CHIMIE CLINIQUE III

UE2LM05 2022-2023
24h
L.Pirson
2

CHAPITRE 2:
DOSAGE DES MARQUEURS PAR TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
 Objectifs des techniques immunochimiques:
3

 Mettre en évidence des antigènes (Ag)

• cellulaires, tissulaires
• présents dans les liquides biologiques (sérum, LCR, urines…)

 A l’aide d’anticorps polyclonaux ou monoclonaux

 Mettre en évidence des anticorps (Ac)

• présents dans le sang/sérum/plasma ou d’autres liquides biologiques (LCR, salive…)

 À l’aide d’antigènes (germe entier, antigènes, tissus...)

4 Techniques exploitant la réaction Ag-Ac:
 Techniques sans traceurs
• Immunoprécipitation (Turbidimétrie, Néphélométrie)
• Immunodiffusion
• Immunochromatographie
• Agglutination immunologique
• Fixation du complément
 Techniques avec traceurs
• Différents types de traceurs
o Enzymes
o Radioisotopes
o Fluorochromes
• Dosages immuno-enzymatiques (ELISA)
• Dosages radio-immunologiques (RIA)
• Immunodosages sur billes magnétiques
• Western Blot
• Immunodot
5 Sans traceur = immunoprécipitation:

Courbe de précipitation de Heidelberger

6 Sans traceur = immunoprécipitation:
7 Sans traceur: immunodiffusion

 réaction de précipitation qui se déroulent en milieu gélifié

 un des partenaires de la réaction Ag-Ac diffuse vers l'autre isolément ou simultanément
 le précipité formé augmente de taille jusqu'à l'équivalence où il est retenu entre les
mailles du gel
• Immunodiffusion simple radiale de Mancini (dosage de protéines)
• Immunodiffusion double d’Ouchterlony (caractérisation d’antigènes/anticorps)
• Immunoélectrophorèse/ Immunofixation (gammapathies)
• Electro-immunodiffusion de Laurell
• Immunochromatographie
8 Avec traceur:
Différents types de traceurs

 Enzymes
 HRP + substrats divers : ABTS, TMB,DAB,…
 PAL + substrats divers : pNPP, BCIP/NBT,…
 Radioisotopes
 Iode-125 (125I)
 Tritium (3H)
 Fluorochromes
 FITC
 PE
 ….
9 Avec traceur: ELISA
10 Avec traceur: immunodosage sur billes
magnétiques
11 Avec traceur: western blot et immunoblot
(cf cours sérologie + séminaire)
12 Réactions croisées:

 Malgré l'emploi de réactifs par définition hautement spécifiques, le résultat peut être faussé
par des interférences dans la réaction Ag/Ac
 Le plus souvent:
 Défaut de spécificité des Ac (réaction croisée)
 Présence dans l'échantillon d'Ac dirigées contre l' analyte à doser (ex: auto-Ac)
 Présence dans l'échantillon d'Ac dirigées contre les Ac du kit de dosage (ex: Ac
anti­immunoglobuline: Ac anti-lg)
13 Réactions croisées:

 La spécificité analytique dépend de:

 l'Ac de capture pour l'analyte à doser
 la spécificité de l'Ac marqué
 LA RC correspond à un défaut de spécificité de l'Ac de cap­ture qui peut aussi reconnaître
un épitope porté par une autre molécule que l'analyte à doser
 La molécule interférente ou cross­réactant (CR) est en général une molécule apparentée à
l'analyte mais ce n'est pas obligatoire car il suffit que deux enti­tés moléculaires différentes
possèdent au minimum un épitope en commun
14 Réactions croisées:
Plus fréquente pour les dosages de type compétitifs que pour les dosages de type non
compétitif car :
 pour les dosages de type compétitif:
 le CR doit posséder au minimum un épitope commun avec l'analyte
 l'Ac de capture étant introduit en défaut, la RC se manifestera pour des
concentrations en CR relativement faibles
 pour les dosages de type non compétitif:
 le CR doit posséder au minimum les deux épitopes de l'analyte reconnaissant l'Ac
de capture et/ou l'Ac traceur.
 ces Ac étant introduits en excès, la RC ne se manifestera le plus souvent que pour
des concentrations en CR relativement plus fortes
15 Conséquences des réactions croisées:

Un résultat faus­sement positif ou faussement négatif dépend:

 de la configuration du dosage compétitif versus non compétitif
 du rapport des concentrations entre l'analyte et le CR
 de la nature monoclonale ou polyclonale des réactifs Ac
16
17 Réactions croisées dues aux Ac de
l’échantillon:
La réaction Ag/Ac peut être perturbée par certains Ac présents dans l'échantillon:
 dirigés contre l'analyte = auto-Ac
 dirigés contre les lg animales du kit de dosage : Ac anti-lg animales
18 Réactions croisées par excès d’Ag:

 Peut induire une sous-évaluation de la concentration en analyte de plusieurs puissances de

1O
 Est consécutive à un large excès d'Ag par rapport aux Ac du coffret de dosage.
 Surtout pour les dosages de type sandwich en une étape (addition simultanée de
l'échantillon et des réactifs) et pour des analytes susceptibles de varier dans un large inter­
valle de concentration (ex: hCG, ferritine, PAL, TSH...)
 L'excès d'Ag à doser sature chacun des Ac réactifs empêchant ainsi la formation du
sandwich
19 Réactions croisées avec certaines protéines
endogènes:
Ex: facteur rhumatoïde
 auto-Ac habituellement de classe lgM
 dirigés contre le fragment Fe des lgG
 pré­sents dans le sérum de patients atteints de diverses patholo­gies auto-immunes
 à plus faible concentration dans le sérum d'environ 5 % des individus sains
20 Dosages couramment réalisés par
immunodosages:
21 Dosages couramment réalisés par
immunodosages:
22 Dosages couramment réalisés par
immunodosages: