Techniques utilisant les

immuno-marquages

Pr A.BENYAHIA & Dr S.METATLA

Année universitaire: 2023 – 2024
Introduction

 reposent sur l’utilisation:

- de la réaction Ag / Ac,
- d’un immuno marquage
Introduction

Rappel sur l’Interaction Ag-Ac

 L’interaction s’établit entre l’épitope sur l’Ag

et le paratope sur l’Ac.

Ag
 Rappel sur l’Interaction Ag-Ac

Antigénécité

Liaisons non covalentes

- Liaisons hydrogènes;
- Liaisons électrostatiques;
- Forces de Van Der Waals.
- Liaisons hydrophobes.
 Affinité

L'affinité est la force de la liaison qui s’établit entre

un épitope et un paratope.

un seul site de liaison de l'anticorps.

 Avidité
• L'avidité = Force de la liaison globale d'un antigène
( possédant des déterminants antigéniques multiples )
avec
plusieurs Acs chacun étant spécifique d’un épiotpe
unique sur cet Ag.
• Immun sérum (Ac polyvalents)
• L’avidité est supérieure à la somme des affinités différentes.
 Réactions croisées
Spécificité Réactions croisées

- Réagir avec un seul épitope; - Existence d’un même

- Réaction antigène- épitope sur 2 Ag différents
anticorps est spécifique. ou d’une homologie de
structure .
 Intérêt de l’utilisation de la
réaction Ag-Ac

 Doser l’Ag en utilisant l’Ac spécifique.

Chercher l’Ac en utilisant l’Ag spécifique.

Dans un liquide biologique (ex: sérum)

Le prélèvement sanguin
sur tube sec

Centrifugation

Sérum
• Transvaser le sérum

• Diluer le sérum
 Solution Ag
+ Solution Ac

La réaction Ag-Ac
Est invisible
Introduction

 Il faut marquer l’Ag ou l’Ac pour révéler

la réaction Ag - Ac,

- Immuno marquage
 Immuno-marquage

Un Fluorochrome  Techniques d’immunofluorescences

(IF)
Une Enzyme  Techniques immunoenzymatiques
(ELISA)
Un Radio isotope  Techniques radio immunologiques
(RIA)
Un chimiluminescent Techniques de chimiluminescence
(CLIA)
Introduction
 la mise en présence de l’Ag et de l’Ac va aboutir,
à l’équilibre, à la formation du CI (Ag – Ac).

 Ce qui pourra être quantifié grâce au traceur

Enzymatique (ELISA ) ou Radio isotopique (Radioimmuno

 La concentration est déterminée à l’aide

d’une courbe d’étalonnage.

 la mesure du signal: Un microscope à fluorescence

Un spectrophotomètre
Un compteur γ,
Un automate de chimilumnesc.
Introduction

Immunofluorescence: IFD (directe)

IFI (indirecte)

Selon la proportion relative de l’Ac ou de l’Ag

présents dans le milieu réactionnel on distingue deux
groupes de dosage

- les techniques par compétition (ELISA/RIA/LIA),

- les techniques Sandwich (ELISA/IRMA/ILMA)

 Ces deux dosages sont réalisés sur phase solide.

IMMUNOFLUORESCENCE
 Fluorochromes ou Fluorophores

Un fluorochrome est caractérisé par deux spectres:

• Son spectre d'absorption
• Son spectre d'émission de fluorescence

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Principaux fluorochromes utilisés:

 La fluorescéine : (isothiocyanate de fluorescéine ou

FITC) Absorbe la lumière bleue (UV) et émet une
fluorescence
verte (vert pomme).

 La rhodamine (isothiocyanate de rhodamine) emet

une fluorescence rouge orangée.

 La phycoérythrine: émet une fluorescence rouge

intense, souvent utilisée dans la cytométrie de flux

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 IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE (IFD)

Ac couplé à la
fluorescéine
spécifique de l’Ag1

Ag1

Fragment biopsique Sur une lame porte objet

Lecture au microscope à fluorescence

Immuno-histochimie
 Exemple:
Dépôt d’Ac et de complément au
niveau des glomérules Microscope à F*

Fragment biopsique du rein (PBR).

IMMUNOFLUORESCENCE DIRECTE

Fluorescéine Rho

Ac* 2 anti Ag2 Ac*1 antiAg1

Ag 2 Ag 1

Fragment biopsique Sur une lame porte objet

IFD avec double marquage

IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE (IFI)

Ac*

Ac du sérum à tester

Ag (un substrat choisi)

Immunofluorescence indirecte
 Le microscope est Lampe
muni d’un filtre UV.

Compartiment
du filtre à UV
Microscope à fluorescence
 IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE (IFI)

Recherche des anticorps anti nucléaire (AAN)

Conjugué : Anti-IgG humaines marqué
ines - Fluorochrome)
par un Fluorochrome (FITC) Conjugué
2

Anticorps anti-

-HEp-2  Cellules tumorales d’un adénocarcinome

du larynx (origine humaine).
 Aspects de fluorescence
rencontrés
MF*

Homogène Moucheté Nucléolaire Centromérique

Aspect de fluorescence :
Moucheté a gros grains
irréguliers

Anti Sn-RNP

Titre : élevé
 Aspects de Fluorescences retrouvés sur
des coupes de tissus.
Microscope à F*

Ac. anti-Muscle lisse Ac. anti-Ilôts de Langerhans

Coupe Coupe de
d’estomac Pancréas
de Rat de primate

HAI DT1

Ac. anti-Endomysium Ac. anti-Cellules pariétales

Coupe Coupe
d’œsophage d’estomac
de primate de Rat

M Cœliaque M. Biermer
Le Titre de l’Ac est estimer par des dilution de ½ à ½ du
sérum du patient.

Le titre = l’inverse de la dernière dilution qui donne un

résultat positif.
Techniques immuno-enzymatiques
et Radio-immunologiques
 LA TECHNIQUE PAR COMPÉTITION (ELISA/RIA)

Principe:

 Des molécules marquées et des molécules non

marquées (à doser, dans l’échantillon à tester) entrent
en compétition vis-à-vis d’un nombre limité de sites Ac
.

 La concentration de la molécule à doser est

inversement proportionnelle à l’intensité du signal
mesuré.
Radio immuno assay (RIA)
 Ag à doser (F)
Ac spécifique
Ag* - Ac
(B*)

Ag – Ac
(B)

Ag* (traceur)
(F*)
Phase
solide
Dosage par compétition
(Principe)
 LA TECHNIQUE PAR COMPÉTITION (ELISA/RIA)

A l’équilibre de la réaction:
Ag * + Ac ↔ Ag*- Ac B* Dosage par compétition
( F*) + Ag (B*) (Mesure du signal)
(F)

Ag- Ac
(B)
F
 Les concentrations des fractions F* et B* sont dans les même
rapports que celles des fractions F et B.

 Ainsi pour toutes les concentrations de l’Ag on a: B/F = B*/F*

 L’utilisation d’une gamme etalon permet de déterminer

la [Ag (F)] qui est inversement proportionnelle au signal
Avantages et inconvenients:

• S’appliquent à tous les antigènes quelque soit leur taille,

en particulier aux haptènes

• Nécessitent une constante d’affinité élevée

• Les réactions croisées sont fréquentes

puisqu’il suffit d’un seul épitope pour capter l’Ag.
Un épitope commun sera reconnu.
 LA TECHNIQUE SANDWISH (ELISA/IRMA)

ELISA SANDWISH / IRMA se distingue par :

 La présence en excés d’ Ac dans le milieu réactionnel.

- Le 1er Ac = Ac de capture de la molécule à doser,
- Le 2nd Ac = Ac traceur (marqué)

 Les deux Ac sont dirigés contre deux épitopes

suffisamment éloignés sur la molécule Ag.
Principe:

 L’Ac liant spécifique de la molécule à doser,

il est fixé sur la phase solide.

 Le 2e Ac = Ac marqué à l’I125 est l’Ac révélateur / traceur

 La molécule à doser est prise en Sandwich entre les deux

Ac qui lui sont spécifiques.

 L’excès de traceur est éliminé par les étapes de lavage.

 La radioactivité liée est directement proportionnelle à la

concentration de l’Ag (la molécule à doser).
 Ac
Ac 2 Ac Ac
Ag
1 1 2

Phase Phase
solide solide
Dosage par IRMA
(Principe)
Ac 1 Ac 2
Dosage par IRMA
Ag (mesure du signal)

[B*]

[F1] [F2] [F]

• A l’équilibre, les molécules libres sont absentes,
elles sont éliminées par les étapes de lavage.

• La molécule à doser étant prise en Sandwich

entre les deux Ac, il y a autant de traceur que de
molécules à doser.

• Les Le signal est proportionnel à la concentration

de l’Ag (la molécule à doser).
Avantages et inconvenients:
• caractérisées par:
- une grande spécificité, l’utilisation de deux Ac
améliore la reconnaissance.
- une bonne Sensibilité, toute molécule(trace) d’Ag mise
en présence de l’Ac liant est susceptible d’être
captée

• La gamme de concentrations est plus étendues

(détections en excès).

• Inconvénients de la radio activité.

• Réactions croisées : Epitopes semblables, Présence
d’autoAc

• Effet crochet pour [Ag] ↑↑↑

l’Ag ne réalise plus de pont entre les deux Ac ce qui
entraîne une baisse du signal.

• Les Ac hétérophiles, présents chez certains patients,

peuvent établir des liaisons avec l’Ac liant et l’Ac
traceur et induire des réactions faussement
positives.
ELISA SANDWISH

[DO]

[C1] [C2] [C]

 ELISA SANDWISH appliquée à
l’identification de la cible des auto-Ac.

Réaction (+)

Antigènes purifiés ou recombinants Résultats qualitatifs

Un antigène par puits réactionnel
 Chemiluminescence Immuno Assay (CLIA)

C’est le phénomène par lequel certaines molécules portées

à un état d’excitation lors d'une réaction chimique,
reviennent à leur état fondamental en restituant tout ou
partie de l’énergie sous forme d‘émission de lumière.
 Intensité de la luminescence

Intensité

Début de la réaction
chimique Fin de la réaction
chimique

[0 10 20 30 40 50] Temps

• L’émission de lumière est déclenchée par la

réaction chimique, elle est fugace
• Son intensité maximale est variable au cours de
la réaction chimique
• La lecture se fait par un automate.
• Pas de lumière parasite
• Grande spécificité du signal