M1 BPM Immunotechnologie Dr. YSMAIL-DAHLOUK L.

Chapitre 2 : Les Anticorps Monoclonaux et les Anticorps Recombinants

-Stratégies d’amélioration-
Immunogénicité des Anticorps monoclonaux murins : Un immense espoir au départ dans de nombreux laboratoires, qui
débouche sur une immense déception. En effet, l’administration d'un anticorps monoclonal d’origine animale à un patient
peut provoquer une réponse immunitaire. Effectivement, des anticorps anti-immunoglobulines de souris (HAMA : Human Anti-
Mouse Antibodies) sont généralement produits chez les patients traités, et qui peuvent réduire son efficacité thérapeutique,
et même ont fait conclure à l’inutilité des anticorps monoclonaux de souris pour un usage thérapeutique.

Stratégies d’amélioration: Création des anticorps recombinants :

Afin d'améliorer l’efficacité et réduire l’immunogénicité des Anticorps murins, différentes approches ont été envisagées et ont
conduit à la l'obtention de plusieurs générations d’Anticorps, jusqu'au développement d’anticorps totalement humains. Ainsi
Chaque nouvelle génération a été développée parce que la précédente était jugée trop immunogène = l'augmentation de
la proportion de séquence humaine dans des anticorps est corrélée avec l'augmentation de leur tolérance.

Les différentes générations d'anticorps développées visent donc à diminuer la proportion de résidus non-humains dans
les anticorps thérapeutiques afin d'optimiser leur tolérance.

Pour ce faire, Trois stratégies, et donc trois générations d'anticorps dites recombinants, principales ont été mises en œuvre. Le
développement de ces différentes générations d'anticorps a été rendu possible par l'avènement des techniques de biologie
moléculaire. Effectivement, la biothérapie ne s’est cependant vraiment développée que récemment, après
l’ingénierie des anticorps et la démonstration de la possibilité de cloner, par PCR, les gènes codant pour les différentes chaînes
de ces Ac. Ainsi, sont nés successivement les Anticorps monoclonaux chimériques, humanisés et totalement humains.

1- La 1ere génération d’anticorps : Les anticorps chimériques :

"-ximab" comme suffixe de la dénomination Commune Internationale, Ex ; L'Abciximab (1993) Le premier anticorps
chimérique commercialisé, utilisé en cardiologie en tant qu'anti-coagulant.

 La chimérisation d'un anticorps consiste à : Exprimer les séquences d'ADN codant les domaines variables d'un
anticorps d'origine animale en fusion avec les séquences d'ADN codant les régions constantes d'un anticorps humain
(formés des domaines constants d’une IgG humaine associés aux domaines variables VH et VL de l’anticorps
de souris) = réduction de la proportion non humains à 33 % = augmentation de la tolérance des anticorps. Nettement
moins immunogènes, ayant une demi-vie accrue, et dotés de capacités de recrutement des effecteurs du
système immunitaire par leur portion Fc.

 La construction d’un anticorps chimérique consiste à:

1/6
M1 BPM Immunotechnologie Dr. YSMAIL-DAHLOUK L.
Chapitre 2 : Les Anticorps Monoclonaux et les Anticorps Recombinants
-Stratégies d’amélioration-
Isoler l’ADN codant pour la région VH et VL d’un AcM de souris et à le lier à l’ADN codant les régions constantes H et L
d’une Immunoglobuline humaine= production un Anticorps hybride dont la partie constante, humaine, n’est pas ou très peu
immunogène chez l’Homme.

Sont humains à 75 % et moins immunogéniques que les anticorps murins.

Spécificité + l’affinité des Anticorps chimériques restent identiques à celles des Anticorps murins parentaux.

Cependant, les anticorps chimériques sont très vite apparus comme imparfaitement tolérés (jusqu’à 61 % des patients traités avec
l'Infliximab ont développé une réponse anticorps anti-Infliximab après cinq injections). Pour pallier ce problème, une nouvelle
génération d'anticorps recombinants a été développée.

2-La 2eme génération d'anticorps: Les anticorps humanisés :

"-zumab" comme suffixe de la dénomination commune internationale. Technologiquement sont plus difficile à obtenir que les
anticorps chimériques. Greg Winter à la fin des années 1980 propose :Le principe général de l'humanisation =

 Consiste à greffer les régions hypervariables (Complementary Determining Regions, CDR) d'un Ac monoclonal d'intéret
de souris (on garde les régions hypervariables capables de lier l'Ac), sur les régions charpentes (Framework Region,
FR) VH et VL d'un anticorps humain.

 = Conserver la spécificité de l'anticorps pour sa cible, tout en ne conservant qu'environ 10 % de résidus codes par des
séquences non-humaines (seules les boucles reconnaissant l’antigène (CDR) sont issues de l’anticorps de
souris d’origine) .

2/6
M1 BPM Immunotechnologie Dr. YSMAIL-DAHLOUK L.
Chapitre 2 : Les Anticorps Monoclonaux et les Anticorps Recombinants
-Stratégies d’amélioration-

• Ces Ac sont très peu immunogènes chez l’Homme, car seules les régions hypervariables sont d’origine murine. En
général, la structure du site de liaison est conservée et l’affinité est proche de celle de départ.

• La plupart des AcM chimériques et humanisés contiennent une région Fc dérivée d’une IgG1 humaine, qui possède
les caractéristiques et les fonctions les plus intéressantes pour l’immunothérapie.

Pour les Ac chimériques et humanisés, on utilise la technique des hybridomes. Puis clonage et séquençage des gènes des
régions variables de l'Ac murin, on conçoit un vecteur d'expression qui va nous permettre de produire l'Ac que l'on veut.

Une fois le clone fait, on le transforme ou transfecte dans des lignées cellulaires de cellules productrices. En général ce sont
des cellules de mammifères qui vont produire en grande quantité des Ac chimériques ou humanisés.

3/6
M1 BPM Immunotechnologie Dr. YSMAIL-DAHLOUK L.
Chapitre 2 : Les Anticorps Monoclonaux et les Anticorps Recombinants
-Stratégies d’amélioration-
3- La 3eme génération d'anticorps : Les anticorps humains

"-umab" comme suffixe de la dénomination commune internationale

Méthode 1: On fabrique des souris transgéniques exprimant des gènes d’immunoglobuline d’origine humain et à partir de
cette lignée on fabrique des hybridomes qui fabriqueront cette fois des Ac humains. «Xenomouse» souris transgénique qui
exprime la grande majorité des gènes codant les immunoglobulines humaines.

Méthode 2 : fabriquer in vitro des banques d’Ac (banques de phages exprimant des VH et VL humains) par : Technologie
du phage display.

Principe des banques de phage (phage display) : est un Outils de synthèse et sélection de peptides. Phages utilisé :
le bactériophage filamenteux se réplique et s’assemble sans tuer son hôte. Phages= virus qui doivent infecter une bactérie
hôte afin de se multiplier= reproduisant leur ADN en un grand nombre de copies== libérés, comportant un assemblage de
protéines virales entourant cet ADN. On peut introduire dans le génome des phages des séquences d’ADN codant les
anticorps=== se retrouvent joints au domaine N-terminal des protéines de surface du phage sous forme de fragments.

1- L’ARN de lymphocytes B est isolé et transcrit en ADNc (sous l'action de la RT),

2- Les ADNc codant les anticorps sont alors spécifiquement amplifiés par PCR,

3- Sélection des gènes codant les parties variable et constante,

4- Construction d'un plasmide avec les gènes d'intérêt,

5- Intégration dans le phage pour expression : Chez ces phages : gène III codant pour la protéine P3 est exposé l’extrémité
du phage. Si on y colle le gène d’intérêt : fusion à la surface entre cette protéine et le gène d’intérêt. Donc lié
au gène pIII du bactériophage filamenteux (ce dernier code pour protéine de capside responsable de se attachement du sur le
pilis F des bactéries).

4/6
M1 BPM Immunotechnologie Dr. YSMAIL-DAHLOUK L.
Chapitre 2 : Les Anticorps Monoclonaux et les Anticorps Recombinants
-Stratégies d’amélioration-

6- Sélection du bactériophage (sélection des clones spécifiques) pour introduction dans le système d'expression : On immobilise
en parallèle l’antigène à la surface d'un puits de plaque microtitre, que l'on met en contact avec le phage modifié.

S'il y a une interaction entre la protéine exprimée à la surface du phage (présentant un anticorps spécifique) et cette cible, le
phage restera accroché au puits (étape d’adsorption) alors que les autres phages seront éliminés par le lavage.

On procède ensuite à l'élution des phages fixés (étape d’élution = récupération les phages fixés).

L’obtention de ligands spécifiques à partir de larges répertoires exprimés à la surface de phages, nécessite plusieurs tours
de sélection et d’amplification.

7- Mise en culture : Les phages précédemment élués seront introduits dans des bactéries pour l’étape d’amplification. En effet,
L'hybride d'ADN constitué par le gène du phage et le gène d'intérêt est inséré dans Escherichia coli, de façon que le phage
modifié soit produit par la bactérie.

Après multiplication, de nouveaux phages seront alors produits en dizaines de millions d’exemplaires et présentent les fragments
d’anticorps à leur surface. Les bactériophages exprimant les fragments d’anticorps dirigés contre la molécule cible seront encore
sélectionnés et isolés par des cycles répétés d’adsorption/élution.

8-Extraction des anticorps secrétés.

5/6
M1 BPM Immunotechnologie Dr. YSMAIL-DAHLOUK L.
Chapitre 2 : Les Anticorps Monoclonaux et les Anticorps Recombinants
-Stratégies d’amélioration-

•
L’arrivée de ces anticorps humains a véritablement constitué une percée thérapeutique, du fait:

- D’une nette réduction de l’immunogénicité,

-D’une importante amélioration de leur capacité à recruter des effecteurs du système immunitaire (système du
complément, cellules cytotoxiques),

-D’une forte augmentation de demi-vie tendant à se rapprocher des 3 semaines qui caractérisent les IgG humaines
endogènes.

De ce fait, les patients pourront bénéficier de thérapeutiques ciblées mieux tolérées, avec des injections plus espacées.

6/6