INTRODUCTION

« Immunologie » dérive du latin immunis « exemption » et logos « discours », »science ».

L’immunologie est un domaine de la biologie qui étudie l’immunité, c’est-à-dire l’ensemble

des mécanismes de défense de l’organisme contre les agents pathogènes.

L’immunité, c’est l’ensemble des facteurs et des processus qui protègent l’organisme contre
les micro-organismes et les substances antigéniques étrangères ou anormales, et qui prenne
place notamment au niveau du système immunitaire.

Les maladies immunologiques sont très nombreuses : les allergies, les maladies auto
immunes, l’ hodgkin, les maladies de lymphomes…….

De nombreuses techniques immunologiques qui reposent sur une réaction antigène anticorps
nous permettront de diagnostiquer ces maladies.

A part les techniques immunologiques le laboratoire immunologie de L’HJRA effectue

également la sérologie.

L’immunologie fournit des outils nécessaires et précieux à toutes les autres disciplines de la
biologie ; elle est donc indispensable pour la médecine.

Ce stage au laboratoire immunologie était pour moi l’occasion parfaite pour enrichir mes
connaissances ainsi que pour améliorer mes capacités techniques. Donc C’était avec une
grande volonté et une grande persévérance que j’ai effectué mon stage dans le service UPFR
Immunologie de l’HJRA.

La première partie de ce rapport de stage consiste à présenter le service UPFR immunologie

de l’HJRA, la deuxième partie parlera des différentes analyses immunologiques que j’ai
effectuées dans ce service.

Avec la plus grande estime que je vous accorde, je vous souhaite de passer des instants
agréables en corrigent mon rapport de stage.

1
 OBJECTIFS DE STAGE

 Maîtriser les techniques d’agglutination et d’hémagglutination

 Effectuer les techniques d’un test ELISA et leur validation selon le protocole
 Acquérir des connaissances en matière de gestion des activités d’un laboratoire.

2
 SITUATION GEOGRAPHIQUE DU SERVICE UPFR IMMMUNOLOGIE ET
PRESENTATION DU SERVICE

L’hôpital Joseph RavoahangyAndrianavalona se situe à Ampefiloha. Dans la ville

d’Antananarivo. Le service UPFR immunologie se trouve dans le département laboratoire. Au
première étage, porte 89, 90.

Ce laboratoire est composé de neuf salles :

 Une salle de réception

 Une salle qui sert de bureaux pour les secrétaires
 Une salle qui sert de bureau pour le chef de service
 Une salle pour la laverie
 Une salle d’étude
 Quatre salles pour les examens de laboratoire :
 Laboratoire A : immunologie virale
 Laboratoire B : immunologie bactérienne et immuno chimie
 Laboratoire C : laboratoire de recherche
 Laboratoire D : immunologie parasitaire.

3
ORGANIGRAMME DU SERVICE

Chef de département :
Pr RANDRIANJAFISAMINDRAKOTROKA
Nantenaina Soa

Chef de service :
Dr RAJAONATAHINA Davidra

Medecins assistants:
Dr ANDRIAMAHENINA Ramamonjisoa et
Dr ANDRIANAVALONA Joba

Major de service:
Me RASOAMANARIVO Clara

Techniciennes de laboratoire:
Me RAZANAMIARANA Lala et
Me RAVAONINDRINA Françoise

Secretaires:
RAKOTOVAO Herison;
RAKOTOMALALA Mbola;
RAVELOMANITRA Lalaina

RAZOELINIVO Soa Noro

RAHOLIMBOLOLONA Nivo

Agent d'appui ANDRIAMANANTENASOA

Rolland

4
 ACTIVITES DU SERVICE

 Activités de soins : analyses immunologiques

1. Immunologie virale :
- Sérologie du VIH : test rapide de dépistage
- Sérologie de l’Hépatite B : Antigène de surface de l’hépatite B (AgHBs)
- Sérologie de l’Hépatite C : Anti-HCV
- Sérologie de la Rubéole
2. Immunologie bactérienne :
- Sérologie de la Syphilis : RPR (Rapids Plasma Reagin), Tréponème pallidum
Hemagglutination (TPHA)
- Sérologie de Widal-Félix
- Anti-Streptolysine-O (ASLO)
3. Immunochimie :
- Immunoglobuline E (IgE)
- Facteur Rhumatoïde
4. Immunologie parasitaire :
- Sérologie de la Cysticercose
- Sérologie de la Toxoplasmose
- Sérologie de l’Amibiase
- Sérologie de la Bilharziose
5. Auto-immunité :
- Anticorps anti-nucléaires (ANA)
 Formations des étudiants en médecine et les étudiants en technicien de laboratoire
 Recherches en immunologie.

5
 APPAREIL ET MATERIELS UTILISES PAR LE SEVCICE
 Deux centrifugeuses
 Sept réfrigérateurs
 Trois agitateurs
 Trois incubateurs
 Un spectrophotomètre
 Les verreries
 Les pipettes
 Les réactifs…………..

6
 TECHNIQUE D’AGGLUTINATION
I. Agglutination passive :
 Principe générale :
L’antigène est artificiellement fixé à des particules qui peuvent être du charbon, du latex, de la
gélatine, des globules rouges d’animaux, on les appelle particules sensibilisées. C’est une
technique pour la détection des anticorps solubles.
 Exemples :
 RPR : Rapide Plasma Reagin test
a. Principe :

Le test RPR (Rapid Plasma Reagin test) consiste en un antigène VDRL

(VeneralDiseaseResearchLaboratory) modifié, contenant des microparticules de charbon, qui
s’agglutine en présence d’un anticorps dans le sérum ou le plasma, indiquant un résultat
positif. L’agglutination peut être lue macroscopiquement. Les échantillons non-réactifs
apparaissent typiquement comme un bouton au centre de la cellule-test.

Ce test mesure les anticorps (IgG et IgM) produits en réponses aux matériaux lipidiques émis
par les cellules hôtes endommagées aussi bien que les lipoprotéines comme matériaux émis
par les spirochètes. Ces anticorps tendent à disparaître après un bon traitement de l’infection
b. Résultats :

Positif : une réaction fortement positive apparaît comme une large agglutination au centre de
la cellule. Une réaction faiblement positive apparaît comme des petites agglutinations autour
du bord de la cellule.

Négatif : un résultat négatif ne montre aucune agglutination. Il se forme soit une suspension
lisse, soit un bouton distinct.

 ASLO : Anti Streptolysine O :

a. Principe :
Les particules polystyrène-latex, couvertes par le Streptolysine-O stabilisé comme antigène,
réagissent immunologiquement avec des anticorps de l'anti-streptolysine-O correspondants
dans l'échantillon du patient ou dans le sérum de contrôle.
b. Résultats :
Positif : présence d’agglutinations distinctes
Négatif : absence d’agglutinations
c. Résultat après titrage :
Lire le titre dans la dernière plage de dilution avec une agglutination visible. Le résultat est
obtenu en multipliant le titre par le facteur de conversion 200

7
Titre : Concentration d’anti-streptolysine-O :

½ 400 UI/ml
¼ 800 UI/ml
1/8 1600 UI/ml
1/16 3200 UI/ml
1/32 6400 UI/ml
1/64 12800 UI/ml

8
II. Hemagglutination :
 Principe générale :
L’inhibition de l’hemagglutination permet soit de titrer un anticorps en présence d’un
antigène connu hemagglutinant comme le cas de la rubéole, soit de titrer un antigène en
présence d’anticorps capable d’agglutiner des globules rouges sensibilisés avec l’antigène en
question.
 Exemples :
 TreponemapallidiumHemagglutination : TPHA
a. Principe :
Le TPHA est un test spécifique d’hémagglutination pour la détection qualitative et semi-
quantitative des anticorps anti-Treponema pallidums dans le sérum humain. Les érythrocytes
stabilisés de poulet sensibilisés avec une solution antigénique de Treponema pallidum
agglutinent en présence des anticorps de Treponema pallidum pour donner un modèle
caractéristique.
b. Résultats :
Positif : présence d’un tapis lisse de cellules couvrant le fond entier du puits.
Négatif : présence de bouton compact défini des cellules, parfois avec un trou très petit au
centre.
c. Remarque :
Des résultats faux positifs peuvent se présenter pour les patients présentant la mononucléose,
la lèpre, la borréliose, les maladies auto immunes et aussi les penchants à la drogue.
Des résultats faux négatifs peuvent résulter du diagnostic précoce de la syphilis active ou
tardif de la syphilis latente. Il est recommandé pour accomplir le profil des résultats de
réaliser le test aux cardiolipidesdans le cas de la syphilis active.
Le test de TPHA n’est pas utile pour déterminer l’efficacité de la thérapie, puis les anticorps
restent longtemps après que la maladie ait été médicalement traitée et le test demeure positif.

 Serologie de l’amibiase
a. Principe
Le test est basé sur le principe de l’hémagglutination indirecte. Les hématies sensibilisées sont
constituées d’hématies de mouton recouvertes par un antigène soluble
d’Entamoebahistolytica.
La présence d’anticorps anti-Entamoebahistolytica sériques entraîne une agglutination des
hématies sensibilisées qui se traduit par un voile rouge/marron tapissant la cupule. En
l’absence d’anticorps spécifiques, ces hématies sédimentent au fond de la cupule sous forme
d’un anneau.Leshématies non sensibilisées assurent la spécificité de la réaction et permettent
d’éliminer les infections dues aux aglutinines naturelles anti mouton.
La réaction s’effectue en microplaque à fond U ;les résultats sont obtenus en 2 heures.
b. Résultats :
Positif : présence d’un voile rouge/marron tapissant la cupule.
Négatif : présence d’un anneau plus ou moins large au fond de la cupule.

9
Interprétation des résultats :
Titre inférieur à 1//80 : réaction négative : absence probable d’amibiase
Titre compris entre 1/80 et 1/160 : réaction douteuse
Titre supériuer ou égal à 1/320 Réaction positive

IMMUNO ENZYMATIQUE

10
 Enzyme linkedImmunoSorbentAssay: ELISA

II. Principe générale :

Les méthodes ELISA appartiennent au groupe des méthodes immunochimique où un

marqueur est fixé sur un antigène ou un anticorps. Et où la mesure de l’un des éléments du
complexe antigène _anticorps revient à la mesure de ce marqueur fixé.

Les méthodes ELISA font appel à la fixation d’une enzyme dont l’activité peut être dosée de
manière simple en spectrophotométrie grâce à un substrat chromogène.

A. CYSTICERCOSE/RIDASCREEN RTaeniasoliumIgG
1. Principe :
Pour le diagnostic in vitro. Ce test est un immuno essai enzymatique pour une caractérisation
qualitative des anticorps IgG contre les boutons de tænia solium dans le sérum humain en cas
de soupçon d’une cysticercose.

2. Calcul des résultats :

Calcul la DO moyen de contrôles négatif : Xn

Calcul de la valeur seuil (V.S) :
V.S= Xn + 0,150

Calcul du taux d’IgM de l’échantillon:

Taux= DOechantillon/ V.S

3. Résultats :

Négatif : taux inférieur à 0,9

Douteux : taux compris entre 0,9 et 1,1
Positif : taux supérieur à 1.1

B. TOXOPLASMOSE/ IgM ELISA

1. Principe :

11
La surface de la microplaque est sensibilisée avec de l’antigène purifié de
toxoplasmagondii.Du sérum dilué du sujet est ajouté dans les micro puits, et si ce sérum
contient des anticorps spécifiques IgM anti_tosoplasma gondii, ceux-ci se fixent à l’antigène.
Toute matière non fixée est éliminée par lavage. Lorsque le conjugué enzymatique est ajouté,
il va se fixer au complexe antigène_anticorps.L’exédant de conjugué enzymatique est éliminé
par lavage, puis un substrat et une solution TMB sont ajoutés .La réaction catalytique du
conjugué enzymatique est stoppée à un moment très spécifique. L’intensité de la coloration
qui se développe est proportionnelle à la quantité d’anticorps spécifiques IgM dans
l’échantillon. Les résultats sont lus par un lecteur de microplaques, et parallèlement comparés
avec un étalon et des contrôles.
2. Résultats :
Négatif : un taux de toxoIgM inférieur ou égal à 0,90 indique un résultat négatif pour
l’anticorps IgM de T.gondii.
Equivoque : un taux de toxoIgM situé entre 0.91 et 0.99 est équivoque.Retester l’échantillon.
Positif :un taux de toxoIgM supérieur ou égal à1.00 indique un résultat positif pour l’anticorps
IgM de T.gondii ; ainsi qu’une probable toxoplasmose récente ou en cours.

C. Sérologie de la Rubéole :

12
1. Principe :
Le test est basé sur la détermination des anticorps IgM dirigés contre le virus de la rubéole
dans le sérum humain.
La surface des micropuits est sensibilisée avec de l’antigène Rubella purifié. Du sérum de
patient dilué est ajouté dans chaque micropuits, s’il y a présence d’anticorps spécifiques IgM
anti-Rubella, ceux-ci se fixent aux antigènes durant l’incubation. Après lavage des micropuits
pour enlever les résidus non liés, un anticorps anti-IgM humaine conjugué à la peroxydase du
raifort (HRP) est ajouté et incubé à 37°C pendant 30 minutes. L’excédent de conjugué
enzymatique est éliminé par lavage. Une solution de substrat TMB est alors ajoutée dans les
micropuits. La réaction catalytique du conjugué enzymatique est stoppée à un moment
spécifique. L’intensité de la coloration générée est proportionnelle à la quantité d’anticorps
spécifique IgM anti-Rubella présent dans l’échantillon. Les résultats sont lus par un
spectrophotomètre et comparés en parallèle avec des étalons et des contrôles.
2. Résultats :
Négatif : résultat après calcul inférieur à la densité optique du contrôle positif.
Positif : résultat après calcul supérieur à la densité optique du contrôle positif.

13
 D Sérologie de l’Hépatite B : recherche de l’Antigène de surface de l’Hépatite B (AgHBs)

1. Principe:
L’anti-HBs pure sensibilise la surface des micropuits. Le sérum et l’anticorps anti-HBs
conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) sont ajoutés dans les micropuits. Après incubation,
si l’antigène HBs est présent dans l’échantillon, un complexe anti-HBs-HBs se formera. Le
lavage des micropuits permet d’enlever les éléments non-fixés. Une incubation avec le
substrat (TMB) permet de former un produit coloré dont l’absorbance peut être mesurée à 450
nm pour indiquer la présence ou l’absence de l’antigène HBs dans l’échantillon. La valeur
seuil est calculée par la formule donnée et les absorbances de tous les échantillons sont
comparées à cette valeur. Tout échantillon ayant une absorbance supérieure à la valeur seuil
est considéré comme réactif.
2.Calcul des résultats :
Valeur seuil : 0,200
Diviser la densité optique de l’échantillon par la valeur seuil

3Résultats :
Négatif : résultat après calcul inférieur à la densité optique du contrôle positif.
Positif : résultat après calcul supérieur à la densité optique du contrôle positif.

14
 IMMUNOCHROMATOGRAPHIE

Ce sont généralement des tests sous forme de bandelette, ces tests sont faits avec des
particules d’or colloïdal ou le latex avec des anticorps ou des antigènes. Ces particules sont
naturellement colorées, donc il ne s’agit pas d’une méthode immuno enzymatique.

Exemples :

Tests rapide HIV détection d’anticorps anti VIH dans le sérum, plasma ou sang total.

Tests rapide pour recherche de l’antigène Hbs pour la détection de l’hépatite B.

Le test n’est pas valide si la barre de contrôle n’apparaisse pas.

15
 GESTION DES ACTIVITES DE LABORATOIRE

 Organisation du personnel pour chaque activité dans le laboratoire :

Les tâches se répartissent au personnel en fonction de leur qualification, leur aptitude et leurs
expériences.
Un planning doit être rédigé par le major de service chaque semaine et doit être approuvées
par le chef de service.
Ce planning doit ensuite être affiché dans chaque secteur du laboratoire.
 Mode travail :
Chaque analyse à effectuer doit être enregistré ainsi que leurs résultats.
Des cahiers de paillasse ainsi que des cahiers d’enregistrement doivent donc exister dans le
laboratoire.
 Système de gestion des stocks :
Une fiche de suivi journalier doit être établie. Sur la fiche seront mentionnés : la date de sortie
des réactifs, la date de péremption, la qualité des réactifs et le nom de celui qui a sorti le
réactif.
 Elimination des déchets
Des procédures simples sur l’hygiène et sécurité sont recommandés à être affichés au
laboratoire.

16
POINTS FORTS ET POINTS A AMELIORER DU SERVICE
 Points forts :
Les tâches sont bien réparties
L’hygiène est bien respectée
Les résultats sortent à temps
Le personnel est ponctuel
Le personnel est accueillant, généreux et participent à l’enseignement des stagiaires
La qualité des résultats est contrôlée
 Points à améliorer
Manque de réactif
Manque d’entretien des matériels
Manque de personnel surtout technicien de laboratoire
 Suggestions
Engager des spécialistes pour entretenir les automates en panne
Donner des formations au personnel concernant l’entretien des automates
Chercher des partenaires qui peuvent fournir des réactifs à bas prix
Recruter de nouveau personnel

17
MES POINTS FORTS ET POINT A AMELIORER
 Points forts :
Maîtrise des techniques immunologiques : agglutination, ELISA, test à la bandelette
Paillasse bien organisée lors de la manipulation
Maitrise des tris de déchets
Respect de l’hygiène
Respect de la hiérarchie au sein du service
Ponctuel
 Point à améliorer
Rapidité lors de la manipulation
Eviter d’être distraite lors de la manipulation
Etre calme lors de la manipulation

18
 STATISTIQUE DU SERVICE

Analyses positifs négatifs total

RPR 2 85 87
TPHA 2 48 50
ASLO 1 16 17
Hépatite B 5 29 34
Hépatite C 0 13 13
Rubéole 0 13 13
Cysticercose 2 Douteux 29 32
1
Sérodiagnostic de 0 6 6
Widal et Félix
Facteur rhumatoïde 0 2 2
Anti ANA 0 2 2
Anti DNA 0 0 0
Bilharziose 10 20 30
Amibiase 2 6 8
VIH 0 20 20
Toxoplasmose 0 35 35
IGE 0 5 5

19
 STATISTIQUE DE MES ACTIVITES

Activités vues Effectués maîtriser

RPR 64 40 39
TPHA 35 25 24
ASLO 10 3 3
Hépatite B 24 10 10
Hépatite C 9 5 5
Rubéole 8 8 8
Cysticercose 16 8 8
Sérodiagnostic de 4 2 2
Widal et Félix
Anti ANA 2 2 2
Amibiase 8 8 8
VIH 3 3 3
Toxoplasmose 20 11 11

20
 CONCLUSION

Ce stage au service immunologie de l’ HJRA m’a été bénéfique car non seulement j’ai pu
améliorer mes compétences du point de vue technique, mais j’ai aussi la chance de m’adapter
dans le monde du travail. Pendant mes quatre semaines de stage j’ai pu atteindre tous mes
objectifs car le service applique tous les techniques immunologiques figurants dans les
objectifs de stage : l’agglutination, l’ hémagglutination, l’ELISA, et la chromatographie. Donc
j’ai pu effectuer toutes ces techniques. Concernant mes relations avec le personnel de ce
service, je me suis bien entendu avec eux, ils ont été très aimables, ils nous enseignent tous ce
que l’on doit savoir dans un laboratoire d’immunologie. En somme, j’ai passé des agréables
moments pendant mes quatre semaines de stage dans ce service.

21