16 Les AC Marqués

FACULTÉ DE MÉDECINE D’ALGER
DÉPARTEMENT DE MÉDECINE
Module d’Immunologie
Les Techniques utilisant

les Anticorps marqués
Dr. Mounira BENIDIR
Maître Assistante en Immunologie
Chef du Laboratoire d’Auto-Immunité
Département d’Immunologie. Institut Pasteur d’Algérie
3ème Année de Médecine

Année Universitaire
2018 - 2019
PLAN
I. Techniques d’Immunofluorescence
II. Techniques Immuno-enzymatiques
III. Techniques Radio-immunologiques
IV. Chimiluminescence
Techniques Immunologiques
Réactions « Antigène – Anticorps »
IMMUNO-DOSAGE
1 2
Sans Marqueur Avec Marqueur
o Agglutination o Immunofluorescence
o Précipitation o Immuno-Enzymologie
o Neutralisation o Radio-immunologie
o Chimiluminescence
Techniques Immunologiques
Réactions « Antigène – Anticorps »
Identification et/ou dosage Mise en évidence et/ou titrage

d’un Antigène (Ag) d’un Anticorps (Ac)
o Cellules o Sérologies infectieuses

o Agents infectieux o Maladies auto-immunes
o Protéines o Allergies
o Hormones o Transplantation
o Médicaments
Techniques Immunologiques utilisant un marquage
PRINCIPE GÉNÉRAL
Réactions « Antigène – Anticorps » utilisant

un Antigène* ou un Anticorps* marqué par un TRACEUR
Nombreuses techniques : qui différent selon :
• La nature du TRACEUR : • Le PROCÉDÉ :

- Fluorescent, - par Compétition,
- Enzymatique, - Direct,
- Isotopique, - Indirect,
- Chimiluminescent. - Sandwich, …
Techniques Immunologiques utilisant un marquage
Antigène – Anticorps
Antigène* Anticorps*
Marqueur (TRACEUR)
F
Fluorochrome
E
Enzyme
R
Radio-Isotope
C
Chimiluminescent
- Fluorescéine - Peroxydase - H3 - Phthalhydrazide
- Rhodamine - PAL - I125 - Esters d’Acridinium
Immunofluorescence Immuno-Enzymologie Radio-Immunologie Chimiluminescence
PLAN
Phénomène de Fluorescence
COONS et coll. (1941) :

Description d’un procédé :
Conjugaison « Anticorps + Composant Fluorescent »

Rendre visible des Complexes Immuns (CI) en Microscopie UV.
Albert Hewett COONS

(1912 – 1978)
La fixation du corps fluorescent sur les Immunoglobulines

(Ig) n’altère pas leurs propriétés immunologiques Site de
(Reconnaissance spécifique de l’antigène). reconnaissance
spécifique d’Ag
Fluorescent = Fluorophore = Fluorochrome

Fluorochromes
Fluorescence
Absorption
Excitation Émission
Fluorophore Fluorophore excité
• Une molécule fluorescente exposée à un faisceau lumineux absorbe l’énergie des

photons incidents.
• Une fois excitée, elle réémet un photon de longueur d’onde (Lambda « λ »)

supérieure à celle du photon excitateur.
Fluorochromes
Fluorophore Excitation Émission

Isothiocyanate de Fluorescéine = 490 nm Fluorescence Jaune Verte
(FITC) =520 nm
Isothiocyanate de Rhodamine =550 nm Fluorescence Rouge Orangée
=580 nm
Phycoérythrine 30 x plus la lumière Fluorescence Rouge Intense
que la fluorescéine.
Fluorochromes
Exemple de Fluorescence : FITC « Fluorescein Isothiocyanate »
Le spectre d’absorption et d’émission de la FITC :

• Max d’absorption à 490 nm (absorbe les radiations bleues) ;
• Max d’émission à 520 nm (restitue une fluorescence verte).
Plus la différence entre ces deux spectres 1 : Absorption

est importante et plus il est facile 2 : Fluorescence
d’éliminer les lumières parasites qui
altèrent la qualité de la lecture (de
fluorescence).
La différence entre les 2 spectres est dite :

« Déplacement de Stokes ».
Déplacement de Stokes
Fluorochromes
Exemple de Fluorescence : FITC « Fluorescein Isothiocyanate »
Marquage des Protéines à la FITC

La conjugaison ou marquage des Ac ou d’Ag protéiques doit se faire en présence
d’un excès modéré de fluorochrome (FITC).
Le marquage se fait dans des conditions relativement douces :
• Temps de contact prolongé : 18 heures au moins ;

• à + 4°C ou à température ambiante ;
• à pH =9,4 (Alcalin) en tampon bicarbonate.
La réaction chimique met en jeu le groupement amine de la lysine (de la

protéine à marquer) et le groupement thiocyanate de la FITC.
Microscope à Fluorescence
Systèmes de mesure de Fluorescence
Microscope à Fluorescence
Systèmes de mesure de Fluorescence
Méthodes de Fluorescence utilisées
Trois types de méthodes d’Immunofluorescence peuvent être utilisés :
1. Réactions d’Immunofluorescence Directe (IFD) ;

2. Réactions d’Immunofluorescence Indirecte (IFI) ;
3. Réactions de Double Marquage.
Réactions d’Immunofluorescence Directe (IFD)
Anticorps spécifique de l’antigène

(Conjugué)
Coupe de tissu
Suspension cellulaire
Cette méthode nécessite le marquage de l’antisérum spécifique de chaque

antigène, ce qui limite ses applications.
Réactions d’Immunofluorescence Indirecte (IFI)
Ac ou Auto-Ac Anti-Ig humaines marquées
Sérum recherchés (Conjugué)
Antigène
1 Lavage Lavage 2
Le marquage d’un seul type d’immun-sérum (anti-IgG, IgM, IgA humaines) permet la
détection de tous les Ac à rechercher. Ainsi, cette méthode n’a, donc, pas les
inconvénients de l’IFD.
L’IFI est utilisée pour la recherche des Ac (ou auto-Ac)  Méthode de choix dans le
diagnostic immunologique des Maladies Auto-Immunes (MAI).
Exemple d’IFI pour la détection des Auto-Anticorps
Sérum du patient
Auto-Anticorps
Anti-Ig humaines
Ag (Substrat) marquée à la FITC
Lavage
Antigène in situ Lavage
Lecture au
Microscope à
Fluorescence (UV)
Exemple d’IFI pour la détection des Auto-Anticorps
Maladie Auto-Immune Auto-Ac recherchés Organes/Cellules (Substrat)

Connectivites AAN Cellules HEp2/HEp2000
Vascularites AI ANCA PNN
Hépatopathies AI ASMA, M2, LKM Foie, Rein, Estomac de rat
Diabète de type 1 (AI) Anti-ilots de Langerhans Pancréas de primates
Maladie Cœliaque Anti-Endomysium Œsophage de primates
Anémie de Biermer Anti-Facteur intrinsèque Estomac de rat
Maladie d’Addison Anti-Surrénales Surrénales de primates
Thyroïdite de Hashimoto Anti-Thyroglobuline Thyroïde de primates
Maladie de Basedow Anti-Récepteur de la TSH Thyroïde de primates
Myasthénie Anti-Récepteur d’Acétyl choline Muscle cardiaque et strié de primates
Neuropathies AI Anti-Myéline Nerf de primates
Syndrome de Good Pasture Anti-MBG Rein, poumon
Dermatoses Bulleuses AI Anti-desmosomes Œsophage de primates
Exemple d’IFI pour la détection des Auto-Anticorps anti-Nucléaires (AAN)
Cellule au Repos Cellule en Division

Cellule au Repos Cellule en Division

Aspects de Fluorescence les Plus Fréquemment rencontrés
Homogène Moucheté Nucléolaire Centromérique

Double marquage (Microscopie Confocale)
Rhodamine
FITC
Ag 1 Ag 2
Utilisation de plusieurs marqueurs fluorescents dans la

même réaction.
Lecture  Microscopie Confocale

PLAN
Techniques Immuno-Enzymatiques et Radio-Immunologiques
Principe de Base
Ces techniques sont assez semblables quant à leur principe.
La différence majeure réside dans la nature du signal mesuré (détecté) :

• Radioactivité  RIA (Radio-Immuno-Assay) ;
• Activité enzymatique  ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay).
En effet :
• Dans la RIA, les Anticorps secondaires (marqués) sont conjugués à un radio-
isotope (Tritium, Iode-125, etc).
• Tandis qu’une enzyme (PAL, Peroxydase de raifort, etc) est utilisée dans la
technique ELISA.
Réactions et dosages Immuno-Enzymatiques
IMMUNO-ENZYMOLOGIE
Techniques Enzymo- Dosages

Immunocytochimiques Immuno-enzymatiques
o Qualitatives o Quantitatifs
o Semi-quantitatives
Techniques Enzymo-Immunocytochimiques
Ces techniques utilisent des Anticorps

marqués aux Enzymes pour localiser des
constituants présents dans des Tissus ou
des Cellules  Procédés identiques à ceux
de l’Immunofluorescence.
Antigènes :
o Cellules :
- Frottis
- Suspension
- Mono-couche
o Tissus : Coupes histologiques ;
o Ag viraux : Cellules ou Tissus infectés ;
o Ag bactériens, Fungiques ou Parasitaires.
Dosages Immuno-Enzymatiques
DOSAGE IMMUNO-ENZYMATIQUE
Phase Hétérogène Phase Homogène
Dosage de type Dosage de type Dosage de type non Dosage des

compétitif non compétitif dit compétitif molécules de faible
de type sandwich Immunométrique PM (Hormones ou
ELISA drogues)
Phase Hétérogène Phase Homogène
Une phase solide est nécessaire pour Aucune séparation n’est nécessaire
immobiliser l’Antigène ou l’Anticorps donc une phase purement liquide et
associé à l’enzyme et, ainsi, le dosage du complexe « Antigène –
permettre l’évaluation de l’activité Anticorps » s’effectue directement
enzymatique du complexe dans le mélange réactionnel
« Antigène – Anticorps ».
Place de l’Immun-Enzymologie
Les Dosages Immuno-Enzymatiques (en phase hétérogène) :
o ont remplacé, dans de nombreux cas, la Radio-Immunologie (RIA) car l’utilisation

de matières radioactives impose le respect des règles de radioprotection (++++).
o et le recours à l’Immuno-Enzymologie a pris plus d’importance et d’ampleur en

raison de l’avènement des Anticorps monoclonaux qui présentent les avantages de :
- Avoir une spécificité très étroite et constante ;

- Pouvoir être produits en quantités illimitées.
Immuno-Enzymologie
Étude de l’Enzyme
Plusieurs Enzymes sont utilisées :
o Peroxydase : origine végétale (extraite à partir d’une plante : Raifort +++) ;

o Phosphatase Alcaline (PAL) : origine animale (muqueuse intestinale) ;
o Glucose Oxydase (Go) ;
o Béta-Galactosidase (β-Gal) : extraite à partir d’Escherichia Coli.
Étude du Substrat
o Peroxydase : un seul substrat  Eau Oxygénée « H2O2 » ;

o Phosphatase Alcaline (PAL)  P. Nitrophenyl Phosphate, Naphthol As Phosphate.
Immuno-Enzymologie
Différents Types de Conjugués
Conjugué spécifique Conjugué spécifique
d’Ag marqué par une d’Ac marqué par une
enzyme Enzyme Enzyme
Liaison covalente
Antigène
tissulaire
Conjugué simple : « Anticorps – Enzyme » Conjugué simple : « Anticorps – Enzyme »
Biotine
Avidine
Conjugué spécifique
d’Ac marqué à la
Antigène tissulaire
Biotine
Conjugué associant le couple « Avidine-Biotine »

PHASE HÉTÉROGÈNE
Compétitifs Non Compétitifs
Direct
Indirect
En sandwich
Exemples de Dosages par Compétition
Dosage d’un ANTIGÈNE
Dosage d’un ANTICORPS

Exemples de Dosages par Compétition
Exemples de Dosages Sans Compétition
Dosage d’un ANTIGÈNE (Directe)
L’Antigène à doser est Fixé sur un support.

La révélation se fait par l’ajout d’un conjugué « Anticorps spécifique de l’Antigène
marqué par une Enzyme ».
Dosage d’un ANTICORPS (Indirecte)
L‘Anticorps à doser est pris entre l‘Antigène et un Anticorps anti-Ig marqué « Anticorps
anti-Ig humaine marqué par une enzyme ».
1 2
Dosage d’un ANTICORPS (Indirecte)
La DO (Densité Optique) est directement proportionnelle

à la quantité d’Anticorps mesurés.
Dosage d’un ANTIGÈNE par méthode Sandwich (ELISA Sandwich)
L‘Antigène doit posséder deux épitopes (déterminants antigéniques) différents

 il est pris en « Sandwich » entre deux Anticorps.
Dosage d’un ANTIGÈNE par méthode Sandwich (ELISA Sandwich)
La DO (Densité Optique) est directement proportionnelle

à la quantité d’Antigènes mesurés.
Densité
optique
(DO)
Concentration de
l’Ag ou de l’Ac
Révélation et Interprétation
La révélation consiste à mesurer l’activité catalytique de l’enzyme par

Spectrophotométrie (Densité Optique).
Les résultats peuvent être rendus de façon qualitative ou quantitative.
En fait, il existe différentes manières de rendre le résultat d’une technique ELISA :

o QUALITATIVE  Valeur seuil « Cut-Off » :
- En Titre : sérum à tester par rapport à la valeur seuil ;
- En Ratio : un Ratio > 1 est, en général, considéré comme positif.
o QUANTITATIVE  Courbe d’étalonnage :
- En Unités Arbitraires (UA/ml) ;
- En Unités Internationales (UI/ml).
Exemple du dosage des anticorps anti-ADN natif :
< 100 UI/ml : Résultat Négatif :
> 100 UI/ml : Résultat Positif.
Révélation et Interprétation
QUALITATIVE : Valeur seuil « Cut-Off » QUANTITATIVE : Courbe d’étalonnage

- Titre : Sérum à tester/valeur seuil ; - Unités Arbitraires (UA/ml) ;
- Ratio : un ratio >1 est en général - Unités Internationales (UI/ml).
considéré comme positif.
Techniques Radio-Immunologiques
DOSAGE RADIO-IMMUNOLOGIQUE
Par Compétition Sans Compétition

RID : Radio-Immuno-Dosage DRIM : Dosage Radio-Immuno-Métrique
RIA : Radio-Immuno-Assay IRMA : Immuno-Radio-Metric Assay
Méthodes par défaut d’anticorps. Radio-immuno-dosage par excès d’anticorps.

Technique en sandwich
Dosage Radio-Immunologique
Choix du Traceur RADIOACTIF
Le traceur « Conjugué » doit garder les mêmes propriétés physico-chimiques et

Immunologiques après marquage.
Impératifs concernant le Traceur :
o Ne pas trop modifier la constante d’affinité vis-à-vis de l’Anticorps spécifiques ;
o Permettre d’obtenir une activité spécifique élevée (grande sensibilité) ;
o Permettre une détection aisée (émetteur « γ » plus pratique que « β ») ;
o Posséder une période (demi-vie) assez longue car elle conditionne la limite
d’utilisation.
Élément Radioactivité(Ci/mmol) Demi-vie Rayonnement
C¹⁴ 0,062 5568 ans β
H³ 29 12,3 ans Β
I¹²⁵ 2200 59,7 j γ
I¹³¹ 16100 8,1 j β, γ
Techniques Radio-Immunologiques
DOSAGE RADIO-IMMUNOLOGIQUE
Par Compétition Sans Compétition

RID : Radio-Immuno-Dosage DRIM : Dosage Radio-Immuno-Métrique
RIA : Radio-Immuno-Assay IRMA : Immuno-Radio-Metric Assay
Radio-Immuno-Dosage par Compétition
Définition
C’est une technique de DRI dans laquelle des molécules marquées (Ag*) et non
marquées (Ag), d’une même espèce, entrent en compétition vis-à-vis d’un nombre
limité de sites de liaison Ac spécifiques. Une fois l’équilibre atteint, le pourcentage de
forme liées « Ag*- Ac » est inversement proportionnel à la concentration de la
substance que l’on veut doser (Ag).
Ag marqués Ag à doser À l’équilibre
+
Interprétation
La concentration de la substance à doser est inversement proportionnelle à la

radioactivité du complexe « Ag* - Ac ».
La réalisation d’un tel dosage nécessite le recours à des solutions étalons de

concentration connue et croissante en Ag marqué : R1, R2, R3, etc.
La détermination de la concentration de la substance à doser, dans un milieu

biologique, se fait graphiquement par extrapolation.
Exemple : Dosage des IgE Totales
Sérum
du patient
IgE Radio-marquées
Radio-Immuno-Dosage Sans Compétition
DRIM : Dosage Radio-Immuno-Métrique (Sandwich)
Capturer les molécules à doser, grâce à des Anticorps fixés sur un support solide puis
les révéler à l’aide d’Anticorps marqués (conjugués) par un isotope radioactif.
Étape 1 : Étape 2 : Étape 3 : Étape 4 :

Support solide Addition du Lavage: Révélation par
saturé par des Ac sérum élimination des anticorps
spécifiques non (Ag) à doser des Ag non marqués
marqués fixés (conjugués) par
un isotope
radioactif
Dans ces conditions, plus la concentration de la substance à doser augmente, plus la

radioactivité des complexes « Ac – Ag – Ac* » augmente  Directement
Proportionnelle.
Exemple : RAST (Radio Allergo-Sorbent Test)
Allergènes
fixés
Sérum du patient
IgE spécifiques Anti-IgE marqués par
un isotope radioactif
IgE spécifiques
Applications
o Allergologie : IgE totales, IgE spécifiques ;
o Auto-immunité : Anticorps anti-ADN natifs (Test de Farr) ;
o Endocrinologie : Dosages hormonaux (FSH, LH, TSH, etc) ;
o Obstétrique : béta-HCG ;
o Pédiatrie et Hématologie : Facteurs de croissance (GH, IGF1, etc) ;
o Cancérologie : Dosage des marqueurs tumoraux.

Avantages et Inconvénients
AVANTAGES :
o Sensibilité très élevée : toute molécule (trace) d’Ag mise en présence de l’Ac
liant est susceptible d’être captée.
o L’isotope permet un marquage facile : encombrement stérique réduit.
o Signal direct : directement émis par l’isotope lui-même.
o Signal spontané : ne faisant pas intervenir une source d’énergie externe.
INCONVÉNIENTS :
o Les précautions et surveillances nécessaires lors de la manipulation.

o Le temps de mesure du signal isotopique est long.
o La péremption du traceur : décroissance radioactive, radiolyse.
PLAN
Marqueurs Luminescents
Marqueur luminescent  émet un signal provoqué par un apport d’énergie extérieure.
Différents types de luminescence utilisés en immuno-analyse, selon la nature de

l’énergie d’excitation :
o Fluorescence  Excitation lumineuse ;
o Chimiluminescence  Réaction chimique provoquée par l’addition d’un

réactif chimique approprié ;
o Bioluminescence  Cas particulier de la chimiluminescence avec

intervention de système enzymatique biologique.
Marqueurs Luminescents
MARQUEURS LUMINESCENTS
Excitation Lumineuse Réaction Chimique

Immuno-dosage Immuno-dosage
par marqueurs Fluorescents par marqueurs Chimilumnescents
Fluoro-Immuno-dosage
Déplacement de Stokes Déplacement de Stokes
Exemple du signal peu spécifique Exemple du signal très spécifique

Les fluorophores conventionnels Quand le fluorophore a une longueur
délivrent un signal peu spécifique car d’onde d’émission « λ » élevée et quand
plusieurs phénomènes parasites le déplacement de stokes est important
peuvent augmenter le bruit de fond >200, les photons de diffusion ne sont
optique dans la bande passante de pas détectés
détection.
Fluorophores classiques
FLUORO-IMMUNO-DOSAGE
Méthodes par Compétition Méthodes Immuno-métriques

FIA IFMA
Fluoro-Immuno-Dosage par Compétition
L’Ag marqué à l’Europium entre en compétition avec l’Ag à doser vis-à-vis de l’Ac fixé sur les puits.
o L’Eu3+ chélaté à l’EDTA n’est pas fluorescent, pour le devenir, il doit être dissocié de son chélateur.
o L’Eu3+ déchélaté, excité par une source lumineuse, émet de la fluorescence.
Méthodes Immuno-métriques
L’Ac est marqué à l’Europium ou à une enzyme.

Immuno-Dosage par Marqueurs Chimiluminescents
o L’excitation des molécules est due à un apport d’énergie chimique
 La chimiluminescence se caractérise seulement par un
spectre d’émission.
o L’émission de lumière commence, immédiatement, après le début de la réaction
chimique.
Intensité
L’intensité d’émission :
o Augmente, rapidement ;
o Passe par un maximum ;
o Pour, ensuite, diminuer et s’annuler en
quelques secondes.
Réactif Fin de la réaction
0 10 20 30 40 50 Temps
[secondes]
Le Signal Luminescent
L’émission lumineuse peut provenir, soit :
o Du marqueur (Luminophore) ;
o D’une molécule transformée par une enzyme spécifique utilisée comme marqueur.
Réactif
Émission directe par le marqueur

λ d’émission
Substrat + Réactif
Produit Émission indirecte grâce à un marqueur enzymatique
luminescent
λ d’émission
Luminophore
Enzyme
Les Marqueurs Chimiluminescents
PHTALHYDRAZIDES
ESTERS D’ACRIDINIUM
DIOXETANES
Phtalhydrazides
Les plus utilisés sont :
Luminol
Isoluminol
Dérivés substitués de l’Isoluminol
O O
NH2 O
C NH2 C
C
NH N – (CH2)n-NH2 NH
HN
n = 2  AEEI
NH n = 4  ABEI NH
HN
n = 5  APEI
C C
C n = 6  AHEI
O O
O
Luminol Dérivés de l’isoluminol Isoluminol
Luminol
Par des réactions d’oxydation en présence d’H202 (peroxyde d’hydrogène) et d’un catalyseur
 Ces molécules sont transformées en espèces excitées qui se désexcitent ensuite, avec
émission de photons.
Exemple de réaction
O O
NH2 NH2 O
C C
NH NH
Peroxydase
+ 2 H202 + OH- + N2 + 3 H2O
NH NH
C C Ion Aminophtalate
O O O (singulet excité)
Luminol
hv
3-Aminophthalhydrazide
NH2 (λ max = 430 nm)
COO-
Lumière BLEUE
NH
NH
COO- Ion Aminophtalate

(singulet fondamental)
Avantages et Inconvénients
AVANTAGES :
o La chimiluminescence étant, seulement, caractérisée par un spectre d’émission (pas de
lumière d’excitation) n’est, donc, pas perturbée par la lumière parasite.
o Une grande spécificité du signal
o La durée d’émission est variable d’une seconde à quelques dizaines de secondes
permettant une lecture rapide.
INCONVÉNIENTS :
Un problème de la reproductibilité du signal : Les marqueurs chimiluminescents posent
souvent ce problème.
La lecture est rapide mais unique car l’émission lumineuse est fugace et d’intensité maximale
fluctuante (variable au cours de la réaction chimique).
Il est, donc, impératif que la mesure se fasse par un automate qui contrôlerait :
- l’injection du réactif
- et la chronologie de mesure de la lumière émise.
Dosage et Applications en Immuno-Biologie
Conclusion
Les immuno-dosages avec marqueurs luminescents sont aujourd’hui de

plus en plus employés en pratique courante.
Ils sont de sensibilité égale à celle des DRI, tout en ayant l’avantage de ne
pas utiliser de marqueurs radioactifs.
Les marqueurs luminescents sont connus depuis longtemps ; c’est grâce

aux progrès de l’instrumentation que ces méthodes se sont développées.

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FACULTÉ DE MÉDECINE D’ALGER

Les Techniques utilisant

3ème Année de Médecine

II. Techniques Immuno-enzymatiques

III. Techniques Radio-immunologiques

Sans Marqueur Avec Marqueur

Identification et/ou dosage Mise en évidence et/ou titrage

o Cellules o Sérologies infectieuses

Réactions « Antigène – Anticorps » utilisant

Nombreuses techniques : qui différent selon :

• La nature du TRACEUR : • Le PROCÉDÉ :

II. Techniques Immuno-enzymatiques

III. Techniques Radio-immunologiques

COONS et coll. (1941) :

Conjugaison « Anticorps + Composant Fluorescent »

Albert Hewett COONS

La fixation du corps fluorescent sur les Immunoglobulines

Fluorescent = Fluorophore = Fluorochrome

Fluorophore Fluorophore excité

• Une molécule fluorescente exposée à un faisceau lumineux absorbe l’énergie des

• Une fois excitée, elle réémet un photon de longueur d’onde (Lambda « λ »)

Fluorophore Excitation Émission

Le spectre d’absorption et d’émission de la FITC :

Plus la différence entre ces deux spectres 1 : Absorption

La différence entre les 2 spectres est dite :

Marquage des Protéines à la FITC

Le marquage se fait dans des conditions relativement douces :

• Temps de contact prolongé : 18 heures au moins ;

La réaction chimique met en jeu le groupement amine de la lysine (de la

Trois types de méthodes d’Immunofluorescence peuvent être utilisés :

1. Réactions d’Immunofluorescence Directe (IFD) ;

Anticorps spécifique de l’antigène

Cette méthode nécessite le marquage de l’antisérum spécifique de chaque

Antigène in situ Lavage

Maladie Auto-Immune Auto-Ac recherchés Organes/Cellules (Substrat)

Cellule au Repos Cellule en Division

Cellule au Repos Cellule en Division

Homogène Moucheté Nucléolaire Centromérique

Utilisation de plusieurs marqueurs fluorescents dans la

Lecture  Microscopie Confocale

II. Techniques Immuno-enzymatiques

III. Techniques Radio-immunologiques

Ces techniques sont assez semblables quant à leur principe.

La différence majeure réside dans la nature du signal mesuré (détecté) :

Techniques Enzymo- Dosages

Ces techniques utilisent des Anticorps

Phase Hétérogène Phase Homogène

Dosage de type Dosage de type Dosage de type non Dosage des

Phase Hétérogène Phase Homogène

Les Dosages Immuno-Enzymatiques (en phase hétérogène) :

o ont remplacé, dans de nombreux cas, la Radio-Immunologie (RIA) car l’utilisation

o et le recours à l’Immuno-Enzymologie a pris plus d’importance et d’ampleur en

- Avoir une spécificité très étroite et constante ;

Plusieurs Enzymes sont utilisées :

o Peroxydase : origine végétale (extraite à partir d’une plante : Raifort +++) ;

o Peroxydase : un seul substrat  Eau Oxygénée « H2O2 » ;

Conjugué simple : « Anticorps – Enzyme » Conjugué simple : « Anticorps – Enzyme »

Conjugué associant le couple « Avidine-Biotine »

Compétitifs Non Compétitifs

Dosage d’un ANTICORPS

L’Antigène à doser est Fixé sur un support.

La DO (Densité Optique) est directement proportionnelle

L‘Antigène doit posséder deux épitopes (déterminants antigéniques) différents

La DO (Densité Optique) est directement proportionnelle