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Imprimé par ALGERIE CERIST le mercredi 17 juin 2015

Biologie médicale
[90­60­0180]

LiPA : Line Probe Assay ou hybridation inverse en ligne

Vincent Marechal : Professeur des Universités
université Pierre et Marie Curie, équipe d'accueil 3500­UMR 7079, 7, quai Saint Bernard, batiment A,
75252 Paris cedex 05 France

Résumé
Les  tests  LiPA,ou  hybridation  inverse  en  ligne,  sont  largement  utilisés  dans  le  cadre  du  diagnostic
moléculaire : typage des virus, recherche des mutations impliquées dans la résistance aux antiviraux
ou  antibactériens,  analyse  du  polymorphisme  génétique  HLA,  etc.  Cet  article  résume  les  étapes  du
test et présente quelques domaines d'application.

© 2005  Elsevier SAS. Tous droits réservés.

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INTRODUCTION

Le  diagnostic  moléculaire  fait  souvent  appel  à  des  techniques  permettant  d'identifier  des  variations
très  discrètes  (une  base  changeant  sur  une  seule  position)  présentes  sur  une  séquence  d'ADN  ou
d'ARN.  Bien  que  mineures  en  apparence,  ces  variations  peuvent  évidemment  avoir  un  impact
biologique  majeur.  Ces  mutations  ponctuelles  peuvent  ainsi  aboutir  à  la  production  d'une  protéine
inactive ou présentant des propriétés nouvelles. Ce type de mutations concerne notamment l'activité
de gènes viraux ou bactériens qui sont les cibles de traitements, ou bien encore des gènes cellulaires
qui  jouent  un  rôle  essentiel  comme  p53...  Alternativement,  ces  variations  peuvent  refléter  une
variabilité  physiologique  des  organismes.  L'analyse  de  cette  variabilité  contribue  alors  à  faciliter  le
typage des variants moléculaires (variants viraux par exemple).

L'analyse de ces mutations ponctuelles peut être réalisée par diverses approches : séquençage, PCR à
l'aide  d'oligonucléotides  spécifiques,  ligase  chain  reaction,  etc.  La  technique  LiPA  (que  l'on  peut
traduire par hybridation inverse en ligne) est une technique rapide permettant de typer rapidement
une  région  génétique  connue  en  testant  la  capacité  de  cette  région  à  s'associer  avec  une  sonde
nucléique complémentaire préalablement fixée sur une membrane.

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PRINCIPE

La  technique  LiPA  est  une  technique  d'hybridation,  après  PCR,  sur  une  bandelette  sensibilisée  avec
des sondes nucléiques. La fixation de la région d'intérêt sur la sonde qui lui est complémentaire est

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ensuite mise en évidence par une révélation enzymatique. La technique implique que l'on connaisse
parfaitement la région génétique sur laquelle on souhaite l'appliquer, et qu'un certain polymorphisme
ait été décrit.

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ÉTAPES

Les différentes étapes de la conception et de la réalisation d'un test LiPA sont présentées sur la figure
1.

La première étape, et l'une des plus importantes, consiste à relever toutes les variations génétiques
connues dans la région d'intérêt. Ce type d'étude est conduit en grande partie en recherchant et en
comparant, sur des banques de données publiques ou privées, toutes les séquences disponibles pour
cette région.

La  seconde  étape  consiste  à  définir  un  jeu  d'oligonucléotides  capable  de  reconnaître  de  façon  très
spécifique chacune des mutations importantes dans la région analysée. La composition chimique de
chaque  oligonucléotide  et  sa  taille  vont  permettre  de  définir  une  séquence  optimale  :  dans  les
conditions  d'hybridation  choisies  par  l'expérimenteur,  et  à  très  forte  stringence,  seule  la  cible  et  la
sonde  qui  lui  est  parfaitement  complémentaire  pourront  s'associer.  Dans  la  technique  LiPA,  une
même  cible,  générée  par  PCR,  est  ainsi  confrontée  à  un  jeu  de  sondes  dont  une  seule  lui  est
complémentaire.  Le  choix  des  sondes  et  les  conditions  d'hybridation  sont  donc  particulièrement
importants.  Ce  choix  est  réalisé  selon  les  contraintes  évoquées  dans  la  fiche  traitant  des  sondes
oligonucléotidiques (fiche XII­031).

Les sondes oligonucléotidiques sont ensuite déposées en ligne sur un support solide, en général une
membrane de nitrocellulose. À ce stade, l'interaction sonde­membrane est pratiquement irréversible.

Les membranes sont découpées en bandelettes de quelques millimètres de large, puis stockées.

La cible est générée par PCR, en présence d'oligonucléotides biotinylés. Après dénaturation de la cible
et blocage des sites libres sur la membrane, la membrane est mise en contact avec la cible. Celle­ci
s'hybride  aux  oligonucléotides  qui  lui  sont  complémentaires  en  partie  ou  en  totalité.  Des  lavages  à
forte  stringence  permettent,  dans  un  second  temps,  de  détacher  la  cible  de  toutes  les  sondes
auxquelles  elle  n'est  qu'imparfaitement  appariée.  À  la  fin  des  lavages,  seules  les  hybridations
complémentaires  à  100  %  sont  maintenues.  La  membrane  est  ensuite  incubée  en  présence  de
streptavidine  (qui  se  fixe  sur  la  biotine)  associée  de  façon  covalente  à  une  enzyme  (peroxydase  ou
phosphatase  alcaline).  Cette  enzyme  permet,  dans  l'étape  finale,  de  catalyser  la  formation  d'un
produit insoluble, coloré, qui permet d'identifier le site de l'hybridation sur la membrane (fig 2).

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CHAMPS D'APPLICATION

La  technique  LiPA  peut  être  proposée  comme  une  alternative  technique  aux  autres  méthodes
d'analyse  des  mutations  ponctuelles.  Elle  permet,  de  façon  simple  et  standardisée,  de  révéler  la
présence ou l'absence d'un ou plusieurs nucléotides spécifiques dans la séquence d'intérêt. Le choix
des sondes ne peut donc être déterminé que si l'on dispose d'une connaissance parfaite des mutations
ponctuelles  présentant  un  intérêt  :  typage  viral  ou  bactérien,  mutations  affectant  la  fonction  d'une
protéine  impliquée  dans  la  réponse  aux  antiviraux  ou  aux  antibactériens,  mutations  connues
affectant un gène cellulaire d'intérêt médical...

Plusieurs  trousses  sont  commercialisées  et  certaines  sociétés,  comme  Innogenetics,  se  sont
spécialisées  dans  la  mise  au  point  de  trousses  LiPA.  Les  trousses  proposées  ou  en  cours  de
développement couvrent plusieurs domaines d'application, dont des exemples sont cités ci­dessous :

détection et typage des mycobactéries; analyse de la résistance à la rifampicine;
détection, génotypage du virus de l'hépatite B et analyse de la résistance aux antiviraux...;
détection et analyse des gènes impliqués dans la résistance du VIH aux antiviraux;

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génotypage du virus de l'hépatite C;
analyse du gène CFTR, dont les mutations sont responsables de la mucoviscidose;
analyse des allèles du système HLA;
typage des gènes codant l'apolipoprotéine E.

Références
[1] Stuyver  L,  Rossau  R,  Wyseur  A,  Duhamel  M,  Vanderborght  B,  Van  Heuverswyn  H  ,  et  al.  Typing  of
hepatitis  C  virus  isolates  and  characterization  of  new  subtypes  using  a  line  probe  assay.  J  Gen
Virol 1993 ; 74 : 1093­1102 [crossref]
[2] Stuyver L, Wyseur A, Van Arnhem W, Hernandez F, Maertens G A second­generation line probe assay
for hepatitis genotyping. J Clin Microbiol 1996 ; 34 : 2259­2266

© 2005  Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Fig. 1 :

Fig. 1 :

Procédure LiPA.

Le test LiPA est une technique d'hybridation inverse réalisée à l'aide d'un produit de PCR marqué (biotinylation) obtenu à
partir d'un échantillon biologique. Le produit de PCR, après dénaturation, est incubé au contact d'une bandelette de
nitrocellulose sur laquelle a été déposée une série d'oligonucléotides (sondes). Les conditions stringentes dans lesquelles
est réalisée l'expérience assurent que seule la sonde parfaitement complémentaire de la cible forme un duplex stable. La
mise en évidence du complexe est réalisée secondairement en utilisant un complexe streptavidine­peroxydase ou
streptavidine­phosphatase alcaline. Celui­ci s'associe à la biotine, et peut être révélé par un test colorimétrique.

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Fig. 2 :

Fig. 2 :

Exemple de test LiPA

Dans l'exemple présenté ici, différents produits de PCR marqués ont été générés et incubés en présence des bandelettes
(numérotées de 1 à 10). La bande « référence » indique la position des différentes sondes, chacune étant spécifique d'une
séquence. Les quatre premières positions de la bandelette sont occupées par des contrôles et doivent être positives : elles
sont utilisées comme contrôle d'hybridation et comme contrôle de réaction.

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