REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE

& POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

& DE LA R ECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE DJILALI LIABES

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE

LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES DE L’ENVIRONNEMENT

Polycopié
Présenté par :

Mme Ghomari Samia

Intitulé

RECUEILDES TRAVAUX PRATIQUES DE LA

CULTUREIN VITROVEGETALE

Ce polycopié est destiné aux étudiants de :

 3ème année licence, spécialités 

Master.

1
 2014/ 2015

Ce document présente les principales techniques de base en

culture in vitro. Les démarches développées sont le fruit des acquis
professionnels dans ce domaine. Les applications élaborées sont
destinées aux étudiants Licences, Masters, et Magisters. Elles sont
actualisées pour être favorable à la micro propagation de toutes les
d’espèces végétales.

Les étudiants auront acquits plusieurs bases de très grandes

importances, luis permettant :

- Une meilleure maitrise de l’asepsie ;

- Un passage plus facile aux techniques de recherche en

vue d’une amélioration variétale, de la conservation des espèces en
voie de disparitions ;

- Des bases assurées pour les doctorants ayant pour

thématique la valorisation de la biodiversité.

2
 TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION ……………………………………………………………………… 01

I. ASPECTS FONDAMENTAUX 02

I.1. Micropropagation ………………………………………….……………………….. 02

I.2. Culture méristèmatique …………………………………….……………………… 04
I.3. Facteurs de régénération et de croissance…………..……………….……………. 05 I.3.1.
Effet de l’explant …………………………………..…….................................. 05
I.3.1.1. L’âge physiologique et ontogénique de l'organe………………. 05
I.3.1.2. L'époque du prélèvement………………………………………… 06
I.3.2. La taille de l’explant …………...……………………………………………... 06
I.3.3. Effet du génotype ……………………………………………..……………… 06
I.3.4. Effet du milieu de culture ……………………………………….…………… 07
I.3.5. Les régulateurs de croissance…………………………………….…………... 07
I.4. Facteurs d’incubation …………………………………………………….…………. 09
I.4.1. La photopériode ……………………………………………………..………... 09
I.4.2. La température ……………………………………………………….……….. 09

II. TRAVAUX PRATIQUES DE LA CULTURE IN VITRO VEGETALE 10

TPN°1 : Equipement et règles à suivre au laboratoire de culture in vitro ………. 10

A- But du TP………………………………………………………………………. 10
B- Matériels de laboratoire………………………………………………………. 10

 Loupe binoculaire………………..……………………………………. 10
• pH mètre……………………………..………………………………… 10
• Balance de précision, 0,001g……………….………………………… 10

Etuve………………………………………………….…….…………..10
• Autoclave…………….………………………………………….……... 10
• Four pasteur…………………………………………………………… 11

3
 • Bec bunsen……………………...……………………………………… 11

 Plaque chauffante- agitateur ……………………………………… 11

• Hotte à flux laminaire………………………………………………… 11

• Entretien de la hotte………………………………………………….. 12

C- Règles à suivre au laboratoire de culture in vitro…….……….……….…... 13

D- Evaluation de l’étudiant…..……………………………….…………….…… 13

TP N°2 : Préparation du milieu de culture Murashige et Skoog (1962) (MS).….... 14

A- But du TP…..……………………………….………………………………….. 14

B- Matériel…..……………………………….…………………………………….. 14

C- Produits chimiques…..……………………………….……………………….. 14

D- Mode opératoire…..……………………………….……………………………. 15

 Solution mère des macroéléments…..……………………….………. 15

 Solution mère des microéléments…..……………………….……….. 16

 Solution mère des vitamines…..……………………………….…….. 17

 Solution mère de FeEDTA…..……………………………….……….. 18

 Préparation du milieu de culture…..………………………………… 19

E- Evaluation de l’étudiant…..……………………………….…………………….. 20

TP N°3 : Désinfection des explants en conditions aseptiques…………….……. 21

A- But du TP…………………….…….…………………….…….………………. 21

B- Matériel…………………….…….…………………….…….………………… 21

C- Produits chimiques…………………….…….…………………….…….……. 21

D- Mode opératoire…………………….…….…………………….…….……….. 21

E- Evaluation de l’étudiant…………………….…….…………………….……. 22

4
 TP N°4 : Manipulation en conditions aseptiques sous hotte à flux laminaire… 23

A- But du TP……………………….…………………….………………………... 23

B- Matériel………………….…….…………………….………………………...... 23

C- Produits chimiques………………….…….…………………….…………….. 23

D- Mode opératoire…...…………….…….…………………….………………… 23

E- Evaluation de l’étudiant………………….…….…………………….……….. 25

TP N°5 : Manipulation en conditions aseptiques à l’absence de la hotte à flux

laminaire………………….…….…………………….……………………….. 26 F-
But du TP…………………….…………………….…………………………... 26

G- Matériel ……………….…….…………………….……………………………. 26

H- Produits chimiques……………….…….…………………….……………….. 26

I- Mode opératoire……...……….…….…………………….…………………… 26

J- Evaluation de l’étudiant……………….…….…………………….………….. 27

TP N°6 : La culture méristèmatique de Solanum tuberosum L. …………….…..…. 28

K- But du TP…………………….…………………….…………………………... 28

L- Matériel……………….….…………………….………………………….......... 28

M- Produits chimiques…………….…….…………………….………………….. 28

N- Mode opératoire……..…….…….…………………….……………………… 28

O- Evaluation de l’étudiant…………….…….…………………….…………….. 30

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ………………………………………………. 31

INTRODUCTION
5
 La multiplication végétative in vitro est un mode de reproduction asexuée
artificielle, elle comprend un ensemble de méthodes faisant intervenir, d’une part des
éléments d’asepsie, et d’autre part la mise en place d’un environnement parfaitement
contrôlé : milieux définis pour chaque espèce végétale, conditions optimales de
température, photopériode, d’humidité,…. Ces méthodes s’appliquent autant à des
fragments de plante (tissus ou organes), qu’à des cellules isolées nommées
protoplastes (Dutuit et Gorenflot, 2008).

La culture in vitro doit toute son extension à la totipotence cellulaire des

végétaux. Toute cellule d’une plante peut, dans certaines conditions, se
dédifférencier pour devenir une cellule œuf, appelée cellule embryogène, capable de
générer un nouvel individu. Ainsi peut–on obtenir à partir d’un fragment végétal
plusieurs dizaines de milliers de plantules (Guyot et al., 2003).

Les techniques in vitro, outre l’aspect technologique qui sera examiné dans les
protocoles expérimentaux, doivent permettre de résoudre un certain nombre de
difficultés, tel que de maintenir l’explant en vie, et favoriser l’activité de sa croissance
par le déclanchement de la division cellulaire.

Ce document a pour but d’arborer un recueille des travaux pratiques de la

culture in vitro végétale, permettant :

• Une initiation à la manipulation d’explants végétaux en conditions stériles

(principales précautions de base pour éviter les contaminations, spécificités du
travail sous hottes à flux vertical et horizontal, stérilisation d’explants…)

• Une réflexion concrète sur la composition minérale et carbonée de milieux de

cultures ;

• L’acquisition d’une base pratique, qui favorise l’intégration des domaines de :

multiplication, conservation, ou encore une amélioration qualitative des
espèces végétales.

I. ASPECTS FONDAMENTAUX

6
 Les applications de la culture in vitro sont nombreuses aujourd’hui tant dans le
domaine de l’horticulture que dans celui de la recherche (notamment en amélioration
des plantes), ou encore pour conserver la diversité variétale (Conservatoires) pour
sauvegarder des espèces menacées (conservations ex-situ). Ces techniques exigent la
connaissance des facteurs de l’environnement (température, lumière, composition du
milieu…) du fragment de plante mis en culture afin de l’orienter vers un programme
d’évolution déterminé (Dellaa, 2013).

La culture in vitro, peut être utilisée pour :

• Reproduire de façon identique, une espèce et la multiplier en grande quantité, et

à moindre coût pour la mettre sur le marché dans les plus courts délais. On parle
d’une micropropagation rapide ;

• Préserver des espèces anciennes et menacées, pour conserver la biodiversité ;

• Elaborer de nouvelles variétés de plantes plus rapidement ;

• Assainir des plantes virosées et conserver des plantes saines (Agnès et al., 2013).

I.1. Micropropagation

Les plantes se multiplient par semis ou par multiplication végétative. La

micropropagation in vitro, apporte un progrès considérable par rapport aux
méthodes traditionnelles avec un taux de multiplication de 100 à 1000 fois plus élevé
et en un temps plus réduit (Ochette, 2005). La technique consiste à proliférer des
bourgeons axillaires préexistants sur l’explant mère. Ceci offre une parfaite garantie
de conformité génétique et une bonne stabilité des caractères au cours des repiquages
successifs (Demol et al., 2008). L’application de la technique de la micropropagation
des plantes ligneuses ; fruitiers, forestiers et d’ornement permet l’amélioration de
leurs capacités d’enracinement notamment sur le porte greffe reconnue difficile
(Soltener, 2005). Cette technique permet la multiplication végétative de plusieurs
plantes alimentaires, médicinales, horticoles, agroforestières,… (Bretaudeau, 2006).

Chez la pomme de terre, cette technique est actuellement utilisée pour la

production de semences de base (figure 1). Désormais les pommes de terre poussent
aussi en pots et produisent des tubercules de la même manière que celles qui sont
produites en terre.
7
 Figure 1 : Principales étapes de la culture in vitro de la pomme de terre en vue
de la production de la semence (Corringan et Trillion, 2005).

D'un point de vue pratique, ce système de production de semences représente

sans nul doute une alternative intéressante et efficace pour constituer rapidement un
stock de matériel de qualité sanitaire irréprochable. Il peut être aisément intégré dans
le cadre d'un approvisionnement en plants de base de haute qualité destiné à la
production de semences certifiées (Changins, 2011).

8
 I.2. Culture méristèmatique

Les méristèmes qui sont des tissus de formation, en expansion continue,

confèrent à la plante une organogenèse permanente chez les végétaux supérieurs. Ils
représentent des petits massifs de cellules indifférenciées (0,1 mm à 0,5 mm) et,
conservent la capacité de se diviser activement. Ces zones méristèmatiques gardent
jusqu'à leur mort le caractère juvénile. Elles jouent un rôle capital dans le
développement végétal puisqu’elles édifient tous les organes (Margara, 1989 ; Zrÿd et
al. 1988).

La culture de méristème est la méthode la plus généralisable et la plus sûre

pour éviter l'apparition de plantes non conformes à la plante mère ou variants (Saadi,
1991). En multipliant le méristème prélevé au sommet d'une plante ou dans le
bourgeon axillaire, le plus souvent indemne de maladies. On pourra très rapidement
obtenir de nombreuses plantes, toutes semblables du point de vue génétique et
débarrassées de maladies dont elles étaient affectées (Sama et al., 1998)

En conditions aseptiques et sous une loupe binoculaire, le dôme du méristème

(partie centrale du bourgeon) est prélevé et placé en milieu artificiel. Selon les
objectifs, le milieu de culture est modifié périodiquement, afin d’aboutir à un jeune
plant. La culture méristèmatique permet donc, d’obtenir une plante identique à la
plante initiale. Lorsqu’une plante est atteinte par un virus ou une bactérie, les
méristèmes restent indemnes, car ils ne sont pas encore infectés du fait que leur
multiplication est plus rapide que la prolifération des virus pathogènes. La culture de
cette structure aboutit alors à une plante saine (Agnès et al., 2013 ; Schmid et Keller,
1984 ; Sama et al., 1998).

I.3. Facteurs de régénération et de croissance

Les facteurs influant sur la régénération in-vitro peuvent être répartis en deux
groupes :

9
 1- Les facteurs internes, liés à la plante : concerne d'une part le génotype, la
nature et l'âge ontogénique de l'explant et d'autre part l'état physiologique de
la plante mère sur laquelle, l'explant a été prélevé ;
2- Les facteurs externes qui englobent, les milieux de cultures (notamment leur
composition en régulateurs de croissance et les sucres) et les conditions de la
mise en culture.

I.3.1. Effet de l'explant

Un des atouts majeurs de la culture in-vitro est de montrer que, les cals
pouvaient produire soit des embryons somatiques, soit des bourgeons et dont le
développement permet de régénérer des plantes conformes à la plante mère.
Pratiquement, n'importent quel organe (bourgeon, racine, feuille, anthère, etc.) ou
fragment d'organe (explant), prélevé sur celle-ci, peut être cultivé isolément sur
milieu nutritif synthétique, mais le choix de celui-ci est d'une importance
primordiale. On retiendra cependant que la réponse in-vitro est sous la dépendance
de nombreux facteurs (Saadi et Hamdani, 2007).

I.3.1.1. L'âge physiologique et ontogénique de l'organe

Généralement dans les cultures in vitro, les explants les plus jeunes (embryons
immatures, jeunes feuilles, méristèmes etc.) sont les plus privilégiés. Leur état
juvénile favorise plus de possibilités de régénération. (Vidalis et al., 1989). Souvent, ce
sont les tissus provenant d'embryons qui expriment le plus souvent, d'une manière
nette et reproductible, l'aptitude à la régénération, suivis de loin par les cotylédons
(Saadi et Hamdani, 2007).

I.3.1.2. L'époque du prélèvement

Ce problème se pose surtout pour les espèces vivaces, on peut distinguer un

stade de vie active et un stade de vie ralentie de la plante ce qui conduit les explants à
développer des réactions différentes en culture in-vitro. Cette différence peut être
expliquée par la modification des équilibres internes des régulateurs de croissance
(auxines, cytokinines, gibbérelline ...) lors des différentes saisons (Vidalis et al., 1989).
10
 I.1.3. La taille de l'explant

Plus la taille est importante et plus les équilibres endogènes sont déterminants
et les conditions extérieures seront influentes. La taille choisie variera selon la nature
de l’explant. Si l’explant est de nature reproducteur, le prélèvement devrait
engendrer l’organe en sa totalité (un nœud, un apex, ou un bourgeon entier). mais
dans le cas d'un tissu différencié (feuilles, tige, racines, inflorescence...) des fragments
de 5 à 10 mm suffiront (Vidalis et al., 1989; Saadi et Hamdani, 2007).

D'une manière générale, il existe des tissus privilégiés appelés «tissus cibles»
qui répondent à un stimulus indicateur qui orientera son programme
morphogénétique vers une voie particulière de développement, contrairement à
certains tissus récalcitrants aux manipulations in-vitro, dues essentiellement à un
manque de compétence cellulaire (Webb et al., 1989; Wheeler et al., 1985).

I.3.2. Effet du génotype

La plupart des plantes montrent une régénération génotypique spécifique liée

à l'espèce. A l'intérieur d'une même espèce, un génotype donne des bourgeons tandis
qu'un autre ne peut fournir que des embryons (Boxus, 1995). Cependant, plusieurs
auteurs mentionnent que seulement certains génotypes paraissent posséder la
capacité d'induire une embryogenèse somatique. Cette capacité, chez beaucoup
d'espèces semble être génotypiquement contrôlée (Isac et al, 1994 ; Vidalis et al, 1985 ;
Caraglio, 2012).

I.3.3. Effet du milieu de culture

Avec le développement des cultures de tissus, divers milieux de base

comprenant des sels inorganiques, des composés organiques (sucres, vitamines et
régulateurs de croissance) ont été progressivement utilisés. Les milieux de culture
sélectionnés doivent être adaptés aux besoins nutritifs de la plante soumise à l'étude,
afin de laisser s'exprimer pleinement son potentiel génétique.

11
 Les principaux constituants d'un milieu de culture sont généralement
représentés par : les macro et les microéléments, les sources carbonée et azotée, les
vitamines et régulateurs de croissance (Vidalis et al., 1989).

Dans 70% des cultures, le milieu Murashige et Skoog (MS) est utilisé comme
milieu de base pour tout type de culture in vitro. Ce milieu est essentiellement
conseillé pour le déclenchement de l'organogenèse, en particulier pour la
néoformation de bourgeons, il s'est révélé nettement supérieur à d'autres milieux
(Margara, 1989).

Le milieu de Murashige et Skoog est caractérisé principalement par une très

forte teneur en sels minéraux, en particulier en potassium et par une concentration
élevée en azote (sous forme de nitrate et d'ammonium) dont 1/3 apporté sous forme
réduite (ions NH4+). Le rapport nitrate/ammonium, dans ce milieu est très favorable
à l'induction de l'embryogenèse somatique (Dalvesco et Guerra, 2001).

I.3.4. Les régulateurs de croissance

Un régulateur de croissance, appelé également «phytohormone», est défini

comme étant, une substance qui, suivant sa concentration absolue ou relative dans le
milieu, peut supprimer, permettre ou modifier sous certaines conditions les
processus de différenciations (Vidalis et al., 1989).

L’induction d’embryons somatiques et la formation de plantules sont très

sensibles aux conditions de cultures dont principalement la composition hormonale
du milieu. Le développement in vitro d'espèces végétales dépend essentiellement
des taux d'auxines et de cytokinines (équilibre hormonal) (Staristsky et Van Hassel,
1980).

L'influence de ce rapport hormonal n'est, cependant, pas une règle générale

pour toutes les espèces végétales. En effet, il suffit, dans certains cas, de modifier la
concentration de l'un des régulateurs pour parvenir à une réponse morphogénétique
(Dalvesco et Guerra, 2001).

Par ailleurs, il est important de dire, en se basant sur la diversité des réponses
obtenues dans ce domaine, qu'il n'existe pas de règle générale, concernant l'efficacité
12
des différentes auxines et cytokinines sur la caulogenèse ou sur la rhizogenèse. Les
effets paraissent varier essentiellement avec le matériel végétal employé. Il est utile
de rappeler, que les auxines les plus souvent utilisées en organogenèse ou en
embryogenèse somatique sont le 2.4-D, l'AIA, l'AIB et l'ANA. A cause de son bon
pouvoir inducteur, le 2.4-D semble détenir, le record d'utilisation dans les études
portant sur l'embryogenèse somatique ; puisque 57 % des travaux de recherche
l'utilisent comme régulateur. Quant aux cytokinines, elles sont représentées par la
Kinétine, la benzyladenine (BA), la 2-isopentenyladénine et la zéatine (Vidalis et al.,
1989).

Outre, les auxines et les cytokinines, d'autres régulateurs de croissance

peuvent intervenir dans le processus d'organogenèse ou d'embryogenèse somatique
tels que les gibbérellines (GA) et l'acide abscissique (ABA) ; cependant, leur
utilisation reste limitée. Les gibbérellines, selon Jayasree et al, 2001, stimulent
fortement la production de bougeons néoformés chez la pomme de terre lorsqu'elles
sont combinées aux cytokinines. Par contre, d'après Margara (1989), les gibbérellines
ont la réputation d'inhiber l'organogenèse et particulièrement la rhizogenèse chez le
Chou-fleur. L'acide abscissique (ABA) quant à lui, est employé par certains auteurs
dans le but de corriger ou d'améliorer la qualité morphologique des embryons
(Unnikrisham et al., 1990; Dodeman et al., 1997). Son usage peut inhiber, en même
temps, le déclenchement éventuel d'une embryogenèse secondaire et empêche la
germination précoce des embryons somatiques (Svobodova et al., 1999)

I.4. Facteurs d’incubation

I.4.1. La photopériode

La lumière est un facteur déterminant pour la culture in vitro des plantes. La

durée de la photopériode affecte la prolifération, la vigueur et la croissance des cals
(Lepoivre, 2003). De façon générale, le début de croissance nécessite une faible
intensité lumineuse (500 à 1000 lux) avec 12 à 16 heures de photopériode (Bommineni
et Jauhar, 2003). Pour la rhizogenèse, l’auxine endogène produite par les plantes
13
pourrait être plus active lorsqu’elles séjournent à l’obscurité. L’obscurité limite
l’oxydation des composés phénoliques et optimise l’expression des phytohormones.
Ceci impliquerait que l’obscurité réduirait la dominance apicale de la pousse
primaire et favoriserait par conséquent la prolifération du tissu méristèmatique
(Kone et al., 2010). Chez la pomme de terre, la dominance apicale est atténuée en
présence d’une photopériode régulière combinée à une température modérée
(5 à 10 °C) (Rousselle et al., 1996).

I.4.2. La température
La température de beaucoup de chambres de culture est constante de l’ordre
de 22° à 25°C (Kone et al., 2010). Mais, selon Lê (1994), des faibles températures de
15°à 20°C stimulant la microtubérisation chez la pomme de terre. Tchetche (2008)
explique dans ces travaux que l’incubation des vitroplants à des températures non
régulières incite la non régularité de l’évapotranspiration du plant, et par conséquent
une diminution de sa croissance.

II. TRAVAUX PRATIQUES DE LA CULTURE IN VITRO VEGETALE

TP N°1 : Equipement et règles à suivre au laboratoire de culture in vitro

A- But du TP: Présentation du matériel nécessaire au laboratoire destiné à la

culture in vitro végétale, et des règles à respecter pour une pratique réussie.

B- - Matériel de laboratoire

14
 Pour le bon déroulement de l’expérimentation ; le laboratoire doit posséder un
équipement de base, et d’en prendre soin :

• Loupe binoculaire : Cette loupe sert à isoler des méristèmes. Elle doit avoir
une très bonne qualité optique. Le grossissement jusqu’à 40 fois permet une bonne
visualisation du tissu.

• pH mètre : Cet appareil est absolument indispensable, et en aucun cas le

test au papier pH ne peut remplacer les mesures précises du pH du milieu de culture
préparé.

• Balance de précision, 0,001g : La balance doit être électronique, dotée d’une

infime précision. Elle doit être placée à l’extrémité de la paillasse afin d’éviter son
déplacement et les bousculements, qui peuvent être source de son endommagement.
Donc à une distance des appareils à moteurs puissants qui peuvent être source de
vibrations. L’horizontalité de la balance doit être vérifiée et éventuellement corrigée
avant chaque utilisation.

• Etuve : Nécessaire pour certaines cultures réclamant des températures

différentes de la température ambiante. Il faudrait s’équiper donc avec des étuves
pourvues de tubes fluorescents (lampes à néon). Dans le cas de cultures non
spécifiques, il suffit de placer sur le mur les lampes à néon au-dessus d’une étagère
pour recevoir les cultures.

• Autoclave : Utilisé pour stériliser les solutions, les milieux de cultures, et le

matériel sensible aux températures élevées (coton cardé, papier filtre, bouchon en
caoutchouc…). La stérilisation de fait à 120°C pendant 20 mn. Il est strictement
interdit de remplir l’autoclave avec l’eau courante, qui risque de l’endommager par la
présence du calcaire. Dans le cas de l’absence de cet appareil, une cocote minute
neuve peut être utilisée pour la stérilisation. Il faut juste la remplir avec de l’eau
distillée jusqu’au niveau de la moitié des bocaux des milieux de culture, fermer et
compter 20 minutes après le premier sifflement.

• Four pasteur : Destiné pour la stérilisation à la chaleur sèche de tous le

matériel qui résiste à des températures élevées. Le matériel, préalablement nettoyé,
est enveloppé soit par le papier filtre ou par le papier aluminium. Il est par la suite
stérilisé à 170°C pendant 30 minutes.

15
 • Bec bunsen : C’est le bruleur le plus utilisé pour une stérilisation sèche, dite
à la flamme, des instruments (pinces, Scalpels et bistouris). La flamme du bec bunsen
doit être non pas jaune mais bleu. Ce type de flamme est obtenu par le réglage de la
virole qui permet d’agencer l’entrée de l’air dans le bec bunsen. Dans ce cas-là, la
température peut atteindre à l’intérieur de la flamme 5000°C. La chaleur produite
stérilise l’atmosphère au-dessous de la flamme, et se produit tout autour du bec un
déplacement ascendant de l’air, créant ainsi une zone stérile d’un diamètre de 20 cm
maximum.

• Plaque chauffante- agitateur : Cet appareil est indispensable au laboratoire.

Il est utilisé généralement pour préparer les milieux de cultures, et pour chauffer les
solutions si nécessaire.

• Hotte à flux laminaire : C’est un appareil qui permet de faire des

manipulations en conditions d’asepsie maximale.

Différents types de hottes : sont de l’ordre de deux :

La hotte à flux laminaire horizontal : Le filtre HEPA se place verticalement et en

face le manipulateur (figure 2). Selon cette figure, de l’air ambiant est aspiré par une
turbine (puissant ventilateur) puis passe à travers un filtre HEPA (Haute Efficacité
sur les Particules Aériennes) avant d’arriver sur la surface de travail. Après le
passage à travers le filtre, l’air ne contient (quasiment) plus de particules (poussières,
bactéries, levures, spores) et il est considéré comme stérile. Ce flux d’air laminaire
empêche toutes les particules de l’air de contaminer vos cultures. Vous devez quand
même veiller à contrôler les autres vecteurs de contaminations, les instruments, etc.).
Certaines hottes sont munies de lampes UV germicide pour stériliser la surface de
travail (Samuel, 2014).

16
 Figure 2: Hotte horizontale (SEFALAB, 2014 ; Samuel, 2014)

La hotte à flux laminaire verticale : C’est le même principe que la hotte

horizontale, avec l’emplacement du filtre HEPA. En cette hotte, l’air filtré est orienté
verticalement vers le manipulateur, sur le plan de travail, pour finir vers l’extérieur
(figure 3).

Figure 3: hotte à flux laminaire verticale (Flowfast, 2015)

- Entretien de la hotte : La hotte nécessite une maintenance particulière telle que le

changement annuel du pré filtre, et l’aspiration de la cuve de la turbine. Avant la
manipulation, il faut allumer la hotte une demi-heure avant la manipulation. Cela
permet d’éliminer la poussière intégrante le filtre, et d’éviter les contaminations.

C- Règles à suivre au laboratoire de culture in vitro :

17
 Le laboratoire de microbiologie exige une tenue exemplaire. Les manipulations
doivent être effectuées avec grand soins. Les règles que tout étudiant devra suivre
dans son propre intérêt, comme celui de ses confrères sont les suivants :

1- Mettre d’une blouse blanche propre est de rigueur, elle doit toujours être
fermée ;

2- Les étudiants aux cheveux longs doivent les attacher lors de la manipulation ;

3- Ne jamais oublier de se laver les mains avant et après chaque séance de

travail, avec du savons additionné antiseptique des distributeurs. Evitez les
pains de savon solides. En se fissurant, ils deviennent eux-mêmes source de
contamination ;

4- Strictement interdit de manger ou de fumer au laboratoire. L’étudiant doit

respecter la présence d’une hygiène parfaite du laboratoire ;

5- Eviter tout courant d’air avant les manipulations, et prévenir les

contaminations en assurant la destruction des souches microbiennes au niveau
du laboratoire ;

6- L’étudiant doit éviter de parler ou de se déplacer lors de la manipulation en

conditions stériles, cela évitera les contaminations des cultures ;

7- Après chaque séance de travail, la paillasse devra être nettoyée et les déchets
éliminés.

D- Evaluation de l’étudiant :

L’évaluation écrite de l’étudiant est faite en lui exposant des questions sur la
thématique du TP

TP N°2 : Préparation du milieu de culture Murashige et Skoog (1962) (MS)

18
F- But du TP: Connaitre les bonnes bases pour préparer soi-même le milieu de
culture.

G- Matériel :

- Béchers 50, 100, 250, 1000 ml ;

- Erlenmeyers, 1000 ml ;
- Pipettes graduées au 1/10 ml : 1, 5, 10, 25 ml ;
- Eprouvettes : 25, 50, 250 ml ;
- Agitateur plaque chauffante, barreaux magnétiques ;
- Spatule, coton cardé ;
- Récipients de culture : bocaux de verre et tubes de verre.
H- Produits chimiques

La liste des produits nécessaires sont résumés dans le tableau qui suit :

Tableau 1 : Milieu de culture Murashige et Skoog (MS) (1962)

Macro-éléments Quantités (mg/l)
KNO3 1900
NH4NO3 1650
CaCl2 332,3
MgSO4, 7H2O 370
KH2PO4 170
Micro-éléments Quantités (mg/l)
MnSO4, 4H2O 22,30
ZnSO4, 7H2O 8,60
H3BO3 (Ac borique) 6,20
Kl 0,83
Na2MO4, 2H2O 0,25
CuSO4, 5H2O 0,025
CaCl2, 6H2O 0,025
Vitamines Quantités (mg/l)
Glycine 2.00
Myo-inositol 100
Acide nicotinique 0.50 0.50
Pyridoxine HCl 0.10
Thiamine HCl
FeEDTA Quantités (mg/l)
Na2FeEDTA 37,3
FeSO4, 7H2O 27,8
Gélifiant Quantité (g/l)
Agar-agar 8

19
 I- Mode opératoire

Cette expérience se déroule en plusieurs étapes :

Au cours de la séance de TD, les étudiants définissent leur plan d’expérience avec
les enseignants, réalisent les calculs de dilution pour les solutions mères et milieu de
culture MS ; qui seront ensuite, réalisés au cours de séance de TP n°2. Cette dernière
étape est répartie entre les groupes d’étudiants, pour permettre le gain de temps de la
préparation. L’autoclavage des tubes ou les bocaux de milieu doit se faire par le
personnel enseignant avant le TP suivant.

 Solution mère des macroéléments

Les composants des macroéléments sont concentrés 10 fois, pour être dissout
dans 250 ml d’eau distillée. Cette solution va former la solution mère des
macroéléments (tableau 2). Les étapes de préparation qui suivent s’appliquent à
toutes les préparations des solutions. Nous parlons donc de :

- Placer sur un agitateur, un bécher ou un Erlenmeyer de 250 ml comportant 200

ml d’eau distillée,

- Ajouter progressivement, sous agitation continue, les concentrations des

éléments et par ordre de présentation dans le tableau 3.

- Il faut veillez à ce que la température de la solution soit entre 19 °C et 22°C.

Dans le cas contraire, l’addition de MgSO 4, 7H2O ou de KH2PO4 peux entrainer
la décomposition de la solution.

- Compléter avec l’eau distillée le volume demandé (250 ml) ;

- Calculer le volume à prélever de la solution mère pour préparer 1l d milieu de

culture. Dans ce cas, l’application de la règle de trois est recommandée :

KNO3 est de 19 g pour un volume de 250 ml

KNO3 est de 1,9 g pour un volume de X ml

Donc X = 1,9 x 250 / 19 = 25 ml

Alors il faut prélever 25 ml de solution mère des macroéléments pour préparer

1000 ml de milieu de culture.

Tableau 2 : Solution mère des macroéléments

20
 Macroélément Quantité pour 1l de Quantité concentrée Quantité à prélever
milieu de culture 10 fois pour 250 ml de la solution mère
(mg) de solution mère (g)

KNO3 1900 19
NH4NO3 1650 16,5
25 ml
CaCl2,2H2O 332,3 3,323
MgSO4,7H2O 370 3,7
KH2PO4 170 1,7

 Solution mère des microéléments :

La préparation se fait de la même manière que celle des macroéléments, mais

répartie en trois sous-solutions mères (S1, S2 et S3).

Solution S1 : les composants représentés dans le tableau 4 sont concentré 10 fois et

dissouts, par ordre décroissant, dans 100 ml d’eau distillée. Il est impératif de
s’assurer de la dissolution totale des éléments avant chaque nouvelle intégration :

- Verser 70 ml d’eau distillée dans un bécher de 100 ml ;

- Peser et dissoudre respectivement les composants indiqués dans le tableau 4 ;

- Compléter à 100 ml avec l’eau distillée ;

- Transférer la solution dans un flacon étanche ;

Mêmes opérations est établie pour S2 et S3.

Le tableau qui suit résume les concentrations à dissoudre pour préparer 100 ml
de solution mère ; Un prélèvement de 10 ml de cette solution S1 est nécessaire pour
préparer 1000 ml de milieu de culture (calcul précédemment expliqué).

Tableau 3 : Solution S1
Quantité pour 1l de Quantité concentrée 10 Quantité à prélever
Micro-éléments milieu de culture fois pour 100 ml de de la
(mg) solution mère (mg) solution mère
MnSO4, 4H2O 22,3 223
ZnSO4, 7H2O 8,6 86 10 ml
H3BO4 (Ac borique) 6,2 62
Solution S2 : Les éléments du tableau 4 sont concentrés 100 fois et dissouts dans

21
100 ml d’eau distillée. La solution est versée dans un flacon, étiquetée et conservée à
4°C durant 30 jours. Suivant ce tableau il faut prélever 1 ml de cette solution pour
préparer 1000 ml de milieu de culture.

Tableau 4 : Solution S2 (100 ml) concentrée 100 fois

Quantité pour 1 l Quantité pour 100 Quantité à
Micro-élément de milieu de ml de solution prélever de la
culture (mg) mère (mg) solution mère
Kl 0,83 83
1 ml
Na2MO4, 2H2O 0,25 25

Solution S3 : Englobe le reste des éléments représentés dans le tableau 5. Ces

composants sont concentrés 1000 fois et dissouts dans 10 ml d’eau distillée. Le flacon
de cette solution est, par la suite, étiqueté et conservé à 4°C durant 30 jours.

Tableau 5 : Solution S3 (10 ml) concentrée 1000 fois

Quantité pour 1 l Quantité pour 10 Quantité à
Micro-éléments de milieu de ml de solution prélever de la
culture (mg) mère (mg) solution mère
CuSO4, 5H2O 0,025 25
0,1 ml
CaCl2, 6H2O 0,025 25

 Solution mère des vitamines :

En cette étape, les vitamines sont réparties en deux solutions V1 et V2 :

Solution V1 :

Comme les microéléments, la solution mère des vitamines du milieu MS est

préparée en deux solutions (V1 et V2) :

- Verser 70 ml d’eau distillée dans un bécher de 100 ml;

- Peser et dissoudre successivement, sous agitation, les vitamines concentrées 100

fois, indiquées dans le tableau 6 ;

- Compléter à 100 ml avec l’eau distillée ;

22
- Transférer la solution dans un flacon, l’étiqueté et le conserver à 4°C ;

- Prélever 1 ml de cette solution pour préparer le milieu de culture.

Tableau 6 : Solution V1 du milieu MS concentrée 100 fois

Quantité pour 1 l de Quantité pour 100
Quantité à prélever
V1 milieu de culture ml de solution mère
de la solution mère
(mg) (mg)
Glycine 2 200
Acide nicotinique 0,5 50
1 ml
Pyridoxine 0,5 50
Thiamine 0,1 10

Solution V2

La vitamine Myo-inositol est soit pesée et mis en en poudre directement dans

le milieu de culture final, ou préparé en solution en la concentrant 5 fois pour être
dissoute dans 50 ml d’eau distillée (tableau 9). Il faudra prélever 1 ml de cette
solution pour l’intégrer dans celle du milieu de culture.

Tableau 8 : Solution V2 (50 ml) concentrée 5 fois

Quantité pour 1 l de Quantité pour 50 ml
Quantité à prélever
Vitamine milieu de culture de solution mère
de la solution mère
(mg) (mg)
Myo-inositol 100 500 1 ml

 Solution mère de FeEDTA :

Fe SO4, 7 H2O et Na2 EDTA, concentrés 10 fois, sont dissous séparément et

respectivement, sous agitation et à 60°C, dans 1/10 et 9/10 du volume d’eau distillée
final. Pour préparer 50 ml de cette solution :

- Verser 45 ml d’eau distillée dans un bécher de 50 ml;

- Sous agitation, intégré la concentration de Na2 EDTA du tableau 10 jusqu’à

dissolution totale ;

23
- Verser 5 ml d’eau distillée dans un autre bécher de 10 ml ;

- Intégré dans ce dernier bécher la concentration de FeSO 4, 7H2O (Tableau 9) sous

agitation ;

- Verser progressivement, sous agitation à 60 °C, la solution de Fe SO 4, 7H2O dans

celle de Na2EDTA ;

- Le virage de la couleur de jaune claire à jaune foncé est le signe de la fin de la

préparation ;

- Un prélèvement de 5 ml permet de l’additionner à la préparation du milieu de

culture.

Tableau 9 : Solution mère de Fe EDTA (50 ml) concentrée 10 fois

Quantité pour 1 l de Quantité pour 50 ml
Quantité à prélever
FeEDTA milieu de culture de solution mère
de la solution mère
(mg) (mg)

NaEDTA 73,3 733 mg/ 45 ml H2O

5 ml
FeSO4, 7H2O 27,8 278 mg/ 5 ml H2O

 Préparation du milieu de culture

- Prendre un Erlenmeyer de 1000 ml et le remplir de 400 ml d’eau distillée ;

- Ajouter dans l’ordre, sous agitation, les éléments suivants :

• Saccharose (20 g)
• Les macro-éléments (25 ml)
• Les micro-éléments (S1 :10 ml, S2 :1 ml, S3 :0,1 ml)
• FeEDTA (5 ml)
• Agar-Agar (8 g)

- Ajuster le volume à 1000 ml avec l’eau distillée ;

24
- Ajuster le pH (5,8) à froid avec le NaOH ou KOH 1N ;

-Verser dans un bécher en inox et porter à l’ébullition sous agitation permanente

jusqu’à que la solution devient transparente.

- Retirer du feu et remettre sur un autre agitateur froid pour intégrer les
Vitamines de MS ou de MV (V1 :1 ml, V2 :1 ml, et V3 : 0,1 ml)

-Verser dans les bocaux (à raison de 40 ml par bocal) de culture ou dans des tubes en
verre (10 ml par tube) et autoclaver à 120 °C durant 20 min.

J- Evaluation de l’étudiant : Le sérieux de l’étudiant et sa vigilance lors des

préparations des solutions font l’objet d’une évaluation par les enseignants.

TP N°3 : Désinfection des explants en conditions aseptiques

F- But du TP : Illustration du protocole de désinfection de germes de pomme de

terre en conditions aseptiques

G- Matériel :

- Pomme de terre germée ;

- 9 béchers de 50 ml ;

25
 - Hotte à flux laminaire ;

- Bec bunsen ;

- Scalpels à lames interchangeables ; - Pinces inox de 13 cm de longueur ;

- Tubes dotés de milieu de culture stérile ;

- Plaque en verre de 30 cm2 ;

- Barre en verre ;

- Etiquettes autocollantes.
H- Produits chimiques

- Liquide vaisselle ;

- Mercryl ou de Dermacide, dilué à 30%

- Eau de javel à 3° ;

- Eau distillée stérile ;

- Papier filtre stérile.

I- Mode opératoire :

- Se laver soigneusement les mains avec un antiseptique et les laisser sécher ;

- Allumer la hotte et désinfecter le plan travail et les parois latéraux avec

l’hypochlorite de sodium (l’eau de javel) ou par de l’éthanol à 70° ;

- Placer le bec bunsen au centre du plan de travail et l’allumer pour avoir une
flamme bleue (sans que sa flamme dépasse 10 cm) ;

- Placer le matériel nécessaire dans la hotte sans création d’encombrement, et

en laissant de l’espace pour la manipulation ;

- Découper les germes de la base de la pomme de terre et les faire passer sous
l’eau du robinet pour éliminer la poussière ;

- Fragmenter les germes au niveau des entre-nœuds pour avoir des explants de
petits tailles ;
26
- La mise en place des germes dans l’eau distillée non stérile durant 15 mn, en
remuant de temps en temps, afin d’éliminer les impuretés et l’air
emprisonnée entre les poils ;

- Dans la hotte à flux laminaire, replacer des germes dans la solution composée
de 10 ml d’eau distillée plus 2 gouttes du liquide vaisselle, durant 5mn ;

- Faire déplacer les germes avec un pince stérile dans la solution de Mercryl ou
de Dermacide à 30% pendant 3 mn;

- Rincer à l’eau distillée stérile pendant 5 mn;

- Passer dans l’eau de javel à 3° pendant 5mn;

- Faire 4 rinçages successif dans l’eau distillée stérile durant 5mn chacun.

- Placer les fragments sur le papier filtre stérile, et couper à nouveau les
extrémités de l’explant ;

- Avec une nouvelle pince stérile, placer les explants dans le milieu de culture ;

- Etiqueter.

- Pendant la manipulation et à chaque utilisation l'extrémité des instruments

est plongée dans l'alcool puis passée dans la flamme.

- Précautions : pendant la manipulation rester sur le plan de travail et ne jamais

toucher les extrémités des instruments ou le végétal désinfecté. Eviter de
parler, et Travailler assez près du bec bunsen.

J- Evaluation de l’étudiant : Un compte rendu de l’étudiant est demandé

à la fin de la séance, expliquant les difficultés rencontrées et les gestes à
éviter lors de la manipulation.

TP N° 4 : Manipulation en conditions aseptiques sous hotte à flux laminaire

27
 K- But du TP : Initiation à la manipulation d’explants végétaux en
conditions stériles sous hotte à flux laminaire

L- Matériel :

- Hotte à flux laminaire ;

- Bocal de vitroplants aseptiques de pomme de terre

- Bec bunsen ;

- Scalpels à lames interchangeables ;

- Pinces inox de 13 cm de longueur ;

- Tubes dotés de milieu de culture stérile ;

- Plaque en verre de 30 cm2 ;

- Barre en verre ;

- Etiquettes autocollantes.

M- Produits chimiques

- Ethanol 95° dans un bécher de 50 ml ; -

Ethanol 75° dans une pissette.

N- Mode opératoire :

- Se laver soigneusement les mains avec un antiseptique et les laisser sécher ;

- Allumer la hotte et désinfecter le plan travail et les parois latéraux avec

l’hypochlorite de sodium (l’eau de javel) ou par de l’éthanol à 70° ;

- Placer le bec bunsen au centre du plan de travail et l’allumer pour avoir une
flamme bleue (sans que sa flamme dépasse 10 cm) ;

- Placer le matériel nécessaire dans la hotte sans création d’encombrement, et

en laissant de l’espace pour la manipulation. Selon la figure qui suit, une

28
 personne droitière doit placer les pinces à droite et les bocaux à gauche. Dans
le cas contraire, il faut inverser les emplacements ;

- Le bécher à l’éthanol à 90° est installé loin du bec bunsen ;

- Installer la plaque en verre de (figure 1) de 30 cm2 ;

- Il est recommandé d’utiliser le double de chaque ustensile (pince et scalpel).

Cela peut éviter l’attente du refroidissement après chaque flambage ;

- Allumer l’UV pendant 15 min après l’installation du matériel tout en restant

éloigné de la hotte. Le matériel végétal doit être loin de ces rayons ;

- Se désinfecté les mains avec de l’éthanol à 70° avant le lancement de la

manipulation.

Figure 1 : Disposition du matériel sur la paillasse de la hotte

- Les manches ne doivent jamais toucher la surface de travail ;

- Ouvrir les contenants stériles devant sous hotte, retirer avec la pince un
vitroplant et le mettre sur la plaque en verre stérile ;

29
 - Fragmenter la tige pour repiquer ces explants dans le nouveau milieu de
culture, et fermer les bocaux (figure 2);

Prélèvement isolement des vitroplants fragmentation

des entre-nœuds
Figure 2 : Repiquage des germes de Solanum tuberosum en conditions aseptiques

- Lors de la manipulation, comme mentionné dans la figure 3, éviter de faire

sortir l’ouverture du bocal hors hotte.

(Bourrain, 2012)
Figure 3 : Erreur de manipulation, bocal hors asepsie

O- Evaluation de l’étudiant : Un compte rendu de l’étudiant est demandé à la fin

de la séance, expliquant les difficultés rencontrées et les gestes à éviter lors de
la manipulation en conditions aseptiques.

30
TP N°5 : Manipulation en conditions aseptiques en l’absence de la hotte à flux
laminaire

A- But du TP : Initiation à la manipulation d’explants végétaux en conditions

stériles en absence de la hotte à flux laminaire.

B- Matériel :

- Bocal de vitroplants aseptiques de pomme de terre ;

- Deux becs bunsen ;

- Scalpels à lames interchangeables ;

- Pinces inox de 13 cm de longueur ;

- Tubes dotés de milieu de culture stérile ;

- Plaque en verre de 30cm2 ;

- Barre en verre ;

- Etiquettes autocollantes.

C- Produits chimiques

- Ethanol 95° dans un bécher de 50 ml ; -

Ethanol 75° dans une pissette.

D-Mode opératoire :

- Fermer la porte et les fenêtres du laboratoire pour éviter le courant d’air ;

- Désinfecter la paillasse avec un chiffon propre imbibé d’eau de javel à 13 ;

- placer deux becs bunsen et les placer à la parallèle, à une distance maximale
de 40 cm (figure 1) ;

- Placer le matériel nécessaire dans la zone intermédiaire, et allumer mes deux

becs bunsen ;

31
 - Entamer la manipulation après minimum 15 mn de l’allumage des flammes.

Figure 1 : Mise en place d’une zone aseptique sans la présence de la hotte à flux
laminaire

- Eviter le déplacement lors de la manipulation pour prévenir les courants

d’air ;

- Placer le matériel végétal sur la plaque stérile, et le fragmenter

- Ouvrir le bocal et flamber l’ouverture (figure 2) ;

- Avec la pince stérile, placer les explants dans le milieu de culture du bocal ;

- Flamber une deuxième fois l’ouverture et le ferme.

Figure 2 : Manipulation en conditions stériles avec deux becs bunsen

32
 E- Evaluation de l’étudiant : Un compte rendu de l’étudiant est demandé à la
fin de la séance, expliquant les difficultés rencontrées et les gestes à éviter lors de
la manipulation en conditions aseptiques.

TP N°6 : La culture méristèmatique de Solanum tuberosum L.

A- But du TP : Aboutir à dénuder, prélever et repiquer le méristème de Solanum

tuberosum L. en conditions aseptiques.

B- Matériel :

- Hotte à flux laminaire ;

- Bocal de vitroplants aseptiques de pomme de terre

- Bec bunsen ;

- Scalpels à lames interchangeables ;

- Pinces inox de 10 cm de longueur ;

- Aiguille de seringue introduite dans l’anse de platine ;

- Boites de Pétri dotées de milieu de culture stérile spécifique ;

- Boites de Pétri stériles ;

- Barre en verre ;

- Etiquettes autocollantes.

C- Produits chimiques

- Ethanol 95° dans un bécher de 50 ml ; -

Ethanol 75° dans une pissette.

D- Mode opératoire :

- Se laver soigneusement les mains avec un antiseptique et les laisser sécher ;

33
- Allumer la hotte et désinfecter le plan travail et les parois latéraux avec
l’hypochlorite de sodium (l’eau de javel) ou par de l’éthanol à 70° ;

- Placer le bec bunsen au centre du plan de travail et l’allumer pour avoir une
flamme bleue (sans que sa flamme dépasse 10 cm) ;

- Placer le matériel nécessaire dans la hotte sans création d’encombrement, et en

laissant de l’espace pour la manipulation.

- Installer la loupe binoculaire, désinfectée avec l’eau de javel, dans la hotte ;

- Il est recommandé d’utiliser le double de chaque ustensile (pince et scalpel). Cela

peut éviter l’attente du refroidissement après chaque flambage ;

- Allumer l’UV pendant 15 min après l’installation du matériel tout en restant

éloigné de la hotte. Le matériel végétal doit être loin de ces rayons ;

- Se désinfecté les mains avec de l’éthanol à 70° avant le lancement de la

manipulation ;

- Ouvrir les contenants stériles devant sous hotte, retirer avec la pince un vitroplant
et le mettre dans la moitié de la boite de Pétri stérile ;

- Avec deux pinces stériles, immobiliser la tige et éliminer les feuilles en les tirants
dans le sens opposé de leur orientation. Les méristèmes ressemblent à la figure qui
suit ;

0,5 cm

Figure 1 : Méristème adventif dénudé de sa feuille

34
- A l’aide d’une aiguille de seringue stérile et sous loupe binoculaire, la paire
suivante d’ébauches foliaires du méristème sont excisées (figure 2) ;

- Sectionner le méristème transversalement en dessous de la première paire du

primordia foliaire. (la longueur de l’explant est comprise entre 0,2 à 0,4 mm) ;

- Le méristème est transféré rapidement sur le milieu de culture.

(1) méristème (2) sous loupe binoculaire

(3) élimination des (4) prélèvement du méristème

ébauches foliaires

Figure 2 : Prélèvement de méristème sous loupe binoculaire grossi deux fois en

conditions aseptiques

35
 E- Evaluation de l’étudiant : Le sérieux de l’étudiant et sa vigilance lors des
préparations des solutions font l’objet d’une évaluation par les enseignants.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

- Agnès B., Hélène R. et F. Louise. 2013. La culture in vitro en TPE. http://culturein-

vitro-tpe.e-monsite.com/

- Bommineni U.R. et P.P. Jauhar. 2003. Regeneration of plant through isolated

scirtelum culture of durum. Wheat. Plant sci. p 116; 197.

- Bourrain L. 2012 : La multiplication in vitro du fraisier (Fragariax ananassa Duch.) :

un outil pour produire en quantité des plants sains dans une large gamme
variétale. Biotechnologie végétale, hier, aujourd’hui et demain, Colloque AFBV.

- Boxus P. 1995 : multiplication végétative: micropropagation et embryogenèse

somatique dans les biotechnologies Végétales. BV 93, Ed CNED.AUPELFUREF
191p.

- Bretaudeau A. 2006. Les techniques de culture in vitro et la micropropagation des

espèces végétales, IPR/Kolibougou Koulikoro B P 06.

- Caraglio Y. 2012. L'organogesèse. UMR Cirad/Inra de Modélisation des plantes

(AMAP). Programme modélisation des plantes du Cirad-amis
http://amap.cirad.fr/architecture/organo/organo.html#introduction.
36
- Cedevit. 2013. La culture in vitro.
http://www2.ulg.ac.be/cedevit/french/Indexinvitro-fr.htm.

- Changins, 2011. Des semences de pomme de terre in vitro à récolter en boîte de

culture « Agrobox ». http://www.news.admin.ch/message/index.html?

lang=fr&msg-id=42719

- Corringan G. et Trillion P. 2005. Catalogue des variétés de pomme de terre

produites en France. Ed : Carousel, Paris (France). 312P.

- Dalvesco L.L et P.M. Guerra. 2001. The effectiveness of nitrogen sources in Feijoa
somatic embryogenesis. Plant Cell Tissue and Organ Culture 64:19 – 25.

- Dellaa A. 2013. La culture in vitro.

http://fr.slideshare.net/AhmedDellaa/culturein-vitro-des-plantes.

- Demol J., Baudoin J.P. et B.P. Louant. 2008. Amélioration des plantes : application
aux principales espéces cultivées en régions tropicales, Ed presse agronomique de
Gembloux, la Belgique, p 581.

- Dodeman V.L., Ducreux G. et M. Kreis. 1997. Zygotic embrogenesis versus somatic

embryogenesis. Journal of Experimental Botany 48N 313 : 1493 -1509.

- Dutuit P. et R. Gorenflot. 2008. Glossaire pour le développement durable : des

mots pour les maux de la planète, Ed des archives contemporaines, p 182.

- FLOWFAST. FLOWFAST V Hotte à flux laminaire verticale.

2015.
http://www.elscolab.com/fr/produits/flowfast-v-hotte-a-flux-
laminaireverticale.

37
- Guyot M.J., Seguier-Guis M. et D. Duris. 2003. Terre des cafés, Ed CIRAD, p 141.

- Isac V., Popescu A.N. et M. Coman. 1994. Studies on plant regeneration from
tissue-derived callus in Fragaria X ananassa Duch. In : Schmidts H. et M
Kellerhals. Progress in temperate fruit breeding. Kluwer Academic Publishers.
395-398 p.

- Jayasree T., Pavan U., Ramesh M., Rao A.V., Reddy J .M.K. et A. Sadanandam.
2001. Somatic embrogenesis from leaf cultures of potato.

- Kone T., Kone M., Kone D., Kouakou T.H., Traore S. et Y.J. Kouadio. 2010. Effet de
la photopériode et des vitamines sur la micropropagation du bananier plantain
(Musa AAB) à partir de rejets écailles de rang. Journal of Applied Biosciences 26:
1675 – 1686.

- Lê C.L. 1994. Apport de l‟électrophorése dans l‟identification des variétés de

pomme de terre saines en suisse .Revue suisse Agric .26(6),373-379.

- Lepoivre P. 2003. Phytopathologie : Bases moléculaires et biologiques des

pathosystèmes et fondements des stratégies de lutte, Ed De Boeck, p 432.

- Margara F. 1989. Bases de multiplication végétative : les méristèmes et

l'organogenèse. Ed INRA Paris 262p.

- Morel G. et R.H. Wetmor. 1951. Ferncallus tissue culture. Ann.J. Bot., 38, 141143. In:
Haïcour R., 2002. Multiplication de plantes herbacées in vitro modèle Solanum
tuberosum L, Biotechnologie végétale, techniques de laboratoire. Londres, Paris,
New york: TEC & DOC., 1-16.

- Murashige T. et F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays
with tobacco tissue cultures. Physiol Plant., 15, 473–497.

38
- Ochette C. 2005. Growth, quality and biothecnology, WFP publisher.finland.

- Rousselle P., Yvon R. et J. Crosnier. 1996. La pomme de terre : production,

ammélioration, ennemis et maladies. Ed INRA, 640p.

- Saadi A. 1991. Régénération de plantes de pois Pisum sativum L par embryogenèse

somatique. Thèse de doctorat. Paris Grignon 162p.

- SAADI A. et F. HAMDANI. 2007. Régénération in vitro du Scorpiurus muricatus ssp.

subvillosus via la caulogenès. Biotechnologie, Agronomie,Société et
Environnement, Volume 11 (2007) numéro 3.
http://popups.ulg.ac.be/Base/document.php?id=815.

- Sama A.E., Simon Z., Nyochembeng L., Tambong T.A., Nezana X. et J.G Wutah.
1998 : Culture in vitro et multiplication rapide de plante à tubercules et racines au
Caméroune. Cahier Agriculture. 7 : 63-66. In : Hamdani F.Z. 2001. Régénération
via l'organogénèse Ou L'embryogenèse somatique chez le Scorpiurus. Univeristé
Hassiba Ben Bouali de Chlef - Magister.

- Samuel 2014. Qu’est-ce qu’une hotte à flux laminaire?

http://champignonscomestibles.com/author/admin

- Schmid J. et E. Keller. 1981. Nouvelles possibilités pour l'amélioration et la

multiplication des plantes : les cultures de tissus et de cellules. Revue Suisse
Agriculture. 13(6): 265-272. In : Hamdani F.Z. 2001. Régénération via
l'organogénèse Ou L'embryogenèse somatique chez le Scorpiurus. Univeristé
Hassiba Ben Bouali de Chlef – Magister.

- Soltener D. 2005. Les grandes productions végétales. Collection Scientifique des

technologies agricoles 20eme édition, p 472.

39
- Staritsky G. et G.A.M. Van Hassel. 1980. The synchronized mass propagation of
Coffea canephora in vitro. Proc. 9. Int. Science Colloquium on Coffea, Paris, 597–
602.

- Svobodova H., Albrechtova J., Kumstyrova L., Lipavska H., Vagner M. et Z.

Vondrakava. 1999. Somatic embryogenesis in Norway spruce.

- Tchetche Y., Bouo-Bella D.F.X., Sallanon H., Coudret A. et H. Isaka. 2008.

Modélisation des conditions d’environnement des bocaux de culture in vitro :
bocaux avec agar et vitroplants. Afrique SCIENCE 04(1) (2008) 154 – 166.

- Unnikrisham S.K., Mehta A.R. et P.N. Bhatt. 1990. Abscisic acid induced high
frequency embryogenesis from Sapindus trifoliatus leaves :89-94. Acta Horticulturae
280. In vitro culture and Horticultural breeding.

- Vidalis H., Augé R., Beauchesne G., et al. 1989. La culture in vitro et ses
applications horticoles. Lavoisier, Tec et Doc (ed). 7- 24.

- Webb K.J., Osifo O.E. et G.G. Henshaw. 1983, Shoot regeneration from leafl et discs
of six cultivars of potato (Solanum tuberosum ssp. tuberosum). Plant Sci.
Lett. 30, 33-47. 26.

- Wheeler V.A, Evans N.E., Foulger D., Webb K.J., Karp A., Franklin J. et S.W.J.
Bright. 1985, Shoot formation from explant cultures of fourteen potato cultivars
and studies of the cytology and morphology of regenerated plants.
Ann. Bot. 55, 309-312.

40