M1 BPM Immunotechnologie Dr. YSMAIL-DAHLOUK L.

Chapitre 1 : Production des Anticorps Polyclonaux/Monoclonaux

En 1900, par un mécanisme d'agglutination, précipitation, Jules BORDET visualisa pour la première fois les anticorps (qu'il
appelait agglutinines) = le prix Nobel de physiologie et médecine en 1919 et ont été a la base d'une nouvelle discipline,
l'immunologie.

• A la suite de ce succès, la sérothérapie fut appliquée a de nombreuses autres pathologies. En effet, il semble que les
sérothérapies anti-pneumococcique, anti-pesteuse et anti-meningococcique aient permis de sauver de nombreuses vies.

• Actuellement la sérothérapie utilisant des produits d'origine animale est peu utilisée.

• Néanmoins on peut considérer que l'utilisation des anticorps recombinant thérapeutiques constitue une forme
moderne de sérothérapie.

1- les anticorps : connaissances fondamentales

1-1: Définition Les anticorps (Ac), de la superfamille des immunoglobulines (Ig), glycoprotéines 150-190 kDa,
ayant une séquence spécifique d’acides aminés qui leur permet d’interagir sélectivement avec l’antigène (Ag) qui induit leur
synthèse dans les lymphocytes B, particulièrement les plasmocytes.

Retrouvés sous forme soluble, dans sérum et d’autres sécrétions, aussi sous forme membranaire à la surface de lymphocytes B
(B-Cell Receptor, BCR).

Leurs propriétés, en font d’eux des outils de diagnostic, de recherche et de thérapie très importants.

1-2-Structure : À la fin 1950: PORTER et EDELMAN : ont décrit Le premier modèle de la structure des anticorps : « le
prix Nobel de physiologie et medecine en 1972 ».

Les Anticorps sont formées de 4 chaînes polypeptidiques: Deux chaînes lourdes (CH) (H pour heavy) (de 50 a 70 kDa chacune)
et, Deux chaînes légères (CL) (L pour light) légères (de 25 kDa chacune) , reliées entre elles par des ponts disulfures (intra et
inter) assurant une flexibilité de la molécule. Chaque chaîne légère est constituée d’un domaine constant et d’un domaine
variable. Les chaînes lourdes sont composées d’un domaine variable et de 3 ou 4 fragments constants selon l’isotype.

Les chaînes légères sont de deux types, kappa et lambda. le type des chaînes lourdes définit la classe de l’Ig (chaînes γ, α, μ, ε
et δ).

Domaines constants : Caractérisés par une séquence en acides aminés très similaire d’un Anticorps à l’autre. Chaque chaîne
légère en possède un exemplaire noté CL. Les chaînes lourdes comportent, selon l’isotype, trois ou quatre domaines constants
CH1, CH2, CH3 et CH4.
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Domaines variables : Un Anticorps comporte quatre domaines variables situés aux extrémités de ses deux «bras». L’association
entre chaque domaine variable porté par chaque chaîne (VH+VL) constitue le paratope (ou site de reconnaissance) de
l’antigène.

Les domaines amino-terminaux des chaînes lourdes et légères, VH (Variable Heavy) et VL (Variable Light), incluent des régions
charpentes (FR pour Framework Regions) et trois régions hypervariables (CDR pour Complementary Determining Region).

1-3 : Les différentes classes Cinq classes d'anticorps sont décrites chez l'Homme, en fonction de l'isotype de leurs chaînes
lourdes : les IgG (gamma), IgA (alpha), IgM (mu), IgE (epsilon) et IgD (delta) avec deux isotopes de chaînes légères : les
chaînes kappa (κ) et les chaînes lambda (λ).

Les IgG : Anticorps solubles qui représentent 70 à 75 % des immunoglobulines totale et la plus longue demi-vie (21 jours).
Avec Quatre sous-classes: IgG1 (66 %), IgG2 (23 %), IgG3 (7 %), IgG4 (4 %). Disposent de deux sites de liaison de l'antigène
(paratope), ce qui augmente l'affinite fonctionnelle de l'anticorps. Les seules immunoglobulines qui peuvent franchir la barrière
placentaire = conférer une immunité passive au fœtus.

Les IgA : 15 à 20 % des immunoglobulines sériques, abondantes dans les secrétions des muqueuses et MALT. Deux sous-
classes IgA1 (90 %) et IgA2 (10 %),

Les IgM, 10 % des immunoglobulines totales. Deux formes, Une forme pentamerique, 970 kDa, c’est la forme secrétée et
présente dans le compartiment intravasculaire, et Une forme monomérique exprimée à la surface des lymphocytes B
immatures. Demi-vie est d'environ cinq jours. Tout comme les IgG, les IgM peuvent activer la voie classique du complément.
Les IgM pentameriques peuvent interagir avec 10 épitopes identiques au maximum ce qui peut conférer aux IgM une avidité
élevée.

Les IgE, Faibles concentrations dans le sérum (20-300 μg.l-1). Retrouvés principalement à la surface des basophiles et des
mastocytes grâce à l'interaction avec le récepteur FcεR (affinité élevée pour les FcεRI et FcεRII) Demi-vie peut atteindre 21
jours (à la surface cellulaire) et de deux jours sous forme soluble. Impliqués dans la libération de médiateurs chimiques au cours
des chocs anaphylactiques, dont l’Histamine.

Les IgD, Seule 1 % est sous forme soluble dans le sérum, le reste est exprimé à la surface des lymphocytes B. leurs fonctions
biologiques encore peu connues, incapables d'activer le système du complément et de franchir la barrière placentaire.

1-4: Principales fonctions Essentiellement, les Anticorps ont trois fonctions : se lier à l’antigène, activer le système du
complément et d’activer des cellules immunocompétentes. Pour ce faire, le domaine variable est responsable de l’interaction
directe avec l’antigène, et les régions constantes vont activer différentes fonctions effectrices.

Liaison à l’antigène: La reconnaissance entre Antigène et Anticorps est mise à profit dans la lutte contre les infections
principalement. En effet, de nombreux virus et bactéries utilisent des facteurs de virulence afin d’exercer leur pathogénicité via
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la fixation aux cellules de l’organisme telles que les adhésives utilisé par les bactéries. Les Anticorps anti-adhésines neutralisent
l’action de ces agents pathogènes en se liant sur les molécules de fixation.

Activation du complément Les Anticorps peuvent déclencher la cascade du complément. L’activation de cet ensemble de
protéines (par la voie classique) permet de détruire des pathogènes par perforation, de faciliter la phagocytose et la libération
de molécules chimiotactiques.

Activation de cellules immunocompétentes: Les cellules immunitaires possédant les récepteurs aux fragments constants
(RFc) sont capables de lier les Ac. En se fixant à son antigène spécifique, un Ac peut donc se lier à des effectrices du système
immunitaire principalement macrophages et et polynucléaires et déclencher une phagocytose (opsonisation). Les lymphocytes
NK peuvent ainsi exercer leur cytotoxicité et lyser des bactéries opsonisées et des cellules infectées (ADCC).

2- Anticorps polyclonaux et monoclonaux

2-1: Anticorps polyclonaux versus monoclonaux

Anticorps polyclonaux : Un mélange complexe d’Ac qui sont produits par des clones plasmocytaires différents. Ils
reconnaissent des épitopes distincts présents soit sur la même molécule antigénique, soit sur des Ag différents. Au cours d’une
réponse immunitaire contre un agent infectieux, la réponse est toujours polyclonale et contre de multiples épitopes appartenant
à de multiples Ag de l’agent infectieux. les Ac isolés à partir de fluides biologiques ont été synthétisés par de multiples clones
de lymphocytes B.

Obtention des anticorps polyclonaux

• Immunisation d'un animal entier (cheval, chèvre ou mouton, lapin) permet d'obtenir plusieurs clones de lymphocytes
B.
• L’ajout de l'adjuvant permet d’accroitre le taux d'anticorps obtenu.
• Après, un ou deux rappels nécessaires à l'obtention d'une quantité suffisante d'anticorps.
• Ainsi, le sérum contient : des anticorps spécifiques de l'Ag issus de différents Lymphocytes B reconnaissant plus ou
moins efficacement plusieurs épitopes de l'antigène (anticorps polyclonaux) ; d'autres anticorps de l'animal.
La purification des anticorps obtenus se réalise généralement par chromatographie d'affinité : les anticorps en solution sont
filtrés sur une colonne de résine, gel ou billes portant l'Ag fixé ; les Ig spécifiques de cet Ag sont retenues puis décrochées par
des tampons.

Anticorps monoclonaux:

(Mab en anglais «Monoclonal antibody»): sont des Ac identiques produits à partir d’un clone de lymphocyte B naïf
initialement activé par un épitope x et après se différencient en plasmocytes, ces anticorps possédant une haute affinité pour
l’épitope x.

Les Ac monoclonaux sont artificiellement produits contre un Ag spécifique dans un but bien défini.
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2-2 : Production des anticorps monoclonaux conventionnels :

Technologie des hybridomes La technique originale de production des Ac monocolaux murins, découverte par Georges
Köhler et César Milstein et faisant appel à la technique de l’hybridome... Une technique permettant de produire à l'identique
des molécules d'anticorps de spécificité unique, à partir de souris immunisées avec un antigène d'intéret... La technique
d’obtention d’anticorps monoclonaux repose sur la fusion de deux types de cellules et la sélection d’hybridomes.

Obtention d'hybridomes:

1-1- Immunisation d'une souris avec l’antigène choisi, prédéterminé, le plus souvent en présence d'un adjuvant "classique", ou
bien l’utilisation de l'interféron de type I et le ligand du CD40 comme stimulant et comme agent de prolifération des
lymphocytes B, respectivement (afin de diminuer le risque d'une dénaturation et réduire la durée des protocoles
d'immunisation). Ainsi, en 18 jours les souris développent une réponse immunitaire vis-à-vis de l’antigène administré, contre
43 à 176 jours avec l'adjuvant.

1-2- Apres obtention d'une réponse immunitaire suffisante, les plasmocytes de la rate sont isolés.

la production d'hybridomes : la fusion de:

• Plasmocytes isolés de la rate de la souris immunisée précédemment, sécrétant des anticorps mais ne se multiplient pas
indéfiniment, ces cellules sont normaux et ne présentant donc aucun marqueur génétique (sont HGPRT+).

• cellules de myélome lymphoïde, obtenus à partir des lignées cellulaires myéloïdes murines servant de partenaires de
fusion ont été obtenues en induisant chimiquement des myélomes chez la souris, ont la capacité de se développer
indéfiniment in-vitro dans un milieu de culture. La lignée a perdu l’enzyme HGPRT (sont HGPRT-) (un marqueur
génétique).

La fusion se fait, en utilisant un agent permettant la fusion des membranes plasmiques, le polyethylene-glycol (PEG), afin de
combiner les caractéristiques distinctes des deux cellules en une cellule = La cellule hybride (hybridome) => conserve les deux
propriétés des cellules mères, elles se multiplient plus rapidement que les cellules normales productrices d'anticorps, et produisent
des anticorps spécifiques pendant une période de temps indéfinie.

1-3- Sélectionner les hybridomes: Une cellule myélomateuse sur mille en moyenne fusionne avec une cellule splénique. Les
cellules fusionnées sont donc mélangées à des cellules spléniques et à des cellules de myélome non fusionnées. Donc il faut
éliminés les cellules splénique et les cellules du myélome non fusionnées restantes et préserver les hybridomes.

-Les cellules spléniques, n’étant pas immortelles, elles disparaissent naturellement en quelques jours.

-Les cellules du myélome non fusionnées doivent synthétiser de l’ADN pour se proliférer, deux principales voies de synthèse
de l’ADN sont décrites ;

• Pour ce faire, nos cellules (cellules hybrides, cellules spléniques non fusionnées et cellules du myélome nos fusionnées)
sont mises en culture dans le milieu de culture HAT, contient de l'Hypoxanthine, de l'Aminopterine et de la Thymidine.

• Ainsi, dans ce milieu les cellules du myélome non fusionnées ne pourront plus se proliférer, car:

 la première voie classique de synthèse de l’ADN, la voie de novo (endogène), est bloquée par l’ajout de
l’aminopterine dans le milieu, et par conséquent ces cellules vont essayer d’utiliser la 2eme voie, de récupération (de
sauvetage), à partir de deux précurseurs rajoutés : la thymidine et l'hypoxanthine.
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 Cependant, ils sont déficients en enzyme HGPRT (hypoxantine- timidine phosphoribosyl transférase), qui est
capitale pour la synthèse de l’ADN par la voie de sauvetage (exogène).

Et donc meurent dans le milieu.

• De ce fait, les hybrides issus des deux type cellulaires, et qui ont incorporé les génomes des deux types cellulaires
parentaux, survivent et peuvent seuls proliférer. En effet, ils conservent la propriété de survivre en culture, héritée de
la cellule myélomateuse, et celle d’utiliser l’HGPRT pour la synthèse du DNA à partir d’hypoxanthine, héritée de la
cellule splénique.

• Après fusion et sélection des hybrides, la spécificité des anticorps sécrétés est encore inconnue. De plus, de nombreux
hybrides ne sécrètent pas d’anticorps.

• Afin d’isoler les cellules hybrides désirées, le clonage est nécessaire.

• Pour ce faire, une technique de dilution des cellules est employée, dans le but d’obtenir des lignées d’hybrides (H1,
H2..) dérivant chacune d’une seule cellule souche, qui constituent des clones. Le mélange est dilué et distribué dans les
puits d’une microplaque de manière à ce que chaque puis contienne au plus un hybridome. Les hybridomes survivants
seront aptes à constituer des clones au bout d’une dizaine de jours.

• Chaque clone est alors testé pour reconnaître ceux qui synthétisent l’anticorps recherché. Les surnageants des cultures
sont dès lors récoltés et examinés pour rechercher la présence d’anticorps spécifiques. En effet, en utilisant une méthode
sensible pour connaître la spécificité des anticorps sécrétés dans le milieu (généralement ELISA), les clones qui
produisent les anticorps désirés sont identifiés.

4- La multiplication des clones se fait dans: un milieu de culture adapté, par inoculation dans la cavité péritonéale de la
souris.

5- Ainsi, un hybridome particulier peut être conservé dans de azote liquide et réutilisé plus tard avec une production illimitée
d’anticorps monoclonaux.
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