamase observée chez les souches d'Esche-
richia c o1 i et d'autres bactéries à Gram négatif. C'est pour
cette raison, selon lui, qu'il serait impossible d'obtenir un
mutant qui ne possède aucune activité g-lactamase, sans dé
truire complètement la synthèse normale du peptidog 1 ycan . En
fin, lorsque l'échantillon analysé ne modifie pas la nitrocé-
fine en 24 heures, il est raisonnable de croire que la bactérie
ne possède pas de g-lactamase.
La méthode biologique permet d'utiliser les antibio
tiques à une faible concentration qui donne une zone d'inhibi
tion mesurable. De cette façon, il est possible d'observer une
hydrolyse des substrats étudiés même si la quantité de g -
lactamase dans l'échantillon est peu élevée. Cette méthode est
très sensible et elle permet d'utiliser une vaste gamme d'anti
biotiques. On ne peut cependant pas exclure la possibilité de
réactions non-spécifiques. Par exemple, les substrats peuvent
perdre leur pouvoir antibiotique s'ils se fixent aux protéines

83
(261). La durée de pré-incubation est parfois très longue
avant d'obtenir une réaction visible. Il est alors difficile
de conclure qu'il s'agit d'une 6-lactamase sécrétée en quantité
infinitésimale ou d'une dégradation de l'antibiotique par d'au
tres enzymes bactériennes.
La méthode d'hydrolyse périphérique est plus sensible
et plus rapide que la précédente. Elle permet de détecter de
faibles quantités de 8-1actamase puisque la concentration d'an
tibiotique à hydro lyser est minimale en périphérie de la zone
d'inhibition. On ne peut cependant pas écarter la possibilité
de réactions non-spécifiques.
4.2. Souches bactériennes
La sensibilité des méthodes de détection a été mise à
1'épreuve à l'aide des 3 souches d'entérobactéries. Au cours
d'expériences antérieures, aucune d'entre elles ne présentait
d'activité 8-1actamase lorsqu'elles étaient examinées par la
méthode acidimétrique et par l'électrofocalisation en gradient
de densité. Cette observation contrastait avec le principe
d'universalité des 8-lactamases chez les entérobactéries. En-
terobacter cloacae 1321E est décrit par Goldner _e_t a 1 . (127)
comme un mutant B-lactamase-négatif d'une souche sauvage cons
titutive déréprimée. A l'aide de la technique d'électrofoca

lisation en gel de polyacrylamide, Matthew et Harris (224) y
ont remarqué une activité B-1actamase. Toutes les méthodes que
nous avons étudiées ont permis de mettre en évidence une acti
vité 8-lactamase chez Enterobacter cloacae ainsi que chez Pro
teus mirabilis. L'activité enzymatique des 3 souches se situe
cependant à la limite de détection des méthodes quantitatives
conventionnelles. L'hydrolyse du 6-APA par Proteus mirabilis
P2 permet de supposer que l'activité soit principalement due à
une pénicillinase. Sykes et Matthew (367) ont affirmé que la
plupart des souches gram-négatives possèdent une 8-lactamase
chromosomique. Or, certaines 8-lactamases chromosomiques de
classe I (301) n'hydro lysent pas le 6-APA. C'est le cas par

84
exemple des céphalosporinases d'E nterobacter cloacae et de
Citrobacter freundi (ces résultats ne sont pas décrits dans ce
chapitre). Il est par conséquent possible que l'activité g -
lactamase observée chez Proteus mirabilis soit d'origine extra-
chromosomique. Il est également intéressant de noter que chez
Proteus, il semble exister une relation entre le niveau de
résistance et la présence du caractère indole. Les souches de
Proteus mirabilis, toutes indo 1e-négatives, sont généralement
sensibles aux g-lactamines et possèdent un faible niveau d'ac
tivité g-lactamase. Nous ne savons pas s'il est possible de
relier de quelque façon cette observation à une autre selon
laquelle les Bacteroides fragilis indo 1e-positifs sont généra
lement plus résistants aux g -1actamines que les souches indole-

négatives (163).
Nous avons été incapables de mettre en évidence une
activité de type g-lactamase chez Streptococcus pyogenes. Les
streptocoques du groupe A sont reconnus pour leur sensibilité
aux g-lactamines et pour ne pas avoir de g-lactamase (296). La
présence de g-1actamase chez les autres espèces de Streptococ
cus est d'ailleurs un phénomène peu fréquent. Des études ont
conclu à l'absence de g-lactamase chez des entérocoques (403,
412). On n'a pas pu démontrer de g-lactamase chez Streptococcus
pneumoniae (303, 427). Par contre, Matthew et Harris (224) ont
focalisé une g-lactamase non-transférable chez une souche de
Streptococcus faeca lis et une souche de Streptococcus uberis.
Les auteurs ne précisent pas s'il s'agit là d'une g-lactamase

produite par un transposon. Clewell ( 7_5 ), dans une revue de la
résistance aux antibiotiques chez les streptocoques, signale
que l'absence de g-lactamase chez ce genre peut réfléter leur
inhabilité à 1 'exprimer, à la sécréter, ou que l'expression de
l'enzyme soit létale pour la cellule. Cette hypothèse semble
moins plausible à la lumière d'une découverte récente signalant
la présence d'une g-lactamase transférable chez Streptococcus

faecalis (240 ).
Les résultats qui concernent les souches de Peptococ-

85
eus e t Peptostreptococcus concordent avec ceux d'Aldridge e t

a 1. (6^). Ils nous permettent de penser qu'il n'y a pas de 8 -
lactamase extracellulaire, ni de 8-1actamase liée à la membrane
ou intracellulaire chez ces souches. 1 Aucun des échantillons
analysés n'a réussi à hydro lyser un substrat, même après des
périodes d'incubation allant jusquà 24 heures. Par contre,
nous avons détecté une activité 8-lactamase chez Bifidobacte
rium et Propionibacterium, ce qui permet de croire que la
méthode d'étude utilisée par d'autres chercheurs n'est pas
toujours suffisamment sensible. Par exemple, Aldridge _e_t a 1.
(6_) incubent des colonies avec la nitrocéfine pendant 1 heure à
la température de la pièce. L'hydrolyse du 6-APA par les deux
souches de Propionibacterium et par la souche de Bifidobacte
rium confirme qu'il s'agit d'une 6-lactamase (l'acylase ne peut
pas dégrader le 6-APA). Il est intéressant de souligner le fait
que la nitrocé fine n'est pratiquement pas attaquée, alors que
des substrats comme la pénicilline ou, dans un cas, la céphalo-
ridine subissent une hydrolyse totale. Les B-lactamases d'ac
tinomycètes pourraient bien être uniques sous cet aspect puis
que la littérature ne mentionne pas une propriété analogue chez
d'autres espèces. Les niveaux comparés d'hydrolyse des surna
geants de culture et des extraits bruts suggèrent que la g -
1actamase de Bifidobacterium est une exo-pénici11inase, tandis
que les Propionibacterium acnes présentent plutôt un profil
de g-1actamase à spectre large. Aucune autre publication n'a
jusqu'à présent mentionné de g -1ac tamase chez ces genres.
L'absence de g-lactamase chez Mycoplasma pneumoniae
ne surprend guère si l'on considère que cette bactérie sans
paroi est insensible à la pénicilline. Cet antibiotique est
également utilisé en culture de mycoplasmes pour empêcher la
croissance d'autres bactéries. Ce résultat pourrait appuyer
1'hypothèse d'un rôle pour la g-lactamase dans la synthèse de
la paroi bactérienne telle que proposée par l'équipe de Saz et
collaborateurs (317). Il faut toutefois signaler que l'étude
généalogique des mycoplasmes a révélé qu'ils sont parents avec
les clostridies (417). La littérature présente des évidences

86
à l'effet que des bactéries qui possèdent une paroi cellulaire

comme Clostridium n'ont pas de g-lactamase (voir l'introduc
tion). Par conséquent, il serait pertinent de s'interroger si
l'absence de B-lactamase chez Mycoplasma est liée à l'absence
de paroi ou bien au fait que cette enzyme est apparue plus tard
dans l'évolution des espèces bactériennes, au moment par exem
ple de 1'apparition des bactéries aérobies.
4.3. Universalité
Ce travail sur l'universalité des 6-lactamases a
permis de reviser la validité des méthodes de détection. Il
est possible que d'autres méthodes plus sensibles aient pu
mettre en évidence une activité B-lactamase là où nous avons
échoué. C'est le cas par exemple de techniques chromatographi-
ques avec des substrats marqués. Il faudrait cependant s'assu
rer de ne pas confondre B-lactamases et enzymes de la paroi
cellulaire. Quant aux résultats positifs que nous avons obte
nus, la quantité de B-lactamase était si faible qu'il serait
très difficile d'obtenir cette enzyme en quantité suffisante
pour l'isoler et la caractériser.
La diversité des résultats obtenus dans cette étude
démontre que le principe de l'universalité des B - lactamases est

loin d'être une question bien définie. Les B-lactamases ont
généralement été recherchées chez des souches d'importance
médicale qui montrent une résistance aux B -lactamines. Il y a

manifestement peu d'intérêt, d'un point de vue clinique, à
préciser le rôle des B-1actamases chez des souches qui présen

tent un profil de sensibilité. Dans cette optique, il est
probable que de nombreuses espèces de micro-organismes n'aient
jamais été analysées à fond. Dans l'état actuel de nos con
naissances, il serait plus juste d'affirmer que la B-lactamase
est répandue chez les bactéries à Gram négatif et chez les
bactéries à Gram positif aérobies. Les données de la littéra
ture et nos résultats permettent de croire que la présence de
cette enzyme chez les espèces gram-positives anaérobies facul-

87
tatives et anaérobies strictes soit un phénomène rare et possi
blement accidentel.
La découverte d'un rôle essentiel de la 6-1actamase
dans le métabolisme cellulaire microbien permettrait d'expli
quer pourquoi certaines espèces n'en possèdent pas et quelles
sont les propriétés métaboliques nouvelles qui sont conférées à
une souche par son acquisition. Dans la perspective de ce
travail et de ces questions, il serait intéressant de détermi
ner si la présence de g-lactamase est associée au métabolisme
aérobie des cellules productrices.

CHAPITRE III
Rôle de l'oxygène sur la synthèse des 13-lactamases
88
89
1. INTRODUCTION
Le thème du rôle physiologique principal des 8-lacta
mases est débattu surtout depuis une vingtaine d'années. On a
cru tout d'abord que ces enzymes jouaient un rôle de protection
des bactéries contre les micro-organismes producteurs d'anti
biotiques (285). Il est possible que certaines espèces de
Bacillus aient pu rencontrer des pénicillines et des céphalos
porines dans le sol. Il est cependant peu probable que les 8 -
lactamases de Staphylococcus et des bactéries entériques aient
pu leur procurer un avantage sélectif dans des niches écologi
ques où la concentration d'antibiotiques produits par d'autres

micro-organismes est plutôt faible (330). On a ensuite proposé
que les g-lactamases soient impliquées dans la sporulation

(27 3, 274). Cette fonction essentielle ne serait réservée qu'à
un groupe très limité d'espèces par rapport à l'ensemble des
bactéries productrices de 8-lactamases. Enfin, Saz et collabo
rateurs soutiennent que les 8~1actamases jouent un rôle dans la
synthèse du peptidog1ycan, notamment chez Staphylococcus aureus
(316, 317). Leur thèse s'appuie en outre sur la constatation
que des fragments de peptidoglycan induisent la synthèse d' en

zyme plus efficacement que la pénicilline (333). Cette hypo
thèse comporte cependant deux lacunes. Premièrement, plusieurs
genres bactériens qui possèdent un peptidog1 ycan n'ont pas de
8-lactamase chromosomique comme Clostridium (42, 411), Strepto
coccus (296, 303, 403, 412, 427), Haemophilus et Neisseria
(52). Deuxièmement, les g-lactamases ont été détectées non
seulement chez des micro-organismes qui possèdent un mucopep-
tide dans leur paroi, mais également chez des organismes euca
ryotes comme une algue {66) et des levures (227).
Les 8-lactamases sont présentes chez un grand nombre
d'espèces de bactéries aérobies et anaérobies facultatives
(3 6 7 ), ce qui porte à croire qu'elles jouent une fonction
essentielle dans le métabolisme des micro-organismes. Les
données de la littérature et nos propres observations (chapitre
II) nous ont amené à penser que la présence de 8- lactamase chez

90
les bactéries anaérobies soit un phénomène rare. Par consé
quent, nous avons formulé l'hypothèse que les g- lactamases
interviennent dans un processus métabolique aérobique. Nous
avons entrepris des essais métaboliques avec des souches d'en
térobactéries. Le but de ces analyses fut de vérifier si la
synthèse de g - lactamase est accrue en aérobiose. Nous avons
évalué le rôle de l'oxygène sur la synthèse de g-lactamase
inductibles ou constitutives, en présence ou non de cyanure de
potassium. L'effet de la pénicilline, de la source d'énergie
et de la composition du milieu de culture sur le taux de syn
thèse de g-lactamases fut également mesuré en présence et en
absence d'oxygène.
D'autre part, Grundstrom et Taurin (133) ont démontré
que le gène de la fumarate réductase possède des séquences
communes, au niveau du terminateur, avec l'atténuateur du gène
ampC chez Escherichia coli. Partant de l'hypothèse que deux
gènes qui se suivent sur le chromosome puissent être impliqués
dans une même séquence de réactions métaboliques, nous avons
étudié la possibilité que la fumarase et la g-lactamase soient
la même enzyme. Cette démarche s'appuyait sur les deux argu

ments suivants: i) la f umarase et la g-lactamase peuvent
libérer une molécule d'eau et ii) la fumarase est impliquée
dans un processus métabolique aérobique, le cycle des acides
tricarboxyliques:
fumarate
réductase
SUCCINATE 5 £_..*> FUMARATE MALATE
succinate
fumarase
dëshydrogënase
91
2.1. Souches bac té riennés
La souche de Citrobacter freundii MULB-601 provenait
de la collection du Département de microbiologie, Faculté de

médecine, Université Laval (Québec). Les souches
d'Enterobacter cloacae P 99 et 1321 E ont été obtenues des
laboratoires de recherche Glaxo (Greenford, Middlesex, U.K.).
Les souches d'Escherichia coli LA 3 et TE 18 ont été fournies

par Bengtake Jaurin; Université d'Umea (Umea, Suède).
2.2. Caractéristiques morphologiques et biochimiques des
souches étudiées
Les caractères morphologiques des colonies d'Entero
bacter cloacae et d'Escherichia co1i ont été déterminées sur
gélose au sang et sur milieu (McConkey (Difco). Les caractères
biochimiques ont été évalués sur API 20 E (Analytab Products
Inc.) et dans le milieu OF (Hugh & Leif son) auquel nous avons
rajouté soit du glucose [ 1 %] ou du glycérol [1%]. L'observa
tion des cellules a été réalisée en microscopie électronique
(Philips EM 300). A cette fin, les échantillons ont été prépa
rés à partir d'une culture (bouillon coeur-cervelle, Difco) de
13 heures. Celle-ci fut d'abord centrifugée pendant 10 minutes
à 1,500 g. Le culot des cellules a ensuite été lavé avec 7 ml
d'acétate d'ammonium [0.1 M, p H 7.0] puis centrifugé à nouveau
pendant 10 minutes. Les cellules contenues dans le culot ont
été utilisées pour préparer les grilles. Les spécimens ont été
colorés au phosphotungstate de sodium [2%, pH 7.0].
2.3. Composition des milieux de culture
Les expériences physico-chimiques visant à mesurer le
taux de synthèse des g-lactamases ont été réalisées en milieu
riche ou en milieu minimal. Le milieu riche était constitué de
bouillon coeur-cervelle (Difco). Le milieu minimal était corn-

92
posé de N hUC 1 [5 g/l]; NH4NO3 [1 g/l]; Na SÛ4 [4.54 g/l]; K2HPO4
[3 g/l]; KH 2 PO 4 El g/l]; MgSÛ4.7H2 0 [0.1 g/l]; glucose [10
g/l]. Le KCN a été incorporé au milieu de culture à une con

centration de 10 3 H lorsqu'il a été utilisé.
2.4. Culture des bactéries
Avant chaque expérience dont le but était de mesurer
le taux de synthèse des 6-1 actamases, les souches ont été repi
quées trois fois à intervalles de 12 heures, en milieu riche et
en milieu pauvre. Lors des expériences avec inducteur, les
souches furent induites avec une concentration sous-inhibitrice
d1 antibiotique qui tenait compte des concentrations minimales
inhibitrices de chaque souche. Les cultures en bouillon d'E n-
terobac ter cloacae P 99, d1Enterobacter cloacae 1321 E et de
Citrobacter freundii MULB-601 ont reçu respectivement 500

y g/ml, 50 yg/ml et 500 yg/ml de pénicilline G (Ayers t). L'in
duction des souches a également été réalisée au cours des
repiquages. L'influence des paramètres physico-chimiques a été
évaluée à partir de flacons ensemencés avec un inoculum de

10 5-10 6 bactéries/100 ml. Les milieux de culture ont été placés
à 3 7 0 C, sous une forte et constante agitation en aérobiose et
en anaérobiose dans une chambre contenant 80% d'azote, 10%
d'hydrogène, 10% de dioxyde de carbone et moins de 15 ppm
d'oxygène. L'incubation a duré 12 heures pour les milieux
riches et 15 heures pour les milieux minimaux.
2.5. Préparation des extraits bruts
Les extraits enzymatiques étudiés ont été préparés
conformément à la procédure décrite pour les entérobactéries au
chapitre 11.
2.6. Détermination de 1'activité enzymatique
L'activité des g-lactamases a été analysée au spec
tro photomètre (Varian Cary 219) en utilisant la nitrocéf ine

93
(Glaxo Research Lab.) comme substrat à une concentration de
10~4 M. Les mesures ont été réalisées à 37°C dans du tampon
phosphate [0.1 M, p H 7.4]. L'activité enzymatique des échan
tillons fut déterminée en mesurant la vitesse d'apparition du
produit d'hydrolyse de la nitrocéfine à 486 nm. La vitesse

initiale (Vo), obtenue par calcul, a donné la quantité d'unités
enzymatiques présentes dans chaque échantillon. Une unité est
la quantité d'enzyme qui hydrolyse 1 pmole de substrat par
minute à 37°C. Le dosage des protéines a été effectué par la

méthode de Bradford (4JJ utilisant la y-globuline bovine comme
standard et un réactif commercial (Bio-Rad) pour colorer les
protéines. Il a permis de calculer l'activité spécifique des

échantillons (nombre d'unités enzymatiques par mg de pro
téines) .
2.7. Essais avec ma la te et fumarate
L'activité fumarase de l'extrait brut d'Enterobacter
cloacae P 99 fut déterminée au spectrophotomètre selon la
méthode de Massey (220). Les solutions de fumarate et de
malate (Sigma) [0.05 M] ont été préparées dans du tampon phos
phate [0.033 M] et ajustées à pH 7.3. La transformation du
malate en f umarate ou du f umarate en malate fut mesurée à 300
nm. L'extrait brut d'Enterobacter cloacae 1321 E a servi de

témoin négatif et la fumarase de coeur de porc (Sigma) de
témoin positif. Une unité d'activité a été définie comme la
quantité d'enzyme qui provoque une modification de la densité
optique de 0.01 par minute à 20°C et pH 7.3.

94
3. RESULTATS
3.1. Expériences préliminaires
Deux paires de souches bactériennes ont été consti
tuées afin d'établir une corrélation entre la production de 0-
lactamase d'une part et des caractéristiques morphologiques et
biochimiques d'autre part. Les paires de souches étaient com
posées chacune d'une souche produisant une quantité de 0-
lactamase plus importante que l'autre. La souche sauvage d'En-
terobacter cloacae P 99 a produit environ 20,000 fois plus de
0-lactamase que la souche mutante d'Enterobacter cloacae 1321
E. Escherichia coli TE 18 produit plus de 60 fois la quantité
de 0-lactamase que la souche parente Escherichia coli LA 5

(161). Au cours des étapes d'isolement, nous avons remarqué
des différences dans la taille des colonies, les souches pro
duisant le moins de 0-lactamase possédaient des colonies 2 à 3
fois plus grosses que leur parent respectif. Nous avons
recherché des différences biochimiques entre les souches peu
productrices et les souches hyperproductrices. La comparaison
des tests biochimiques de l'API 20 E et du milieu 0F avec
glucose ou glycérol n'ont pas apporté de renseignements con
cluants. L'observation des cellules en microscopie électroni
que n'a pas permis non plus d'établir une relation entre la
production de 0-lactamase et les caractères morphologiques.
Nos travaux se sont par la suite orientés vers des expériences
physiologiques.
3.2. Influence des paramètres physico-chimiques sur JL ja
synthèse de B-lactamase
Enterobacter cloacae P 99 qui sécrète une 0-lactamase
constitutive et Citrobacter freundii MULB-601 qui fabrique une
0-lactamase inductible furent choisies pour cette étude. La
souche d'Enterobacter cloacae 1321 E, mutante de P 99, a servi
de témoin à cause de sa faible production de B-lactamase.
L'influence de l'oxygène a été déterminée par la croissance en

95
aérobiose par rapport à 11 anaérobiose. Le rôle d'un inducteur
exogène, la pénicilline, a été évalué afin de comparer les taux
de synthèse obtenus avec l'oxygène. Enfin, ces paramètres ont
été étudiés dans un milieu riche et un milieu pauvre dans le
but de vérifier l'influence de la source nutritive sur le
niveau de synthèse de 6-lactamase. Le tableau 12 montre les
résultats issus des expériences réalisées avec ces trois varia
bles. Les valeurs sont exprimées en activité spécifique, ainsi
qu'en pourcentage relatif de g-lactamase produite, par rapport
au niveau de base établi en milieu riche, sans oxygène et sans
inducteur. Deux échantillons n'ont pas pu fournir de résultats
puisque leur croissance n'a pas été satisfaisante dans les
temps d'incubation prescrits. La souche 1321 E possède une g-
lactamase dont la synthèse semble réprimée. Les niveaux d'ac
tivité spécifique sont demeurés très faibles d'une expérience à
l'autre. L'activité enzymatique a été mesurée à la limite de
détection du spectrophotomètre, ce qui nous oblige à considérer
avec réserve les pourcentages relatifs issus de cette souche.
Le taux de synthèse de g-lactamase en conditions d'aérobiose et
d'anaérobiose a été analysé en incorporant au milieu de culture

(milieu minimal) du cyanure de potassium afin de bloquer la
chaîne des accepteurs d'électrons. Le tableau 13 présente les
résultats obtenus avec cet inhibiteur.
3.3. Essai de l'activité fumarase
Une activité de 32 unités par minute a été mesurée
lorsque le ma 1 a te a été transformé par la fumarase commerciale.
Aucune différence sensible d'activité n'a pu être observée
entre l'extrait brut d'Enterobacter cloacae P 99 et celui
d'Enterobacter cloacae 1321 E. L'activité envers le malate et
le fumarate a été inférieure à 1 unité par minute pour les deux
souches.
MILIEU COMPLEXE (B,H,I.) MILIEU MINIMAL
- 02 + 02 " °2 + 02 - o2 + 02 - 02 + o2
- IND - IND + IND + IND - IND - IND + IND + IND
0.00014 0.00019 N.D. 0.00008 0.00009 0.00013 0.00011 0.00012

Enterobaater cloacae
1321E 100 t42 N.D. 57 66 91 78 90
Enterobaater cloacae
5.98186 19.29867 17.17554 21.28973 9.79152 22.95206 22.17395 25.58216
P99 t64
too 323 207 356 384 37t 428
Citrobacter freundii
0.01032 0.01645 2.89436 7.75115 0.01176 N.D. 5.44947 8.39459
MULB-601
too t59 28,059 75,tt6 tt4 N.D. 52,8t0 8t,35t
Légende : * N.D. et N.D.: résultat non déterminé.
* IND : réfère 5 1'induction avec la pénicilline G.
* Les chiffres en caractères gras indiquent des activités spécifiques (Unités/mg de protéines).
* Les chiffres en italique représentent un pourcentage relatif de 6-lactamase qui a été produite,
comparée 3 des bactéries qui se sont développées en milieu complexe, sans oxygène, sans inducteur.
Tableau 12. Effet de l'oxygène, de l'induction et de la composition du milieu

de culture sur la synthèse de 6-lactamase.
- o2 + Og - Og + Og
- KCN - KCN + KCN + KCN
Entevobactev cloacae
0.00015 0.00014 0.00020 0.00017
1321E 700 91 732 770
Enterobacter cloacae
9.93327 20.36259 9.92654 16.31612
P99
700 205 700 764
Cttvobactev fveundii
0.01340 0.01484 0.01370 0.00988
MULB-601 770 702 24
700
Légende: * Les chiffres en caractères gras indiquent des activités spécifiques

(Unités/mg de protéines).
* Les chiffres en italique représentent un pourcentage relatif
de 6-lactamase produite.
Tableau 13. Effet du KCN sur la synthèse de 3-1actamase

en milieu minimal.
lO
98
4. DISCUSSION
4.1. Expériences préliminaires
Des différences dans la taille des cclcnies, entre
des souches qui produisent des quantités différentes de g -

lactamases, ont déjà été signalées par Novick (259). Il men
tionne que les Staphylococcus aureus pénicillinase-positifs ont
des colonies petites et opaques, tandis que les souches
pénicillinase-négatives possèdent des colonies plus grosses et
translucides. C'est la production de grandes quantités de la
protéine pénicil1 inase qui serait responsable, selon lui, de
l'altération de la morphologie des colonies. Pour notre part,
nous n'avons pas pu déterminer à quoi sont imputables ces
différences. La comparaison des caractéristiques biochimiques
et morphologiques des cellules des Enterobacter et des Escheri
chia n'apporte pas d'indices contribuant à éclaircir le phéno
mène. Il se pourrait qu'une synthèse trop importante de g -
lactamase, par rapport aux besoins de la cellule, monopolise
une partie du métabolisme provoquant un ralentissement de la
croissance cellulaire et consécutivement de la division cellu
laire. Cette hypothèse pourrait être vérifiée par un dénombre
ment des cellules dans les colonies. Une autre approche possi
ble consisterait à comparer en culture synchrone le temps de
génération des souches hyperproductrices de g-lactamases et de
leur contrepartie.
4.2. Influence des paramètres physico-chimiques
Les expériences préliminaires nous ont conduit à
retenir les deux souches d'Enterobacter pour les finalités
d'études axées sur la physiologie d'expression de g - lactamase.
En plus du caractère inductible de sa cépha1osporinase, Citro-
bacter freundii a été utilisé pour sa ressemblance biochimique
avec Enterobacter (351). La croissance en présence d'oxygène a
permis d'observer des niveaux plus élevés de synthèse qu'en
anaérobiose. Cette observation est applicable à la souche

99
inductible et à la souche constitutive, que le milieu de cul
ture soit complexe ou minimal et qu'il contienne ou non de la
pénicilline. Ces résultats s'accordent donc avec l'hypothèse
de départ, quoique les taux comparés avec un inducteur connu
des g-lactamases (257) montrent que la pénicilline exerce une
influence beaucoup plus grande sur la souche inductible que

l'oxygène. Pollock (282) avait également démontré la nécessité
de conditions d'aérobiose pour obtenir une synthèse maximale de
la pénici11inase de Bacillus cereus. La situation semble par
contre différente dans le cas de certaines 6 - lactamases plasmi-
diques. Chez Escherichia coli, l'activité spécifique de la 6-
lactamase des cellules poussant en anaérobiose est 3 à 5 fois
plus grande que celle des cellules placées en aérobiose (289).
La production accrue de 6-lactamase en anaérobiose serait cau
sée par une diminution de la croissance cellulaire. Ceci
aurait pour effet d'augmenter le nombre de copies de plasmides
dans les cellules et conséquemment, provoquerait une synthèse

plus grande d'enzymes. Asselin (1_3_) a obtenu les mêmes résul
tats que nous avec les B-lactamases de deux souches
d'Enterobacter cloacae, l'une inductible et l'autre constitu
tive. Il a proposé que la présence d'oxygène provoquerait
l'apparition d'un inducteur interne responsable de la synthèse
de la 6~lactamase.
Le milieu riche sans oxygène et sans inducteur a été
considéré comme le niveau basal de la synthèse de 6-lactamase.
Ce choix part de l'hypothèse suivante: si la 6~lactamase joue
un rôle dans une voie métabolique reliée à un processus aérobi
que comme la respiration, les besoins cellulaires en B-lacta-
mase seraient minimaux en absence d'oxygène puisque les souches
sont toutes anaérobies facultatives. Elles peuvent alors uti
liser une autre voie métabolique comme celle des nitrates pour
accepter les électrons. A l'inverse, le taux maximal devrait
être atteint en milieu minimal avec oxygène et avec induction.
Les résultats de la souche constitutive et de la souche induc
tible abondent en ce sens. En milieu minimal, la bactérie doit
synthétiser la plupart des matériaux dont elle a besoin pour

TOO
croître et se diviser, d'où une demande énergétique supérieure.
Cette énergie est alors fournie par la libération d'électrons
dans le cycle de l'acide citrique en aérobiose. Dans cette
perspective, il est possible qu'il y ait plus de B-lactamases
produites lorsque les besoins énergétiques de la cellule sont
plus grands.
Afin de vérifier si la synthèse de B-lactamase était
reliée à une induction par l'oxygène, nous avons réalisé une
expérience en milieu minimal (où les niveaux de g-lactamase
sont plus élevés qu'en milieu complexe) et en absence d'induc
teur exogène. Le cyanure à la concentration utilisée (1 mM)
avait inhibé fortement la respiration aérobique chez Citrobac-

ter (175). Avec Enterobacter cloacae P 99 et Citrobacter
freundii MULB-601, la présence de KCN en anaérobiose n'a pas
modifié l'activité spécifique des B -lactamases. En aérobiose
par contre, le KCN a freiné l'effet inducteur de l'oxygène.
A première vue, ces résultats suggèrent que la synthèse de B -
lactamase dépend davantage du fonctionnement normal de la
chaîne des transporteurs d'électrons que de l'influence directe
de l'oxygène à d'autres niveaux métaboliques.
4.3. Activité fumarase
Le cycle de l'acide citrique affecte le catabolisme
de l'acétyl-coenzyme A pour fournir le pouvoir réducteur qui
conduit le système de phosphorylation oxydative des cellules
aérobiques. Les séquences de réaction de ce cycle sont égale
ment importantes pour fournir les intermédiaires synthétiques

de la plupart des cellules (2_5_) . Dans les micro-organismes
qui, comme Escherichia coli, possèdent une succinate déshydro-
génase et une fumarate réductase liée à la membrane, la pre
mière enzyme est réprimée pendant la croissance en anaérobiose
et la dernière est réprimée en aérobiose (147). La fumarate
réductase est l'enzyme terminale qui effectue le transfert des
électrons lorsqu'Escherichia coli croît en anaérobiose et que
le fumarate est l'accepteur d'électrons (29). D'après Normark

101
(communication personnelle), il est possible que les niveaux
d'activité g-lactamase plus faibles observés en anaérobiose
soient causés par la proximité du gène f umarate réductase

(f r dB) et du gène codant pour la cépha1osporinase (ampC) comme
chez Escherichia coli (133 ). S'appuyant sur cette observation,
la synthèse accrue de fumarate réductase en anaérobiose impli
querait un nombre élevé d'ARN polymérases sur le gène fr dB.
Ceci aurait pour effet de causer un encombrement nuisant à
l'initiation de la transcription du gène ampC. Nous ne savons
pas si cette explication peut s'appliquer à Enterobacter

cloacae. Bergstrom et a 1. (29) ont confirmé la proximité de
f r dB et de ampC chez Citrobacter f reundii. L'espace qui les
sépare (1100 paires de bases) contiendrait le gène responsable
du caractère inductible de la B-lactamase de Citrobacter.
Selon des expériences d'hybridation qui ont été réalisées par
ces chercheurs, les gènes ampC d'Escherichia et d'Enterobacter
seraient approximativement équidistants de celui de Citrobacter
freundii.
4.4. Conclusions ^
Les bactéries peuvent dériver l'énergie dont elles
ont besoin pour leur croissance à partir d'un nombre considéra
ble de réactions diverses. Ces réactions particulières utili
sées par un organisme donné peuvent changer selon les condi

tions de croissance employées (133). Par exemple, Escherichia
coli est une bactérie anaérobie facultative qui est capable de
dériver l'énergie pour sa croissance de façon fermentative via
la glycol y se, et de façon oxydative, utilisant l'oxygène ou,
sous des conditions d'anaérobiose, le fumarate et le nitrate
comme accepteur final d’électrons. Chez Citrobacter, les trois
accepteurs d'électrons sont l'oxygène, le té trathionate et le
nitrate (174). Dans cette perspective, les résultats obtenus
au cours des expériences physiologiques ne représentent pas
nécessairement de simples relations de cause à effet. Même si
les résultats ont semblé appuyer notre hypothèse de départ (la
synthèse de g-lactamase serait relié à un processus métabolique

102
aérobie), nous ne pouvons ignorer des variables qui ont pu
influencer ces résultats. La composition des milieux de cul
ture est l'une de ces variables. Par exemple, le glucose
contenu dans le milieu minimal peut bloquer la production de

plusieurs enzymes inductibles (278). Cette action résulterait
d'une diminution de la concentration cellulaire d'AMP cyclique.
Nous ne savons pas cependant si ce dernier peut influencer la
synthèse des g-lactamases. D'autres substances qui sont conte
nues dans des milieux complexes peuvent induire la synthèse de
g- lactamase. Cullmann et Dick (87_) ont généralement obtenu des
taux d'activité spécifique plus élevés en milieux complexes
parce que certaines des substances qui y sont contenues comme
le tryptophane, la thiamine, l'acide folique et l'hémine, peu
vent induire la synthèse de g-lactamase chez Enterobacter cloa
cae et Citrobacter f reundii. Mentionnons toutefois qu'une
souche d'Enterobacter cloacae a présenté une augmentation de la
production d'enzyme en milieu minimal mais aucune explication
n'a été fournie sur cette observation. D'autre part, en
bloquant la chaîne des transporteurs d'électrons, le cyanure
inhibe l'oxydation du N ADH et du succinate (3 97 ). Nous ne
pouvons pas préciser dans quelle mesure ces effets ont pu
influencer les niveaux d'activité spécifiques mesurés.
A la lumière de ces arguments, il nous est apparu
évident que les expériences réalisées dans ce chapitre compor
taient des lacunes. Premièrement, notre protocole visait
essentiellement à dé terminer de façon ponctuelle les taux d'ac
tivité spécifique et de les comparer à la fin de la période de
croissance. Conséquemment, les expériences ont été exécutées
sans prendre en considération le stade de croissance de la
culture. Il a déjà été observé que le taux de synthèse de g -
lactamase varie selon l'âge de la culture. Des expériences de
cinétique d'induction réalisées avec Citrobacter freundii et
Enterobacter cloacae montrent que l'activité spécifique des
souches est maximale entre 2 et 6 heures après le début de la
croissance, au cours de la phase exponentielle (.87.) • Sachitha-
n an dam et al. (316) ont obtenu des résultats semblables avec la

103
pénicillinase de Staphylococcus aureus. Deuxièmement, les
expériences n'ont pas été conçues de façon à prendre en consi
dération la régulation de l'expression de la B-lactamase.
Pourtant, les g-lactamases d'Enterobacter et de Citrobacter
n'ont peut-être pas le même mode de régulation. Il est par
conséquent hasardeux de comparer l'effet de diverses variables
entre ces souches. De plus, les augmentations de synthèse qui
ont été observées, peuvent être imputées à l'oxygène ou au
métabolisme aérobie de la cellule. Elles peuvent également
dépendre du mécanisme de régulation de l'expression du gène 3 -
lactamase. Il est possible qu'un répresseur ou un inducteur
interne soit directement affecté par la tension d'oxygène ou la
composition du milieu de culture.
En conclusion, les différences dans la morphologie
des colonies entre les souches, et l'effet du métabolisme
aérobie sur la synthèse de 3-lactamase constituent des indices
qui pourraient permettre d'élucider le rôle physiologique de
cette enzyme. Il nous apparaît néanmoins essentiel de connaî
tre les mécanismes de régulation des enzymes étudiées afin de
mieux contrôler les variables dirigeant l'expression de leurs
gènes.
CHAPITRE IV
Interaction de protéines solubles du foie de rat avec

les B-îactamïnes
104
105
1 . INTRODUCTION
L'inactivation des antibiotiques du groupe des $ -
lactamines chez les mammifères dépend de trois facteurs princi
paux indépendamment de toute activité bactérienne. Ces fac
teurs sont premièrement, une interaction avec les protéines
solubles présentes dans le sérum ou le plasma (4_3 , 2 61, 2 6 3,
307, 383, 414); deuxièmement, une dégradation non-enzymatique
avec des molécules et des ions en solution (142, 131, 216, 30 2,
333); troisièmement, une modification enzymatique. Quatre
familles d'enzymes participent à ce dernier processus. Les
esté rases sont les mieux connues, d'abord parce qu'elles ren
dent actives certaines pénicillines absorbées oralement (74,
408), mais aussi parce qu'elles sont en partie responsables de
la perte d'activité antimicrobienne des céphalosporines qui
possèdent un radical acétoxyméthy 1 e en position 3 (6_Q_, 8_4, 113,
242, 264, 281, 312, 36 2). Les acylases sont également présen
tes dans les tissus animaux (138). Kind je_t j_l. soupçonnent ces
enzymes d'être responsables de l'inactivation de la pénicilline
G et de l'ampicilline dans le foie de rat (182). La dipepti-
dase rénale a récemment été identifiée comme étant l'enzyme
responsable de la destruction des antibiotiques de type pénème

et carbapénème (2_3, 180, 19 7, 229, 343). Enfin, Hamil ton-
Miller (139) a proposé l'hypothèse que les 3-lactamases puis
sent être présentes dans les tissus animaux et participer à
l'inactivation des g -1ac tami nés _in vivo. Cependant, mis à part
quelques évidences circonstancielles, il n'y a pas de données
biochimiques pertinentes qui permettent d'élucider la nature de
ces 3-lactamases animales.
On devrait s'attendre à ce que la distribution des g-
lactamases soit confinée aux micro-organismes procaryotes, si
l'on accepte l'hypothèse qu'elles puissent jouer un rôle dans
un mécanisme physiologique propre aux bactéries, comme la spo

rulation (273, 274) ou la synthèse de la paroi (316, 317). Par
contre, à la suite des travaux présentés dans les chapitres II
et III, nous avons formulé l'hypothèse que la fonction physio-

106
logique primaire des g-lactamases soit commune à la plupart des
êtres vivants et qu'elle ait été conservée dans le processus
évolutif jusqu'aux mammifères. La confirmation de cette hypo
thèse permettrait de prouver que i) elle est associée à une
fonction physiologique qui n'a rien à voir avec la sporulation
ou la synthèse du peptidog 1 ycan et ii) cette fonction est liée
de près ou de loin à un processus métabolique aérobique. Le
but de la présente étude est donc d'établir la présence de g-
lactamase chez le rat. Les méthodes d'études ont été basées
sur l'interaction des protéines de rat avec une gamme d'anti
biotiques représentant les principales classes de g-1actamines,
ainsi que les céphalosporines chromogéniques pyridinium-2-azo-

p-diméthy1-ani1ine chromophore (PADAC) et nitrocéfine.
107
2.1. Antibiotiques et autres produits chimiques
Les g-lactamines suivantes ont été utilisées. Pé-
names : pénicilline G, carbénici11ine et cloxacilline (Ayerst);
méthicilline et oxacilline (Bristol Laboratories); ticarcilline
(Beecham Laboratories, Inc.); pipéraci 1 line (Cyanamid Canada,
Inc.); ampicilline (Sigma Chemical Co.) ; acide 6-aminopénicil-
lanique [6-A PA] (Aldrich Chemical Co. Inc.) ; azlocilline (De 1-
bay Research Co.); mécillinam (Hoffman-Laroche). Pénème: SCH
29482 (Shering Corporation). C1 a v ame: acide clavulanique
(Bristol Research Laboratories). Carbapénème: N-formimi-
doy1-thiénamycine [imipénème ] (Merck, Sharp & Dohme Research
Laboratories). Céphèmes: céphapirine (Bristol Research Labora
tories); céphazoline, céphalexine, céphalosporine C, cépha-
lothine et céfamandole (Eli Lilly & Co.); céphaloridine (Sigma
Chemical Co.); acide 7-aminocépha 1osporanique [7-ACA] (Aldrich
Chemical Co., Inc.); ceftazidime, nitrocéfine et céfuroxime
(Glaxo Groups Research, Inc.); céfoxitine (Merck, Sharp & Dohme
Research Laboratories); céfotaxime (Roussel Canada, Inc.);
ceftriaxone (Roche) ; céfopérazone (Pfizer Canada, Inc.);
céphradine (Squibb); ceftizoxime (Smith, Kline & French Labora
tories) ; pyridinium-2-azo-p-diméthy 1-ani 1ine chromophore [PADAC]
(Calbiochem-Behring Corp.). Oxacéphème: moxalactame (Eli Lilly
& Co.). Monobactame; azthréonam (Squibb).
L'imipénème ainsi que le composé MK 0791 (cilastatin)
ont été obtenus du Dr Helmut Kropp (Merck, Sharp & Dohme Re
search Laboratories).
L'acylase I d'Aspergi 1 lus s p. et de rein de porc ont

été achetées commercialement (Sigma).
2.2. Animaux
Les rats Spra gue-Daw1ey ont été obtenus de Charles

108
River Canada, Inc. (5t-Constant, (Québec)) et maintenus sous
des conditions standardisées de lumière (06:00 - 18:00 h) et de
température (21 - 22 °C). Ils ont été nourris avec de la moulée
Purina L a b C ho w et ont reçu de l'eau et des aliments a d 1 ibitum
jusqu'à ce qu'ils soient sacrifiés. Au moment des expériences,
les rats mâles pesaient de 250 à 500 g. Les rats axéniques
étaient des femelles âgées de 8 semaines qui pesaient environ
200 g.
2.3. Préparation des organes
Le cerveau, le coeur, le foie, les poumons, la rate
les reins et les yeux d'un rat ont été prélevés, puis coupés en
petits morceaux avant d'être homogénéisés dans 2 volumes de
sucrose [0.25 M ] à l'aide d'un broyeur à tissus. Après une
première centrifugation à 600 g (10 minutes), le surnageant a
été centrifugé à nouveau à 10,000 g. Le culot ainsi obtenu a
été resuspendu dans 2.5 ml de sucrose [0.25 M] et soumis aux
ultrasons (Artek, modèle Sonic 300, muni d'une pointe intermé
diaire) à 180 W de puissance relative pendant 2 minutes.
2.4. Préparation du foie de rat
Les rats ont été anesthésiés à l'éther U.S.P. Le
foie a été perfusé in situ via l'artère hépatique avec une
solution de NaCl [ 0.86% poids/volume] stérile afin d'enlever
les cellules sanguines. Le débit de la perfusion était réglé à
25 ml/minute pendant 10 minutes. Les perfusions ont été consi
dérées satisfaisantes lorsque la couleur de l'organe était uni
formément beige en apparence. Le foie a été retiré de l'animal
puis coupé en petits morceaux en prenant soin d'enlever le plus
de tissu vasculaire possible. Il a été ensuite placé dans un

broyeur de tissus de type Potter-Elvehjem (Kontes), d'une capa
cité de 45 ml et avec un espacement de 0.10 à 0.15 mm. L'homo
généisation a été réalisée dans 50% (poids/volume) de tampon
phosphate [0.1 M, pH 7.4 ] conservé sur glace.

109
2.5. Localisation de _1 ja fraction 1a plus active de
1 1 homoqénat
L'homogénat a été fractionné afin de déterminer la
fraction cellulaire qui possède la plus forte activité enzyma
tique. Le protocole expérimental utilisé était basé sur la

méthode de T and 1e r et Hoppel (371). L'homogénat a été soumis à
3 centrifugations successives (figure 8) afin d'isoler les
organe lies cellulaires. Les précipités obtenus ont été resus
pendus dans 50% (poids /volume) de tampon phosphate [0.1 H , pH
7.4], puis soumis aux ultrasons pendant 3 minutes avant d'être
centrifugés à 30,000 g. L'activité enzymatique envers le PADAC
a été déterminée par dosage spectrophotomé trique des surna
geants.
2.6. Préparation des extraits enzymatiques
Les extraits enzymatiques qui ont été utilisés pour
les fins d'analyse et de purification ont été obtenus à partir
de la fraction soluble des cellules de foie. L'homogénat de
foie a d'abord été centrifugé à 30,000 g (Beckman, modèle 02-
21) pendant 20 minutes à 0° C. Le surnageant obtenu a ensuite
été centrifugé à 100,000 g (IEC, modèle B-60) pendant 30 mi
nutes à 00 C. Après chacune des centrifugations, les lipides à
la surface du surnageant ont été éliminés. L'extrait brut
provient du surnageant final qui a été filtré à travers un
filtre de 0.22 y m (Mil lipore). Il a été conservé à -65° C avant
d'être utilisé.
Les extraits bruts d'Enterobacter cloacae 16 7 2 E et
d'Escherichia co1 i TEM ont été préparés selon la procédure
présentée au chapitre II.
2.7. Chromatographie
Les extraits enzymatiques bruts de foie ont été fil
trés dans une colonne de chromatographie contenant du Sépharose

no
FOIE
HOMOGÉNAT
Centrifugation
(600 g , 10 minutes)
SURNAGEANT PRÉCIPITÉ (gros débris)

- Matériel nucléaire
- Membranes plasmiques
- Cellules non brisées
Jltrasons Centrifugation
(30, OO'o g , 30 minutes)
Centrifugation
(10,000 g , 10 minutes)
SURNAGEANT CULOT
(éliminé)
SURNAGEANT PRÉCIPITÉ (fraction mitochondriale)

- Mitochondries
- Lysosomes
Ultrasons Centrifugation
(30,000 g , 30 minutes)
Centrifugation
% 000 g , JO minutes; SURNAGEANT CULOT
(éliminé)
SURNAGEANT PRÉCIPITÉ
(fraction soluble) (fraction microsomale)
(éliminée)
Figure 8. Procédure expérimentale utilisée pour

fractionner 11homogénat de foie.
in
4B (Pharmacia). Les colonnes ont été équilibrées et éluées
avec du tampon phosphate [0.1 M, pH 7.4] et du Na C1 [0.25 M ] .
La procédure expérimentale est détaillée au chapitre V. La
concentration des fractions actives a été accomplie par ultra
filtration à l’aide d'une membrane DIAFLO PM 10 (Amicon Corp).
2.8. Détection de l'activité enzymatique
L'activité hydrolytique des extraits d'organes de rat
a été mesurée par un test in vitro où 50 y1 d'extrait d'organe

ont été mélangés avec 50 yl de nitrocéfine [ 10~3 M ] ou de PADAC
[5 x 10-4 M]. L'activité enzymatique de l'extrait de foie a
été démontrée en suivant avec un spectrophotomètre la modifica
tion des substrats chromogéniques PADAC et nitrocéf ine. Le

PADAC, préparé à une concentration de 5 x 1 0 _4 M, change de
couleur du violet au jaune lorsqu'il est hydro lysé par une g -
lactamase (334). La procédure employée avec ce substrat est la
même que celle décrite au chapitre II pour l'hydrolyse de la
nitrocéfine. La méthode microbiologique de diffusion simple
ainsi que la méthode microbiologique d'hydrolyse périphérique
ont été également appliquées selon le protocole établi au
chapitre II. L'imipénème a été préparé à une concentration de

1 x 10 “3 M.
2.9. Essais de l'activité enzymatique
Le mélange réactionnel était composé de 800 yl de
tampon phosphate potassique [0.1 M, pH 7.0] pré-chauffé à 370 C,

et de 100 yl d'une solution de PADAC [5 x 10-4 M] ou de nitro
céf ine [1 x 10-3 M ]. Ces solutions ont été déposées dans une
cuvette de spectrophotomètre qui possède un parcours optique de
1 cm. Après que la température se soit équilibrée à 37 0 C dans
la cuvette à l'aide d'un porte-cuvette chauffant, l'essai enzy
matique a été amorcé en ajoutant 100 yl d'extrait enzymatique.
L'activité enzymatique a été déterminée suivant la diminution
de la densité optique à 573 nm pour le PADAC ou l'augmentation
de la densité optique à 486 nm pour la nitrocéfine dans un

112
spectrophotomètre Varian Cary 219. La cuvette de référence
contenait du tampon et de l'extrait enzymatique, mais pas de
substrat. Les vitesses initiales ( V o) ont été mesurées,
donnant après calcul la quantité d'unités enzymatiques présen
tes dans l'échantillon. Une unité de g-lactamase hydrolyse 1
ymole de substrat par minute à 3 7° C et à p H 7.0. Le contenu en
protéines a été estimé selon une méthode développée par Brad
ford (Zpl ) . La y-globuline bovine qui a été utilisée comme
référence standard ainsi que le réactif qui colore les pro

téines sont préparés commercialement (Bio-Rad Laboratories).
2.10 Essais de compé tition
Trente-deux molécules appartenant à 7 sous-classes de
g-1actamines ont été étudiées pour leur pouvoir d'inhiber l'hy
drolyse de la nitrocéfine et du PADAC. Elles ont toutes été

préparées dans du tampon phosphate [0.1 M, pH 7.0], à une
concentration de 10 ~2 M. Cent yl de la solution précédente ont
été substitués à un volume équivalent de tampon dans le milieu
réactionnel de l'essai spectrophotométrique. Le tampon, la

céphalosporine chromogénique (PADAC ou nitrocéfine) et la g -
laetamine compétitive ont été ajoutés successivement. La réac
tion fut amorcée avec l’extrait brut de foie, la pénici11inase
d'Escherichia coli T E M ou la céphalosporinase d'Enterobacter
cloacae 1672 E. Tous les essais ont été réalisés en triplica
ta. Le pourcentage d'inhibition de l'hydrolyse du PADAC et de
la n itrocé fine a été calculé par rapport à un essai témoin
réalisé en omettant la g-lactamine compétitive. La significa
tion des résultats a été déterminée par le test de Student sur
des données non-pairées (332). Des contrôles ont été effectués
en omettant l'addition de l'extrait enzymatique dans le mélange
réactionnel ou bien en omettant d'ajouter la céphalosporine
chromogénique.
2.11. Méthode iodomé trique
La production d'acide pénicilloi que a été testée par

113
la méthode iodométrique selon la procédure décrite par Ross et

O'Callaghan (311). Un volume de 100 ml d'amidon de maïs [0.2%]
a été ajouté à 0.15 ml d'un réactif composé d'iode [0.08 M ] et
d'iodure de potassium [3.2 M ]. La pénicilline G, utilisée
comme substrat, a été dissoute dans du tampon phosphate [0.1 H,
p H 7.0] à une concentration de 0.20 m M. L'analyse des
échantillons consiste à placer dans un tube à essai 1 ml de la
solution d'amidon-iode, 1 ml du substrat, 0.9 ml de tampon
phosphate et 0.1 ml de l'échantillon à analyser. La céphalos-
porinase d'Enterobacter cloacae 1672 E a été utilisée comme
témoin positif. Des essais contrôles ont été exécutés pour la
solution d'enzyme et la solution de substrat.
2.12. Essais immunologiques
Le sérum de rat a été obtenu par ponction cardiaque
d'un rat Sprague Dawley. Le sérum de chèvre anti-albumine de
rat a été prélevé par le Service des animaux de laboratoire de
l'Université Laval. La zone d'équivalence a été mesurée à 50
yg d'antigène pour 60 y1 de sérum. Le sérum de chèvre normal a
été obtenu du Laboratoire de virologie de l'Université Laval.
L'effet du sérum anti-albumine de rat sur 1'extrait
enzymatique brut de foie a été évalué au spectrophotomètre. La
présence d'albumine dans l'extrait a été mesurée par immunopré

cipitation sur lame selon la technique d'Ouchterlony (272). Un
tampon TRIS [0.01 M, pH 7.6] a été utilisé pour diluer le sérum
de rat et l'extrait de foie. Le test a été réalisé sur des
lames de microscope. Un système à 7 puits a été creusé dans
1 'agarose. Les solutions étudiées ont été placées dans chaque
puits en 2 volumes successifs de 5 y 1 .

114
3. RESULTATS
3.1. Détection d'une activité hydrolytique dans différents
organes du rat
Sept organes du rat ont été analysés par un test
qualitatif pour démontrer leur capacité d'hydrolyser deux
céphalosporines chromogéniques. Les résultats ont indiqué que
tous ces organes possèdent la capacité d'hydrolyser la nitrocé-
fine en moins de 5 heures. Seul l'extrait de foie possède la
capacité de transformer le PADAC qui, comme la nitrocéfine, a
donné un résultat positif après moins de 20 minutes d'incuba

tion (tableau 14). Toutefois, la lecture des résultats a été
difficile pour les organes qui contenaient du sang : la lyse des
globules rouges au cours de l'homogénéisation a causé une
interférence quant à une détermination adéquate du changement
de la coloration du PADAC et de la nitrocéfine. C'est pour
cette raison que le foie a été perfusé dans les étapes suivan
tes. De plus, il faut noter que certains organes comme le
coeur, les poumons et les reins n'ont pu être homogénéisés
totalement, ce qui peut expliquer en partie leur résultat
négatif ou faiblement positif.
3.2. Localisation de 1a fraction 1 a plus active du foie de
rat
Dans l'essai précédent, l'activité était présente
principalement dans la fraction du surnageant 10,000 g. Afin
de localiser la fraction cellulaire dans laquelle se situe
cette activité hydrolytique, le foie de rat a été fractionné
par une procédure de séparation des organelles cellulaires.
L'activité spécifique la plus importante a été mesurée dans le
surnageant 30,000 g correspondant à la fraction soluble compre
nant une grande partie des protéines cytoplasmiques des cel
lules de foie (figure 9). La fraction soluble utilisée dans

NITROCÉFINE PADAC
ORGANES
A B C A B C
CERVEAU + + ± - - -
COEUR + + ± - - -
FOIE + + + -
POUMON + + ±
- - -
RATE + + ±
- - -
REIN + + + - - -
YEUX + + + - - -
Légende: a = surnageant 600 g + = résultat positif

g = surnageant 10,000 g - = résultat négatif
C = précipité 10,000 g ± = résultat imprécis
(traité aux ultrasons) (changement de
couleur partiel)
Tableau 14. Détermination d'une activité hydrolytique envers

les céphalosporines chromogëniques (PADAC et nitro-
cëfine) dans différents organes du rat.
HOMOGÉNAT
SURNAGEANT CULOT
Ultrasons 30, 000 g
SURNAGEANT CULOT SURNAGEANT CULOT

6.97 x IO"*
Ultrasons 30,000 g
SURNAGEANT CULOT SURNAGEANT CULOT

14.72 x IO"* 2.17 x IO"*
Figure 9. Localisation de 1 'activité hydrolytique de 11homogénat

de foie envers le PADAC. Les résultats sont exprimés
en activité spécifique (Unités/mg de protéines).
117
les étapes qui suivent a été obtenue après une centrifugation à
100,000 g, dans le but de maximiser le rendement et d'éliminer
le plus d'impuretés possibles dans 1'extrait enzymatique brut.
3.3. Modification de céphalosporines chromoqéniques
L'activité de la fraction soluble des cellules de
foie de rat et d'un extrait partiellement purifié sur Sépharose
4B a été étudiée envers le PADAC et la nitrocéfine. Des ana
lyses de contrôle ont été exécutées avec un surnageant brut
dénaturé par la chaleur et deux solutions d'acylase commer
ciale, une de source procaryote et l'autre de source eucaryote,
préparées à une concentration de 1000 unités/ml (tableau 15).
Ces résultats ont été obtenus par un test in vitro où l'on note
simplement le changement de coloration. Nous avons noté au
cours de ces tests que le PADAC hydrolysé avait tendance à se
décolorer, c'est-à-dire de perdre sa coloration jaune, caracté
ristique de la rupture du lien (3-lactame. Le spectre d'ab
sorption du PADAC et de la nitrocéfine intacts, puis hydrolysés
par le surnageant de foie a été mesuré au spectrophotomètre.
De plus, les spectres obtenus ont été comparés à ceux qui ont
été enregistrés lorsque ces substrats sont hydrolysés par la
céphalosporinese d'Enterobacter cloacae. Les balayages ont été
réalisés dans le spectre visible. Ils ont révélé que les
produits de dégradation du PADAC et de la nitrocéfine par
l'extrait de foie avaient les mêmes caractéristiques d'ab
sorption que ceux qui ont été mesurés avec la g-lactamase
bactérienne (figure 10).
3.4. Essais biologiques
L'activité du surnageant de foie filtré sur Sépharose
4B a été évalué sur 9 g-lactamines par une méthode biologique
de diffusion simple et une méthode dite d'hydrolyse périphéri
que. La nitrocéfine et la céphalothine ont présenté la plus
grande sensibilité à l'hydrolyse. L'imipénème et l'ampicilline

118
ÉCHANTILLONS ANALYSÉS NITROCÉFINE PADAC
CONTRÔLE NÉGATIF
(tampon phosphate 0.1 M) - -
EXTRAIT BRUT DE FOIE

(surnageant 100,000 g) + +
EXTRAIT DE FOIE FILTRÉ

(Sépharose 4B) 4- +
EXTRAIT BRUT TRAITÉ À LA

± -
CHALEUR (60 °C, 5 minutes)
ACYLASE I
(.Aspergillus sp.) - -
ACYLASE I
(rein de porc) ± -
Légende: + = réaction positive en 5 minutes

± = réaction positive après une longue
exposition (> 1 heure)
- = réaction négative
Tableau 15. Activité d'échantillons de surnageants de

foie et d'acylases commerciales envers les
céphalosporines chromogéniques PADAC et
nitrocéfine.
119
PADAC
Absorbance
Longueur d'onde (nm )
NITROCEFINE
Absorbance
Longueur d'onde (nm )
Figure 10. Analyse spectrophotométrique des céphalosporines chromogé

niques (---------) et de leur produit d'hydrolyse avec une B-lac-
tamase d'Entevobactev cloacae (........ ) et avec le surnageant
de foie (———4.
120
n'ont pas subi de modification. Le PADAC a conservé une acti
vité inhibitrice après 6 heures de pré-incubation, même si le
changement de couleur du violet au jaune semblait complété

(tableau 16). L'extrait brut de rats axéniques a été soumis à
ces essais afin d'écarter le risque que ces résultats puissent
être dus à des contaminations bactériennes. Un test de stéri
lité a été réalisé par écouvillonnage du côlon et ensemencement
sur gélose sang et dans un bouillon "cooked meat". Ces milieux
ont été incubés à 37 0C en aérobiose et en anaérobiose. Aucune
croissance n'a été observée après 4 jours d'incubation.
3.5. Recherche d'une $-lactamase par la méthode
iodomé trique
La présence d'une g-1actamase est révélée dans cette
méthode par la décoloration du réactif amidon-iode qui possède
une teinte bleue. La réaction est considérée comme positive
lorsque la décoloration survient en moins de 10 minutes. Nos
résultats ont montré que cette méthode n'est pas adéquate pour
mettre en évidence une g-lactamase dans les tissus animaux

(tableau 17). Pour les extraits de foie, la décoloration s'est
effectuée rapidement et complètement en moins de 3 minutes,
qu'il y ait ou non de la pénicilline. La cépha1osporinase
d'Enterobacter cloacae a, quant à elle, permis de vérifier la
validité de la méthode pour les g-lactamases bactériennes. Il
faut noter néanmoins que l'échantillon contrôle où l'on avait
omis de placer du substrat, a subi une décoloration, mais
beaucoup plus lente excédant 10 minutes.
3.6. Essais de compétition
Les essais de compétition entre les g-lactamines et
les céphalosporines chromogéniques ont permis d'obtenir des
renseignements utiles quant à la nature de l'activité présente
dans l'extrait de foie de rat. Partant du fait que le PADAC et

121
MÉTHODE MÉTHODE DE DIFFUSION SIMPLE*
BÊTA-LACTAMINES d'hydrolyse
1 heure ** 6 heures
PÉRIPHÉRIQUE TÉMOIN FOIE TÉMOIN FOIE
PÉNICILLINE G + 25 23 23 . 20
6-apa 35 33 31 27
-
42 42 39 39
AMPICILLINE -
CÉPHALOSPORINE C + 31 23 29 20
CÉPHALORIDI NE 33 31 28 25
-
CÉPHALOTHINE + 31 1 4 29 N.I.
N ITROCÉFI NE + 39 N.I. 38 N.I.
PADAC + 32 25 29 21
IMIPÉNÈME N.D. 56 56 N.D. N.D.
Légende : + = hydrolyse de l'antibiotique a la limite de la zone d'inhibition
- = résultat négatif
* = diamètre de la zone d'inhibition (en mm)
** = temps de pré-incubation de 1'antibiotique et de 1'échantillon
N.I. = absence de zone d'inhibition
N.D. = résultat non déterminé
Tableau 16. Activité du surnageant de foie envers 9 g-lactamines

évaluée par deux méthodes microbiologiques.
122
ÉCHANTILLONS CONTRÔLE
ANALYSE
ANALYSÉS SANS SUBSTRAT
EXTRAIT BRUT BACTÉRIEN

+ +
{Enterobactev cloacae 1672E)
EXTRAIT ENZYMATIQUE DE
+ +
FOIE (ACTIF)1
EXTRAIT ENZYMATIQUE DE
+ +
FOIE (PAS ACTIF)2
Légende : + résultat positif: décoloration en moins de 3 minutes

± décoloration lente et progressive
i surnageant 100,000 g
2 chauffé à 60°0 pendant 5 minutes
Tableau 17. Résultats de la méthode iodométrique.

123
la nitrocéfine étaient hydro 1ysés par ce dernier, nous avons
supposé que des concentrations de g-lactamines, 10 fois supé
rieures à celle de la nitrocéf ine et 20 fois plus grandes que
celle du PADAC, permettraient à un substrat d'une enzyme
présente dans le surnageant de foie d'être facilement détecté
s'il compétitionne avec l'une ou l'autre des céphalosporines
chromogéniques. Les témoins cépha1osporinase d'Enterobacter
cloacae et pénici11inase d'Escherichia co1 i TE M ont permis de
vérifier la validité de la méthode et des solutions d'antibio
tiques utilisées. Ils ont constitué un moyen de comparer les

résultats obtenus avec l'extrait de foie.
Les résultats ont été calculés à partir de la formule

^ x 10 0 où "x" est la moyenne des V o obtenus avec le témoin
(extrait brut de foie + substrat chromogénique) et "y" est la
moyenne des V o obtenus avec l'essai (extrait brut de foie +
substrat chromogénique + 6-1actamine). Les résultats signifi
catifs sont présentés en italique (tableaux 18-A et 18-B). Le
seuil de signification des résultats a été établi pour p<0.05.
Toutes les g-lactamines ont compétitionné avec les
céphalosporines chromogéniques lorsque la céphalosporinase
d'Enterobacter a été utilisée, à l'exception du mécillinam
envers la nitrocéfine. Les pourcentages ont révélé en outre
1 'affinité relative de la g-lactamine pour l'enzyme. Par
exemple, l'activité de la céphalosporinase envers la nitrocé
fine et le PADAC a été moins réduite en présence des céphèmes
dits de première génération qu'avec les molécules des autres
familles de g-lactamines. Pour la pénici11inase TEM, la compé
tition des g-lactamines avec les céphalosporines chromogéniques
s'est exercée davantage avec le groupe des pénames et le pénème
5CH 29482. L'écart entre les pourcentages d'activité observés
en présence de PADAC ou de nitrocéfine dans le groupe des
céphèmes peut s'expliquer par une plus grande activité de la
pénie i 11inase envers la nitrocéfine. Il est difficile d'expli
quer l'efficacité de la pénicillinase en présence de mécilli-
nam, d'acide clavulanique et d'imipénème. Il est possible que

NITROCÉFINE PADAC
SUBSTRATS
FOIE 1672E TEM FOIE 1 672E TEM
PÉNAMES
Pénicilline G 111.68 2.95 0 106.80 0.76 9.08
6-APA 92.39 0 0.22 98.64 0.22 37.59
Méthicil line 94.22 0.29 0.24 87.94 0 0.22
Ampicilline 97.44 0 35.08 94.71 0.22 22.87
Oxacilline 101.87 0 2.23 74.16 0 0.52
Cloxacilline 99.92 0 27.92 50.59 0 6.25
Carbénicilline 95.61 . 0 9.47 95.35 0 2.26
Ticarcilline 106.02 0 20.86 100.12 3.02 3.04
Mécillinam 102.29 86.26 94.21 80.86 23.22 94.97
Azlocilline 93.75 0 20.60 74.82 0 6.43
Pipëracilline 105.65 0.58 54.47 96.41 2.52 25.72
PÉNÈME
SCH 29482 63.94 0.29 0.32 97.71 0 0.22
CLAVAME
Acide clavulanique 97.90 5.00 108.60 101.63 2.22 100.08
MONOBACTAME
Azthréonam 35.30 0 94.27 102.73 0.22 106.70
CARBAPÉNÈME
Imipénême 92.44 2.32 117.02 114.71 2.68 83.95
INHIBITEUR DE LA PEPTIDASE
Cilastatin (MK0791) N.D. N.D. N.D. 89.47 N.D. N.D.
Tableau 18-A. Résultats des essais de compétition (suite page suivante).

NITROCÉFINE P AD AC
SUBSTRATS
FOIE 1 672E TEM FOIE 1 6 72 E TEM
CÉPHÈMES
Céphalosporine C 99.39 62.86 94.86 101.37 60.58 57.24
7-ACA 106.40 23.20 97.36 98.91 22.52 86.90
Céphalothine 95.25 20.70 69.23 94.87 7.56 45.63
Cëphaloridine 98.66 62.47 (%.09 91.33 25.73 63.72
Cëphalexine 114.70 20.84 80.00 96.68 33.66 97.97
Céphazoline 113.32 39.86 94.66 84.75 7.56 81.28
Céphapirine 104.44 9.30 80.00 87.85 4.53 65.02
Cëphradine 110.69 44.45 94.66 98.80 (%. 34 93.97
Céfamandole 98.35 0.39 104.18 96.74 3.02 79.28
Cëfoxitine 85.67 0.08 117.02 95.81 0 94.53
Céfuroxime 99.34 0 83.90 93.38 0 73.08
Céfotaxime 105.96 0 96.65 85.98 0.22 229.70
Cëfopërazone 101.42 3.02 89.71 97.66 2.22 49.38
Ceftazidime 96.16 0.49 99.03 96.11 0 102.34
Ceftriaxone 92.81 0 96.65 85.06 0 99.19
Ceftizoxime 108.26 0.20 91.89 97.56 0 98.02
OXACÉPHÈME
Moxalactam
CO
98.71
r-,
r-'.
0 98.85 0.22 110.99
Légende: - Les résultats sont exprimés en pourcentage.
- Les chiffres en ita ique indiquent les résultats avec p < 0.0 5 .
- 1672E et TEM référé it respecti vernent 3 la cëphalosporinase d'E'nterobacter cloacae et 3 la

pënicillinase plasm dique d'Esaheriahia coli.
Tableau 18-B. Résultats des essais de compétition (fin).

126
l'effet d'inhibition attendu aurait pu être observé si une
pénicilline avait été utilisée à la place des céphalosporines
chromogéniques. Les résultats obtenus avec l'extrait de foie
démontrent que l'activité enzymatique hépatique envers la
nitrocéfine et le PADAC diffèrent considérablement des profils
obtenus avec une céphalosporinase et une pénicillinase. Les
deux molécules qui ont compétitionné avec la nitrocéfine, le
pénème 5CH 29482 et le monobactame azthréonam possèdent peu de
caractéristiques communes, mis à part le cycle azé tidinone

(voir figures 2 et 4). Ces antibiotiques n'ont pas provoqué le
même effet avec le PADAC. Quatre molécules de pé names, 1'azlo
ci 1 1 ine , le mécillinam, l'oxacilline et la cloxacilline, ainsi
que deux céphèmes, la ceftriaxone et la céfotaxime, ont c om pé
titionné avec le PADAC de façon significative.
3.7. Mesure de 1'inhibition par 1a céfotaxime
Suite aux résultats précédents, nous avons tenté de
mesurer la nature de la compétition entre une g-lactamine et
l'extrait de foie. Un profil d'inhibition a été réalisé avec
la céfotaxime. Les vitesses initiales (V o) ont été dé terminées

avec des concentrations croissantes (0.125 à 5 x 10 ~5 M) de
PADAC avec et sans la céfotaxime [10 ~3 M ] au spectrophotomètre,
avec un extrait enzymatique brut de foie. Les droites de
Lineweaver-Burk qui ont été obtenues suggèrent le type d'inhi
bition compétitive (figure 11). La grande dispersion des
valeurs mesurées nous oblige cependant à considérer ce résultat
avec réserves.
3.8. Détection de 1a peptidase rénale
Dans le but de confirmer que l'activité enzymatique
observée dans l'extrait de foie n'était pas due à une enzyme
similaire à la dipeptidase rénale, des essais à la méthode
biologique et au spectrophotomètre ont été réalisés avec l'imi-
pénème et le cilastatin, respectivement substrat et inhibiteur
de la dipeptidase.
80
1/V 40
0?.Q^
200000 400000
1/[S]
Figure 11. Droites de Lineweaver-Burk représentant l'inhibition de l'extrait de foie par la cefota
xime. La droite de régression A correspond au PADAC seul (O) et la droite B au PADAC +
céfotaxime (S). La constante K1 = 1.833 x IO-4 M. Les unités de 1/[S] sont en M™1 et
celles de 1/V en ptrole”"1 .minute. rv)

128
L'essai de détection par la méthode biologique de
diffusion simple a permis de constater que l'imipénème n'est
pas hydrolysé par l'extrait de foie (tableau 16). L'absence de
compétition entre l'imipénème et les céphalosporines chromogé

niques a confirmé l'observation précédente (tableau 18-A). Par
ailleurs, le cilastatin a été soumis à un essai analogue de
compétition avec l'extrait de foie et le PADAC. Cette substan
ce n'a pas causé d'inhibition significative de l'enzyme.
3.9. Effet de 1'albumine
O'Callaghan et al. (263) ont signalé la capacité du
sérum et de l'albumine sérique de modifier la couleur de la
nitrocéfine. Les expériences suivantes ont été réalisées afin
d'établir la présence d'albumine dans l'extrait de foie ce qui
pourrait expliquer les résultats obtenus précédemment avec la
nitrocéfine d'une part et de déterminer la stabilité du PADAC
envers le sérum de rat d'autre part.
Un test in vitro a été effectué avec du sérum de rat
(tableau 19). Les résultats ont démontré que le changement de
coloration du PADAC et de la nitrocéfine est plus rapide avec
l'extrait brut de foie. Le PADAC a donné un résultat positif
avec le sérum après 15 heures d'incubation. Nous avons ensuite
vérifié au spectrophotomètre si un sérum anti-albumine de rat
pouvait inhiber la réaction de 1 'extrait de foie envers le
PADAC. Le sérum de chèvre a été placé en contact avec l'ex
trait brut pendant 8 heures. Des mesures d'activité ont été
exécutées à toutes les deux heures. Un sérum normal de chèvre
a été utilisé comme témoin. Les résultats obtenus ont montré
que le sérum de chèvre anti-albumine de rat n'a pas modifié
l'activité de l'extrait brut envers le PADAC. Les courbes
d'activité ont révélé l'instabilité de l'activité enzymatique
du foie qui a diminué progressivement avec le temps (figure
12). Une dernière analyse a été réalisée par immunodiffusion.
Après seulement 24 heures d'incubation, les systèmes sérum
anti-albumine de rat versus sérum de rat ont formé des lignes

129
ÉCHANTILLONS NITROCÉFINE PADAC
ANALYSÉS
T = 10 T = 60 T = 10 T = 60
EXTRAIT BRUT
+ + + + + + + + + + +
DE FOIE DE RAT
SÉRUM DE RAT '+ + + - -
Légende: T = 10, T = 60 : temps de la lecture en minutes

+ + + : changement de la coloration rapide et intense
+ + : changement de coloration moins rapide
+ : peu de changement de coloration
- : pas de changement de coloration
Tableau 19. Activité de l'extrait brut et

du sérum de rat envers les
cëphalosporinés chromogëniques.
0.8
T
Vo
(A D.O./min)
temps (heures)
Figure 12. Détermination spectrophotométrique de l'activité avec un sérum de chèvre normal (#) et un sérum
de chèvre anti-albumine de rat (O) sur l'activité enzymatique de l'extrait de foie de rat (■).
GO
O
de précipitation alors que les systèmes sérum anti-albumine
versus extrait brut de foie n'ont pas formé de précipité, même
après 48 heures d'incubation (figure 13).

132
Légende : A = sérum de rat dilué 1/10

B = Il II II
1/20
C = Il II II
1/40
D = Il II II
1/80
E = Il II II
1/160
F = il II II
1/320
G extrait brut de foie dilué 1/10

H 1/20
I 1/40
J 1/80
K 1/160
L 1/320
Puits du centre = sérum anti-albumine

de rat
Figure 13. Immunodiffusion sur lame.

133
4. DISCUSSION
Trois procédures sont utilisées fréquemment pour

étudier le métabolisme des antibiotiques dans un organisme : i)
i n _v par analyse des métabolites excrétés dans l'urine et
les fécès; i i ) jui situ par perfusion d'un organe comme le foie
et, iii) i_n vitro avec des cellules isolées. L'apparition de
métabolites au cours de ces études est tributaire de la capa
cité des molécules de pénétrer dans les cellules. Il a été
démontré qu'un certain nombre de g-1actamines, comme la péni
cilline, peuvent entrer dans les cellules; le degré de pénétra
tion dépendrait de facteurs tels que la nature des chaînes

latérales (103) et la solubilité dans les lipides (189). Le
sujet de la pénétration des antibiotiques dans les cellules de

mammifères est cependant difficile à cerner (383). C'est dans
le but de contourner ce phénomène que nous avons jugé essentiel
d'étudier la dégradation des g-lactamines dans des homogénats
de tissus.
Nous avons recherché une activité de type g-1actamase
chez le rat. Les essais préliminaires ont indiqué que le foie
possédait une telle activité. Quant aux autres organes analy
sés, l'activité était soit trop faible pour être décelée, ou
simplement inexistante. La nette différence dans la capacité
de la plupart des tissus d'hydrolyser la nitrocéfine, mais pas
le PADAC, permet de douter de la spécificité de ces réactions.
Le PADAC est reconnu pour sa grande stabilité et son insensibi
lité face aux agents réducteurs (334), contrairement à la
nitrocéfine qui peut donner des réactions faussement positives

avec ces agents (263). De plus, le PADAC n'est pas influencé
par le contenu en protéines des spécimens biologiques, quoique
les réactions avec ce substrat soient généralement plus lentes
qu'avec la nitrocéfine (l_9, 166). L'hydrolyse des deux cépha
losporines chromogéniques par les protéines solubles des cel
lules de foie de rat est survenu très rapidement avec les
caractéristiques d'une activité g-lactamase. Les essais biolo
giques ont démontré la capacité des surnageants de rat d'inac

134
tiver des g-lactamines connues comme la pénicilline G, le 6-
APA, la céphalosporine C, la céphalothine et la cépha1oridine.
Il est connu depuis longtemps que certaines g-laetamines puis
sent subir une hydrolyse au niveau hépatique. Ce n'est pas
surprenant puisqu'une des fonctions du foie consiste à b i o-
transf ormer diverses substances endogènes ou exogènes. Ce qui
est moins connu cependant, ce sont les mécanismes qui gouver
nent ces réactions.
Les spectres d'absorption des produits de dégradation
du P ADAC et de la nitrocéfine se sont révélés semblables à ceux
que l'on peut obtenir avec une g-lactamase bactérienne. Ce
résultat permet de supposer qu'il y a une enzyme hydrolytique
du PADAC et de la nitrocéfine dans le foie. On peut relier le
faible pic du PADAC dégradé avec l'observation de Jorgensen et

a 1. (16 7) qui ont signalé la possibilité que certains micro-
organismes puissent attaquer directement le radical chromophore
avec ou sans hydrolyse du lien g-lactame. Le PADAC devient
incolore le cas échéant. Il est donc permis de présumer que la
molécule puisse subir plus d'une dégradation car nous avons
également observé ce phénomène suivant 1'apparition de la cou
leur jaune caractéristique de la rupture du cycle g-lactame.
Les expériences avec des préparations d'acylase com
merciale ont permis de confirmer la plus grande sensibilité de
la nitrocéfine par rapport au PADAC et d'établir la spécificité
de la réaction acylase vis-à-vis de la nitrocéfine. Le pic
d'absorption de la nitrocéfine dégradée par 1'acylase est à
^4 9 5 nm versus -486 nm lorsqu'elle est dégradée par une g -
lactamase bactérienne. Le produit de dégradation de la nitro
céfine par l'extrait de foie possédait un pic d'absorption qui
se situe plus près de cette dernière valeur. On ne peut cepen
dant pas écarter la possibilité que la nitrocéfine puisse subir
plusieurs dégradations, tout comme le PADAC. Ce dernier a par
ailleurs démontré une résistance à l'hydrolyse par les acylases
d'Asperqil lus et de rein de porc. Il est certain qu'une acy
lase n'est pas responsable de l'inactivation partielle du 6-APA

135
puisqu'il ne possède pas de chaîne latérale en position 6 (138,
150). Nos résultats semblent par conséquent en accord avec les
travaux de English ejt _aju. (104) qui n'ont pas détecté d'activi
té acylase dans des extraits broyés de tissus chez le rat.
Des études pharmacocinétiques ont reconnu la sensibi
lité des céphalosporines, avec un radical acétoxyméthyle en
position 3, à l'action des estérases sériques. Il est probable
qu'une enzyme de ce type soit responsable de la dégradation de
la céphalothine (113, 362) et de la céphalosporine C (162). A
notre connaissance, personne n'a isolé ou caractérisé une telle
enzyme dans le foie bien qu'elle soit présente principalement
dans cet organe (4^4). La perte totale de l'activité antibacté
rienne de la céphalothine laisse cependant présumer qu'une
autre enzyme ait pu agir sur cette molécule car le métabolite
dé sacéty 1-cépha1othi ne conserve une partie de son pouvoir anti-

microbien (189, 409).
La possibilité que l'activité enzymatique hépatique
puisse être l'effet de la peptidase rénale a été écartée.
L'extrait de foie n'a pas attaqué l'imipénème. Le cil astat in
de son côté n'a pas modifié l'activité enzymatique de l'extrait
de foie envers les céphalosporines chromogéniques. A l'inver
se, la nitrocéfine est insensible à l'action de la peptidase
(197). On a donné le nom de B-lactamase à la peptidase rénale

puisqu'elle provoque l'ouverture du cycle 3-1 actame (180, 197,
345). Pourtant l'imipénème possède une structure chimique
assez éloignée de celle des pénicillines ou des céphalospo
rines. En plus d'être un carbapénème, elle présente une chaîne
latérale inverse de celle des B-lactamines classiques, en po
sition 6. Il semble, par conséquent, que le terme B - lactamase
puisse comprendre une variété d'enzymes très différentes chez
les organismes supérieurs.
Dans toutes les études pharmacocinétiques que nous
avons consultées, il nous est apparu qu'à l'exception de l'im
plication des estérases, la plupart des B-lactamines modifiées

136
chimiquement sont stables in vivo , assurant des niveaux san
guins et un recouvrement urinaire adéquats. Nos observations
ont néanmoins mis en évidence une faible perte d'activité
antimicrobienne du 6-APA, de la pénicilline G et de la céphalo-
r i dine jjn v itro. Nous avons envisagé qu'une faible activité 8-
lactamase d'origine eucaryote soit responsable de cette diminu
tion d'activité. La possibilité qu'une g-lactamase bactérienne
puisse avoir dégradé ces antibiotiques a été repoussée car les
mêmes résultats ont été obtenus avec des rats axéniques. Cra
be r et a 1. (131) soulignent la difficulté d'identifier le
mécanisme de dégradation de la pénicilline dans l'organisme.
Il faut considérer par conséquent qu'il puisse être attribué à
un processus métabolique ou spontané. Par exemple, le lien 6-
lactame est instable ce qui rend les g-lactamines sensibles aux
attaques nucléophiles _i_n vitro (151, 335 ). Les pénicillines
subissent une hydrolyse analogue à l'action d'une g-lactamase
avec production d'acide pénici11oique biologiquement inactif.
O'Callaghan et Muggleton (264) ont étudié le métabolisme de la
céphalosporine C et d'autres substances apparentées par des
homogénats de tissus de différentes espèces animales. Le foie
de rat produit rapidement un métabolite microbiologiquement
inactif qui est un dérivé acide hydroxylé du composé mère. Les
pertes d'activité peuvent également survenir lorsque les anti
biotiques se lient aux protéines de l'organisme. Kornguth e t
a 1. (190) rapportent que des antibiotiques comme la pénicilline
G, la céphalothine et la céphalexine sont liés _in vitro par une
macromolécule présente dans les surnageants 100,000 g d'homo
génats de foie de rat. La protéine purifiée rappelle la 1igan
din e isolée par Litwack _e_t a1 . (211) dans le foie de rat.
L'antibiotique lié à cette protéine est microbiologiquement

inactif. Kunin (199) signale une diffusion réduite en milieu
gélifié des antibiotiques mis en présence d'homogénats de tis
sus. Il attribue ce phénomène à une liaison électrostatique.
L'albumine sérique de rat peut causer des effets irréversibles
sur plusieurs g-lactamines. Bruderlein e_t _a_l. (5_1_) remarquent
l'instabilité des pénèmes dans le sérum et attribuent la des
truction du cycle g-1actame à une liaison irréversible à 1 'a 1-

137
bumine. 0'Callaghan (261) pour sa part rapporte la propriété
de protéines sériques, dont l'albumine, de réagir avec la
nitrocéfine. Nous avons donc vérifié l'interférence possible
de l'albumine sur nos résultats. Aucune évidence substantielle
n'est venue appuyer cette hypothèse. Nous avons d'abord con
firmé que le produit de la réaction de la nitrocéfine avec le

sérum possède un pic d'absorption à 510 nm (263). Ensuite,
l'analyse spectrophotométrique et l'immunodiffusion avec un
sérum anti-albumine de rat ont permis de constater que le rôle
joué par l'albumine dans l'activité de l'extrait brut de foie
est nul ou négligeable.
Les essais de compétition ont jeté un éclairage sup
plémentaire sur la nature de l'activité enzymatique dans l'ex
trait de foie. Le fait que des molécules comme le 6-APA, la
pénicilline G, la cépha1oridine, la céphalothine et la céphalo
sporine C n'aient pas compétitionné avec le PADAC et la nitro
céfine illustre que ces molécules sont de mauvais substrats
pour l'enzyme étudiée qui dégrade ces derniers. Elle possède
aussi peu d'affinité pour les autres g-lactamines. Dans le cas
contraire, les vitesses d'hydrolyse du PADAC et de la nitrocé
fine auraient subi une diminution sensible. Par contre, d'au
tres molécules se sont révélées inhibitrices. En regard des
substances qui corn pétitionnent avec le PADAC et la nitrocéfine,
il semble que l'on ait affaire à deux activités différentes
envers les g-lactamines dans l'extrait de foie. La diminution
de l'activité envers la nitrocéfine causée par le pénème est
troublante puisqu'elle va dans le sens des observations de

Cruder 1 ein e_t a_l. (5_l) et O'Callaghan (261), signalées dans le
paragraphe précédent. D'autre part, la compétition entre le
PADAC et des molécules de g-lactamines plus classiques comme
des pénames et céphèmes suggère fortement que l'on puisse être
en présence d'une g-lactamase plus classique. L'inhibition
partielle de l'activité envers le PADAC par la céfotaxime n'est
pas sans rappeler la même propriété que possède cette substance
à l'égard de certaines g-lactamases bactériennes. D'autres
enzymes animales peuvent également être inhibées par des g-

138
lactamines. C'est le cas notamment de l'alanine aminopeptidase
humaine qui est inhibée par la cloxacilline, l'oxacilline et la

méthicilline (358), ainsi que de la peptidase pulmonaire
humaine également inhibée par ces substances mais surtout par

la céphalexine (349).
L'impureté relative de l'extrait enzymatique et la
difficulté d'établir si celui-ci dégrade, lie ou métabolise les
8-lactamines posent le problème d'une méthode d'étude adéquate.
Celle-ci devrait permettre de déterminer qu'il existe une g -
lactamase dans les tissus animaux en prouvant que le produit
d'hydrolyse d'une g-laetamine correspond à la rupture du lien
g-lactame. D'ailleurs, quoiqu'il soit possible de faire cette
démonstration avec les pénicillines par la détection d'acides

pénici11olques, il serait difficile de faire cette preuve avec
les céphalosporines qui, à l'exception de la nitrocé fine (2 63),
sont instables après hydrolyse (142). Dans cette optique, nous
avons tenté sans succès de confirmer par la méthode iodométri
que la dégradation de la pénicilline. La multitude de pro
téines qui sont présentes dans le foie pourrait expliquer notre
échec; il est ainsi possible que des enzymes ayant la propriété
de modifier l'amidon soient à l'origine de la décoloration non-
spécifique qui a été observée. La méthode acidimétrique n'est
pas adéquate parce que le surnageant de foie est tamponné. Les
essais spectrophotométriques sont limités aux substrats qui ont
leur spectre d'absorption dans le visible, comme le PADAC et la
nitrocéfine. Quant aux autres molécules qui absorbent dans
l'ultra-violet, la quantité de protéines présentes dans l'ex
trait brut rend cette méthodologie inapplicable. Les essais de
compétition nous ont donc apparu comme étant la seule méthode
permettant de contourner le problème de 1'impureté de 1'extrait
brut, à défaut d'une autre méthode, pour étudier son interac
tion avec des g-lactamines. La détection des produits d'hydro
lyse serait possible en utilisant une technique de chromato

graphie liquide à haute pression (HPLC). Cependant, elle a
avantage à être réalisée à partir d'extraits enzymatiques puri
fiés afin de limiter la présence de contaminants et d'être

139
assuré que l'activité mesurée résulte d'une protéine définie.
Il est remarquable qu'après 40 années d'utilisation
thérapeutique des 6 -1actamines, le métabolisme de ces antibio
tiques ne soit encore que partiellement élucidé. Le rôle du
foie dans la dégradation des g -1actamines peut être complexe et
multifactoriel. Cependant, il semble possible que le foie
possède un type inhabituel de g-lactamase. Compte tenu de
l'impureté des extraits enzymatiques utilisés, il serait préfé
rable que les essais puissent être effectués à partir de pro
téines purifiées. Cette considération fera l'objet du chapitre
suivant.
CHAPITRE V
Caractérisation de l’activité B-lactamase des cellules

de foie de rat
140
141
1. INTRODUCTION
La sécrétion d'une g-lactamase constitue l'un des
principaux moyens de défense des organismes procaryotes contre
les antibiotiques du groupe des g-lactamines. Cette fonction
est consistante avec la toxicité sélective qu'exercent ces
antibiotiques envers les bactéries, comparée à leur inocuité
relative vis-à-vis la plupart des cellules eucaryotes. Consé
quemment, peu d'études se sont appliquées à définir le sort des
g-lactamines dans les organismes eucaryotes. Plus récemment,
on a reconnu une activité g-lactamase associée avec l'enzyme

dipeptidase rénale (197).
Les données obtenues dans le chapitre précédent sug
gèrent que plusieurs enzymes capables de dégrader les g-lacta-
mines sont présentes dans les cellules eucaryotes. L'utilisa
tion du PADAC, une céphalosporine chromogénique, a constitué un
outil déterminant pour le repérage d'une activité de type g -
lactamase dans les cellules de foie de rat. Nos observations
ont indiqué que l'enzyme hépatique ne possède pas les mêmes
propriétés que la dipeptidase rénale.
La présence d'une g-lactamase dans les cellules de
foie de rat pourrait contribuer à déterminer leur rôle physio
logique essentiel. Dans cette optique, nous avons entrepris de
purifier et de caractériser l'activité g-lactamase des cellules
de foie de rat afin de pouvoir comparer ses propriétés enzyma
tiques et physico-chimiques avec les g-1actamases bactériennes.

142
2.1. Produits chimiques et antibiotiques
Tous les produits chimiques utilisés dans la prépara
tion des tampons étaient des réactifs de qualité analytique.
Les produits chimiques suivants ont été obtenus de Sigma Chemi
cal Co. : dithiothréitol , TRIS-base, TRIS-HC1 , acide 6-aminoca-

proïque, 2-mercaptoéthano1, trypsine, pepsine, protéase fongi
que (protéinase K de T ritirachium album), aprotinine, leupep-
tine, acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), adénosine
5'-triphosphate (A T P), chlorure de thiamine pyrophosphate
(cocarboxylase), pyridoxal 5'-phosphate (codécarboxy1ase), fla
vine adénine dinucléotide (PAD), g-nicoti namide adénine dinu-
cléotide (N AD), g-nicotinamide adénine dinucléotide réduit
( N ADH), nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (N AD P) ,
nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit ( N ADP H),
standards de poids moléculaires (dextran bleu, albumine sérique
bovine, ribonucléase A, chymotrypsinogène A, thyroglobuline,
ferritine, catalase et ovalbumine). Le p-ch1oromercuribenzoate
(pCMB) a été obtenu de Nutritional Biochemical Corporation.
Les g-1actamines ont été gracieusement fournies : la
nitrocéfine par Glaxo Research Ltd; le pyridinium-2-azo-p-

diméthyl-aniline chromophore (P ADAC ) par Calbiochem Behring
Corp.; la céfotaxime par Roussel Canada Inc.; la céphalosporine
C par Eli Lilly & Co.
Le Sépharose 4B, le Séphadex G-25, le Séphacryl 5-200
et le diéthy1aminoéthy1 (DEAE) - Séphadex A-50 ont été achetés
de Pharmacia Fine Chemicals. L'acrylamide, le N , Nméthy1ène-
bis-acrylamide, le N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine
(TEMED), le persulfate d'ammonium et le bleu de Coomassie R-250
provenaient de Bio-Rad Laboratories.

143
Le concentré d'organosi1 ane (Prosil-28) a été acheté
de PCR Research Chemicals Inc. Les ampholytes porteurs ont été
obtenus de LKB-Produkter AB.
L'agar et la caséine de boeuf non-hydrolysée sont des
produits de Difco Laboratories.
2.2. Préparation de l'extrait enzymatique de foie
L'extrait enzymatique utilisé au cours de ces expé
riences a été obtenu et préparé selon la procédure décrite au
chapitre IV. Le terme extrait brut de foie fait référence à la
fraction du surnageant 100,000 g filtré.
2.3. Purification de l'activité de type R-lactamase
2.3.1. üriiciPitüticm a.ve.c_lj3 su 1/a.te. d.' amm.orîjjm_
Le sulfate d'ammonium a été ajouté à l'extrait brut
de foie. La préparation a été placée dans un bain de glace et
soumise à une agitation constante. La précipitation des pro
téines a été amorcée avec 33% de sulfate d'ammonium. Chaque
addition de sulfate d'ammonium a été suivie d'une période
d'incubation de 30 minutes après laquelle la solution a été
centrifugée pendant 10 minutes à 9000 g. Le sulfate d'ammonium
a été ajouté au surnageant par tranches de 5% jusqu'à 60% de
saturation. Les précipités ont été dissous dans 1 ml de tampon
TRIS [0.05 M , pH 7.5].
2.3.2. Chromatôçj.ra.ph.ie. d.'.af_fin.i_té
2.3.2.1. Préparation de la colonne
Cinquante ml de Sépharose 4B ont été lavés dans un
filtre Buchner avec 2 litres d'eau distillée puis avec 3 litres
d'eau ajustée à pH 12 avec du Na0H [4 M]. L'activation au
bromure de cyanogène a été faite dans le double du volume

144
d'agarose (ex: 2 5 ml d'agarose + 25 ml d'eau [pH 12]). L'acti
vation a été amorcée en plaçant dans un bain de glace la solu
tion de Sépharose 4B puis le bromure de cyanogène finement

broyé à raison d'environ 200 m g/g d'agarose. L'activation
s'est poursuivie pendant 15 minutes en maintenant le pH à 11
avec du Na0H 4 M. Le Sépharose activé a ensuite été lavé
rapidement avec 2 litres d'eau distillée, puis avec 3 litres de
tampon bicarbonate [0.1 M , pH 8.3]. Le couplage a été exécuté
dans le tampon bicarbonate à 40 C en ajoutant la substance à
coupler (céphalosporine C ou céfotaxime) à la solution de
Sépharose. La concentration de substance à être couplée est de
1 g par 50 ml d'agarose, et elle doit d'abord être dissoute
dans le tampon bicarbonate avant d'être ajoutée à la solution
de Sépharose en proportions finales 1:1. Le tout a ensuite été
placé sous agitation pendant 24 heures. Le blocage des sites
non couplés a été exécuté en plaçant le Sépharose dans un
tampon bicarbonate [0.1 M, pH 8.0] auquel on a ajouté de la
glycine [0.2 M] pendant 12 heures à 40 C. Le mélange Sépharose-
cépha1osporine a été lavé avec 3 litres de tampon bicarbonate
[p H 8.0] puis avec 2 litres de Na C1 [0.01 M] avant de 1'intro
duire dans une colonne de chromatographie.
2.3.2.2. Déroulement de la chromatographie
L'extrait brut de foie a été chromatographié à un
débit de 10 0 ml/heure à 40 C. La nature des produits élués a
été analysée à l'aide d'un spectrophotomètre (LKB, Uvicord II,
série 8 3 00 ) et enregistrée graphiquement (Fisher Recordai 1,
série 5000). L'élution des protéines de l'extrait brut a été
exécutée avec de l'eau distillée jusqu'à ce que la densité
optique (absorbance à X = 283 nm) de l'éluat atteigne zéro. La
g-lactamase est ensuite décrochée en augmentant la force ioni
que de l'é luant à l'aide de N a C1 [1 M]. Les colonnes ont été
régénérées par lavage avec du tampon phosphate [0.05 M, pH 7.4]
contenant de 1 'azide de sodium [0.2 g/l], et conservées à 40 C.
Le repérage des fractions contenant l'activité B-lactamase a
été réalisé à l'aide du PADAC.

145
2.3.3. J3hjrojna_to_grjapj2ij3 j|c_ha_[ige.uj5e_d/_i cm_s
La purification sur DEAE - Séphadex A-50 a été réali

sée selon les instructions publiées par le fabricant (Ion
Exchange Chromatography, Principles and Methods. Publication X,
Mars 1980. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suède). Le pH
du tampon de départ et le pH d'élution de l'enzyme furent
établis par un essai en tubes à la température de la pièce.
L'essai a été fait avec du tampon TRIS pour une gamme de p H
s'échelonnant de 7.3 à 8.7, avec des intervalles de 0.2 unité.
La colonne de DEAE-Séphadex A-50 a été équilibrée avec du
tampon TRIS [0.05 M, p H 8.9]. La colonne a été lavée avec le
même tampon pour éluer les protéines non adsorbées, puis avec
du tampon TRIS [p H 7.7] contenant du NaCl [0.2 M] pour décro
cher l'enzyme. Le repérage des fractions actives a été effec
tué avec du PADAC.
2.3.4. F)i_l t_ra_t içm_sLir_gj31__
Vingt à trente ml d'extrait brut ont été placés dans

une colonne de Séphacryl 5-200 (2.5 x 90 cm) équilibrée à 4°C
avec du tampon TRIS [0.1 M, pH 8.0] contenant du NaCl [0.5 M]
et de 1'azide de sodium [0.2 g/l]. Les protéines ont été
éluées au rythme de 100 ml/heure. La concentration des pro
téines dans l'éluat de la colonne a été estimée en mesurant la
densité optique dans un spectrophotomètre (LKB, Uvicord II,
série 8300) à une longueur d'onde de 283 nm. L'information
recueillie est transmise à un enregistreur graphique (Fisher
Recordall, série 5000). Les fractions (10 ml chacune) ont été

récoltées et analysées avec PADAC [10-4 M] ou nitrocéfine
[10~3 M] pour détecter l'activité enzymatique. Le dextran
bleu, l'albumine sérique bovine, la ribonucléase A et la chymo-
trypsinogène A ont été utilisés comme marqueurs de poids molé
culaires .
D'autres expériences de filtration ont également été
réalisées dans de petites colonnes (seringues de 50 ml) et de

146
plus petites quantités d'extrait brut (3 à 5 ml). Ces essais
ont été réalisés avec 3 types différents de gels: Séphacryl 5-
200, Séphadex 0-25 et Sépharose 4B. Ils ont été équilibrés
dans un tampon phosphate [0.1 H, p H 7.4] à 4° C. Le débit a été
fixé à 1.6 ml/min. L'éluat a été récolté par fractions d'envi
ron 5 ml chacune.
2.3.5. Ultrafiltration
La concentration des protéines a été accomplie par
ultrafiltration dans un bain de glace avec une membrane

filtrante DIA F L 0 PM 10 (Amicon Corp.) qui retenait les molé
cules de poids moléculaire supérieur à 10,000.
2.4. Essai de l'activité de type g-lactamase
L'activité g-lactamase a été détectée et mesurée
selon le protocole expérimental décrit au chapitre IV. La
plupart des expériences ont été réalisées dans du tampon phos
phate [0.1 M] à moins qu'il soit indiqué autrement. Les me
sures ont été réalisées en triplicata et les milieux réaction
nels ont été gardés à 50 C avant les essais sauf indications
contraires. Les essais enzymatiques ont été exécutés au spec-
trophotomètre à 37 0 C. Les cuvettes contenant le tampon et
l'extrait de foie ont été préchauffées au bain-marie à environ
38 0C et la température vérifiée avec un thermocouple avant
d'ajouter le substrat. L'activité enzymatique a été déterminée
avec le PADAC comme substrat pour la plupart des expériences.
L'utilisation de la nitrocéfine sera signalée le cas échéant.
Pour les expériences réalisées à différents temps, une quan
tité suffisante d'extrait brut, de substance à analyser et de
tampon sont mélangés ensemble à t = 0, pour tenir compte des
réactions de l'enzyme diluée dans le milieu réactionne 1 avec la
substance à analyser. Par exemple, lorsqu'un échantillon subit
une mesure à 5 temps, les solutions sont placées dans des tubes
à essais en verre d'une capacité de 5 ml dans les proportions
suivantes: tampon 3.85 ml, substance à étudier (pCMP, EDTA, ion

147
ou autre) 0.55 ml, extrait brut 0.55 ml. Au moment de la
mesure, 900 yl de ce mélange réactionne 1 seront placés dans la
cuvette du spectrophotomètre et 100 yl du substrat. Les con
centrations des produits dont il sera question dans la section
"résultats", correspondent aux concentrations finales dans la
cuvette. L'activité enzymatique a été dé terminée en mesurant
la vitesse initiale de la réaction (V o) exprimée en Adensité
optique ( A D.O.) par minute. Une unité d'activité enzymatique
correspond à la quantité d'enzyme qui hydrolyse 1 ymole de
substrat par minute à 3 7° C et à pH 7.0.
2.5. Essai des protéases dans l'extrait brut
L'activité protéase de l'extrait brut a été estimée
par une méthode adaptée d'un essai intitulé: "Easy protease
detection with a tablet", tiré du bulletin "BioRadiations

# 82-0276" (Bio-Rad Laboratories). Il consiste à préparer une
solution aqueuse contenant 1% d'agar et 1% de caséine de boeuf
non-hydrolysée dans du tampon phosphate [0.05 H, p H 7.2]. Le
tout est porté à ébullition puis coulé dans des boîtes de
Pétri. On creuse des puits dans le gel solidifié et on y place
les échantillons à analyser. La révélation est réalisée après
24 heures d'incubation à la température de la pièce, en rajou
tant de l'acide acétique [ 3%] à la surface de la gélose. Trois
enzymes protéolytiques ont été étudiées comme témoins: tryp
sine, pepsine et protéase fongique.
2.6. Electrofocalisation
2.6.1. .EljiC_tro.fo.cj3l_isjjtjLoj2 _en_gj3l_dj3 £.°i.y_§.cHyl.aniijde_
L'électrofocalisation en gel de polyacrylamide a été
exécutée avec le système LKB Multiphor à partir de la méthodo
logie décrite dans la brochure LKB 1818-P intitulée "Introduc
tion for high-performance analytical electrofocusing in 0.5 mm
thin-layer polyacrylamide gels" (LKB-Produkter AB, Bromma,
Suède).
148
Le gel a été préparé en ajoutant 2.1 ml d'acrylamide
[29.1% ( P / V )] , 2.1 ml de bis-acrylamide [0.9%] , 0.9 ml d'ampho-
lytes porteurs (pH 3.5 à 10.0) et 7.2 ml d'eau bidistiliée. Ce
mélange a été dégazé avant d'ajouter 0.3 ml de persulfate
d'ammonium [1% ]. Cette solution de gel a été coulée entre des
plaques de verre impeccablement propres dont l'une d'elles a
été traitée au silicone (Prosi 1-28) et l'autre a été recouverte
de papier cellophane puis d'un espacement en polyéthylène de
0.4 mm d'épaisseur. Les solutions d'électrodes étaient compo
sées de H 3 P Û4 1 M à l'anode et de Na 0 H 1 M à la cathode. Le
gel a été préfocalisé pendant 10 minutes avant d'ajouter à 2
reprises 10 yl d'échantillon. La focalisation a été réalisée
sous un potentiel de 2000 V et un courant de50 mA à 80 C
pendant 60 minutes. La détection de l'activité de type g-

lactamase a été accomplie avec la nitrocéfine [ 10 _ 3 M] et avec
le PADAC [5 x 10-1< M ] à l'aide d'un papier filtre imbibé de
l'un ou l'autre de ces substrats. Les g-lactamases plasmidi-
ques TEM-1, P5E-2 et 0XA-1 ont été utilisées comme marqueurs.
2.6.2. jî le^cJî.r_ofo_ca_ll_s£itiôn en_g.rac[ie/ijt ç[e_sjjc_rojê_
L'électrofocalisation a été réalisée à 4° C dans un
gradient de densité de sucrose et d'ampholytes porteurs à
l'aide d'une colonne de 110 ml (L K B 8101, LKB-Produkter AB,
Bromma, Suède). La procédure expérimentale recommandée par ce
manufacturier a été respectée.
2.6.2.1. Bande large de pH (3 à 11)
L'échantillon analysé (3 ml) a été obtenu à partir
d'un extrait filtré sur Séphacryl 5-200 concentré par ultrafil
tration. Egalement 0.5 ml des ampholytes porteurs suivants a
été placé dans les colonnes: pH 3 à 5, pH 5 à 7, pH 7 à 9 et pH
9 à 11.
149
2.6.2.2. Bande étroite de pH (7 à 9)
Cette expérience a été accomplie avec 8 ml des frac
tions les plus actives de la focalisation précédente. Deux ml
d'ampholytes de pH 7 à 9 ont été ajoutés dans la colonne.
Après la focalisation, le contenu de la colonne a été récolté
en fractions d'environ 2 ml. Le p H et l'activité enzymatique
de chacune ont été mesurés.
2.7. Electrophorèse en gel de polyacrylamide
Un gel de 0.75 mm d'épaisseur a été préparé selon la

méthode de Thomas et Kornberg (376), où la concentration d'a-
cryl amide dans le gel séparateur est de 12%. Cinquante yl de
chaque échantillon ont été placés dans les réservoirs préparés
à même le gel. Les plaques de verre ont été montées sur une
cellule Bio-Rad (modèle Protean). L'électrophorèse s'est dé
roulée è 8 -10° C. La cellule a été placée sous un courant de 10
mA par plaque, pendant environ 16 heures. Les gels ont été
colorés au bleu de Coomassie R.
2.8. Estimation du poids moléculaire
Le poids moléculaire a été évalué au cours d'une
filtration sur gel TSK à l'aide d'une colonne G3000SW de 7.5 mm

x 30 cm (Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., Tokyo, Japon) et
d'un système de chromatographie à HPLC (Waters). Le tampon de
chromatographie était composé de TRIS [0.05 Ml, de sucrose

[0.25 M], de dithiothréitol [ 10 -4 M ] et d'acide 6-aminocaproi-
que [0.6%]. Aussi 0.5 ml d'extrait brut de foie a été placé
dans la colonne. Le débit a été ajusté à 1 ml/min. Les frac
tions ont été récoltées dans des plaques sérologiques à raison
de 300 yl par puits. La révélation des fractions a été faite

en plaçant 30 yl de P ADAC [10 4 Ml dans chaque puits. Des
substances de poids moléculaires connus ont été utilisées comme
standards: ovalbumine, catalase, f erritine, thyroglobuline et
dextran bleu.
150
2.9. Détermination des protéines
Le contenu des échantillons en protéines a été mesuré

d'après la méthode de Bradford (4_1_). La procédure utilise la
y-globuline bovine comme référence standard et un réactif pré

paré commercialement (Bio-Rad Laboratories).
151
3. RESULTATS
3.1. Purification de 11 activi té de type g-lactamase
3.1.1. üré.c_ipitja t^Lori a. v_ec_lj3 s.u_l f 81U3 ci ' amjmoj2ijjm_
Les foies de rat ont été homogénéisés dans du tampon

TRIS [ 0.05 M, pH 7.5 ] contenant du sucrose [0.25 Ml, du dithio-
thréitol [10M 3 et de l'acide 6-aminocaprolque [0.6%]. Les
tentatives de dialyse sous vide exécutées dans le but de con
centrer l'activité enzymatique ont échoué puisque le dosage de
l'activité s'est révélé négatif après 12 heures à 4°C. L'expé
rience a donc été réalisée en omettant cette procédure. La
figure 14 montre que cette première étape de purification n'a
pas permis d'augmenter le rendement de 1'enzyme car la quantité
de 6-lactamase précipitée a été essentiellement proportionnelle
à la quantité de protéines précipitées.
3.1.2. j2hjômajLO£raph.ie. d.'a_f_f in_i t_é_
La purification de la g-lactamase de foie a été
tentée par chromatographie d'affinité sur Sépharose 4B avec
deux g-lactamines comme hameçon. La colonne portant la cépha
losporine C, dont 1'efficacité a été vérifiée avec la g-lacta
mase d'Enterobacter cloacae, n'a pas permis la séparation de la
g-lactamase de foie. Le dosage des protéines éluées avec Na C1
[1 M] a révélé que 1 'hameçon avait accroché 4.6% des protéines
et 4.6% de l'activité au cours d'un essai de purification. Il
a été impossible de déterminer la capacité réelle de la g -
lactamase de foie de s'accrocher à l'hameçon compte tenu de sa
dégradation rapide. Cette observation est également applicable
à la chromatographie sur la colonne portant la céfotaxime.
L'essai de cet hameçon avec des g-lactamases bactériennes a
néanmoins démontré que ce type de colonne comporte une lacune
importante : la chromatographie de la cépha1osporinase d'Entero
bacter cloacae sur colonne portant la céfotaxime a permis de
vérifier la capacité de rétention de cet hameçon ; cependant la

80
0 -I------ 1-------1------ \------- 1----- 1------ 1------- 1

30 35 40 45 50 55 60 65
% de saturation en sulfate d'ammonium
Figure 14. Pourcentage cumulatif de protéines totales précipitées (O) et d'unités de 8-lacta-
mases précipitées (#) en fonction du pourcentage de saturation en sulfate d'ammonium.
en
no
153
g-lactamase a résisté à l'élution par le Na C1, même à la con
centration 3 M.
3.1.3. ChromatnDcjrapjiie^ (|chaji gie u£ê_dj_icM\s
La chromatographie de l'extrait brut de foie sur
DEAE-5épha dex A-5Q n'a pas permis de purifier la protéine
possédant une activité de type g-lactamase. La méthode en
tubes a révélé que cette protéine ne reste pas accrochée à
l'échangeur d'ions à un pH inférieur à 7.9. Plusieurs essais
de purification ont été tentés, tant avec le tampon TRIS

qu'avec un tampon phosphate, dans une grosse colonne (2.5 x 45
cm) et une petite colonne (seringue de 10 ml). Au cours de
toutes les chromatographies effectuées, l'activité enzymatique
détectée avec le PADAC était trop faible pour être mesurée
quantitativement, même après concentration par ultrafiltration
des fractions les plus actives. Un résultat semblable a été
obtenu au cours des tentatives de purification en vrac dans des
tubes à essai. L'activité spécifique de l'enzyme récupérée
dans le surnageant était inférieure à celle de l'échantillon de
départ dans une zone de p H où la protéine ne devrait pas être
liée au DEAE-Séphadex (p H 7.4). La raison de ces résultats
demeure inconnue, mais il semble que la protéine soit instable
dans les conditions de chromatographie utilisées.
3.1.4. F)i_l tjâ_t ij3n_sjjr_gj3l_
La purification de l'activité de type 6-lactamase du
foie de rat sur gel de Séphacry1 est résumée au tableau 20.
L'activité spécifique mesurée après chromatographie et ultra
filtration des fractions les plus actives a donné un taux de
rendement inférieur à 1. Ce résultat laisse présumer une perte
importante d'activité. Le modèle d'élution de l'extrait brut
est présenté sur la figure 15. Dans les conditions où la
chromatographie a été réalisée, l'activité 3-lactamase a été
éluée sur la bordure d'un gros pic qui contient d'autres pro
téines tel qu'il a été établi en électrophorèse analytique

PROTÉINES ACTIVITÉ ACTIVITÉ
ÉTAPE VOLUME RECOUVREMENT
TOTALES TOTALE SPÉCIFIQUE
(ml ) (mg) (Unité) ( U ni t é / m g ) (%)
EXTRAIT BRUT 8.68 x IO"*

20 1329 1.15 100
DE FOIE
FILTRATION SUR 0.58 x IO'*

7.3 142 0.0082 0.7
SEPHACRYL *
* Après ultrafiltration
Tableau 20. Purification de l'activité de type 6-lactamase par

filtration sur gel de Séphacryl S-200.
<
S
Activité
enzymatique
Absorbance (283 nm)
Fractions
Figure 15. Modèle d'élution de l‘extrait brut de foie sur colonne de Sëphacryl S-200.
en
en
156
(figure 16). D'autres essais de chromatographie ont été exécu
tés en vue d'améliorer le rendement de la purification. Des
résultats semblables ont été obtenus lorsque la colonne de
Séphacryl a été équilibrée avec du tampon phosphate [ 0.1 M, pH
7.4] contenant du N a C1 [0.5 M] avec ou sans azide de sodium
[0.2 g/l]. Des expériences ont été réalisées dans des condi
tions similaires de température, de tampon et de dilution, mais
en absence de gel. Elles ont permis de confirmer l'instabilité
de la protéine étudiée: une dilution 1 dans 9 de l'extrait brut
dans le tampon phosphate avec ou sans Na C 1 et azide de sodium a
provoqué une perte presque totale d’activité après 4 heures.
Dans le but de déterminer si la perte d’un cofacteur
pouvait être responsable de cette perte d'activité, des filtra
tions ont été réalisées sur des gels possédant différentes
gammes de rétention des protéines: le Séphacryl S-200 qui
purifie les protéines de 5,000 à 250,000, le Séphadex G-25 qui
filtre entre 1,000 et 5,000 et le Sépharose 4B qui peut séparer
les protéines de 60,000 à 20,000,000. Quoique la perte d'acti
vité ait été moins importante sur Sépharose 4B, aucune d’entre
elles n'a permis d'augmenter le niveau d'activité spécifique de
l'échantillon chromatographié au-delà de celui de l'extrait
brut non filtré.
3.2. Détermination jdjbjs conditions c[j3 stabilisation
enzymatique
Les paramètres physico-chimiques suivants ont été
évalués afin d'améliorer la stabilité de l'enzyme et de déter
miner les conditions expérimentales permettant sa purification.

157
EXTRAIT BRUT SÉPHACRYL S-200
Figure 16. Electrophorèse analytique de la filtration

sur Sëphacryl S-200.
158
3.2.1. Efêt du_t£m£on e.t_de^ JLa_f o_r c_e_i on_i qjje
3.2.1.1. Influence de la nature et de la composition des
tampons
Pour réaliser cette expérience, le foie de rat avait
été homogénéisé dans du tampon TRIS [0.1 M]. Quatre milieux

réactionnels ont été analysés: tampon TRIS [0.1 M , p H 7.4] (à
3 7 0 C), tampon phosphate (K Hz P 04 + K 2 HP04) [0.1 M, pH 7.4] ,
tampon phosphate + sucrose [0.25 M] et tampon véronal [0.1 M,
pH 7.4]. Chacun des milieux réactionnels contenait du Na C1
[0.5 ou 1 M ] et une mesure a été réalisée à quatre périodes,
soit à 0, 1, 2 et 3 heures d'incubation à 5° C. Les résultats
sont présentés sur la figure 17. Ils montrent que l'activité
enzymatique est plus stable dans le tampon phosphate que dans
le tampon TRIS. L'insolubilité relative du véronal à des
températures froides limite son utilisation à une zone de p H
située entre 8.2 et 8.9.
3.2.1.2. Influence des ions sodique et potassique dans la
composition du tampon phosphate
Les solutions mères de K2HPO4, KH2PO4 et N a Hz P O4 .H20
ont été préparées à des concentrations de 0.025, 0.05 et 0.1 M.
Les concentrations en Na C1 ont été préparées de sorte qu'elles
soient à 0.05 ou 0.5 M au moment d'effectuer les mesures au
spectrophotomètre. Le p H des tampons a été ajusté à 6.0. Les
mesures ont été effectuées à 5 reprises à des intervalles de 2
heures. Des essais témoins ont été exécutés avec chacun des
tampons et le P AD A C, sans extrait brut. Aucun d'entre eux
n'hydro lyse le PADAC. Les résultats sont présentés sur la
figure 18. Ils montrent que l'activité enzymatique atteint des
niveaux plus élevés avec le tampon formé des sels dipotassique
et monopotassique.
0.8 Tampon TRIS [0.1 M] Tampon véronal [0.1 M]
0.6 ■ ■
•o
D
( a D.O./mln)
O 0.4
0.2 -
Molarité Molarité
(A D.O./mln)
0 ------1----- 1 o ------------------------------------------------- 1--------------------------------------------------1

0 0.5 10 0.5 1
Molarité Molarité
Figure 17. Influence de la nature et de la composition de solutions tampons en fonction du temps [après
0 (•), 1 (O), 2 (■) et 3 (D) heures d'incubation] et en fonction de la concentration en NaCl.
en
KO
NaCI [0.05 M] + phosphate monopotassique NaCI [0.5 M] + phosphate monopotassique
(A D.O./mln)
temps (heures) temps (heures)

(A D.O./mln)
Figure 18. Influence du phosphate mono potassique et monosodique [ 0.025 M (•), 0.05 M
(O) et 0.1 M (■)] en fonction du temps et de la concentration en NaCI.

CT»
O
161
3.2.1.3. Influence du NaCl
Le milieu réactionnel est constitué de tampon phos
phate (K2HPO4 + KH2PO4) [0.1 M, pH 7.4] à 3 7° C, contenant des
concentrations de Na Cl comprises entre 0 et 2 M. Une mesure a
été effectuée pour chacune de ces concentrations à 9 reprises
au cours des 20 heures qu'a duré l'expérience. Les résultats
sont illustrés graphiquement sur la figure 19. L'activité
enzymatique semble peu influencée par les différences de force
ionique à l'exception du Na C1 [2 M] qui a donné des mesures
d'activité les plus grandes à 8, 9 et 10 heures.
3.2.2. E.f_£e_t _du_pH.
Le pH optimum de l'activité enzymatique a été estimé
avec une préparation d'extrait brut de foie. Tous les tampons
ont été préparés à la concentration 0.2 M afin d'atténuer
l'influence de l'extrait brut sur le pH de l'essai. D'ailleurs
l'écart entre le pH des tampons et celui du mélange tampon et
extrait brut a varié d'environ 0.1 à 0.3 unité pour la gamme
large et de 0.1 à 0.4 unité pour la gamme étroite.
3.2.2.1. Gamme large
Les tampons utilisés sont : acide citrique + phosphate
disodique [p H 3.0 à 6.0], phosphate dipotassique + phosphate
monopotassique [ pH 6.3 à 8.0] et glycine + hydroxyde de sodium
[p H 8.5]. Le graphique de l'activité enzymatique en fonction
du temps (figure 20) révèle la diminution graduelle de l'acti
vité en deçà de 8 heures. Le graphique de l'activité enzymati
que en fonction du p H (figure 21) montre quant à lui que l'ac
tivité enzymatique se maintient plus élevée à p H 6.0 à partir
de t = 2 heures. Même si on note à t = 0 une forte activité à
pH 8.5, celle-ci tombe très rapidement par la suite.

•- [NaCI] 0 M
O- [NaCI] 0.05 M
■- [Nad] 0.1 M
□- [Nad] 0.25 M
A- [NaCI] 0.5 M
-A- [NaCI] 1 M
Vo X- [NaCI] 2 M
(A D.O./min)
temps (heures)
Figure 19. Influence de la concentration en NaCI en fonction du temps.

163
0.8 ■■
Vo
(A D.O./min)
0.4 ‘1
0.2 ■■
temps (heures)
Figure 20. Influence du pH [5.0 (•), 5.5 ( O ), 6.0 (■), 6.5 (□), 7.0
(A), 7.5 (A), 8.0 ( f ) et 8.5 (0)1 sur 1 'activité enzyma
tique restante après différents temps d'incubation à 5°C.
1.2
Figure 21. Activité enzymatique en fonction du pH (gamme large) après 0 (•),

2 (O), 4 (■), 6 (□) et 8 (A) heures d'incubation.
164
165
3.2.2.2. Gamme étroite
L'expérience précédente a été recommencée pour une

échelle de pH plus restreinte (5.0 à 7.0 ) avec des intervalles
de 0.2 unité. Le tampon a été préparé à partir de phosphate
monopotassique et de phosphate dipotassique. La figure 22
illustre l'activité enzymatique en fonction du pH pour une
période de temps variant de 0 à 8 heures. Il est moins aisé
que dans le graphique précédent de déterminer le pH où l'on
trouve l'activité optimale. Il semble néanmoins que cette
dernière se situe dans la zone de pH comprise entre 6.0 et 6.4.
3.2.3. jLfXeJL jde_l_a jternparaiture
3.2.3.1. Effet de la température sur la cinétique de la
réaction
Cette expérience a été réalisée afin d'évaluer
l'effet de la température sur l'activité enzymatique de la g -
lactamase hépatique. La cuvette utilisée pour mesurer les
réactions a été thermostatée à des intervalles de température
de 50 C entre 0 et 6 0 0 C. Le milieu réactionnel , composé de
tampon phosphate, avait un pH de 7.2 à 2 5 0 C. Le substrat

(PADAC) a été utilisé à une concentration finale de 10 5 M. Il
a été pré incubé à la température de l'essai. L'extrait brut,
conservé sur la glace, ainsi que le tampon ont été pré incubés
pendant environ 2 minutes à la température de l'essai avant d'y
ajouter le substrat. La figure 23 montre l'effet de la tempé
rature sur l'activité de l'enzyme hépatique. Des résultats
similaires ont été obtenus avec le tampon TRIS, quoique l'acti
vité enzymatique était 2 fois plus grande à 5 0 0 C pour ensuite
être nulle à 60 °C.
3.2.3.2. Effet de la température sur la stabilité enzymatique
Nous avons déterminé la stabilité de l'enzyme hépati
que au cours d'une longue période de temps à 6 températures

Figure 22. Activité enzymatique en fonction du pH (gamme étroite) après 0 (•),
2 (O), 4 (■), 6 (□) et 8 (A) heures d'incubation.
CTi
CT)
0.75
Vo
(A D.O./min)
0.25
0 20 40
Température (°C)
Figure 23. Effet de la température sur 1'activité de l'enzyme hépatique.

168
différentes. Ces températures correspondent aux conditions
usuelles d'utilisation et de conservation des solutions enzyma
tiques soit -650 C et -200 C (congélation à long et court terme),
0° C (bain de glace), 5° C (réfrigérateur), 2 3° C (température de

la pièce) et 3 7° C (température des essais enzymatiques). Un
extrait brut de foie a par conséquent été séparé en 6 frac
tions. Toutes les mesures d'activité ont été réalisées à 37 °C.

Toutes les mesures ont été effectuées périodiquement pour cha
que échantillon. Les portions a 1iquotes ont été maintenues à la
température prescrite pendant une période de temps de 75 heures
pour les expériences réalisées au-delà du point de congélation.
Ces résultats sont présentés à la figure 24. La même expérien
ce exécutée avec le tampon TRIS a donné des résultats sembla
bles. Les expériences effectuées aux températures de congéla
tion ont révélé que l'enzyme est demeurée stable à -65 ° C après
6 mois de conservation, alors qu'elle a perdu plus de 90% de
son activité après 2 semaines à -20 0 C. Environ 50% de l'acti
vité enzymatique à -2 0 0 C et 80% à -6 5 0 C ont été conservés
lorsqu'une portion aliquote a été soumise à 4 congélations-
décongélations successives.
3.2.4. jï f_f eil jlu_s_y.cIL0-§.e—du_gl_ycéjro 1_
Le sucrose et le glycérol sont parfois utilisés afin
de stabiliser les protéines dans un extrait brut. Les expé
riences suivantes avaient pour objectif d'évaluer la capacité
de ces substances d'améliorer la stabilité de la g-lactamase
dans l'extrait brut de foie.
3.2.4.1. Effet du sucrose
Le sucrose C0.25 M ] ajouté au tampon phosphate ne
modifie pas de façon importante les niveaux d'activité et la
stabilité de la g-lactamase de foie (figure 17). La solution
de sucrose à la concentration étudiée est très dense et peut
rendre difficile le traitement des échantillons aux différentes
étapes de la purification, notamment en chromatographie et en

Vo
(A D.O./min)
uufie D—I
temps (heures)
Figure 24. Effet de la temperature [0 *C (•), 5 °C (D), 23 °C (O) et 37 °C (■)]

sur la stabilité de l'activité enzymatique du foie en fonction du temps.
CD
LO
170
ultrafiltration. Pour cette raison, nous avons écarté la pos
sibilité de l'ajouter systématiquement lors de la préparation
de l'extrait brut.
3.2.4.2. Effet du glycérol
La stabilité de l'activité en présence de glycérol
[10%] dans le milieu réactionnel a été comparée à celle d'un
témoin au cours d'une période de 8 heures. Les résultats
obtenus sont présentés graphiquement sur la figure 25. Le
glycérol a montré une influence négative significative sur
l'activité enzymatique. D'autres essais réalisés avec des
concentrations de glycérol de 15 et de 30% ont permis de
constater que plus la quantité de glycérol augmente, plus
faible est l'activité enzymatique, indépendamment de la force

ionique du milieu réactionnel (Na C1 0, 0.05 et 1 M).
3.2.5. E/Let. cj'.age/it_s_ox_ydajits^ j3t_rj§dum_teu.r_s
3.2.5.1. Effet de l'oxygène
Une expérience a été tentée afin d'évaluer le rôle de
l'oxygène dans la perte d'activité enzymatique. L'extrait brut
de foie a été placé dans une cellule à ultrafiltration bloquée
au niveau de la membrane par un disque de parafilm. Il a
ensuite été placé sous agitation dans un bain de glace. Une

portion aliquote a été soumise à une pression de 10 lbf/po2
d'oxygène et une autre à 10 lbf/po2 d'azote dans la cellule.
Des mesures d'activité enzymatique ont été réalisées à 4 re
prises (figure 26) pendant 1 heure. D'après les résultats, il
ne semble pas que l'oxygène puisse compromettre l'activité de
l'enzyme hépatique.
3.2.5.2. Effet du pCMB
L'influence du pCMB [0.1 m M] a été mesurée (figure
27). Les résultats montrent que ce composé diminue l'activité

0.8
T
Vo
(A D.O./min)
temps (heures)
Figure 25. Influence du glycerol [10 %] (O) sur la stabilité

de l'enzyme hépatique comparée a 1 'extrait brut (•).
0.8
Vo
(A D.O./min)
temps (minutes)
Figure 26. Effet comparatif de l'azote (■) et de 1'oxygène (H) sur

la stabilité de l'activité enzymatique du foie.
r\j
173
g-lactamase de façon significative au cours des 4 premières
heures, de sorte qu'à t = 4, on n'observe plus qu'environ 10%
de l'activité initiale.
3.2.5.3. Effet d'agents réducteurs
Le dithiothréitol [0.1 m M] et le 2-mercaptoéthano 1
[1 mH ] n'ont pas modifié l'activité enzymatique (figure 27).

Cependant, à des concentrations égales ou supérieures à 10 ~3 M,
le dithiothréitol a interféré directement avec l'essai enzyma
tique en dégradant la molécule de PADAC. La même observation a
également été notée avec le 2-mercaptoéthanol à la concentra

tion 10 1 M.
3.2.6. E/£.et. des. prj3teâsês.
3.2.6.1. Détermination de l'activité protéolytique de
l'extrait de foie
L'essai des protéases a été réalisé à partir des
échantillons d'extrait brut et d'extrait filtré sur Sépharose
4B. Aucune activité de type protéase n'a pu être détectée par
cette méthode alors que les préparations commerciales de tryp
sine et de protéase fongique ont donné des résultats positifs.

La pepsine n'a pas montré d'activité (figure 28).
3.2.6.2. Influence des inhibiteurs de protéases
Afin d'étudier la possibilité qu'une protéase d'un
autre type puisse être responsable de la perte d'activité de
l'enzyme hépatique, deux inhibiteurs de protéases, l'aprotinine

[100 mg/ml] et la leupeptine [100 mg/m1], ont été étudiés seuls
ou en combinaison. Les résultats (figure 29) ont montré que
ces inhibiteurs ne modifient pas l'activité enzymatique de
façon significative. Il est donc permis de penser que la perte
d'activité enzymatique dans l'extrait brut n'est pas causée par
une protéolyse de l'enzyme hépatique.

1 T
Vo
(A D.O./min)
temps (heures)
Figure 27. Influence du 2-mercaptoéthanol [1 mM] (O), du dithiothréitol [0.1 uiM] (■) et du
pCMB [0.1 mM] (□) sur 1 'activité de l'enzyme de foie en fonction du temps. Ces
substances sont comparées à un témoin extrait brut seul (•).
'--J
-P*
175
Légende : En haut = extrait brut de foie

A droite = protéase fongique (2 yg)
En bas = trypsine (10 yg)

A gauche = tampon phosphate [0.1 M, pH 7.4]
Au centre = extrait brut filtré sur
Sépharose 4B
Figure 28. Détermination de 1 'activité protéolytique

de 1 'extrait de foie.
Figure 29. Influence de 1 'aprotinine [100 mg/ml ] (O), de la leupeptine [100 mg/ml ] (■) et de ces
deux substances combinées (□) sur 1 'activité de l'enzyme de foie en fonction du temps.
Ces inhibiteurs de protéases sont comparés à un témoin extrait brut seul (•).
en
177
3.2.7. E_f\£.eJt de£ _L°Ils—eJL c|e_lj_EDJ/\
3.2.7.1. Influence des ions
Le rôle de 9 ions sur l'activité de la g-lactamase
hépatique a été évalué. Chaque sel a été dissout dans l'eau

distillée et préparé à des concentrations de 10 ~3, 10~ 4 et
10”5 M pour que la concentration finale dans la cuvette soit
respectivement de 10-4 , 10 ~5 et 10~6 M. Les sels suivants ont
été étudiés: H g5 04 , M n 0 12, KOI, Ca C la, Na2MoCl4. 2H2 0, C0CI2,

Zn(C2H302)2.2 H 20 , FeCl2.4H2Û, Cu5 04.3H20. Les résultats ont
été rapportés graphiquement sur les figures 30 à 38. Pour la
majorité de ces composés, nous n'avons observé aucune diffé
rence significative entre les diverses concentrations des ions
et le témoin sans ion pour les 5 temps étudiés. Seul le sul

fate de cuivre à la concentration 10 4 M abaisse significa
tivement l'activité enzymatique.
3.2.7.2. Influence de l'EDTA
L'EDTA est un agent chélateur dont l'effet a été
analysé afin de déterminer si certains ions peuvent jouer un
rôle négatif sur l'activité de l'enzyme hépatique. Les résul
tats obtenus ne nous permettent pas d'affirmer qu'il existe des
différences significatives entre le témoin et l'EDTA [1m M ]

(figure 39).
3.2.8. Ê.f-Let. ile_m2.1.£cju 1 s_oj2ga/ij^qjjejs
3.2.8.1. Influence de l'ATP et de 5 coenzymes
Le rôle possible de l'ATP et de 3 coenzymes (cocarbo-
x y 1 as e, codé carboxy 1ase, F AD, NAD et NADP) sur l'activité et la
stabilité de l'enzyme hépatique a été évalué à la concentration

10 ~5 M. Les résultats sont présentés aux figures 40 et 41. Il
fut impossible d'effectuer les mesures à 6 heures pour la
cocarboxy1ase et la codécarboxy 1ase. Deux coenzymes ont montré

0.8 □
Vo
(A D.O./min)
temps (heures)
Figure 30. Influence de l'ion magnésium [100 yM (S), 10 yM (O) et 1 yM (■)! sur l'activité de
l'enzyme de foie en fonction du temps et comparée à un témoin extrait brut seul (□).
00
'I
0.8 *
Vo
(A D.O./min)
fiPOÜ
0 2 4 6 8
temps (heures)
Figure 31. Influence de l'ion manganèse [100 yM (#), 10 yM (O) et 1 yM (■)] sur 1 'activité de
l'enzyme de foie en fonction du temps et comparée S un témoin extrait brut seul (□).
KO
Figure 32. Influence de l'ion potassium [100 pM (#), 10 yM (O) et 1 pM (■)] sur 1 'activité de
CO
O
I
Vo
(A D.O./min)
temps (heures)
Figure 33. Influence de l'ion calcium [100 uM (#), 10 yM (O) et 1 yM (■)] sur l'activité de
l'enzyme de foie en fonction du temps et comparée â un témoin extrait brut seul (□).
'T
Vo
(A D.O./min)
temps (heures)
Figure 34. Influence de l'ion molybdène [100 yM (•), 10 yM (O) et 1 uM (■)] sur 1 'activité de
00
fV>
'T
Vo
(A D.O./min)
(CD
temps (heures)
Figure 35. Influence de l'ion cobalt [100 yM (#), 10 yM (O) et 1 yM (■)] sur l'activité de
00
CO
Figure 36. Influence de l'ion zinc [100 yM (#), 10 yM (O) et 1 yM (■)] sur 1 'activité de
l'enzyme de foie en fonction du temps et comparée â un témoin extrait brut seul (□).
184
Figure 37. Influence de l'ion fer [100 yM (•), 10 yM (O) et 1 yM (■)] sur 1 'activité de
00
en
O
Vo
(A D.O./min)
temps (heures)
Figure 38. Influence de l'ion cuivre [100 yM (•), 10 yM (O) et 1 yM (■)] sur l'activité de
l'enzyme de foie en fonction du temps et comparée S un témoin extrait brut seul (□).
CO
en
Figure 39. Influence de 1 'EDTA [1 rtiM] (O) sur 1 'activité de l'enzyme de foie en
fonction du temps et comparée S un témoin extrait brut seul (•).
CO
'-J
Figure 40. Influence des cofacteurs cocarboxylase [100 yM3 (O) et codëcarboxylase [100 yM]
(■) ainsi que de 1 'ATP [100 yM] (#) sur 1 'activité de l'enzyme de foie. Ces
substances sont comparées â un témoin extrait brut seul (□).
CO
oo
1.6 T
Vo
(A D.O./min)
temps (heures)
Figure 41. Influence des cofacteurs NAD [100 yM] (#), NADP [100 yM3 ( O) et FAD
[100 yM] (■) sur l'activité de l'enzyme de foie en fonction du temps.
Ces substances sont comparées à un témoin extrait brut seul (□).
CO
LO
190
des différences significatives avec l'extrait brut soit le NAD
et le NADP. Avec ce dernier, non seulement l'activité à t = 0
est 2 fois plus élevée que celle de l'extrait brut, mais cette
méthode permet de conserver environ 80% de l'activité initiale
de l'extrait brut 8 heures après le début de l'expérience.
3.2.8.2. Détermination des concentrations optimales de N AD et
de NADP
Les concentrations optimales de NAD et de NADP ont
été étudiées pour une période de temps de 48 heures. Les
mesures ont été effectuées à 3 reprises, soit à 0, 2, 4, 24 et
48 heures. Le tampon phosphate a été préparé à 6.4 compte tenu
que l'activité maximale avait été mesurée près de cette valeur.
Les résultats des deux composés ont été calculés à partir du
même témoin. L'influence du NADP (figure 42) sur la stabilité
et l'activité de la 8-1actamase de foie est supérieure à celle

du NAD (figure 43). Avec ce dernier, des mesures significati
vement différentes de l'extrait brut ont été obtenues à 10-4 et
5 x 10 ~5 M. La concentration optimale de NADP se situe entre
10 ~5 et 10 ~4 H. L'addition de ce composé en concentration
suffisante a permis de multiplier par 4 le taux de base. L'ac
tivité enzymatique s'est maintenue stable au cours des 4 pre
mières heures pour diminuer d'environ 20% en 24 heures et de
30% en 48 heures. Par ailleurs, nous avons tenté de restaurer
une activité enzymatique dans des échantillons inactifs qui
avaient été conservés au congélateur. Ces essais réalisés avec
le PADAC ont été positifs. Cependant, lorsque la nitrocéfine a
été utilisée comme substrat de la réaction, les niveaux d'acti
vité sont demeurés les mêmes, avec ou sans NADP.
Ces résultats, qui contrastent avec les précédents,
suggèrent que le NAD et surtout le NADP jouent un rôle de
coenzyme essentiel pour une protéine qui dégrade le PADAC.
Néanmoins, il faudrait déterminer si c'est la forme réduite ou
oxydée de ces cofacteurs qui leur confère ce rôle.

Vo
(A D.O./min)
temps (heures)
Figure 42. Determination de la concentration optimale de NADP [500 pM (A), 100 pM

(□), 10 pM (■), 1 pM (O) et 0.1 pM (#)] pour stabiliser 1'enzyme de
foie en comparaison avec un extrait brut seul (A).
Figure 43. Détermination de la concentration optimale de NAD [500 pM (A),
100 pM (□), 10 pM (■), 1 pM (O) et 0.1 pM (•)] pour stabiliser
l'enzyme de foie en comparaison avec un extrait brut seul (A).
ho
193
3.2.8.3. Influence comparative du NAD, NADH, NADP et NADPH
Les analyses suivantes ont été réalisées selon les
mêmes critères que l'expérience précédente. Une mesure a été
effectuée à 6 heures au lieu de 4 heures. La concentration

finale de coenzyme dans la cuvette a été fixée à 5 x 10 ~ 4 M.
La figure 44 résume les résultats qui ont été obtenus. L'acti
vité enzymatique a été un peu plus élevée avec les formes

réduites (NADH et NADPH) par rapport aux molécules oxydées (NAD
et NADP). Il faut cependant signaler que les essais témoins
sans extrait brut ont révélé que le NADH et le NADPH peuvent

dégrader le PADAC (A D.O./min. - 0.02).
3.3. Détermination des caractéristiques physico-chimiques
3.3.1. Poids moléculaires
Compte tenu des difficultés rencontrées lors des
essais de purification, il fut impossible de déterminer un
poids moléculaire sur gel dénaturant de polyacrylamide à partir
d'une protéine purifiée. Néanmoins, des estimations ont pu
être accomplies en filtration sur gel. L'une d'elle, exécutée
sur gel T S K G300ÛSW à partir d'un système HPLC avec 3 molécules
de poids moléculaires connus, a révélé que l'enzyme de foie qui
hydrolyse le PADAC possède un poids moléculaire inférieur à

45.000 (figure 45). Des résultats obtenus sur une colonne moins
performante de Séphacryl 5-200 ont situé celui-ci près de

25.000 (figure 15). Une activité très faible a été notée dans
les fractions correspondant aux standards de poids moléculaires
de 440,000 et 669,000. Une autre chromatographie a été réali
sée dans une colonne de 2.5 x 90 cm. Le Séphacryl 5-200 a été
équilibré avec du tampon phosphate [0.1 M, p H 6.4]. Les frac

tions ont été analysées à l'aide de nitrocéfine [10 ~ 3 M], de
PADAC [10-4 M], de PADAC + NADP [10-4 M] et de PADAC + NADPH
[10-4 M]. L'enregistrement graphique de la filtration et la
position des pics d'activité détectés sont illustrés à la
figure 46. Les résultats de cette filtration ont démontré

2 T
□
(A D.O./min)
20 25 3(
temps (heures)
Figure 44. Influence des cofacteurs NAD [500 yfi] (•) et NADP [500 yM] (■), NADH [500 yM]
(O) et NADPH [500 yM] (□) sur l'activité de l'enzyme de foie en fonction du
temps. Ces substances sont comparées à un témoin extrait brut seul (A).
vn
4^
5 5 5 s
O Q. O 0-
Absorbance (283 nm)
Fractions
Figure 45. Estimation du poids moléculaire de l'enzyme hépatique qui dégrade le PADAC en HPLC sur gel TSK
G3000SW. La position des standards de poids moléculaires connus est indiquée par une flèche.
LD
en
196
RÉVÉLATION AVEC NITROCÉFINE
RÉVÉLATION AVEC PADAC

Aclivité enzymatique relative
Æi
RÉVÉLATION AVEC PADAC + NADP
1 -
RÉVÉLATION AVEC PADAC + NADRH

5r
Absorbance (283 nm)
Fractions
Figure 46. Filtration de l'extrait brut de foie

sur gel de Sëphacryl S-200.
197
l'existence d'au moins deux protéines de poids moléculaires
différents qui dégradent les céphalosporines chromogéniques
nitrocé fine et PADAC. Les principales fractions montrant une
activité envers la nitrocéfine ont pu être détectées en moins
de 5 minutes. Elles correspondent à une protéine dont le poids
moléculaire serait inférieur à celui de la protéine précédente.
Le pic d'activité détecté avec le PADAC a été le même que celui
qui a été détecté avec PADAC et N A D P. Dans les deux cas,
l'activité enzymatique a été révélée après une longue incuba
tion (17 heures). Lorsque le N ADP H a été utilisé pour révéler
le pic d'activité enzymatique envers le PADAC, le changement de
coloration est survenu en moins de 2 minutes. Ce résultat
confirme le rêle du N AD P H comme coenzyme et sa capacité à
restaurer l'activité après la purification.
3.3.2. Electrofocalisation
3.3.2.1. Electrofocalisation en gel de polyacrylamide
L'électrofocalisation de l'extrait brut de foie a
permis de séparer 4 bandes lorsque la nitrocéfine a été utili
sée comme révélateur (figure 47-A). Le point isoélectrique de
la bande majeure s'est situé au même niveau que la g-lactamase
TEM-1 (figure 47-B). Il fut impossible de révéler quoi que ce
soit avec le PADAC (figure 47-C).
3.3.2.2. Electrofocalisation en gradient de sucrose
Deux focalisations sur colonne ont été nécessaires
afin d'estimer le point isoélectrique de l'activité enzymatique
envers le PADAC. La première, réalisée avec une gamme large
d'ampholytes [p H 3 à 11] a établi le pI à environ 7.9. La
seconde, exécutée dans une gamme étroite [ p H 7 à 9], l'a situé

à 7.7 (figure 48).
198
5.4
OXA-1 PSE-2 TEM-1 FOIE
Figure 47. Electrofocalisation de 1'extrait brut de foie en gel de poly

acrylamide. A) Détails des bandes après 30 minutes de révéla
tion avec la nitrocéfine. B) Comparaison avec 3 B-lactamases
plasmidiques. C) Comparaison de la révélation avec le PADAC

(gauche) et la nitrocéfine (droite).
Activité enzymatique relative
Fractions
Figure 48. Electrofocalisation en gradient de sucrose d'un extrait de foie

filtré sur Séphacryl S-200. Gamme étroite d1ampholytes (pH 7 à 9).
200
4. DISCUSSION
Même si Hamilton-Miller (13 9) a proposé que la g-
lactamase puisse être une authentique protéine animale, la
caractérisation d'une enzyme de mammifère capable d'hydrolyser
les pénicillines et les céphalosporines n'avait pas encore été
réalisée.
Les essais de purification ont été entrepris afin
d'isoler la protéine responsable de l'hydrolyse du PADAC. Mal
heureusement, ces tentatives se sont soldées par un échec.
Chaque étape a été caractérisée par une faible récupération de
1'activité enzymatique. Il en résultait une perte nette de
l'activité spécifique. Nous avons attribué ce résultat à une
grande instabilité de l'enzyme, causée par un facteur indéter
miné. Dans le but d'établir des conditions optimales de
purification, nous avons évalué l'effet de divers facteurs
physiques et chimiques.
Malgré que le tampon TRIS ait été utilisé au tout
début de notre étude, il est apparu par la suite que le tampon
phosphate constituerait un meilleur environnement. Le tampon
fabriqué à partir de sels potassiques a été préféré à celui qui
est composé avec des sels sodiques. Une meilleure solubilité
des premiers aux températures froides est un avantage indénia
ble pour la chromatographie en chambre froide. La force ioni
que n'a pas semblé jouer un grand rôle au chapitre de la stabi
lité et conséquemment, la présence de N a C1 ne devrait pas
compromettre les procédures de purification. L'étude de l'in
fluence du pH en fonction du temps a révélé un maximum d'acti
vité dans la zone de pH comprise entre 6.0 et 6.4. On peut
toutefois s'interroger si ces résultats ont illustré réellement
le comportement de l'enzyme étudiée. Il est possible que
certaines conditions de p H conviennent davantage à l'activation
d'un cofacteur impliqué dans la réaction. L'augmentation de la
vitesse de la réaction avec la température puis l'augmentation
du taux d'inactivation thermique de la protéine au-delà d'une

201
température critique nous a renseigné sur la nature enzymati
que de l'activité. L'enzyme est dénaturée en moins de 2
minutes à 6 0 0 C. Cette propriété écarte la possibilité que
cette protéine soit identique à celle étudiée par O'Callaghan
(261) qui peut décomposer la nitrocéfine même après 15 minutes
à 100°C.
Les sucres glycérol et sucrose, les inhibiteurs de
protéases et les anti-oxydants, généralement employés pour
améliorer la stabilité d'une protéine, n'ont pas permis d'évi
ter la perte d'activité. Curieusement, le dithiothréito1 et le
2-mercaptoéthano1 n'ont pas exercé d'influence déterminante sur
la stabilité malgré l'effet négatif du pCMB. Ce résultat
représente la présence de groupements thiol au niveau du site
actif. Nous n'avons pas vérifié cependant la capacité des
anti-oxydants de contrecarrer l'effet du pCMB. Le pCMB peut
inhiber complètement des enzymes contenant des résidus cys
téines comme la g-lactamase chromosomique de Klebsiella et cer

taines g-1actamases transférables comme 0XA-1 (367).
En dernier recours, nous avons examiné l'influence de
cofacteurs. L'analyse de 9 ions métalliques n'a pas permis de
redresser les niveaux d'activité. L'influence négative du

cuivre 10_l* M nous a amené à étudier la possibilité qu'un ion
présent dans le milieu réactionnel puisse inhiber l'activité.
Cette hypothèse a été vérifiée avec l'EDTA. Les résultats
obtenus semblent indiquer que l'enzyme n'est pas iono-
dépendante. Par contre, deux des 5 coenzymes, le N AD et
surtout le NADP, ont permis de la stabiliser et d'augmenter les
niveaux d'activité. Cette découverte a modifié la perspective
négative qui s'était dégagée des essais de purification réali
sés auparavant. Nous avons voulu déterminer si le coenzyme
essentiel est la forme oxydée ou réduite du NADP. La filtra
tion sur Séphacryl a fourni la réponse. Le NADPH a été beau
coup plus efficace que le NADP pour repérer les fractions
actives, alors qu'il était plus difficile d'estimer les diffé
rences en extrait brut entre ces deux substances. Par consé-

202
quent, il apparaît plausible que la filtration ait pu séparer
une enzyme d'un système métabolique nécessaire au recyclage du
N AD P H :
PADAC - PADAC dégradé

(violet) (jaune)
oxydoréductase?
3-lactamase?
NADPH
Les pyridine-nucléotides comme le NAD, le NADP et leurs formes
réduites sont les coenzymes d'un grand nombre d'oxydoréductases

(206). Par conséquent, l'influence marquée du NADPH suggère
que l'enzyme hépatique active envers le PADAC soit une oxydo
réductase. Nous ne savons pas s'il existe une relation entre
le dérivé pyridine de la molécule de NADPH et celui du PADAC.
Rappelons que la couleur violette du PADAC est due au radical
chromophore pyridinium-2-azo-p-diméthy1 ani 1ine en position 3 de
l'anneau dihydrothiazine. Ce dernier libère le groupement
pyridine-2-azo-p-diméthy 1 ani 1ine qui est jaune lorsque le lien

(3-lactame est rompu (3 34). S'il a été impossible de déterminer
le type de réaction chimique qui est impliqué ici, il est
toutefois intéressant de noter l'interaction d'une 3-lactamase

de Streptomyces cellulosae avec le NADP (268). Ogawara (267) a
proposé qu'une déshydrogénase ou une oxygénase, utilisant le
NADP oxydé comme cofacteur, ait pu être à l'origine de cette 3-
1actamase. Par conséquent, la relation à l'échelle moléculaire
de cette 3-1actamase avec l'enzyme hépatique est intéressante
du point de vue de l'évolution.
La filtration sur gel a également révélé que deux
protéines différentes pourraient être responsables de la dégra
dation des 3-lactamines chromogéniques dans le foie. Ce résul
tat confirme les présomptions recueillies au chapitre IV lors

203
des expériences de compétition avec les g -1ac tamines. Si l'on
peut supposer que l'enzyme qui a pour cofacteur le NADPH soit
une déshydrogénase, il y a lieu de s'interroger sur la possi
bilité qu'une autre protéine puisse dégrader le P ADAC dans le
foie. Nous avons remarqué une légère différence dans la posi
tion des fractions actives lorsque la révélation est effectuée
avec et sans NADPH. Les poids moléculaires étant voisins, il
est difficile d'affirmer s'il s'agit de la même protéine. Dans
la négative, il deviendrait également délicat d'attribuer les
caractéristiques physico-chimiques à l'une ou l'autre d'entre
elles. D'autres études seront donc nécessaires pour le confir
mer. D'ici là et jusqu'à preuve du contraire, nous considérons
qu'il y a dans le foie une seule protéine responsable de l'hy
drolyse du PADAC. Le repérage d'une faible activité dans des

fractions de poids moléculaires très élevés (440,000 et
669,000), lors de la filtration en HPLC, suggère que l'enzyme
puisse être attachée à d'autres macromolécules. Par analogie
avec les g-1actamases bactériennes, on peut supposer que l'en
zyme puisse être liée à la membrane et que ces protéines de
poids moléculaires élevés sont des fragments de membrane cellu
laire. Le poids moléculaire de l'enzyme est rapproché de ceux
de la grande majorité des g-lactamases bactériennes. Le résul

tat du point isoélectrique (environ 7.7) en gradient de sucrose
a été confirmé par d'autres évidences. Ainsi, il se situe très
près du pH où la protéine se décroche de l'échangeur d'ions
DEAE-Séphadex A -5 0 ( p H 7.9). De plus, la courbe du p H optimum
a fourni des indications montrant une diminution marquée d'ac
tivité vers le p H 7.5. Ce résultat peut s'expliquer du fait
qu'une enzyme tend à précipiter à son point isoélectrique.
Quant à l'activité envers la nitrocéfine, il semble
que la protéine responsable soit plus petite que les autres
avec un poids moléculaire inférieur à 25,000. Il est donc
possible d'écarter définitivement qu'il puisse s'agir de l'al
bumine qui possède un poids moléculaire d'environ 65,000 (190).
Nous n'avons pas pu déterminer s'il s'agit de la même protéine
décrite par O'Callaghan (261) dans le sérum de rat. L'électro

204
focalisation tendrait à appuyer ce fait puisque nous avons
observé 4 bandes avec l'extrait brut de foie versus 3 pour le
sérum. Cependant, le point isoélectrique de la bande majeure
se situe à environ 6.7 pour la protéine sérique versus 5.4 pour
la protéine hépatique. De plus, il ne semble pas que la dégra
dation de la nitrocéfine dans le sérum soit un mécanisme enzy
matique. Il serait donc intéressant de vérifier ce point dans
l'extrait de foie.
L'objectif de prouver la présence d'une g - lactamase
dans les cellules de foie de rat demeure encore en suspens. A
la lumière des résultats obtenus dans ce chapitre, deux avenues
s'ouvrent afin d'établir ce fait avec plus de certitudes. La
première serait de purifier la protéine hépatique qui hydrolyse
la nitrocéfine et d'étudier davantage ses caractéristiques
enzymatiques. La seconde aurait pour but de se concentrer sur
celle qui dégrade le PADAC. La perte d'activité qui caractéri
sait les étapes de purification présentées au début, les ren
dait à toutes fins pratiques inefficaces et inutiles. Le rôle
positif joué par le NADRH permet maintenant d'entrevoir la
réalisation de purifications plus fructueuses. Il serait alors
possible de vérifier plus précisément le profil de substrat et
éventuellement le mécanisme d'action de cette enzyme.
En conclusion, le foie de rat possède deux protéines
capables de s'attaquer à des céphalosporines. L'enzyme qui
dégrade le PADAC a besoin de NADPH comme cofacteur, possède un
point isoélectrique d'environ 7.7 et un poids moléculaire voi
sin de 25,000. La protéine qui hydrolyse la nitrocéfine possé
derait un poids moléculaire légèrement inférieur et un point
isoélectrique près de 5.4. La capacité de ces protéines de

réagir avec d'autres g-lactamines (chapitre IV) n'écarte pas la
possibilité qu'il puisse s'agir de g-1actamases.

CHAPITRE VI
Conclusion
205
206
Il est reconnu qu'il est plus avantageux pour une
cellule de synthétiser une protéine seulement lorsque celle-ci
contribue à son bien-être (155). Compte tenu que des g-lacta
mases ont été retrouvées dans des souches qui n'ont pas eu de
contact fréquent en nature avec les antibiotiques, il nous a
semblé évident qu'elles aient un rôle physiologique essentiel.
L'objectif de ce projet de recherche était donc d'élucider ce
rôle. Cette cible initiale a été visée sous plusieurs angles
différents.
Les expériences portant sur l'universalité des 6-
lactamases ont permis d'évaluer les limites des méthodes de
détection et la difficulté d'identifier une g-1actamase lorsque
les taux d'activité sont très bas. Dans cette perspective,
1'utilisation d'anticorps monoclonaux ou de sondes radioac
tives, dirigés respectivement contre les g-lactamases ou leurs
gènes, permettrait d'aborder ce sujet avec des outils plus
sensibles. Nous avons vérifié que la synthèse de g-lactamase
soit une caractéristique propre aux bactéries aérobies et anaé
robies facultatives et conséquemment, que la présence de cette
enzyme chez les bactéries anaérobies strictes soit un phénomène
rare, en particulier chez les bactéries à Gram positif. Les
études sur l'universalité des g - lactamases sont difficiles à
réaliser parce qu'un grand nombre de souches ont maintenant des
g - lactamases transférables. Il nous semble essentiel, si l'on
veut en apprendre plus sur le rôle physiologique, de déterminer
quelles sont les espèces qui possèdent ou ne possèdent pas une
B-lactamase chromosomique. Dans la même veine, il serait dif
ficile de répondre à l'heure actuelle si une g-1actamase p1 as-
mi di que peut jouer un rôle autre que de détruire les g-lacta-
mines, comme chez Staphylococcus aureus. Il aurait certes été
intéressant, sinon primordial, d'étudier un plus grand nombre
de souches chez un plus grand nombre d'espèces, mais le but
visé consistait davantage à récolter des indices qui puissent
nous orienter vers une voie métabolique.
Nous avons par la suite entrepris des expériences qui

207
nous permettaient de rassembler des évidences sur l'implication
de la g-lactamase dans un processus métabolique vital pour la
cellule bactérienne. Prenant en considération l'absence de g-
lactamase chez plusieurs germes anaérobies et sa présence dans
des cellules eucaryotes, nous pouvions nous interroger sur le
rôle des g-1actamases dans le métabolisme de la paroi cellu
laire. Or, l'effet positif de l'oxygène dans 1 'induction com
biné avec une production accrue de g-lactamase dans un milieu
de culture pauvre, où la cellule a besoin d'énergie pour procé
der à ses synthèses, suggèrent que cette enzyme soit impliquée
dans une fonction physiologique reliée à une voie métabolique
aérobie. Toutefois, il est très difficile d'interpréter adé
quatement des résultats sur le métabolisme microbien sans con
trôler parfaitement toutes les variables en présence. Il se
rait donc avisé d'entreprendre de telles expériences dans un
environnement génétiquement défini.
A la suite de ces constatations, nous avons décidé de
diriger nos efforts vers la mise en évidence et la caractérisa
tion d'une activité g-lactamase dans des cellules de mammi
fères. Nous avons démontré la capacité des cellules de foie de
rat de dégrader et d'inactiver de nombreuses g-1actamines. Au
premier regard, l'activité hépatique a semblé complexe et mul
tifactorielle. L'utilisation de deux céphalosporines chromogé
niques a permis d'isoler deux protéines différentes. La puri
fication de l'une d'entre elles a été tentée sans succès. La
recherche des conditions optimales pour stabiliser cette pro
téine a permis de déterminer qu'elle nécessite la présence d'un
cofacteur, le NADP H. Elle réagit aussi avec quelques pé names
et céphèmes. L'autre possède un poids moléculaire inférieur
qui se rapproche des g-lactamases chromosomiques bactériennes.
Elle réagit avec un pénème et un monobactame. Nous avons
écarté la possibilité que ces protéines puissent être sembla
bles à des estérases, à la peptidase rénale ou à l'albumine.
Il est également peu probable qu'il s'agisse d'acylases. Une
purification plus poussée de ces protéines devrait permettre
d'établir si elles appartiennent réellement à la famille des g-

208
lactamases. L'étude détaillée de leurs profils de substrat et
d'inhibition ainsi que l'analyse des produits de dégradation de
leurs substrats seront à cet égard déterminants. Enfin, puis
que de nombreux auteurs reconnaissent les g-lactamases comme
des enzymes exclusivement bactériennes, il est possible qu'une
preuve ultime nécessite la comparaison des séquences des gènes
eucaryotes et procaryotes codant pour une g-1actamase.
Nous avons mentionné précédemment l'avantage qu'au
rait la découverte du rôle physiologique dans une meilleure
compréhension de l'évolution moléculaire des g-lactamases. Les

travaux d'Ambler ( et la constitution de 3 grandes classes de
g-lactamases fournissent un point de départ intéressant. R ap
pelons-en les grandes lignes. Les g-lactamases de la classe C
se retrouvent toutes chez des bactéries gram-négatives. Bacil
lus cereus est le seul représentant de la classe B et possède
une g - lactamase (type II) du genre métalloenzyme qui requiert
du zinc comme cof acteur. Les g-lactamases de la classe A
appartiennent à des bactéries gram-positives, à l'exception de
la g-lactamase transférable TE M. Cette dernière est également
la plus différente des autres g-lactamases de cette classe.
Les g-lactamases de classe A et C ont tellement peu de simili
tudes dans leur séquence qu'elles ont probablement une origine
évolutive différente (160). Pourtant, elles partagent un site
actif sérine et possèdent un mécanisme d'action de type a c y 1-
enzyme. Cette situation rappelle celle d'un autre groupe d'en
zymes, les protéases. Les subtilisines sont des sérine-pro
téases qui diffèrent de la famille de la trypsine à tel point
qu'on les considère d'origine indépendante (193). Cependant,
leur site actif possède exactement le même arrangement d'acides

aminés responsables de l'activité catalytique (248). Par con
séquent, la trypsine et les subtilisines sont un exemple d'évo
lution convergente à l'échelle moléculaire où deux gènes diffé
rents ont évolué indépendamment pour donner naissance au même
mécanisme catalytique. Une évolution convergente pourrait par
conséquent expliquer l'origine de protéines possédant une même
propriété (hydrolyser les g-lactamines) mais plusieurs

209
différences (profils de substrats, poids moléculaires, séquen
ces en acides aminés, besoin de cofacteurs).
La conservation de la g-lactamase dans l'évolution
bactérienne pour des substrats qui étaient, pour la plupart,
inconnus il y a à peine 40 ans, commande une certaine prudence
en lui attribuant seulement une fonction de protection. Quand
on considère la variété des g-lactamases décrites jusqu'à pré
sent, il nous semble que le seul point commun qui puisse exis
ter entre les trois classes d'Ambler soit d'hydrolyser une
catégorie de substrats, les g-1actamines, toute autre ressem
blance étant fortuite. Cette hypothèse sous-entend que chaque
classe de g-1actamases joue un rôle bien précis dans le métabo
lisme des cellules qui les synthétisent. Par conséquent, il
serait plus juste de parler de plusieurs rôles physiologiques
que d'un seul. Par exemple, un rôle dans la sporulation chez
Bacillus; un rôle dans la synthèse du peptidoglycan chez Sta

phylococcus (leur g-lactamase montre une certaine divergence
d'homologie avec celle des Bacillus); chez Bacillus cereus, la
g-lactamase II aurait un rôle accessoire ou essentiel non iden
tifié. Seule la g-lactamase TEM peut logiquement jouer un rôle
de protection; on la retrouve exclusivement chez des bactéries
à Gram négatif alors que le gène semble originer des gram-
positives, et chez des souches qui ont déjà une g-lactamase
chromosomique. Si l'on a trouvé des évidences que la g-lacta-
mase joue un rôle dans la synthèse du peptidoglycan chez Sta
phylococcus , rien n'indique qu'il en soit de même chez les
bactéries à Gram négatif. De plus, notre hypothèse d'un rôle
physiologique lié au métabolisme aérobie ne s'applique pas
nécessairement à ces dernières. Comme ce sont surtout les
bactéries anaérobies gram-positives qui n'ont pas de g-1acta
mases, il serait plus logique d'associer cette hypothèse aux
membres de la classe A.
Quelle fonction peut-on attribuer aux g-lactamases de
la classe C ? L'analyse comparative des séquences des ARN
ribosomaux 16 S a permis d'explorer la phylogénie des proca-

210
ryotes et l'origine de la lignée eucaryote (115). Il ressort
de ces travaux que la cellule eucaryote est une chimère phylo
génétique, mais dont l'un des constituants, la mitochondrie,
originerait du groupe des bactéries photosynthétiques pourpres.
Or, les bactéries à Gram négatif ont évolué à partir de ce
groupe. Par conséquent, la recherche de g-lactamase dans les
cellules eucaryotes peut permettre de déterminer si la fonction
a été conservée dans le processus évolutif, comme nous l'avons
affirmé plus tôt. In extenso, nous pourrons déterminer si la
g-lactamase n'appartient qu'aux bactéries. Il est peu probable
qu'une enzyme possédant un rôle dans la sporulation ou la
synthèse du peptidoglycan ait été conservée jusqu'aux euca
ryotes. Dans cette optique, la g-1actamase de classe C serait
1 ' ancêtre le plus probable d'une g-lactamase eucaryote. Cepen
dant puisque l'on remarque chez les procaryotes des divergences
dans la structure génétique de la g-lactamase (référence à la
classification d'Ambler), il ne serait pas surprenant qu'au
rang des mammifères celle-ci ait divergé davantage tout en
conservant la même fonction. Il faut également envisager
qu'elle ait gardé le même rôle essentiel mais perdu sa capacité
d'hydrolyser facilement les g-1actamines.
En conclusion, ce travail a permis d'explorer de
nouvelles avenues de recherche. Nous croyons que la confirma
tion de l'existence d'une g-lactamase dans les tissus animaux
aurait un double impact : d'un point de vue pratique, elle
jetterait un éclairage nouveau sur la pharmacocinétique des g-
laetamines; sur le plan fondamental, elle contribuerait à con
naître le substrat véritable de l'enzyme et éventuellement de
révéler quel serait l'inhibiteur le plus efficace des 6-lacta
mases des bactéries pathogènes.

211
BIBLIOGRAPHIE
1- ABBOTT, B.J. and FUKUDA, D.S. 1975.

Physical properties and kinetic behavior of a cephalospo
rin acetylesterase produced by Bacillus subtilis.
Appl. Microbiol . , 3_0_: 413-419.
2- ABDALA, M.A., FOGG , A. G . and BURGESS, C. 1982 .

Selective spectrophotometric determination of cephalospo
rins by alkaline degradation to hydrogen sulphide and
formation of methylene blue.
Analyst, 107: 213-217.
3- ABRAHAM, E.P. and CHAIN, E. 1940.

An enzyme from bacteria able to destroy penicillin.
Nature (bond.), 146: 837.
4- ABRAHAM, E.P., CHAIN, E.B., FLETCHER, G.M., GARDNER, A.D.,

HEATLEY, N.G., OENNINGS, M. A. and FLOREY , H.W. 1941.
Further observations on penicillin.
Lancet, : 177-189.
5- ABRAHAM, E.P. and WALEY, S.G. 1979.

j3-lactamases from Bacillus cereus, p. 311-338.
I n U.M.T. Hamilton-Miller and U.T. Smith (ed.) ,
g-lactamases.
Academic Press, London .
6- ALDRIDGE, K.E., SANDERS, C.V., LEWIS, A.C. and MARIER,

R.L. 1983.
Susceptibility of anaerobic bacteria to g-lactam antibio
tics and g-lactamase production.
0. Med. Microbiol . , 1^: 75-82 .
7- AMANUMA, H. and STROMINGER, 3.L. 1984.

Trapping of the substrate-derived acyl enzyme intermediate
of purified penicillin-binding protein la of Escherichia
coli .
0. Bacteriol., 160: 824-825.
8- AMBLER, R.P. 1980.

The structure of g-lactamases.
Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 2 89: 321-331.
9- AMBLER, R.P. and MEADWAY, 0. 1969.

Chemical structure of bacterial penicillinases.
Nature (Lond.), 222: 24-26.
10- ANDERSON, W.H. and BRODERSEN, R. 1949.

The elimination of penicillin G in bilaterally nephrecto-
mized dogs.
3 . Clin. Invest . , 2_8^: 821-825 .
212
11- ANGUS, B.L., CAREY, A.M., CARON, D.A., KROP INSKI, A.M.B.
and HANCOCK, R.E.W. 1982.
Outer membrane permeability in Pseudomonas aeruginosa:
comparison of a wild-type with an antibiotic-supersuscep-
tible mutant.
Antimi crob . Agents Chemot her . , 2_1: 299-309 .
12- A 0 KI, H., SAKAI, H., KOHSAKA, M., KONOMI, T., HOSODA,
KUBOCHI, Y., IGUICHI, E. and IMANAKA, M. 1976.
Nocardicin A, new monocylic 8-lactam antibiotic.
0. Antibiot., 2_9: 492-500.
13- ASSELIN, C. 1981.

Influence de facteurs physico-chimiques sur la synthèse de
deux 8-1actamases produites simultanément par Enterobacter
cloacae 1683E.
Thèse de maîtrise, Université Laval, Québec, novembre
1981.
14- AYLIFFE, G.A.]. 1965.

Cepha1osporinase and penicillinase activity of gram-
negative bacteria.
3. Gen. Microbiol., 40^: 119-126.
15- BALL, C. 1982.

Genetic approaches to over-production of 8-lactam antibio
tics in eukaryotes, p. 515-534.
I n V. Krumphanz 1 , B. Si ky ta and Z. Vanek ( ed.), Overprodu
ction of microbial products (FEMS Symposium no 13).
16- BAKKER, E.P. and RANDALL, L.L. 1984.

The requirement for energy during export of 8-lactamase in
Escherichia coli is fulfilled by the total proton-motive
force.
EMB0 3., J5: 895-900.
17- BARBALAS, M.P. and McLAFFERTY, F.W. 1983.

Targeted class analysis of 8 - lactam antibiotics by tandem
mass spectrometry.
Biomed. Mass Spectrom. , 10.: 258-261 .
18- BARBOUR, A.G., AMANO, K., HACKSTADT, T., PERRY, L. and

CALDWELL, H.D. 1982.
Chlamydia trachomatis has penicillin-binding proteins but
not detectable muramic acid.
3. Bacteriol . , 151: 420-428.
19- BARLAM, T. and NEU, H.C. 1984.

Pyridinium 2-azo-p-dimethylaniline chromophore, a
chromogenic reagent for 8-lactamase testing compared to
nitrocefin.
Eur . 3. Clin. Microbiol., J.: 185-189.
213
20- BARNES, P. and WATERWORTH, P.M. 1977.

New cause of penicillin treatment failure.
Brit. Med . 0., _i : 991-993 .
21- BARRETT, S.P. and WATT, P.3. 1979.

Antibiotics and the liver .
3. Antimicrob. Chemo ther . , 5_: 337-348.
22- BARZA, M. and WEINSTEIN, L. 1974.

Some determinants of the distribution of penicillins and
cephalosporins in the body. Practical and theoretical
considerations.
Ann . N.Y. Acad . Sc i . , 233 : 613-620.
23- BASKER, M.3. 1982.

The carbapenem family.
3. Antimicrob. Chemother . , IJD: 4-7.
24- BATESON, 3.H., BAXTER , A.3.G., ROBERTS, P.M., SMALE, T.C.

and SOUTHGATE, R. 1981.
Olivanic acid analogues. Part I. Total synthesis of the 7-
oxo-1-azabieye 1 o ((3.2.0 ) ) hept-2- e n e-2-c ar box y 1 a t e system
and some related g-lactams.
3. Chem. Soc . , 12 : 3242-3249.
25- BEATTY, 3.T. and GEST, H. 1981.

Biosynthetic and bioenergetic functions of citric acid
cycle reactions in Rhodopseudomonas capsulata.
3. Bacteriol., 148: 584-593.
26- BECHTOLD, H., ANDRASSY, K., 3AHNCHEN, E., KODERISCH, 3.,

KODERISCH, H., WEILEMANN, L.S., SONNTAG, H.G. and RITZ, E.
1984.
Evidence for impaired hepatic vitamin K 1 metabolism in
patients treated with N-methy1-thiotetrazo1e cephalospo
rins.
Thromb. Haemostasis, _5JL: 358-361.
27- BENNETT, 3.V., BRODIE, 3.L., BENNER, E.3. and KIRBY,

W.M.M. 1966.
Simplified, accurate method for antibiotic assay of
clinical specimens.
Appl. Microbiol . , IA: 170-177 .
28- BERGAN, T. 1978.

Penicillins, p. 1-122.
I n H. Schonfeld (ed.), Antibiotics and chemotherapy, vol.
25.
Karger, Basel.
2 9- BERGSTROM, S., LINDBERG, F.P., OLSSON, 0. and NOR MARK, 5.

1983 .
Comparison of the overlapping f r d and am pC opérons of
Escherichia coli with the corresponding DNA sequences in
other gram-negative bacteria.
3. Bacteriol . , 155: 1297-1305
214
30- BERGSTROM, S., OLSSON, 0. and NORMARK, S. 1982.

Common evolutionary origin of chromosomal 8-lactamase
genes in enterobacteria.
0. Bacteriol., 130 : 528-334.
31- BERKS, M., REDHEAD, K. and ABRAHAM, E.P. 1982.

Isolation and properties of an inducible and a
constitutive 8-lactamase from Pseudomonas aeruginosa.
0. Gen. Microbiol., 128: 155-159.
32- BINDERUP, E., G0DTFEDSEN, W.O. and R0H0LT, K . 1971.

Orally active cephalosporin ester.
0. Antibiot., 24: 767-773.
33- BLUMBERG, P.M. and STR0MINGER, 3.L. 1974.

Interaction of penicillin with the bacterial cell:
penici1lin-binding proteins and penici1 lin-sensiti ve
enzymes.
Bacteriol. Rev., _38: 291-335 .
34- B0DEY, G.P., FAINSTEIN, V., GARCIA, I., ROSENBAUM, B. and

WONG, Y. 1983.
Effect of broad-spectrum cephalosporins on the microbial
flora of recipients.
3. Infect. Dis., 148: 892-897.
35- BOM AN, H.G., 30NSS0N, 5., M0NNER, D., NORMARK, S. and
BLOOM, G.D. 1971.
Cell-surface alterations in Escherichia ç_oü K-12 with
chromosomal mutations changing am pi ci 1lin resistance.
Ann. N.Y. Acad. Sci . , 182: 342-357.
36- B0MAN, H.G., NORDSTROM, K. and NORMARK, S. 1974.

Penicillin resistance in Escherichi a coli K-12: synergism
between penicillinases and a barrier in the outer part of
the envelope.
Ann. N.Y. Acad. Sci., 235: 56 9-58 5.
37- BONDAREVA, N.S. and LEVITOV, M.M. 1980.

The microbiological transformation of cephalosporin C.
Microbiology, 4_9: 683-687 .
38- BONNER, D.P. and SYKES, R.B. 1984.

Structure activity relationships among the monobactams.
3. Antimicrob. Chemother . , 1^4 : 313-327.
39- BORDERS, C.L., PATRICK, S.L., DAVIS, T.L., MEZES, P.S.F.

and VISWANATHA, T. 1982.
Inactivation of g-lactamase I from B. cereus 569/H with
phenylglyoxal, an arginine-selective reagent.
Biochem. Biophys. Res. Commun., 109: 242-249.
215
40- BORIS, B., DUSART, J., FRERE, 0.M. , VAN BEEUMEN, 0 .,

EMANUEL, E.L. PETURSSON, S., GAGNON, 3. and WALEY, S.G.
1984.
The active site of the P 99 g-lactamase from Enterobacter
cloacae.
Biochem. 3., 223 : 271-274.
41- BRADFORD, M.M. 1976.

A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of
protein-dye binding.
Anal . Biochem. , 7_2.: 248-254.
42- BRAZIER, J.S., LEVETT, P.N., STANNARD, A. J., PHILLIPS,

K.D. and WILLIS, A.T. 1985.
Antibiotic susceptibility of clinical isolates of
clostridia.
3 . Antimicrob. Chemother . , JU5 : 181-185.
43- BRIAND, C. , SARRAZIN, M . , PEYROT , V., G I ELI, R.,

BOURDEAUX, M. and SARI, O.C. 1982 .
Study of the interaction between human serum albumin and
some cephalosporins.
Mol. Pharmacol 21: 92-99.
44- BROGARD, O.M. and COMTE, F. 1982.

Pharmacocinetics of the new cephalosporins, p. 145-210.
In H. Schonfeld (ed.), Antibiotics and chemotherapy, vol .
31.
Karger, Basel.
45- BROGARD, 3.M., COMTE, F. and PINGET , M. 1978 .

Pharmacokinetics of cephalosporin antibiotics, p. 123-162.
I n H. Schonfeld (ed.), Antibiotics and chemotherapy, vol.
25 .
Karger, Basel.
46- BROGARD, 3.M., PINGET, M., D0FF0EL, M., ADLOFF, A. and

LAVILLAUREIX, 3. 1979.
Evaluation of the biliary excretion of penicillin G.
Chemotherapy , 2_5 : 129-139 .
47- BROGDEN, R.N., CARMINE, A., HEEL, R.C., MORLEY, P.A.,

SPEIGHT, T.M. and AVERY, G.S. 1981.
Amoxyci 11in/c 1 avu1anic acid: a review of its antibacterial
activity, pharmacokinetics and therapeutic use.
Drugs, 22.: 337-362.
48- BROUGH ALL, O.M., BY WATER , M.3., HOLT, H.A., REEVES, D.S.
1979.
Stabilization of cephalosporins in serum and plasma.
0. Antimicrob . Chemother . , : 471-472.
49- BROWN, A.G. 1982.

(3- lactam nomenclature .
3 . Antimicrob . Chemother . , 10_: 365-372
216
50- BROWN, K.R. and MARTIN, C.M. 1981.

Analysis of safety of g-lactam antibiotics, p. 445-459.
I n M . Sal ton and D. S hock man ( e d. ) , g-lactam antibiotics.
Mode of action, new developments, and future prospects.
Academic Press, New York.
51- BRUDERLEIN, H. , DANIEL, R. , PERRAS, D., DiPAOLA, A.,

FIDELIA, A. and BELLEAU, B. 1981.
An investigation of the destruction of the g - lactam ring
of penems by the albumin drug-binding site.
Can. 3. Microbiol . , 5_9 : 857-866 .
52- BRUNTON, 3., BENNETT, P. and GRINSTED, 3. 1981.

Molecular nature of a plasmid specifying g-lactamase
production in Haemophilus ducreyi♦
3. Bacteriol ., 148 : 788-795 .
53- BRYAN, L.E., KWAN, S. and GODFREY, A.3. 1984.

Resistance of Pseudomonas aeruginosa mutants with altered
control of chromosomal g-lactamase to piperacillin,
ceftazidime, and cefsulodin.
Antimicrob. Agents Chemother . , 2_5_: 382-384.
54- BRYANT, R.E., RASHAD, A.L., MAZZA, 3.A. and HAMMOND, D.

1980 .
g-lactamase activity in human pus.
3. Infect. Dis., 142 : 594-601.
55- BRYSKIER , A. 1984.

Classification des g-lactamines.
Pathol. Biol., 32: 658-667.
56- BUH5, R.P., MAXIM, T.E., ALLEN, N., 3 AC 0 B, T.A. and WOLF,
F.3. 1974.
Analysis of cefoxitin, cephalothin and their deacylated
metabolites in human urine by high-performance liquid
chromatography.
3. Chromatogr . , 9J9: 609- 618 .
57- BUNSTER, M. and CID, H. 1984.

A model for the secondary structure of g-lactamases.
FEB5 Lett., 1_75: 267-274.
58- BORMAN, L.G., PARK, 3.T. , LINDSTROM, E-B. and BOM AN, H.G.
1973 .
Resistance of Escherichia coli to penicillins: identifica
tion of the structural gene for chromosomal penicillinase.
3. Bacteriol., 116: 123-130.
59- BUSH, K. and SYKES, R.B. 1984.

Interaction of g-1 act am antibiotics with g-lactamases as a
cause for resistance, p. 1-31.
I n L.E. Bryan (ed.), Antimicrobial drug resistance .
Academic Press, Orlando.
217
60- CABANA, B.E., VAN HARKEN, D.R. and H0TTEND0RF, G.H. 1976.
Comparative pharmacokinetics and metabolism of cephapirin
in laboratory animals and humans.
Antimi crob . Agents Chemother . , 1_0 : 307-317.
61- CALVERLEY, M.3. and BEGTRUP, M. 1983.

N-( functionalized alkyl) derivatives of 6 -
aminopenici1 lanic acid: a new series of specific
inhibitors of 8-lactamase from Enterobacter cloacae P 99.
0. Antibiot., 36: 1307-1515.
62- CAMPBELL, B.J., FORRESTER, L.J., ZAHLER, W.L. and BURKS,

M. 1984.
8-lactamase activity of purified and partially characte
rized human renal dipeptidase.
0. Biol. Chem., 259: 14586-14590.
63- CAMPBELL, B.3., LIN, Y.C., DAVIS, R. V. and BALLEW, E.

1966.
The purification and properties of a particulate renal
dipeptidase.
Biochim. Biophys. Acta, 118: 371-386.
64- CARTWRIGHT, S.J. and C0ULS0N, A.F.W. 1980.

Active site of staphylococcal 8-lactamase.
Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 289: 370-372.
65- CARTWRIGHT, 5.3. and FINK, A.L. 1982.

Isolation of a covalent intermediate in 8-lactamase I
catalysis.
FEBS Lett., %37: 186-188.
66- CASAL, M., SOLIS, F., GONZALEZ, 3.M. 1984.

Investigation of the 8-lactamase activity of Prototheca
zopfii.
Ann. Microbiol . (Paris), 135 B: 359-362 .
67- CHAIN, E. and FLOREY, H.W. 1942.

The discovery of the chemotherapeutic properties of
penicillin.
Brit. Med. Bull., 2: 5-7.
68- CHAIN, E., FLOREY, H.W., GARDNER, A.D., HEATLEY , N.G.,

JENNINGS, M.A., 0RR-EWING, 3. and SANDERS, A.G. 1940.
Penicillin as a chemotherapeutic agent.
Lancet, H: 226-228.
69- CHARLIER, P., DIDEBERG, 0., FRERE,, 3.M., M0EWS, P.C. and
KNOX, 3.R. 1983.
Crystallographic data for the 8-lactamase from
Enterobacter cloacae P 99.
3. Mol. Biol., 171 : 237-238.
218
70- CHASE, H.A. and REYNOLDS, P.E. 1981.

The cell wall as a permeability barrier to 6-lactam
antibiotics in Bacillus meqateriurn.
EEMS Microbiol . Lett., 10.: 285-289.
71- CIMARUSTI, C.M. and SYKES, R.B. 1984.

Monocyclic 6-lactam antibiotics.
Med. Res. Rev., 4j 1-24.
72- CITRI, N., KALKSTEIN, A., SAMUNI, A. and ZYK, N. 1984.

Conformational adaptation of RTEM 6-lactamase to
cefoxitin.
Eur . 0. Biochem . , 144: 333-338.
73- CITRI, N. and POLLOCK, M.R. 1966.

The biochemistry and function of 6-lactamase (penicilli
nase), p. 237-323.
I n F.F. Nord (ed. ) , Advances in enzymology and related
subjects of biochemistry, vol. 28.
John Wiley and Sons, New York.
74- CLAYTON, Ü.P., COLE, M., ELSON, S.W., HARDY, K.D., M I ZEN,
L.W. and SUTHERLAND, R. 1975.
Preparation, hydrolysis and oral absorption of a-carbox y
esters of carbenicillin.
0. Med . Chem. , 18.: 172-177 .
75- CLEWELL, D.B. 1981.

Plasmids, drug resistance, and gene transfer in the genus
Streptococcus.
Microbiol. Rev., j45: 409-436.
76- COHEN, N.C. 1983.

6 - lactam antibiotics: geometrical requirements for
antibacterial activities.
0. Med. Chem., 26j 259-264.
77- COHEN, 5.A. and PRATT, R.F. 1980.

Inactivation of Bacillus cereus 6-lactamase I by 6 6-
bromo-penici 11 anic acid mechanism.
Biochemistry, JJ? : 3996-4003.
78- COLE, M. 1964.

Properties of the penicillin deacylase enzyme of Escheri
chia co 1 i .
Nature (Lend.), 203 : 519-520.
79- COLE, M. 1979.

Inhibition of 6-lactamases, p. 205-289.
Xu O.M.T. Hami lton-Mi 1 1er and 3.T. Smith (ed.), 6-
lactamases.
Academic Press, London.
80- COLE, M. 1980.

6-lactams as 6-lactamase inhibitors.
Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci . , 2 8 9: 207-223.
219
81- COLE, M., KENIG, M.D. and HEWITT, V . A. 1973.

Metabolism of penicillins to penicilloic acids and 6-
aminopenici 1lanic acid in man and its significance in
assessing penicillin absorption.
Antimicrob . Agents Chemother . , 3_: 463-468.
82- COLLINS, J.F. 1979.

The Baci11 us licheni formis 6-lactamase system, p. 351-368.
I n J.M.T. Hami 1ton-Milier and J.T. Smith ( e d. ), 6-lacta
mases.
83- CONNOLLY, A.K. and WALEY, S.G. 1983.

Characterization of the membrane 6 - lactamase in Bacillus
cereus 569/H/9.
Biochemistry, 2_2: 4647-4651.
84- COOMBES, 3.D. 1982.

Metabolism of cefotaxime in animals and humans.
Rev . Infect. Dis., j4 : S 325-S 332.
8 5- COUILLARD, M., LET ARTE, R., PECHERE, 3.C. and MORIN, C.

1980.
Need of a combination of methods for identifying 6-
lactamases: the case of Enterobacter, p. 764-766.
In 3.D. Nelson and C. Grassi (ed.) , Current chemotherapy
and infectious disease, vol. I.
American Society for Microbiology, Washington, D.C.
86- C0ULS0N, A.F.W. 1984.

Proteins that bind the 6-lactam antibiotics.
Nature (Lond.), 309: 668.
87- CULLMANN, W. and DICK, W. 1985.

Evidence for nonspecific induction of 6-lactamase in
overproducing variants of Enterobacter cloacae and
Citrobacter freundi.
Eur. J. Clin. Microbiol., 4_: 34-40.
88- CULLMANN, W., FLENSBERG, T., OPFERKUCH, W., ST IEGLITZ, M.

and WIEDEMANN, B. 1982.
Correlation of 6-lactamase production and resistance to 6-
1 act am antibiotics in Enterobacteriaceae.
Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt Orig. A, 252:
480-489.
89- CURTIS, N.A.C., BROWN, C., BOX ALL, M. and BOULTON, M.G.
1978 .
Modified peptidoglycan transpeptidase activity in a
carbenici 11in-resistant mutant of P seudomonas aeruginosa
18 s.
Antimicrob. Agents Chemother., 1_4: 246-251.
220
90- DALBADIE-McFARLAND, G., RIGGS, A.D. and RICHARDS, 3.H.

1984 .
Directed mutagenesis as a technique to study protein
function: application to (3-lactamase.
Biochem. Soc . Trans., 1%: 226-228.
91- DATTA, N. and K0NT0MICHAL0U, P. 1965.

Penicillinase synthesis controlled by infectious R-factors
in Enterobacteriaceae.
Nature (bond.), 208 : 239-241.
92- DAVIES, 3. 1979.

General mechanisms of antimicrobial resistance .
Rev. Infect. Dis., .1: 23-29.
93- DAVIS, B.D. and T AI, P.C. 1980 .

The mechanisms of protein secretion across membranes.
Nature (bond.), 283: 433-437.
94- DEb BENE, V.E. 1979.

Enzymatic and genetic basis for (3-lactam resistance in
anaerobic bacteria, p. 443-464.
I n 3.M.T. Hamilton-Mil 1er and 3.T. Smith ( ed.), (3-lacta
mases.
Academic Press, bondon.
95- DE bOUVOIS, 3. and HURbEY, R. 1977.

Inactivation of penicillin by purulent exudates.
Brit. Med. 3., 1: 998-1000.
96- DEMAIN, A.b. 1974.

How do antibiotic-producing microorganisms avoid suicide?
Ann. N.Y. Acad. Sci . , 2 3 5: 601-612.
97- DEMAIN, A.b. and SObOMON , N.A. 1983 .

Antibiotics containing the g-lactam structure, part II.
In Handbook of experimental pharmacology, vo1 . 67.
Springer-Verlag, Berlin, 479 p.
98- DEMAIN, A.b., WAbTON, R.B., NEWKIRK, 3.F. and MIbbER, I.M.
1963 .
Microbial degradation of cephalosporin C.
Nature (bond.), 199: 909-910.
99- DIDEBERG , 0., EIBERT, M., FRERE, 3.M., CHARE 1ER, P., ZHAO,
H. and KNOX, 3.R. 1985.
Crystallization and preliminary X-ray data for the
exocel lular (3-lactamase of Bacillus 1 icheniformis
749/C.
3. Mol . Biol., 181: 145-146.
100- DUEZ, C., FRERE, 3.M., GHUYSEN, 3.M., VAN BEEUMEN, 3.,
DEtCAMBE, b. and DIERICKX. 1982.
Purification and properties of the exocellular (3-lactamase
of Actinomadura strain R39.
221
101- DYKE, K.G.H. 1979.

g-lactamases of Staphylococcus aureus, p. 291-310.
I n 3.M.T. Hamilton-Miller and 3.T. Smith ( e d. ) , g-lacta
mases .
102- ELIASSON, I. and KAMME, C. 1985.

Characterization of the plasmid-mediated g-lactamase in
Branhamella catarrha lis with special reference to
substrate affinity.
0. Antimicrob. Chemother., 15_: 139-149.
103- ELTAHAWY, A . T. 1983.

The penetration of mammalian cells by antibiotics.
0. Antimicrob. Chemother . , 293-298.
104- ENGLISH, A.R., HUANG, H.T. and S0BIN, B. A. 1960 .

6-amino penicillanic acid in urine after oral
administration of penicillins.
Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 104: 405-406.
105- ENGLISH, A.R., MacBRIDE, T.3. and HUANG, H.T. 1960.

Microbial resistance to penicillin as related to
penicillinase or penicillin acylase activity.
106- ERIKSSON-GRENNBERG, K.G., B0MAN, H.G., T0RBJ0RN JANSS0N,

0.A. and TH0REN, 5. 1965.
Resistance of Escherichia co 1 i to penicillins. I. Genetic
study of some ampicillin-resistant mutants.
3 . Bacteriol . , 9_Q : 54-62 .
107- FABRE, H., HUSSAM EDDINE, N. and BERGE, G. 1984.

Degradation kinetics in aqueous solution of cefotaxime
sodium, a third-generation cephalosporin.
3. P harm . Sci . , 7_3 : 611-618.
108- FARMER, T. and READING, C. 1982.

g-lactamases of Branhamel la catarrhal is and their
inhibition by clavulanic acid.
Antimicrob . Agents Chemother., 2Jj 506-508.
109- FISHER, 3. 1984.

g-lactams resistant to hydrolysis by the g-lactamases, p.
33-79.
In L.E. Bryan (ed . ), Antimicrobial drug resistance .
110- FISHER, 3., CHARNAS, BRADLEY , S.M. and KNOWLES, 3.R.

1981.
Inactivation of the RTEM g-lactamase from Escherichia
coli. Interaction of penam sulfones with enzyme.
Biochemistry, 2_0: 2726-2731.
222
111- FISHMAN, Y., ROTTEN, S. and CITRI, N. 1978.

Evidence linking penicillinase formation and secretions to
lipid metabolism in Bacillus licheniformis.
3. Bacteriol . , 134 : 434-439 .
112- FLEMING, A. 1929.

On the antibacterial action of cultures of a penicillin
with special reference to their use in the isolation of
B. influenzae.
Brit. 3. Exp. Pathol . , 1_0: 226-236.
113- FLYNN, E.H. 1967.

Biological and chemical studies of the cephalosporins,
p. 715-716.
Antimicrob. Agents Chemother . 1966.
114- FONTANA, R., CERINI, R., LONGONI, P., GROSSATO, A. and

CANEPARI, P . 1983.
Identification of a streptococcal penicillin-binding
protein that reacts very slowly with penicillin.
3. Bacteriol . , 155 : 1343-1350.
115- FOX, G.E., STACKEBRANDT, E., HESPELL, R.B., GIBSON, 3.,

MANILOFF, 3., DYER , T.A., WOLFE, R.S., BALCH, W.E.,
TANNER, R.S., M AGRUM , L.3., ZABLEN, L.B., BLAKEMORE, R.,
GUPTA, R., BONEN, L., LEWS, B.3., STAHL, D.A., LUEHRSEN,
K . R . , CHEN, K.N. and WOESE, C.R. 1980 .
The phylogeny of prokaryotes.
Science, 209: 457-463.
116- FRERE, 3.M., GHUYSEN, 3.M., VANDERHAEGHE, H., ADRIAENS,

P. and DEGELAEN, 3. 1976.
Fate of thiazolidine ring during fragmentation of penicil
lin.by exocellular D,D-carboxypeptidase-transpeptidase of
Streptomyces R 61.
Nature (Lond . ), 260 : 451-454.
117- FRERE, 3.M., KELLY, 3.A., KLEIN, D., GHUYSEN, 3.M., CLAES,
P. and VANDERHAEGHE, H. 1982.
A2- and A3-cepha1osporins, penicillinate and 6-unsubsti-
tuted penems.
Biochem. 3., 203: 223-234.
118- FU, K.P. and NEU, H.C. 1979.

Inactivation of g-lactam antibiotics by Legionella
pneumophila.
Antimicrob . Agents Chemother . , ljj_: 561-564.
119- FORTH, A. 1979.

The 3-lactamase of Pseudomonas aeruginosa, p. 403-428.
I n 3.M.T. Hamilton-Miller and 3.T. Smith (ed.), g-lacta-
mases.
223
120- GARDNER, P., SMITH, D.H., BEER, H. and MOELLERING, R.C.

1969.
Recovery of resistance (R) factors from a drug-free
community.
Lancet, _ii : 77 4-77 6.
121- GE0RG0PAPADAK0U , N.H., SMITH, 5. A. and BONNER , D.P. 1982 .

Penicillin-binding proteins in a Staphylococcus aureus
strain resistant to specific 8-lactam antibiotics.
Antimicrob. Agents Chemother . , 22_: 172-175.
122- GE0RG0PAPADAK0U , N.H., SMITH, S.A., CIMARUSTI, C.M. and

SYKES, R.B. 1983.
Binding of monobactams to penicillin-binding proteins of
Escherichia c_oJL_i and Staphylococcus aureus : relation to
antibacterial activity.
Antimicrob . Agents Chemother . , 2_3_: 98-104 .
123- GE0RG0PAPADAK0U , N.H., SMITH, S.A. and SYKES, R.B. 1983 .

Penicillin-binding proteins in Bacteroides fragilis.
0. Antibiot. , 36.: 907-910.
124- GHUY5EN, O.M. 1977.

Penicillin-sensitive enzymes of peptidog 1 ycan metabolism,
p. 195-202.
In D. Schlessinger (ed.), Microbiology - 1977.
American Society for Microbiology, Washington, D.C.
125- GODFREY , A. J. and BRYAN, L.E. 1984.

Intrinsic resistance and whole cell factors contributing
to antibiotic resistance, p. 113-145.
In L.E. Bryan (ed.), Antimicrobial drug resistance.
Academic Press, Orlando .
126- GODFREY, A.0 . , HATLELID, L. and BRYAN, L.E. 1984.

Correlation between lipopolysaccharide structure and
permeability resistance in 8-lactam-resistant Pseudomonas
aeruginosa.
Antimicrob . Agents Chemother ., 26_: 181-186.
127- G0LDNER, M. , GLASS, D.G. and FLEMING, P.C. 1969.

Spontaneous mutant with loss of 8-lactamase in Aerobacter
cloacae.
0. Bacteriol . , 97_: 961.
128- G00TZ, T.D., JACKSON, D.B. and SHERRIS, J.C. 1984.

Development of resistance to cephalosporins in clinical
strains of Citrobacter spp.
Antimicrob . Agents Chemother . , 2_5 : 591-595 .
129- G00TZ, T.D. and SANDERS, C.C. 1983.

Characterization of 8 - lactamase induction in Enterobacter
cloacae.
Antimicrob . Agents Chemother . , 2_3: 91-97.
224
130- G00TZ, T.D., SANDERS, C.C. and GOERING, R.V. 1982.

Resistance to cefamandole: derepression of g-lactamases by
cefoxitin and mutation in Enterobac ter cloacae.
0. Infect. Dis., 146: 34-42.
131- GRABER, H., PERENYI, T., ARR, M. and LUDWIG, E. 1976.

On human biotransformation of some penicillins.
Int. 0. Clin. Pharmacol. B iopharm. , 1_4: 284-289.
132- GREENWAY, D.L.A. and DYKE, K.G.H. 1983.

The effect of membrane-bound 8-lactamase on linoleic acid
sensitivity in Staphylococcus aureus.
3. Gen. Microbiol., 129: 2437-2465.
133- GRUNDSTROM, T. and 3AURIN, B. 1982.

Overlap between amp C and frd opérons on the Escherichia
coli chromosome.
Proc . Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79: 1111-1115.
134- GUTMANN, L. and TOMASZ. 1982.

Penicillin-resistant and penicillin-tolerant mutants of
group A streptococci.
Antimicrob. Agents Chemother . , 22\ 128-136 .
135- HADDOCK, B.A. and 30NES, C.W. 1977 .

Bacterial respiration.
Bacteriol. Rev., 4%: 47-99.
136- HAFIZ, S., McENTEGART, M.G. and GOOCH, H. 1982.

Did Neisseria gonorrhoeae acquire the ability to produce
8-lactamase in 1976 ?
Lancet, jL: 558.
137- HAMILTON-MILLER, 3.M.T. 1965.

Modes of resistance to benzy1penici11in and ampici11 in in
twelve Klebsiella strains.
3. Gen . Microbiol . , 4Jj 175-184 .

Penicillinacylase.
Bacteriol . Rev., 25.: 761-771.

8-lactamase - a human enzyme, too.
3. Antimicrob. Chemother., 9_x 87-88 .

8-lactamases and their clinical significance.
3. Antimicrob . Chemother . , 9_ (Suppl. B ) : 11-19.

Binding of antibiotics by non albumin proteins.
3. Antimicrob. Chemother . , 1_3: 303-305 .
225
142- HAM ILTON-M ILLER, 3.M.T. NEWTON, G.G.E and ABRAHAM, E.P.
1970 .
Products of amino lysis and enzymic hydrolysis of the
cephalosporins.
Biochem . 3 ., 116 : 371-384 .
143- HAMMER5TR0M, S. and 5TR0MINGER, 3.L. 1975.

Degradation of penicillin G to pheny1 acety1 g 1ycine by D-
alanine carboxypeptidase from Bacillus stearothermophi1 us.
Proc . Natl . Acad. Sci . , U.S.A., 7_2: 3463-3467.
144- HARDY, L.W. and 3.F. KIRSCH. 1984.

Diffusion-limited component of reactions. Catalyzed by
Bacillus cereus 8-lactamase I.
Biochemistry, 2J5: 1275-1282 .
145- HART, C.A., BARR, K., MAKIN, T., BROWN, P. and COOKE,
R.W.I. 1982.
Characteristics of a 6-lactamase produced by Clostridium
butyricum.
3. Antimicrob . Chemother . , 1^0 : 31-35 .
146- HART, C.A. and PERCIVAL, A. 1982.

Resistance to cephalosporins among gentamicin-resistant
klebsiellae.
3. Antimicrob. Chemother . , 9_: 275-286.
147- HEDERSTEDT, L. and RUTBERG, L. 1981.

Succinate dehydrogenase - a comparative review.
Microbiol. Rev., 4_5 : 542-555.
148- HIRUMA, R., YAMAGUCHI , A. and SAWAI, T. 1984.

The effect of lipopolysaccharide on lipid bilayer
permeability of 8-lactam antibiotics.
FEBS Lett., 170: 268-272.
149- HOLLANDER, 1.3., SHEN, Y.Q., HEIM, 3., DEMAIN, A. L. and

WOLFE, 5. 1984.
A pure enzyme catalyzing penicillin biosynthesis.
Science, 224: 610-612.
150- HOLT, R.3. and STEWART, G.T. 1964.

Production of amidase and 8~lactamase.
3. Gen. Microbiol . , 3^: 203-213 .
151- HOU, 3.P. and POOLE, 3.W. 1971.

8-lactam antibiotics: their physicochemical properties and
biological activities in relation to structure.
3. Pharm. Sci., 60.: 503-532.
152 - IKEUCHI, T. and 0SADA, Y. 1981.

A possible role of R plasmids in bacterial permeability
for 8-lactam antibiotics.
Microbiol . Immunol . , 25_i 333-344.
226
153- IKEUCHI, T. and OSADA, Y. 1981.

Distribution of R plasmids conferring a permeability
barrier to cephalosporins on bacteria isolated from
clinical specimens.
Microbiol. Immunol . , 2_5: 727-735.
154- IMADA, A., KITANO, K., KINTAKA, K., MUROI, M. and AS AI, M.
1981 .
Sulfazecin and isosu 1fazecin novel -lactam antibiotics of
bacterial origin.
Nature (bond.), 289 : 590-591 .
155- IMSANDE, 0. 1978.

Genetic regulation of penicillinase synthesis in gram-
positive bacteria.
Microbiol. Rev., 4_2: 67-83 .
156- IZUI , K., NIELSEN, 3.B.K., CAULFIELD, M.P. and DAMPEN,

0.0. 1980.
Large exopenicillinase, initial extracellular form
detected in cultures of Bacillus 1icheniformis.
Biochemistry, 12: 1882-1886.
157- JACK, G.W. and RICHMOND, M.H. 1970.

A comparative study of eight distinct 3~lactamases
synthesized by gram-negative bacteria.
0. Gen. Microbiol . , jSJj 43-61.
158- JAFFE, A., CHABBERT, Y.A. and DERL0T, E. 1983.

Selection and characterization of g-lactam-resistant
Escherichia col i K-12 mutants.
Antimicrob. Agents Chemother ., 7J>\ 622-625.
159- JAFFE, A., CHABBERT, Y .A. and SEM0NIN, 0. 1982.

Role of porin proteins ompF and ompC in the permeation of
3-lactams.
Antimicrob . Agents Chemother ., 22_: 942-948.
160- JAURIN, B. and GRUNDSTROM, T. 1981.

Am pC cephalosporinase of Escherichia c o1 i K-12 has a
different evolutionary origin from that of 3-lactamases of
the penicillinase type.
Proc . Natl. Acad . Sci . , U.S.A., 7_§_: 4897-4901 .
161- JAURIN, B., GRUNDSTROM, T., EDLUND, T. and NOR MARK, S.

1981 .
The E_i. coli 3-lactamase attenuator mediates growth rate-
dependent regulation.
Nature (Lond.) , 290 : 221-225.
162- JEFFERY, J. D ' A . , ABRAHAM, E.P. and NEWTON, G.G.F. 1961.

Deacetylcephalosporin C.
Biochem. J . , j31j 591-596.
227
163- JENKINS, S.G., BIRK, R.J. and ZABRANSKY, R.J. 1982 .

Differences in susceptibilities of species of the
Bacteroides fragilis.
Antimicrob. Agents Chemother . , 2_2: 628-634.
164- JEPSEN, O.B., MORTENSEN, I. and ROSDAHL, V.T. 1979.

Screening methods for detection of g-lactamases in
gram-negative bacteria.
J . Antimicrob . Chemother . , : 383-389.
163- JOHNSEN, J. 1977.

Utilization of benzylpenici 1 lin as carbon, nitrogen and
energy source by a P seudomonas f1uorescens strain.
Arch. Microbiol., 113: 271-275.
166- JONES, R.N., WILSON, H.W. and NOVICK, W.J. 1982.

I n vitro evaluation of pyridine-2-azo-p-dimethyl aniline
cephalosporin, a new diagnostic chromogenic reagent, and
comparison with nitrocefin, cephacetri le, and other (3 -
lactam compounds.
J . Clin. Microbiol . , 15_i 677-683.
167- JORGENSEN, J.H., CRAWFORD, S.A. and ALEXANDER, G.A. 1982.

Pyridinium-2-azo-p-dimethylaniline chromophore, a new
chromogenic cephalosporin for rapid 13-lactamase testing.
Antimicrob. Agents Chemother., 2_2: 162-164.
168- JORIS, B., DE MEESTER, F., GALLENI, M., RECKINGER, G.,

COYETTE, J. and FRERE, J.M. 1985.
The (3-lactamase of Enterobacter cloacae P 99. Chemical
properties, N-terminal sequence and interaction with 6 (3 -
halogenopenicillanates.
Biochem. J., 228 : 241-248.
169- JORIS, B., VAN BEEUMEN, J., CASAGRANDE, F., GERDAY, C.,
FRERE, J.M. and GHUYSEN, J.M. 1983.
The complete amino acid sequence of the Zn ++-containing D-
a 1 any1-D-a1 anine-c1eaving carboxypeptidase of 5 treptomyces
albus G.
Eur . J. Biochem. , 130: 53-69.
170- J0UVEN0T, M., DESCHASEAUX, M.L., MICHEL-BRIAND, Y. and

ADESSI, G.L. 1984.
(3-lactamase with high molecular weight: evidence for an
interaction with neuraminic acid-containing structures.
J. Antimicrob . Chemother . , L4 : 549-552.
171- KAHAN, F.M., KROPP, H., SUNDELOF, J.G. and BIRNBAUM, J.

1983 .
Thienamycin: development of i mipenem-ci 1astatin.
J. Antimicrob. Chemother . , JL_2 ( Suppl . D ) : 1-35.
228
172- KAHAN, J.S., KAHAN, F.M., GOEGEL MAN, R., CURRIE, S.A.,
JACKSON, M., STAPLEY, E.O., MILLER, T.W., MILLER, A.K.,
HENDLIN, D., MOCHALES, S., HERNANDEZ, S., WOODRUFF, H.B.
and BIRNBAUM, J. 1979.
Thienamycin, a new B-lactam antibiotic. I. Discovery,
taxonomy, isolation and physical properties.
J. Antibiot., jF2: 1-12.
173- KANEDA, S. and YABU, K. 1983.

Purification and some properties of B-lactamase from
Mycobacteriurn smegmatis.
Microbiol. Immunol., 7J_\ 191-193.
174- KAPRALEK, F. and FORMAN, 3. 1971.

Factors influencing the rate of electron transport in
different respiratory pathways of bacteria.
Folia Microbiol., _16 : 465-471.
175- KAPRALEK, F. and PICHINOTY, F. 1970.

The effect of oxygen on tetrathionate reductase activity
and biosynthesis.
J. Gen. Microbiol., 6_2: 95-105.
176- KASIK, J.E. 1979.

Mycobacterial B - lactamases, p. 339-350.
I n J.M.T. Hami lton-Mi 1 1er and J.T. Smith (ed.), B-lacta
mases.
177- KELLY, J.A., FRERE, J.M., KLEIN, D. and GHUYSEN, J.M.

1981.
Interaction between non-classical B-lactam compounds and
the Zn^-containing G and serine R 61 and R 3 9 D-alanyl-D-
alanine peptidases.
Biochem. J., 199: 129-136.
178- KELLY, J.A., M0EW5, P.C., KNOX, 3.R., FRERE, J.M. and
GHUYSEN, J.M. 1982.
Penicillin target enzyme and the antibiotic binding site.
Science, 218: 479-481.
179- KIM, K.S. and ANTHONY, B.F. 1981.

Penicillin tolerance in group B streptococci isolated from
infected neonates.
J. Infect. Dis., 144: 411-419.
180- KIM, H.S. and CAMPBELL, B.J. 1982.

B-lactamase activity of renal dipeptidase against N-
formimidoyl-thienamycin.
Biochem. Biophys. Res. Commun., 10 8: 1638-1642.
181- KIMURA, Y. M0T0KAWA, K., NAGATA, H., KAMEDA, Y., M ATSUURA,

S., MAYAMA, M. and K0SHIDA, T. 1982.
Asparenomycins A, B and C, new carbapenem antibiotics.
IV. Antibacterial activity.
J. Antibiot., 3_5 : 32-38.
229
182- KIND, A.C. , BEATTY, H.N., FENSTER, L.E. and KIRBY, W.M.M.
1968.
Inactivation of penicillins by the isolated rat liver.
J . Lab. Clin. Med., %1_: 728-735.
183- KIRSCH, R., FLEISCHNER, G., KAMISAKA, K. and ARIAS, I.M.

1975.
Structural and functional studies of ligandin, a major
renal organic anion-binding protein.
0. Clin. Invest . , J75 : 1009-1019.
184- KNOTT-HUNZIKER, V., PETURSSON, S., 0AYATILAKE, G.S.,

WALEY, S.G., 0AURIN, B. and GRUNDSTROM, T. 1982.
Active sites of 3-lactamases.
Biochem. 0., 201 ; 621-627.
185- KNOTT-HUNZIKER, V., PETURSSON, S., WALEY, S.G., 0AURIN, B.

GRUNDSTROM, T. 1982.
The acyl-enzyme mechanism of (3-lactamase action.
Biochem. 3., 207 ; 315-322.
186- KNOTT-HUNZIKER, V., WALEY, S.G., 0RLEK, B.S. and SAMMES,

P.G. 1979.
Penicillinase active sites: labelling of serine-44 in £3-
lactamase I by 6(3-bromopenic.i 1 lanic acid.
FEBS Lett., 99.: 59-61 .
187- KOCH, A.L. 1981.

Evolution of antibiotic resistance gene function .
Microbiol. Rev., 45.: 355-378.
188- KOCH, E., BOHN, H., HEISS, F. and SCHNEIDER, R. 1953.

Uber peni ci 1lin-intoxikation .
Arch. Exp. Pathol. Pharmakol . , 220: 157-183 .
189- K0RNGUTH, M.L. and KUNIN, C.H. 1976.

Uptake of antibiotics by human erythrocytes.
3. Infect. Dis., 133 : 175-184.
190- K0RNGUTH, M.L., M0NS0N, R.A. and KUNIN, C.M. 1974.

Binding of antibiotics to a soluble protein from rat
liver .
3. Infect. Dis., 129: 552-558.
191- K0RNGUTH, M.L., M0NS0N, R.A. and KUNIN, C.M. 1976.

The binding of penicillin antibiotics to a human liver
protein.
Arch. Biochem. Biophys., 174: 339-343.
192- K0SS, E.H. 1981.

A view from the clinic: can we afford to evaluate
antibiotics ?, p. 429-436.
I n M. Sal ton and D. Shockman ( ed.), (3-lactam antibiotics.
Mode of action, new developments, and future prospects.
230
193- KOYASU, S., FUKUDA, A., OKADA, Y. and POINDEXTER, J.S.

1983.
Penicillin-binding proteins of the stalk of Caulobacter
crescentus.
3. Gen. Microbiol., 129 ; 2789-2799.
194- KOZARICH, 3.W. and STROMINGER, 3.L. 1978.

A membrane enzyme from Staphyl ococcus a._u_r_e_u.§. which
catalyzes transpeptidase, carboxypeptidase, and penicilli
nase activities.
3. Biol. Chem., 253 : 1272-1278.
195- KRAUT, 3., ROBERTUS, 3.D., BIRKTOFT, 3.3., ALDEN, R.A.,

WILCOX, P.E. and POWERS, 3.C. 1972.
The aromatic substrate binding site in subtilisin BPN and
its resemblance to chymotrypsin.
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 36.: 117-123.
196- KROPINSKI, A.M., KUZIO, 3., ANGUS, B.L. and HANCOCK,

R.E.W. 1982.
Chemical and chromatographic analysis of lipopolysaccha
ride from an antibiotic-supersusceptible mutant of
Pseudomonas aeruqinosa.
Antimicrob. Agents Chemother., 2%: 310-319.
197- KROPP, H., SUNDELOF , 3.G., HA3DU, R. and KAHAN, F.M.

1982 .
Metabolism of thienamycin and related carbapenem antibio
tics by the renal dipeptidase, dehydropeptidase-I.
Antimicrob . Agents Chemother . , 22_ (4): 62-7 0.
198- KUDO, T. , KATO, C. and H0RIK0SHI, K. 1983 .

Excretion of the penicillinase of an alkalophilic Baci1 lus
sp. through the Escherichia coli outer membrane.
3. Bacteriol . , 156 : 949-951.
199- KUNIN, C.M. 1970.

Binding of antibiotics to tissue homogenates.
3. Infect. Dis., 121 : 55-64.
200- KUNIN, C.M. 1985.

The responsibility of the infectious disease community for
the optimal use of antimicrobial agents.
3. Infect. Dis., 151: 388-398.
201- KUSHNER, D.3. and BREUIL, C. 1977.

Penicillinase (8-lactamase) formation by blue-green algae.
Arch. Microbiol., 112 : 219-223 .
202- LABIA, R. and GUI0NIE, M. 1981.

Semi-quantification of a microbiological method using 3-
1actamases in detecting the hydrolysis of 3-lactam anti
biotics.
Ann. Microbiol. (Paris), 132 j3 : 257-265.
231
203- LACEY, R.W. 1975.

Antibiotic resistance plasmids of Staphylococcus aureus
and their clinical importance.
Bacteriol. Rev., 39.= 1-32.
204- LAMPE, M.F., ALLAN, B.3., MINSHEW, B.H. and SHERRIS, 3.C.
1982 .
Mutational enzymatic resistance of Enterobacter species to
g-lactam antibiotics.
Antimicrob . Agents Chemother . , 21_i 655-660.
205- LEGAKIS, N.3., PROTOPAPPAS, N.P ., LE0 N A RD0P0 UL0 S, 3.G. and
PAPAVASSILIOU, J.T. 1978 .
Lipid composition of Escherichia c_oJA in relation to
resistance to penicillin.
Can . 3. Microbiol., 24: 245-253.
206- LEHNINGER, A.L. 1975.

Biochemistry, 2nd ed.
Worth Publishers Inc., New York, 1104 p.
207- LEVESQUE, R., LETARTE, R. and PECHERE, 3.C. 1983.

Comparative study of the g-lactamase activity found in
A chromobacter.
Can. 3. Microbiol . , 29. : 819-826 .
208- LEVESQUE, R., ROY, P.H., LETARTE, R. and PECHERE, 3.C.

1982.
A plasmid-mediated cephalosporinase from Achromobacter
species.
3. Infect. Dis., 145 : 753-761 .
209- LEYHAUSEN, G., SEIBERT, G., MAIDH0F, A. and MULLER, W.E.G.

1984 .
Differential stimulation of lymphocyte cell growth Jjn
vitro by cephalosporins.
210- LINDSTR0M, E.B., B0MAN, H.G. and STEELE, B.B. 1970.

Resistance of Escherichia co1 i to penicillins. VI.
Purification and characterization of the chromosomal1 y -
mediated penicillinase present in .a rn._p.A_ containing
strains.
3. Bacteriol., 101: 218-231.
211- LITWACK, G., KETTERER, B. and ARIAS, I.M. 1971.

Ligandin: a hepatic protein which binds steroids, biliru
bin, carcinogens and a number of exogenous organic anions.
Nature (Lond . ), 234 : 466-467.
212- LOWE, D.A., ROMANIC, G. and ELANDER, R.P. 1981.

Penicillin acylases: a review of existing enzymes and the
isolation of a new bacterial penicillin V acylase.
Dev. Ind. Microbiol . , 2_2: 163-180 .
232
213- LOWRY, F.D., NEUHAU5, E.G., CHANG , D.C. and STEIGBIGEL,

N.H. 1983.
Penicillin therapy of experimenta 1 endocarditis induced by
tolerant Streptococcus sanguis and non tolerant
Streptococcus mitis.
Antimicrob. Agents Chemother . , 2_3: 67-73 .
214- MAGOT, M. 1981.

Some properties of the Clostridium butyricum group 3-
lactamase.
O. Gen. Microbiol., 127: 113-119.
215- MANTSALA, P. and LEHTINEN, H. 1982.

Secretion of 8-lactamase by Escherichia coli in vivo and
in vitro : effect of cerulenin.
Antonie Leeuwenhoek 0. Microbiol . , 4J^: 353-364.
216- MARKOWITZ, S.M. and WILLIAMS, D.S. 1985.

Effect of L-cysteine on the activity of penicillin anti
biotics against Clostridium difficile.
Antimicrob. Agents Chemother . , 21_\ 419-421.
217- MARRE, R., MEDEIROS, A.A. and PASCULLE, A.W. 1982.

Characterization of the 8-lactamases of six species of
Legionella.
J. Bacteriol., 151 ; 216-221.
217b-MARTIN, H.H., SCHILF, W. and SCHIEFER, H.-G. 1980.

Differentiation of mycoplasmatales from bacterial
protoplast L-forms by assay for penicillin binding pro
teins.
Arch. Microbiol . , 127 : 297-299.
218- MARTIN, J.F. and DEMAIN, A.L. 1980.

Control of antibiotic biosynthesis.
Microbiol. Rev., 44: 230-251.
219- MARTINEZ, O.V., GRATZNER, H.G., MALININ, T.I. and INGRAM,

M. 1982.
The effect of some 8-lactam antibiotics on Escherichia
co1i studied by flow cytometry.
Cytometry, 3^: 129-133.
220- MASSEY, V. 1955.

Fumarase, p. 729-735.
I n S.P. Colowick and N.O. Kaplan ( ed.), Methods in enzy mo-
logy, vol. I.
221- MASUDA,G. and T0MI0KA, 5. 1977.

Possible 8-lactamase activities detectable in infective
clinical specimens.
3. Antibiot. , 30.: 1093-1097.
233
222- MASUDA, G., TOMIOKA, 5. and HASEGAWA, M. 1976.

Detection of 3-lactamase production by gram-negative bac
teria.
3. Antibiot., 29: 662-664.
223- MATTHEW, M. 1979.

Plasmid-mediated 3-lactamases of gram-negative bacteria :
properties and distribution.
3. Antimicrob. Chemother., j?: 349-358 .
224- MATTHEW, M. and HARRIS, A.M. 1976.

Identification of 6-lactamases by analytical isoelectric
focusing: correlation with bacterial taxonomy.
3. Gen. Microbiol . , .94 : 55-67.
225- MEDEIROS, A.A. 1984.

3-lactamases.
Brit. Med. Bull., 40.: 18-27.
226- MEDEIROS, A.A., C0HENF0RD, M. and 3AC0BY, G.A. 1985.

Five novel plasmid-determined 6-lactamases.
Antimicrob. Agents Chemother. , 2J7: 715-719.
227- MEHTA, R.3. and NASH, C.H. 1978.

3-lactamase activity in yeast.
3. Antibiot., 3%: 239-240.
228- MENDEL MAN, P.M., CHAFFIN, D.O., STULL, T.L., RUBENS, C.E.,
MACK, K.D. and SMITH, A.L. 1984.
Characterization of non-3-lactamase-mediated ampici11in
resistance in Haemophi1 us influenzae.
Antimicrob. Agents Chemother. , 26_: 235-244.
229- MIKAMI, H. , OGASHIWA, M ., SAINO, Y ., INDUE, M. and

MITSUHASHI, S. 1982.
Comparative stability of newly introduced 3-lactam anti
biotics to renal dipeptidase.
Antimicrob . Agents Chemother., T2: 693-695.
230- MILLAR, M. and LACEY, R.W. 1984.

Possible selection of 3-lactamase-producing Staphylococcus
aureus by lysozyme.
Lancet, i_i : 987 .
231- MI NAM I, S., INDUE, M. and MITSUHASHI, S. 1980.

Purification and properties of a cephalosporinase from
Enterobacter cloacae.
Antimicrob . Agents Chemother., 1J3 : 853-857.
232- MINATO, K. and ABIKO, Y. 1984.

3-lactam antibiotics resistant Rothia dentocariosa from
infected postoperative maxillary cyst: studies on R-
plasmid and 3-lactamase.
Gen. Pharmacol . , 1_5 : 287-292 .
234
233- MITSUHASHI, S., YAM AGI SHI, S., SAWAI, T. and KAWABE, H.
1977.
Biochemical mechanisms of plasmid-mediated resistance,
p. 195-251.
In S. Mitsuhashi (ed.), R factor, drug resistance plasmid.
University Park Press, Baltimore, London, Tokyo.
234- MOEWS, P.C. and KNOX, 3.R. 1979.

Predicted secondary structures of four penicillin 8-
lactamases and a comparison with two lysozymes.
Int. 0. Pept. Protein Res., 1^3 : 385-393.
235- MOEWS, P.C., KNOX, 3.R., WAXMAN, D.3. and STROMINCER, 3.L.
1981.
Secondary structure relations between B-lactamases and
penicil1in-sensitive D-alanine-carboxypeptidases.
Int. 0. Pept. Protein Res., J/7: 211-218.
236- MORIN, R.B. and GORMAN, M. (ed.). 1982.

Chemistry and biology of 8-lactam antibiotics, vo 1 . 1:
penicillins and cephalosporins.
Academic Press, New York, 553 p.

Chemistry and biology of 8-lactam antibiotics, v o 1. 2:
non-traditiona1 8-lactam antibiotics.

Chemistry and biology of 6-lactam antibiotics, vol. 3: the
biology of 8-lactam antibiotics.
239- MOULT, 0., SAWYER, L., HERZBERG, 0., JONES, C.L., C0ULS0N,
A.F.W., GREEN, D.W., HARDING, M.M. and AMBLER, R.P. 1985.
The crystal structure of 8-lactamase from Staphylococcus
aureus at 0.5 nm resolution.
Biochem. J., 225: 167-176.
240- MURRAY, B.E. and MEDERSKI-SAMAR0J, B. 1983.

Transferable 8-lactamase: a new mechanism for in vitro
penicillin resistance in Streptococcus faecalis.
J. Clin . Invest. , _72 : 1168-1171.
241- NAKAGAWA, J. and MATSUHASHI, M. 1982.

Molecular divergence of a major peptidog1 yean synthetase
with transg1ycosy1ase-transpeptidase activities in Esche
richia co1i. Penicillin-binding protein 1 Bs.
Biochem. Biophys. Res. Commun., 105: 1546-1553.
242- NAKAI, Y., KANAI,

Y., FUG0N0, T. and TANAYAMA, S. 1976.
Metabolic fate of cephacetrile after parenteral adminis
tration in rats and rabbits.
J. Antibiot. , 2_9: 81-90.
235
243- NAKAZAWA, H. and OGAWARA, H. 1982.

Mechanisms of acquired penicillin-resistance in Strepto-
myces cacaoi. Role of penicillin-binding proteins in
penicillin resistant mutants.
1. Antibiot. , 3_5 : 1683-1691.
244- NEFTEL, K.A., WALT I , M., SCHULTHESS, H.K. and GUBLER, 1.

1984.
Adverse reactions following intravenous penicillin-G
relate to degradation of the drug Jjn vitro.
Klin. Wochenschr . , 6_2: 23-29 .
245- NEU, H.C. 1982.

Mechanisms of bacterial resistance to antimicrobial
agents, with particular reference to cefotaxime and other
6-lactam compounds.
Rev. Infect. Dis., j4: 5288-5299.
246- NEU, H.C. 1984.

Changing mechanisms of bacterial resistance.
Am. 3. Med., 7_7 : ( Suppl . IB): 11-23.
247- NEUMAN, M. 1981.

Mechanisms of action of 6-lactam antibiotics: relation
between P.B.P. (penicillin-binding proteins) and autoly-
sins.
Drugs Exp. Clin. Res., 7_t 363-367.
248- NEURATH, H. 1984.

Evolution of proteolytic enzymes.
Science, 224: 350-357.
249- NEWTON, G.G.F., ABRAHAM, E.P. and KUWABARA, 5. 1968.

Preliminary observations on the formation and breakdown of
"cephalosporoic acids" , p. 449-455.
Antimicrob. Agents Chemother. 1967.
250- NIELSEN, 3.B.K. and LAMPEN, 3.0. 1982.

Membrane-bound penicillinases in gram-positive bacteria.
3. Biol. Chem. , 257: 4490-4495.
251- NIELSEN, 3.B.K. and LAMPEN, 3.0. 1983.

6-lactamase III of Bacillus cereus 569: membrane lipopro
tein and secreted protein.
Biochemistry, 2%: 4652-4656.
252- NIGHTINGALE, C.H., GREENE, D.S. and QUINTILIANI, R. 1975.

Pharmacokinetics and clinical use of cephalosporin anti
biotics.
3. Pharm. Sc i . , 6^4 : 1899-1927 .
253- NIKAID0, H., ROSENBERG, E.Y. and F0ULDS, 3. 1983.

Porin channels in Escherichia coli: studies with 6-lactams
in intact cells.
3. Bacteriol . , 153.: 232-240.
236
254- NISBET, L.3., MEHTA, R.3., OH, Y ., PAN, C.H., PHELEN,

C.G., P0LAN5KY , M.3., SHEARER, M.C., GIO V ENELL A, 3. and A.
GRAPPEL, S.F. 1985.
Chlorocardicin, a monocyclic 8-lactam from a Streptomyces
sp.
3. Antibiot. , 38.: 133-138 .
255- NISH IDA, M., YOTOTA, Y., OKUI, M., MINE, Y. and MATSUBARA,
T. 1968.
Studies on microbial degradation of cephalosporin C deri
vatives. I. The role of 8-lactamase and acyl esterase in
the enzymatic degradation of cephalosporins.
3. Antibiot. , 2A: 165-169.
256- NORD , C.E. and OLSSON-LIL3EQU I ST, B. 1981.

Resistance to 8-lactam antibiotics in Bacteroides species.
3. Antimicrob . Chemo ther . , j3 ( Suppl . D ) : 33-42 .
257- NORDSTROM, K. and SYKES, R.B. 1974.

Effects of sublethal concentrations of benzylpenici 1 1 in on
Pseudomonas aeruginosa♦
Antimicrob. Agents Chemother., 6^: 741-746.
258- NORRBY, S.R., ALESTIG, K., B30RNEGARD, B., BURMAN, L.A.,

FERBER, F., HUBER, 3.L., 30NES, K.H., KAHAN,
F.M., KAH AN,
3.S., KROPP, H., MEISINGER, M.A.P. and SUNDELOF, 3.G.
1983.
Urinary recovery of N-formimidoy1 thienamycin (MK 07 87) as
affected by coadministration of N-formimidoy1 thienamycin
dehydropeptidase inhibitors.
Antimicrob. Agents Chemother. , 23.: 300-307.
259- NOVICK, R.P. 1965.

The genetic determinant of staphylococcal penicillinase.
Ann. N.Y. Acad. Sci . , 12 8 : 165-182.
260- NUESCH, V.3., GRUNER, 3., KNUSEL, F. and TREICHLER, H.3.

1967.
Cephalosporin C- und 7-aminocepha1osporansaure abbauende
enzyme aus mikroorganismen.
Pathol. Microbiol . , JSJD : 880-889 .
261- 0 ' CALLAGHAN, C.H. 1978.

Irreversible effects of serum proteins on 8-lactam anti
biotics.
Antimicrob . Agents Chemother . , _1_3 : 628-633 .
262- 0 ' CALLAGHAN, C.H. 1979.

Description and classification of the newer cephalosporins
and their relationships with the established compounds.
3. Antimicrob. Chemother . , j> : 635-671 .
237
263- O'CALLAGHAN, C.H., MORRIS, A., KIRBY, S.M. and 5HINGLER,

A.H. 1972 .
Novel method for detection of g-lactamases by using a
chromo genic cephalosporin substrate.
Antimicrob . Agents Chemother . , 1_: 283-288 .
264- 0'CALLAGHAN, C.H. and MUGGLETON, P.W. 1963.

The formation of metabolites from cephalosporin compounds.
Biochem. 0., 8_9: 304-308.
265- DEFIT, P.A., CAMPOS, J.M. and PLOTKIN, S.A. 1982 .

Am pici11in-re sistant, g-lactamase-negative Haemophilus
influenzae type b.
Pediatrics, 6_9: 230-232.
266- OGAWARA, H. 1975.

Production and property of g-lactamases in Streptomyces.
Antimicrob. Agents Chemother . , J3: 402-408.
267- OGAWARA, H. 1981.

Antibiotic resistance in pathogenic and producing bacte
ria, with special reference to g-1 actam antibiotics.
Microbiol . Rev., 45.: 591-619.
268- OGAWARA, H. and H0RIKAWA, S. 1979.

Purification of g-lactamase from Streptomyces cellulosae
by affinity chromatography on Blue Sepharose.
0. Antibiot. , 32.: 1328-1335.
269- O’GRADY, F.W. 1982.

Twenty-one years of beating g-lactamases.
Brit. Med. 0., 284: 369-370.
270- OLSON, B., WEINSTEIN, R.A., NATHAN, C. and KABINS, S.A.

1983.
Broad spectrum g-lactam resistance in Enterobacter: emer
gence during treatment and mechanisms of resistance.
0. Antimicrob . Chemother ., JJj 299-310.
271- 0N0, H., N0ZAKI, Y., KATAYAMA, N. and OKAZAKI, H. 1984.

Cephabacins, new cephem antibiotics of bacterial origin.
1. Discovery and taxonomy of the producing organisms and
fermentation .
0. Antibiot. , 3%: 1528-1535 .
272- 0UCHTERL0NY , 0. 1948 .

I n vitro method for testing the toxin-producing capacity
of diphtheria bacteria.
Acta Pathol. Microbiol. Scan d . , 2_5: 186-191 .
273- 0ZER, 3.H., LOWERY, D.L. and SAZ, A.K. 1970.

Derepression of g-lactamase (penicillinase) in Baci1 lus
cereus by peptidoglyeans.
0. Bacteriol., 102: 52-63.
238
274- OZER, 3. H. and SAZ, A.K. 1970.

Possible involvement of 0-lactamase in sporulation in
Bacillus cereus.
0. Bacteriol., 102 : 64-71.
’ 275- PAGE, M.I. and PROCTOR, P. 1984.

Mechanism of 6-lactam ring opening in cephalosporins.
0. Am. Chem. Soc., 106: 3820-3825.
276- PARDEE, A.B. and PRESTIDGE, L.S. 1961.

The initial kinetics of enzyme induction.
Biochim. Biophys. Acta, 4_9: 77-88.
277- PARR, T.R. and BRYAN, L.E. 1984.

Non enzymatic resistance to 0-lactam antibiotics and
resistance to other cell wall synthesis inhibitors, p. 81-
Hl .
In L.E. Bryan (ed.), Antimicrobial drug resistance.
278- PASTAN, I. and ADHYA, 5. 1976.

Cyclic adenosine 3',5'-monophosphate in Escherichia coli.
Bacteriol . Rev., 4J^t 527-551.
279- PECHERE, 3.C., LETARTE, R., GUAY, R. , AS SEL I N , C. et

MORIN, C. 1982.
Sch 29482 : stability and inhibitory potency towards 0-
lactamases from gram-negative bacteria.
0. Antimicrob. Chemother., 9_ (Suppl. C ) : 123-132.
280- PECHERE, J.C. et LEVESQUE, R. 1983.

0-lactamases: clinical and genetic perspectives.
0 . Antimicrob . Chemother . , 12^: 529-534.
281- PITT, 3. , SIAS0C0, R., KAPLAN, K. and WEINSTEIN, L. 1968.

Antimicrobial activity and pharmacological behaviour of
cephaloglycine, p. 630-635.
Antimicrob. Agents Chemother . , 1967.
282- POLLOCK, M.R. 1953.

The effect of oxygen back on penicillin-induced penicilli
nase formation by Bacillus cereus.
Brit. 3. Exp. Pathol . , 34: 251-262 .
283- POLLOCK, M.R. 1965.

Purification and properties of penicillinases from two
strains of Bacillus licheni formis : a chemical, physico
chemical and physiological comparison.
Biochem. 3., JM: 666-675.
284- POLLOCK, M.R. 1967.

Origin and function of penicillinase: a problem in bioche-
mical evolution.
Brit. Med. 3.,9 iv: 71-77.
239
285- POLLOCK, H.R. 1971.

The function and evolution of penicillinase.
Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci . , 17 9: 385-401.
286- PRATT, R.F., ANDERSON, E.G. and ODEH, I. 1980.

Certain monocyclic g-lactams are g-lactamase substrates:
nocardicin A and desthiobenzylpenicillin.
Biochem. Biophys. Res. Commun . , 93_: 1266-1273.
287- PRATT, R.F. and GOVARDHAN, C.P. 1984.

g-lactamase-catalyzed hydrolysis of acyclic depsipeptides
and acyl transfer to specific amino acid acceptors.
Proc. Natl. Acad. Sci. U . S . A. , 8_1 : 1302-1306.
288- RAO, V.S.R. and VASUDEVAN, T.K. 1983.

Conformation and activity of (3-lactam antibiotics.
Crit. Rev. Biochem., L4 : 17 3-206.
289- RASHTCHIAN, A., NOURAVARSANI, R., MILLER, G.R. and GER-

LACH, E.H. 1979.
Increased production of g-lactamase under anaerobic condi
tions in some strains of Escherichia coli.
Antimicrob. Agents Chemother . , l_6j 772-775.
290- READING, C. and COLE, M. 1977.

Clavulanic acid: a g - 1 ac t amase-inhibi t ing (3-lactam from
S treptomyc es clavuliqerus.
Antimicrob . Agents Chemother., _11_: 852-857.
291- READING, C. and FARMER, T. 1981.

The inhibition of g-lactamases from gram-negative bacteria
by clavulanic acid.
Biochem. J., 199 : 779-787.
292- READING, C., FARMER, T. and COLE, M. 1983.

The g-lactamase stability of amoxycillin with the g -
lactamase inhibitor, clavulanic acid.
0. Antimicrob . Chemother . , 1_1: 27-32.
293- REANNEY, D. 1976.

Extrachromosomal elements as possible agents of adaptation
and development.
Bacteriol . Rev., 40. : 552-590.
294- RICHMOND, M.H. 1965.

Wild-type variants of exopenicillinase from Staphylococcus
aureus.
Biochem. 0., 9J\_\ 584-593 .

g-lactamase (Staphylococcus aureus) , p. 664-673 .
I n S.P. Colowick and N. 0. Kaplan ( ed.), Methods in enzy mo-
log y , vol . 43.
240

Factors influencing the antibacterial action of 6-lactam
antibiotics.
3. Antimicrob. Chemother., _4 (Suppl. B): 1-14.

6-lactam antibiotics and 6-lactamases: two sides of a
continuing story.
Rev. Infect. Dis., _1: 30-38.

6-lactamases and bacterial resistance to 6-lactam antibio
tics, p. 261-273.
I n M. Salton and G.D. Shockman (ed.), 6-lactam antibio
tics.
299- RICHMOND, M.H., BENNETT, P.M., CHOI, C.-L., BROWN, N.,

BRUNTON, 3., GRINSTED, 3. and WALLACE, L. 1980.
The genetic basis of the spread of 6-lactamase synthesis
among plasmid-carrying bacteria.
Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 289: 349-359.
300- RICHMOND, M.H. and CURTIS, N.A.C. 1974.

The interplay of 6-lactamases and intrinsic factors in the
resistance of gram-negative bacteria to penicillins and
cephalosporins.
Ann. N.Y. Acad. Sci., 235: 553-567.
301- RICHMOND, M.H. and SYKES, R.B. 1973.

The 6-lactamases of gram-negative bacteria and their pos
sible physiological role, p. 31-88.
In A.H. Rose and D.W. Tempest (ed.), Advances in microbial
physiology, vol. 9.
302- RIFF, L.3. and THOMASON, 3.L. 1982.

Comparative aminoglycoside inactivation by 6-lactam anti
biotics. Effect of a cephalosporin and six penicillins on
five aminoglycosides.
3. Antibiot., 3_5: 850-857.
303- ROBINS-BROWN, R.M., CASPAR, M.N., WARD, 3.1., WACHSMUTH,

I.K., K00RNH0F, H.3., 3AC0BS, M.R. and THORNSBERRY, C.
1979.
Resistance mechanisms of multiply resistant pneumococci:
antibiotic degradation studies.
Antimicrob. Agents Chemother., L5: 470-474.
304- RODRIGUEZ-TEBAR, A., R030, F., M0NTILLA, 3.C. and VAZQUEZ,

D. 1982.
Interaction of 6-lactam antibiotics with penici 11 in-bin
ding proteins from Pseudomonas aeruginosa.
FEMS Microbiol. Lett., 1_4: 295-298.
241
305- ROLINSON , G.N. 1979 .

6-APA and the development of the g-lactam antibiotics.
J . Antimicrob. Chemother . , 5_: 7-14.
306- R0LINS0N, G.N. and BATCHELOR, F.R. 1963 .

Penicillin metabolites, p. 654-660 .
307- R0LINS0N, G.N. and SUTHERLAND, R. 1965.

The binding of antibiotics to serum proteins.
Brit. 0. Pharmacol . , 2_5: 638-650 .
308- R0LINS0N, G.N. and SUTHERLAND, R. 1973.

Semi-synthetic penicillins.
Adv . Pharmacol . , Chemother ., 1_1: 151-220 .
309- R0SDAHL, V.T. 1973.

Naturally-occuring constitutive g-lactamase of novel sero
type in Staphylococcus aureus.
0. Gen . Microbiol . , 77_: 229-231.
310- ROSENBLATT, 3.E., KIND, A.C., BR0DIE, 3.L. and KIRBY,

W.M.M. 1968.
Mechanisms responsible for the blood level differences of
isoxazoly1 penicillins.
Arch. Intern. Med., 121: 345-348.
311- ROSS, G.W. and 0 1 CALLAGHAN, C.H. 1975.

g-lactamase assays, p. 69-85.
I n S.P. Colowick and N.O. Kaplan ( ed.), Methods in en z y mo-
logy, vol. 43.
312- R0SSELET, A. and ZIMMERMAN, V. 1973.

Mutants of P seudomonas aeruginosa with impaired g-lacta-
mase inducibility and increased sensitivity to g-lactam
antibiotics.
3. Gen. Microbiol ., 76_: 455-457.
313- ROSSI, L., T0NIN, E., CHENG, Y.R. and FONTANA, R. 1985.
Regulation of penicil lin-binding protein activity:
description of a methici11in-inducib1e penicillin-binding
protein in Staphylococcus aureus.
Antimicrob. Agents Chemother . , 2_7: 828-831.
314- SABATH, L.D. 1980.

Achievements and problems from the view of a physician.
Philos. Trans. R. Soc. L ond. B Biol. S ci., 2 8 9: 251-256.
315- SABATH, L.D. 1982 .

Mechanisms of resistance to g-lactam antibiotics in
strains of S taphylococcus aureus.
Ann. Intern. Med., 91_i 339-344.
242
316- SACHI THANANDAM, S., LOWERY , D.L. and SAZ, A.K. 1974.
Endogenous, spontaneous formation of g-lactamase in
Staphylococcus aureus.
Antimicrob. Agents Chemother . , 763-769.
317- SACHITHANANDAM, 5., LOWERY, D.L. and SAZ, A.K. 1978.

Isolation of g-lactamase from a penicillin-susceptible
strain of Staphylococcus aureus.
Antimicrob. Agents Chemother. , !]>_•. 289-292.
318- SAINO, Y., INDUE, M. and MITSUHASHI , S. 1984 .

Purification and properties of an inducible cepha1ospori-
nase from Pseudomonas maltophi lia ON 12873 .
Antimicrob. Agents Chemother . , 2b_\ 362-365 .
319- SAINO, Y., KOBAYASHI, INDUE, M. and MITSUHASHI , S. 1982.

Purification and properties of inducible penicillin g-
lactamase isolated from Pseudomonas maltophilia.
Antimicrob. Agents Chemother., 2_2_: 564-570.
320- SALTON, M. and SHOCKMAN, G.D. (ed.). 1981.

g-lactam antibiotics. Mode of action, new developments,
and future prospects.
321- SANDERS, C.C. 1983.

Novel resistance selected by the new expanded-spectrum
cephalosporins : a concern.
0. Infect. Dis., 147 : 585-589.
322- SANDERS, C.C. 1984.

Inducible g-lactamases and non-hydrolytic resistance
mechanisms.
0. Antimicrob . Chemother . , IJ5_: 1-3.
323- SANDERS, C.C. and SANDERS, W.E. 1985.

Microbial resistance to newer generation g-lactam antibio
tics: clinical and laboratory implications.
0. Infect. Dis., 151: 399-406.
324- SATO, A., HIRATA, T . and NAKAMIZ0, N. 1983 .

Synthetic studies on novel g-lactam compounds from L-
aspartic acid.
Agric. Biol. C hem. , 47_: 799-806 .
325- SAWAI, T., HIRUMA, R., KAWANA, N., KANAK0, M., TANIYASU,
E. and INAMI, A. 1982.
Outer membrane permeation of g-lactam antibiotics in Es
cherichia c_o JA, Proteus mirabilis, and Enterobacter
cloacae.
Antimicrob. Agents Chemother . , 22_: 585-592 .
243
326- S A W AI, T., MATSUBA, K., TA MURA, A. and YAMAGISHI, 5.

1979.
The bacterial outer-membrane permeability of g-lactam
antibiotics.
J. Antibiol., 32: 39-63.
327- SAWAI, T., MITSUHA5HI, S. and YAMAGISHI, 5. 1968.

Drug resistance of enteric bacteria. XIV. Comparison of
8-lactamases in gram-negative rod bacteria resistant to a -
aminobenzylpenicillin.
Jpn. 3. Microbiol., 1^: 423-434.
328- SAWAI, T., NAKAJIMA, S., M0R0H0SHI, T. and YAMAGISHI, 5.

1977.
Thermo labile repression of cepha1osporinase synthesis in
Citrobacter freundii♦
Microbiol . Immunol. , 21_: 631-638 .
329- SAWAI, T., YOSHIDA, T., TSUKAMOTO, K. and YAMAGISHI, S.

1981.
A set of bacterial strains for evaluation of 8-lactamase-
stability of 8-lactam antibiotics.
J. Antibiot. , 34_: 1318-1326.
330- SAZ, A.K. 1970.

An introspective view of penicillinase.
J. Cell. Physiol . , 76_: 397-403.
331- SAZ, A.K. and LOWERY , D.L. 1964.

Staphylococcal penicillinase. II. Non-penicil1 in-like
cyclic peptides as inducers of, and substrates for, the
enzyme.
Biochem. Biophys. Res. Comm., L3 : 525-529 .
332- SAZ, A.K. and LOWERY, D.L. 1965.

Non-penici1lin-like peptides as inducers of, and sub
strates of Bacillus cereus 569 penicillinase.
Biochem. Biophys. Res. Comm., _19: 102-107.
333- SAZ, A.K. and LOWERY, D.L. 1979.

Do 8-lactamases have a biological function?, p. 465-479.
I n J.M.T. Hamilton-Mil 1er and J.T. Smith (e d . ), 8-lacta
mases.
334- SCHINDLER, P. and HUBER, G. 1980.

Use of PADAC, a novel chromogenic 8-lactamase substrate,
for the detection of 8-lactamase producing organisms and
assay of 8-lactamase inhibitors/inactivators, p. 169-176.
In U. Brodbeck (ed.), Enzyme inhibitors.
Verlag Chemie, Weinheim.
244
335- SCHWARTZ, M.A. 1979.

Non-enzymic analogues of 6-lactamases, p. 51-72.
In 3.M.T. Hamilton-Miller and 3.T. Smith (e d . ) , 6-lacta
mases .
Academie Press, London.
336- SCHWARTZ, M.A. and BUCKWALTER, F.H. 1962.

Pharmaceutics of penicillin.
3. Pharm. Sci., 5J^: 1119-1128.
337- SEGALOVE, M. 1947.

The effect of penicillin on growth and toxin production by
enterotoxic staphylococci.
3. Infect. Dis., 81: 228-243.
338- SEIBERT, G. and LIMBERT, M. 1982.

Purification and characterization of a cephalosporinase
from jlj_ coli .
Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. I Abt Orig. A, 253:
358-363.
339- SELWYN, S. 1982.

The evolution of the broad-spectrum penicillins.
3. Antimicrob. Chemother. , 9_ (Suppl. B ) : 1-10.
340- SEN, P.K., VEAL, C.3. and YOUNG, D.W. 1981.

Photochemistry of dehydrodipeptides related to 6-lactam
antibiotics.
3. Chem. Soc. , 12: 3053-3058.
341- SEWELL, D.L. and GOLPER , T. A. 1982 .

Stability of antimicrobial agents in peritoneal dialysate.
Antimicrob. Agents Chemother. , 2J^: 528-529.
342- SHANNON, K. and PHILLIPS, I. 1980.

B-lactamase detection by three simple methods: intra 1 ac
tam , nitrocefin and acidimétrie.
3. Antimicrob. Chemother . , j5 : 617-621.
343- SHIBAM0T0, N., SAKAMOTO, M., FUKAGAWA, Y. and ISHIKURA, T.

1982.
Pharmacological studies on carbapenem antibiotics. II.
Isolation of a PS-5 inactivating factor from the rat
kidney.
3. Antibiot., 35: 729-735.
344- SHIBAM0T0, N. , SAKAMOTO, M . , IGUCHI, H., TONE, H.,

FUKAGAWA, Y. and ISHIKURA, T. 1982.
Pharmacological studies on carbapenem antibiotics. I.
Metabolism of PS-5 in animal tissues.
3. Antibiot., 35: 721-728.
245
345- 5HIBAM0T0, N., Y 0 S H I 0 K A, T., SAKAMOTO, M., F U K A G A W A, Y.

and ISHIKURA, T. 1982.
Pharmacological studies on carbapenem antibiotics. III.
Chemical structure of PS-5D III, the primary renal metabo
lite of PS-5.
3 . Antibiot. , 35.: 736-741.
346- SHIMIZU, K., WATANABE, Y., KITAYAMA, R., HAYASHI, T.,

NAKASHIMA, Y., NOGUCHI, M., YASUDA, T. and SAIKAWA, I.
1982 .
Studies on protein binding of antibiotics. V. Effect of
the binding of drug to 100,000 g supernatant fluid of
human liver homogenates on urinary excretion .
3. Antibiot . , 3_5 : 1610-1615.
347- SH0CKMAN, G.D., DANE0-M00RE, L., McDOWELL, T.D. and WONG,

W. 1982.
The relationship between inhibition of cell wall synthesis
and bacterial lethality, p. 304-338.
In R.B. Morin and M. Gorman (ed. ) , The chemistry and
biology of 8-lactam antibiotics, vol. 3.
348- SHYU, W.C., NIGHTINGALE, C.H., QUINTILIANI, R. and 0LES,

K.S. 1981.
Stability of cephalosporins in commercial sera.
3. Infect. Dis., 144: 483.
349- SID0R0WICZ, W., SZECHINSKI, 3., CAN IZAR0, P.C. and BEHAL,
F.3. 1984. j 2
Cleavage of the ARC -PRO bond of bradykinin by a human
lung peptidase : isolation, characterization, and
inhibition by several 8-lactam antibiotics.
350- SIMPSON, I.N., PAGE, C.D. and HARPER, P.B. 1982.

The contribution of 8-lactamases to 8-lactam resistance in
Bacteroides fragilis.
3. Antimicrob. Chemother . , _9: 29-45.
351- SL0C0MBE, B. and SUTHERLAND, R. 1970.

8-lactamase activity and resistance to ampici11 in, carbe-
nicillin, and cephaloridine of Klebsiella, Enterobacter
and Citrobacter, p. 78-85.
Antimicrob . Agents Chemother . , 1969 .
352- SNEDEC0R, G.W. and COCHRAN, W.G. 1980.

Statistical methods, 7th ed .
The Iowa State University Press, Ames, Iowa, 507 p.
353- SNOW, G.A. 1962.

Liver enzymes acting on methyl benzyl-penicillinate.
Biochem . 3., 8_2 : 6P .
246
354- SONG, Y., SAWA, T., TSUCHIYA, M., HORIUCHI, Y., KONDO, S.,
HAMADA, H. and UMEZAWA, H. 1981.
The screening of 3-lactamase inhibitors: inhibition by
fatty acids produced by bacteria.
0. Antibiot., 34: 980-983.
355- SPRATT, B.G. 1978 .

Escherichia c o1 i resistance to 3-lactam antibiotics
through a decrease in the affinity of a target for
lethality .
Nature (bond.), 27 4: 713-715.
356- SPRATT, B.G. 1980.

Biochemical and genetical approaches to the mechanism of
action of penicillin.
Philos. Trans. R. Soc. bond . B Biol. Sci . , 289 : 273-283 .
357- SPRATT, B.G. 1983.

Penicil lin-binding proteins and the future of 3-lactam
antibiotics.
0. Gen. Microbiol . , 129 : 1247-1260.
358- STARNES, W.b., SZECHINSKI, 0. and BEHAb, F.O. 1982.

Human-liver alanine aminopeptidase. A kinin-converting
enzyme sensitive to 3-lactam antibiotics.
Eur. 0. Biochem . , 124 : 363-37 0.
359- SUGIURA, M., IT0, Y., HIRAN0, K. and SAWAKI, 5. 1978.

Purification and properties of human kidney dipeptidases.
360- SUbbIVAN, H.R., BIbbINGS, R.E. and McMAHON, R.E. 1969.

Metabolism of D-cepha1og1ycin- 14C and b-cepha1og1 ycin-14C
in the rat.
0. Antibiot. , 22.: 27-33.
361- SUbbIVAN , H.R., BIbbINGS, R.E. and McMAHON, R.E. 1969.

Metabolism of cephalexin-lif C in mice and in rats.
0. Antibiot. , 22.: 195-200.
362- SUbbIVAN, H.R., McMAHON, R.E. and HEINEY, R.E. 1971.

The fate of parenteral cephalothin and related antibiotics
in the rat. The nature of a minor long-lived metabolite.
0. Antibiot. , 24: 375-382 .
363- SWANN, O.P. 1983.

The search for synthetic penicillin during World War II.
Br. 0. Hist. Sci., 1_6: 153-190.
364- SYKES, R.B. 1982 .

The classification and terminology of enzymes that hydro
lyze 3-lactam antibiotics.
0. Infect. Dis., 145 : 762-765.
247
365- SYKES, R.B., BONNER, D.P., BUSH, K., G E O R G O P A P AD A K O U , N.H.

and WELLS, 3.S. 1981.
Monobactams-monocyclic B-lactam antibiotics produced by
bacteria .
3. Antimicrob. Chemother., j), Suppl. E : 1-16.
366- SYKES, R.B. and BUSH, K. 1982.

Physiology, biochemistry, and inactivation of 8-lacta
mases, p. 155-207.
I n R.B. Morin and M. Gorman ( ed. ) , Chemistry and biology
of 8-lactam antibiotics, vol . III.
367- SYKES, R.B. and MATTHEW, M. 1976.

The 8 -lactamases of gram-negative bacteria and their role
in resistance to 8-lactam antibiotics.
3. Antimicrob , Chemother ., j2 : 115-157 .
368- SYKES, R.B. and MATTHEW, M. 1979.

Detection, assay and immunology of 8-lactamases, p. 17-49.
In 3.M.T. Hami lton-Mil1er and 3.T. Smith (ed.), 8-lacta
mases.
369- SYKES, R.B. and SMITH, 3.T. 1979.

Biochemical aspects of 8-lactamases from gram-negative
organisms, p. 369-401.
In 3.M.T. Hamilton-Mil1er and 3.T. Smith (ed.), 8-lacta
mases.
370- TAMURA, R., IMAE, Y. and STROMINGER, 3.L. 1976.

Purification to homogeneity and properties of two D-
alanine carboxypeptidases I from Escherichia coli.
3. Biol. Chem. , 251: 414-423.
371- TANDLER, B. and HOPPEL, C.L. 1972.

Mitochondria .
Academic Press, London, 59 p.
372- THATCHER, D.R. 1975.

8-lactamase (Bacillus cereus), p. 640-652.
In S.P. Colowick and N.O. Kaplan (ed.), Methods in enzymo-
logy , vol. 43.
373- THATCHER, D.R. 1975.

6-lactamase (Bacillus licheniformis), p. 653-664.
In S.P. Colowick and N.O. Kaplan (ed.), Methods in enzymo-
logy, vol. 43.
248
374- THEN, R.L. and ANGEHRN, P. 1982.

Trapping of nonhydrolyzable cephalosporins by cephalospo-
rinases in Enterobacter cloacae and Pseu domonas aeruginosa
as a possible resistance mechanism.
Antimicrob . Agents Chemother . , 2J^ : 711-717 .
375- THI3SSEN, H.H.W. and HATTIE, H. 1976.

Active metabolites of isoxazolylpenicillins in humans.
Antimicrob. Agents Chemother . , JJ3 : 441-446.
376- THOMAS, 0.0. and KORNBERG , R.D. 1975 .

An octomer of histones in chromatin and free in solution.
Proc . Natl. Acad. Sci. U.S.A., ]_2: 2626-2630.
377- TIPPER, D.O. 1979.

Mode of action of g-lactam antibiotics.
Rev . Infect. Dis., 1_: 39-54.
378- TIPPER, D.O. and STROMINGER, O.L. 1965.

Mechanism of action of penicillins: a proposal based on
their structural similarity to acyl-D-alany1-D-alanine.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 54^ 1133-1141.
379- TOMASZ, A. 1974.

The role of autolysins in cell death.
Ann. N.Y. Acad. Sci., 235: 439-447.
380- TOMASZ, A. 1982.

Penicillin-binding proteins in bacteria.
Ann. Int. Med., _96^ 502-504.
381- TOMASZ, A., ALBINO, A. and ZANATI, E. 1970.

Multiple antibiotic resistance in a bacterium with
suppressed autolytic system.
Nature (bond.), 227: 138-140.
382- TOTH-MARTINEZ, B.L. and HERNADI, F.O. 1983.

Thin-layer chromatographic method for screening the hydro
lysis of g-lactam esters. I_n vitro hydrolysis of benzyl-
penicillin-benzamidomethyl ester by non-specific serum
esterases.
0. Chromatogr . , 264 : 171-181.
383- TSUOI, A., YOSHIKAWA, T., NISHIDE, K., MINAM I, H., KIMURA,
M., NAKASHIMA, E., TERAS AK I , T., MIYAMOTO, E., NIGHTIN
GALE, C.H. and YAMANA, T. 1983.
Physiologically based pharmacokinetic model for g-lactam
antibiotics I: tissue distribution and elimination in
rats .
0. Pharm. Sci., 72.: 1239-1251.
384- TURCK, M. 1982 .

Cephalosporins and related antibiotics : an overview.
Rev. Infect. Dis., 4^: 5281-5287 .
385- UNGAR, 3. 1947.
The jjn vivo activity of penicillin esters.
Brit. 3. Exp. Pathol . , 2jL 88-93.
385 b-UTSUI, Y. and YOKOTA, T. 1985 .

Role of an altered penicillin-binding protein in methicil-
lin- and cephem-resistant Staphylococcus aureus.
Antimicrob . Agents Chemother . , 2_8 : 397-403 .
386- VALDES, M.V., LOBBINS, P.M. and SLOTS, 3. 1982.

3-lactamase producing bacteria in the human oral cavity.
3. Oral Pathol . , LI ; 58-63 .
387- VANDAMME, E.3. 1977.

Enzymes involved in 8-lactam antibiotic biosynthesis, p.
89-123.
I n D. Perlman (e d. ) , Advances in applied microbiology,
vol. 21.
388- VANDAMME, E.3. 1981.

Penicillin acylases and 8~ lactamases.
Econ. Microbiol., _5: 468-522.
389- VANDAMME, E.3. and VOETS, 3.P. 1974.

Microbial penicillin acylases, p. 311-369.
I n D. Perlman (ed. ) , Advances in applied microbiology,
vol. 17.
390- VONEN, B. and NORLAND, 3. 1982.

Penicillin toxicity in isolated rat hepatocytes revealed
by decreased incorporation of valine into proteins.
Acta Pharmacol. Toxicol ., 5J^: 81-86 .
391- VON KRUGER, W.M.A. and PARISH, 3.H. 1981.

8-lactamase activity and resistance to penicillins in
Myxococcus xanthus.
Arch . Microbiol . , 130 : 150-154.
392- VON ZABERN, I., PRZ YKLENK, H., NOLTE, R. and VOGT, W.
1984 .
Effect of different penicillin derivatives on complement
components in human serum.
In t . Arch. Allergy Appl. Immunol . , 7_5 : 164-172 .
393- VU, H. and NIKAIDO, H. 1985.

Role of 8-lactam hydrolysis in the mechanism of resistance
of a 8-lactamase-constitutive Enterobacter cloacae strain
to expanded-spectrum 8-lactams.
Antimicrob. Agents Chemother . , 2J_: 393-398.
250
394- WALLACE, R.J., VANCE, P., WEISSFELD, A. and MARTIN, R.R.

1978 .
3- lactamase production and resistance to 3 - lactam
antibiotics in Nocardia.
Antimicrob. Agents Chemother . , %4 : 704-709.
393- WATANABE, T. 1963.

Infective heredity of multiple drug resistance in bacte
ria.
Bacteriol . Rev., 2J7 : 87-115.
396- WATANABE, Y., KI TAYA MA, R., HAYASHI, T., NAKASHIMA, Y.,
NOGUCHI, M. , YASUDA, T. , SAIKAWA, I. and SHIMIZU, K. 1982 .
Studies on protein binding of antibiotics. IV. Effect of
the binding of drug to 100,000 g supernatant fluid of
rabbit liver homogenates on urinary excretion.
0. Antibiot . , _3J5 : 1603-1609 .
397- WATANUKI, M. , 0ISHI, K . , AIDA, K. and UEMURA, T. 1972.

Oxidative phosphorylation in bacteria. I. Oxidative
phosphorylation of gram-positive and gram-negative bacte
ria.
J. Gen. Appl. Microbiol., JJ3: 29-42.
398- WAXMAN, D.J., AMANUMA, H. and STR0MINGER, 3.L. 1982.

Amino acid sequence homologies between Escherichia c o1i
penicillin-binding protein 5 and class A 3-lactamases.
FEBS Lett., 139.: 159-163.
399- WAXMAN, D.J. and STR0MINGER, J.L. 1980.

Sequence of active site peptides from the penicillin-
sens i ti ve D-a 1 ani ne carboxypeptidase of Bacillus subtilis.
3. Biol. Chem., 255: 3964-3976.
400- WAXMAN, D.B. and STROMINGER, O.L. 1983.

Penicillin-binding proteins and the mechanism of action of
3-lactam antibiotics.
Ann. Rev. Biochem. , 5_2 : 825-869.
401- WAXMAN, D.J., YOCUM, R.R. and STROMINGER, J.L. 1980.

Penicillins and cephalosporins are active site-directed
acylating agents: evidence in support of the substrate
analogue hypothesis.
Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. , 289: 257-271.
402- WEINRICH, A.E. and DEL BENE, V.E. 1976.

3-lactamase activity in anaerobic bacteria.
Antimicrob . Agents Chemother . , JJJ : 106-111.
403- WEINSTEIN, A.J. and M0ELLERING, R.C. 1975.

Studies of cephalothin: aminoglycoside synergism against
enterococci .
251
404- WELCH, C.L. and CAMPBELL, B.3. 1980.

Uptake of glycine from L-alanylglycine into renal brush
border vesicles.
0. Membr. Biol., ^4: 39-50.
405- WELLS, 3.S., HUNTER, 3.C., ASILE, G.L., SHERWOOD, 3.C.,

RICCA, G.M., TRE30, W.H., BONNER, D.P. and SYKES, R.B.
1982 .
Distribution of (3-lactam and 0- lactone producing bacteria
in nature.
3. Antibiot . , J35 : 814-821 .
406- WERNER, R.G., P0ETSCH, M. and ERNE, A.M. 1981.

Inhibition of the synthesis of the TEM-type 0 -lactamase by
purine derivatives.
Arzneim. Forsch. , J51 (II): 2044-2048.
407- WHARTON, C.3. and WRIGGLESWORTH, R. 1984.

The synthesis of peptide 8-lactams as potential protease
inhibitors.
3. Chem. So c . Perkin Trans. I, 1984: 29-39.
408- WHEELER, W.3., WRIGHT, W.3., LINE, V.D. and FR0GGE, 3.A.
1977.
Orally active esters of cephalosporin antibiotics. Syn
thesis and biological properties of acy1 oxymethy 1 esters of
7-(D-2-amino-2-phenylacetamido)-3- 5-methyl-(1,3,4-thia-
diazol-2-yl)thiomethyl-3-cephem-4-carboxylic acid.
3. Med. Chemother . , 2JD: 1159-1164.
409- WICK, W.E. 1966.

I n vitro and Jjn vivo laboratory comparison of cepha 1 othin
and deacety1-cephalothin, p. 870-875.
410- WIENT3ES, F.B., 0LI3H0EK, T.3.M., SCHWARZ, U. and NANNIN-

GA, N. 198 3.
Labeling pattern of major penicillin-binding proteins of
Escherichia coli during the division cycle.
3. Bacteriol . , 15 3: 1287-1293.
411- WILLIAMSON, R. 1983.

Resistance of Clostridium perfringens to 0-1 actam antibio
tics mediated by a decreased affinity of a single essen
tial penicillin-binding protein.
3. Gen. Microbiol . , 129_: 2339-2342.
412- WILLIAMSON, R., CALDERWD0D, S.B., M0ELLERING, R.C. and

T0MASZ, A. 1983.
Studies on the mechanism of intrinsic resistance to 0 -
lactam antibiotics in group D streptococci.
3. Gen. Microbiol . , 12 9: 813-822 .
413- WISE, R. 1982.
g-lactamase inhibitors.
3 . Antimicrob. Chemother . , 9_ (Suppl. B) : 31-40.
414- WISE, R. 1983 .

Protein binding of 0-lactams: the effects on activity and
pharmacology particularly tissue penetration. I.
0. Antimicrob . Chemother . , _1%: 1-18.
415- WISE, R. 1983.

Protein binding of 0-lactams: the effects on activity and
pharmacology particularly tissue penetration. II.
3. Antimicrob. Chemother . , _12^ 105-118.
416- WISE, R., ANDREWS, O.M. and BEDFORD, K . A. 1978.

In vitro study of clavulanic acid in combination with
penicillin, amoxycillin and carbenicillin.
Antimicrob . Agents Chemother . , 1J5: 389-393 .
417- WOESE, C.R., MANILOFF, 3. and ZABLEN, L.B. 1980.

Phylogenetic analysis of the mycoplasmes.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 7J7: 494-49 8.
418- WOLFE, S., DEMAIN, A.L., 3ENSEN, S.E. and WESTLAKE, D.W.5.
1984.
Enzymatic approach to syntheses of unnatural 0-lactams.
Science, 226: 1386-1392.
419- WYATT, R.C., 0KAM0T0, G .A. and FEIGN, R.D. 1972.

Stability of antibiotics in parenteral solutions.
Pediatrics, 49^: 22-29.
420- YAMAGUCHI, A., HIRUMA, R. and SAWAI, T. 1982.

Phospholipid bilayer permeability of 0-lactam antibiotics.
3. Antibiot., 35: 1692-1699.
421- YAMAGUCHI , A., HIRUMA, R. and SAWAI, T. 1983 .

The effect of hydrophobic!ty of 0-lactam antibiotics on
their phospholipid bilayer permeability.
FEBS Lett., 164: 389-392.
422- YAMAMOTO, T., MURAYAMA, S.Y. and SAWAI, T. 1983 .

Cloning and expression of the gene(s) for cepha1osporinase
production of Citrobacter freundii.
Mol. Gen. Genet., 190: 85-91.
423- YAMAMOTO, T. and Y0K0TA, T. 1977.

0-lactamase-directed barrier for penicillins of
Escherichia coli carrying R plasmids.
Antimicrob. Agents Chemother . , Ij^: 936-940.
424- YAMANA, T., TSU3I, A. and MIZUKAMI, Y. 1974.

Kinetic approach to the development in 0-lactam antibio
tics. I. Comparative stability of semisynthetic penicil
lins and 6-aminopenici1lanic acid in aqueous solution.
Chem . P harm. Bull., 2/Zi 1186-1197 .
253
425- YOCUM, R.R., WAXMAN, D.3., RASMUSSEN, J.R. and STROMINGER,

3.L. 1979.
Mechanism of penicillin action: penicillin and substrate
bind covalently to the same active site serine in two
bacterial D-alanine carboxypeptidases.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76s 2730-2734.
426- YOSHIMURA, F. and NIKAIDO, H. 1985.

Diffusion of g -1ac tarn antibiotics through the porin chan
nels of Escherichia coli K-12.
Antimicrob. Agents Chemother., 2%: 84-92.
427- ZIGHELBOIM, 5. and TOMASZ, A. 1981.

Multiple antibiotic resistance in South African strains of
Streptococcus pneumoniae: mechanism of resistance to g -
lactam antibiotics.
Rev. Infect. Dis., 3_: 267-276.
428- ZIMMERMANN, W. 1980.

Penetration of g -1ac tarn antibiotics into their target
enzymes in P seudomonas aeruginosa : comparison of a highly
sensitive mutant with its parent strain.
Antimicrob. Agents Chemother . , 1_8^ 94-100.
429- ZIOMEK, E. , SLOWINSKA, R. and SZEWCZUK, A. 1982.

Acylases in plasma of hamsters with experimental hepati
tis.
Enzyme , 27.: 221-226 .
430- ZIOMEK, E., SLOWINSKA, R. and SZEWCZUK, A. 1979.

Molecular forms of cobalt-activated acylase in human
tissues and serum of patients with viral hepatitis.
Clin. C him . Acta, 93_: 189-194.
APPENDICE
Résumés des communications présentées à des congrès scientifiques.
A- XIIle International Congress of Microbiology.

Août 1982, Boston.
Beta-Lactamase Activity and Bacterial Respiration.
C. MORIN*, M. COUILLARD, J.C. PECHERE and R.
LETARTE. Laval University, Quebec City, CANADA.
B-lactamase production is nearly universal among aero
bic and facultative anaerobic bacteria. Preliminary results
revealed no significant 8-lactamase activity in most anae
robic bacteria studied while it seemed to be present in the
mitochondrial fraction of eucaryotic cells. This raises the
hypothesis of a respiratory-linked function for 8-lactama
ses. The effect of oxygen on the synthesis of B-lactamase
was evaluated, in combination with KCN, induction with ben-
zylpenicillin and source of nutrients in the culture me
dium. Three strains of Enterobacteriaceae were selected:
Enterobacter cloacae P99 with a constitutive chromosomal
8-lactamase, E. cloacae 1321E, a so-called "8-lactamase-
less" mutant of P99 and Citvobactev frcundii MULB601 harbo
ring a fully inducible chromosomal 8-lactamase. Specific
activity of 8-lactamase was increased by the presence of
oxygen in the two constitutive strains as well as in the
inducible one, whether or not it was induced. Using KCN as
a respiratory inhibitor, B-lactamase synthesis was quanti
tatively decreased. An effect of the nutrient source was
also observed, the specific activity being higher for cells
grown in minimal medium than in more complex medium. Pre
sent data suggest the participation of 8-lactamase in the
respiratory system and agree with the theory of a physio
logical role for 6-lactamase unrelated to 8-lactam anti
biotics.
B- 23e Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy.

Octobre 1983, Las Vegas.
Inactivation of ll-lactam Compounds by Rat Liver
Homogenates. M. COUILLARD*, J.C. PECHERE, C. MORIN,
G. RICHER, and R. GUAY. Université Laval, Québec, Qc, CANADA
Animal tissues are known to produce enzymes able to
inactivate some 8-lactam compounds. This investigation was
focused on hepatic hydrolytic activity towards these mole
cules . Livers from male Sprague Dawley rats were perfused
via the hepatic artery to remove blood cells, they were then
excised and homogenized in a tissue grinder to disrupt the
cytoplasmic membrane. After centrifugation at 72,000 x g,
the supernatant was collected and kept on ice. K-lactar.iase-
like activity has been assayed using chromogenic cephalospo
rins (PADAC and nitrocefin), biological methods based upon
the loss of antibacterial activity, and spectroohotometry.
PADAC and nitrocefin showed a modification in color within
5 minutes. Benzylpenici11 in , 6-apa, ampici11 in, cephalothin
and ceohaloridine were partially or totally inactivated
within one hour. This activity was competitively inhibited
by cefotaxime and followed a typical pattern of enzymatic
behaviour. A spectrophotometric scan of PADAC, nitrocefin
and their inactivated products showed identical patterns to
those obtained with a bacterial B-lactamase. Since similar
results were obtained with homogenates from germ free rats,
this activity is not of contaminating bacterial origin.
In conclusion, these results cannot be explained solely by
an esterase or an acylase. Rat liver do contain a
B-lactamase-like activity.

Faculte de Medecine: These

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Faculte de Medecine: These

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

uü

A L'ECOLE DES GRADUES

DU GRADE DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph.D.)

RECHERCHE D'UNI ROLE PHYSIOLOGIQUE ESSENTIEL POUR LA BETA-

A l'automne 19 8 0, Robert De 1 age, alors étudiant gra­

dué à la maîtrise en microbiologie médicale, soulignait la

ressemblance entre la structure de base des céphalosporines et

la molécule de nicotinamide adénine dinucléotide. Il s'inter­

rogeait sur la possibilité que cette dernière puisse être un

substrat des 6-1actamases. Claude Asselin pour sa part complé­

tait sa thèse de maîtrise qui portait sur l'influence de fac­

teurs physico-chimiques sur la synthèse de deux g-lactamases

dans une souche d'Enterobacter. A cette époque, Claude Morin

et moi-même étions en quête d'un sujet de thèse qui puisse

combler nos aspirations et compétences en matière de recherche.

Les discussions que nous avons eues à l'époque avec Robert

Del age et Claude Asselin allaient nous motiver à proposer un

projet de recherche. Celui-ci visait à déterminer le rôle

physiologique essentiel des g-lactamases. Les hypothèses de

départ étaient tributaires de sept années de travaux qui eurent

lieu dans ce laboratoire sous la direction des professeurs

Roger Guay, Robert Letarte et Jean-Claude Pechère.

La présente thèse de doctorat comporte une revue de

la littérature ainsi que quatre chapitres de résultats expéri­

mentaux. Les deux premiers constituent l'aboutissement de

travaux exécutés conjointement avec mon collègue et ami Claude

Morin. Au début de 1982, il fut décidé que mon travail se

concentrerait sur la mise en évidence et la caractérisation

d'une B-lactamase eucaryote. Les deux derniers chapitres abor­

dent ces sujets.

La réalisation du projet de recherche et la prépara­

tion de cette thèse n'auraient pas été possibles sans la colla­

boration de plusieurs personnes.

De veux d'abord souligner la contribution de mon

directeur de thèse, le docteur Dean-Claude Pechère, de mon co­

directeur, le docteur Roger G u a y, ainsi que des professeurs

Gilles Richer et Robert Letarte. De désire les remercier pour

m'avoir fourni un encadrement scientifique et des facilités

matériel les. Leurs conseils et leurs encouragements à des

moments parfois difficiles m'ont été précieux. De leur exprime

D'autres professeurs du Département de microbiologie

ont contribué à ma formation et m'ont fourni une aide à l'une

ou l'autre des étapes expérimentales de cette thèse. De veux

remercier les professeurs Hans W. Ackermann, Michel G. Berge­

ron, Dean R. Do1 y et Roger Lévesque.

Des professeurs d'autres départements de l'Université

Laval ont également joué un rôle dans la réalisation de ce

projet de recherche en me fournissant une aide technique et

matériel le, ou en me prodiguant des conseils. C'est le cas de

Luc Bélanger, Claude Gagnon, Seymour Heisler, Dacques Huot,

Marcel Lalanne, Denis Mayrand, M.R.V. Murthy, Michel P a g é,

Robert Tanguay et Doan Willemot.

De suis également redevable aux nombreux collègues

étudiants et assistants de recherche qui m'ont fourni une aide

indispensable à certaines étapes expérimentales. De désire

souligner plus particulièrement la collaboration de Dean Berge­

ron, Maurice Boissinot, Corinne Marlot, Marc Martin, Mario

Martin, Claude Morin, Darnel Rafrafi, Daniel le Ramsay, Docelyne

Tardif et Nancy Watt.

Enfin, je veux adresser mes remerciements au person­

nel de la Faculté de médecine, dont Betty Boulet, Docelyne

Gagnon, Francine Garneau, Louiselle Garon, Dean-Marc Dacques,

Brigitte Roy et Amédée Tremblay du Département de microbiolo­

A l'automne 19 8 0, Robert De 1 age, alors étudiant gra

la molécule de nicotinamide adénine dinucléotide. Il s'inter

substrat des 6-1actamases. Claude Asselin pour sa part complé

tait sa thèse de maîtrise qui portait sur l'influence de fac

la littérature ainsi que quatre chapitres de résultats expéri

d'une B-lactamase eucaryote. Les deux derniers chapitres abor

La réalisation du projet de recherche et la prépara

tion de cette thèse n'auraient pas été possibles sans la colla

directeur de thèse, le docteur Dean-Claude Pechère, de mon co

remercier les professeurs Hans W. Ackermann, Michel G. Berge

souligner plus particulièrement la collaboration de Dean Berge

Enfin, je veux adresser mes remerciements au person

Brigitte Roy et Amédée Tremblay du Département de microbiolo

réalisation de ce document et qui a eu la patience de dactylo

Cette étude a eu pour but d'élucider le rôle physio

souches bactériennes, dites g-1actamases-négatives, de synthé

ce type. Chez les micro-organismes à Gram positif, les actino

lactamase décelable. Ces deux espèces sont des bactéries anaé

Nous avons ensuite réalisé des expériences métaboli

Citrobacter. Le cyanure de potassium a freiné l'effet induc

que la synthèse de g-lactamase dépend davantage du fonctionne

l'influence directe de l'oxygène à d'autres niveaux métaboli

d'expériences avec des souches microbiennes génétiquement défi

méthodes d'études ont été basées sur 1 'interaction des pro

foie de rat pourrait contribuer à élucider son rôle physiologi