CHAPITRE VI : CONSTRUCTION DES BANQUES D'ADN GENOMIQUE ET D'ADN COMPLEMENTAIRE

Une banque d'ADN (ou bibliothèque) est une collection de clones recombinants renfermant chacun un ADN étranger particulier, il existe deux
types de banque fig. 1
banque d'ADN génomique: les clones sont réalisés à partir de la totalité de l'ADN chromosomique d'un organisme. banque d'ADNc:
les clones sont réalisés à partir d'ADNc provenant des ARNm d'un même type cellulaire.
Exemple: clonage du gène codant pour l'hormone de croissance humaine:
Clonage à partir de sa forme génomique, donc n'importe quelle cellule de l'individu est utilisée (gène = introns + exons).
Ou à partir de la forme ADNc. Il faut donc des cellules où le gène s'exprime pour extraire les ARNm d es ce!!ules de l'hypophyse et les
convertir en ADNc (gène = exons).

Il. Fabrication d'une banque d'ADN qénomique

L'ADN est préparé à partir du tissu le mieux adapté, puis découpé d'une façon la plus aléatoire possible (par digestion incomplète par une
nucléase de restriction). La construction d'une banque génomique implique le clonage de la totalité du génome, le seul moyen d'y parvenir est
de partir de fragments chevauchants. Tous les fragments de taille admissible par le vecteur choisi auront la possibilité d'être clonés, tout le
génome pourra être représenté. Le nombre minimum de clones nécessaires pour qu'une séquence quelconque, appartenant à un génome de
taille donnée soit présent dans la banque (qui, théoriquement, contient l'ensemble des séquences d'ADN de l'espèce considérée) peut se
calculer par

N : nombre de clones constituant la banque (ou bibliothèque) P : probabilité pour qu'une séquence donnée soit présente
dans la banque (une valeur de 0,99 est acceptable) L : taille moyenne des fragments insérés X : taille de la séquence
souhaitée M : taille du génome

Quelle que soit la prétention de cette formule, ceci veut dire qu'une banque génomique réalisée dans un vecteur dérivé du phage lambda
devra comprendre environ 40 000 clones différents pour un génome de drosophile et 800 000 pour celui du maïs ou de l'homme. Ces banques
sont donc très lourdes et dans bien des cas on constitue un autre type de banque.

Ill. Fabrication d'une banque d'ADNc

Extraction des ARN cellulaire: Il faut partir des cellules où s'exprime le gène concerné. Il s'agit d'en extraire la totalité de l'ARN
cellulaire (ARNr, ARNt et ARNm) car on ne sait pas sélectionner l'ARNm.

Séparation: On ne veut garder que les ARNm Cette étape est basée sur la présence d'une queue polyA à l'extrémité 3'OH de tous les
ARNm eucaryotes. La colonne d'oligo-dT permet de stopper les ARNm grâce aux liaisons H qui s'établissent entre leur queue polyA
et l'oligo-dt tandis que les ARNr et les ARNt traversent la colonne. On récupère ensuite les ARNm en éluant la colonne. Attention, on
obtient tous les ARNm de la cellule, pas seulement ceux du gène voulu.
On a à notre disposition une préparation d'ARN messagers d'une cellule qu'il va falloir transformer en ADN. Ils seront alors appelés ADN
complémentaires ou ADNc. On distingue la technique à la nucléase SI pour fabriquer un ADNc.
Technique à la nucléase SI : fig. 2
Pour la synthèse du premier brin, on utilise une reverse transcriptase, on a besoin d'une amorce pour initier la polymérisation. On utilise un
oligonucléotide qui s'hybridera sur tous les ARN messagers, un oligodT qui s'hybridera sur toutes les queues polyA. On détruit l'ARN par un
traitement alcalin. Lorsque l'extrémité 5' de l'ADN se retourne et s'hybride sur lui-même en faisant une boucle en épingle à cheveux, on a une
extrémité double brin qui peut servir d'amorce à une ADN polymérase. On obtient alors un ADNc double brin avec une extrémité en épingle à
cheveux. Une telle structure ne peut pas être intégrée dans un vecteur. Pour avoir une extrémité franche on fait agir une nucléase dégradant
le simple brin, la nucléase SI
Intéqration de l'ADN qénomique ou de l'ADNc dans un vecteur
Il faut maintenant intégrer l'ADN génomique ou l'ADNc double brÎn préparées dans un vecteur de façon à pouvoir I 'amplifier, et à obtenir des
clones. On peut liguer directement la population de A c a un vec eur coupé par une enzyme de restriction générant des extrémités franches.
Le vecteur est alors déphosphorylé en utilisant une phosphatase alcaline pour éviter sa recircularisation et donc pour éviter la présence d'un
grand nombre de clones non recombinants. Toutefois, cette ligation est relativement inefficace et on préfère faire une ligation avec une
extrémité cohésive. Il faudra donc ajouter des extrémités cohésives aux deux bouts.
A cette étape, on est en présence d'une banque d'ADNc, c'est à dire d'un ensemble de bactéries ou de phages recombinants, chacun portant
un insert différent, représentant l'ensemble de la population d'ARN de départ. La banque sera donc rcprésentative uniquement du matériel de
départ. Comme la population d'ARN dépend de la transcription, chaque banque sera représentative du type de cellule utilisé. Les ARN les plus
fréquents seront les plus représentés et à l'inverse les ARN les plus rares seront les moins représentés dans la banque. Dans certains cas on
désire diminuer cette différence de représentativité, on réalise une banque dite normalisée. On hybride les ARN messagers à de l'ADN
génomique fixé sur une membrane. Pour chaque gène, un seul ARN peut s'hybrider, les ARN non hybridés sont éliminés par lavage de la
membrane. Après dénaturation, les ARN messagers sont récupérés et une banque d'ADNc est construite.
CHAPITRE Vil : SELECTION ET CRIBLAGE DES CLONES RECOMBINANTS

Plusieurs techniques éprouvées permettent de construire des banques. Il reste à les exploiter, même avec une banque d’ADNc, te nombre de
clones est important et le tri représente la paftie la plus délicate des expériences de clonage, il existe de nombreuses stratégies mais aucune
n’est universelle.

Les termes de cribler et de sélectionner n’ont pas la même signification : lors de la sélection, on élimine tous les clones non intéressants, le
criblage permet de repérer le clone intéressant. Le tri peut se faire par sélection lorsque le gène intéressant confère un phénotype particulier
à l’hôte tel qu’une résistance à un antibiotique particulier auquel les cellules sauvages sont sensibles  : la culture sur un milieu contenant cet
antibiotique ne fera apparaître que les clones transformés contenant ce gène précis.

Le tri par criblage reste le plus courant. I.a détection immunologique du produit du qène représente un crible intéressant si le gène recherché
est exprimé dans la cellule transgénique ce qui n’est pas toujours le cas.

Le criblage par hybridation de l’ADN des clones transformés avec une sonde spécifique constitue une méthode de choix. L’hybridation peut se
faire in situ : on effectue des répliques de clones bactériens cultivés en boîte de Fœtri sur des disques de nitrocellulose, après un temps de
culture suffisant, les bactéries de ces répliques sont ensuite lysées par la soude qui, en même temps, dénature l’ADN, les molécules simple brin
correspondantes se trouvent immobilisées à l’emplacement de chaque clone. Après hybridation, avec la sonde radioactive,
l’autoradiographie révélera les clones positifs.
11. On a un anticorps diriqé contre la protéine d’intérêt : Si on a la protéine, on peut avoir un anticorps dirigé contre cette protéine,
simplement en l’injectant à un lapin et en récupérant son sérum un à trois mois après. On obtient ainsi un anticorps polyclonal, c’est-à-dire un
mélange d’anticorps dirigés contre un ensemble d’épitopes de la protéine.

Criblage immunologique d’une banque d’ADNc

La banque est étalée sur une boite de pétri et répliquée sur des filtres de nitrocellulose. La protéine hybride est repérée en incubant le filtre
avec une solution contenant l’anticorps qui lui-même est repéré par la suite à l’aide d’un anticorps secondaire lui-même porteur d’une activité
enzymatique (fig. 4).

Pour effectuer un criblage immunologique, il faut que la protéine soit exprimée par la bactérie. La traduction est initialisée grâce à des
séquences présentes dans le vecteur, le site de liaison du ribosome (RBS) et ATG à proximité. Il y a donc synthèse d’une protéine de fusion, la
partie N-terminale correspond à une séquence codée par le vecteur, la séquence suivante correspond à traduction de l’insert (fig. 5).

21. On connait la séquence de la protéine : Si on a purifié la protéine, on peut aussi en séquencer des morceaux après l’avoir coupé à l’aide
d’une protéase. Des stratégies ont été successivement développées pour cloner des gènes à partir de ces séquences peptidiques. On peut
cribler une banque d’ ADNc à l’aide d’oligonucléotides de séquences déduites de la séquence en acide aminé ; on peut amplifier par PCR le
fragment d’ADN compris entre deux oligonucléotides déduits de la séquence protéique. C, 2.11. Criblaqe d’une banque avec des
oliqonucléotides dérivés de la séquence protéique :

Si on trouve une séquence composée uniquement de méthionines et de tryptophanes dans la protéine, on pourra faire un oligonucléotide
spécifique de cette séquence. La phénylalanine est codée par deux codons. S’il y a une phénylalanine avec les méthionines et tryptophane, on
fera un mélange des deux oligonucléotides. S’il y a une sérine codée par 6 codons, on aura un mélange d’un nombre encore plus grand
d’oligonucléotides. Dans ce cas un seul des oligonucléotides hybridera à la bonne séquence. Mais la fréquence sera trop faible pour obtenir
une hybridation visible. On utilisera donc parmi les séquences de la protéine disponibles, une région qui donnera le moins d’oligonucléotides
possibles.

Ces oligonucléotides sont marqués radioactivement avec du y-32P ATP. La banque est étalée sur des boites de pétri, répliquée sur
nitrocellulose. Les bactéries (dans le cas d’une banque de plasmide) ou les phages sont réî ;iqués sur nitrocellulose, lysés par la soude ce qui a
aussi pour effet de dénaturer l’ADN qui se fixe sur la nitrocellulose. On effectue alors une hybridation que l’on révèle par radioautographie. La
position du spot est repérée et permet de retrouver la position de la bactérie ou du phage.

2.21. Clonaqe direct par PCR : Si on a purifié la protéine, on peut la couper à i’aide d’une protéase et séquencer plusieurs fragments. A partir
de ces séquences on peut préparer plusieurs oligonucléotides. On ajoute dans un tube une préparation d’ADNc, deux oligcnucléotides
hybridant sur chacun des deux brins de l’ADN. Une polymérase thermostable et les 4 nucléotides triphosphates. On effectue alors une réaction
de PCR. Si les deux oligonucléotides ont reconnu des séquences, on aura amplification d’un fragment d’ADN. Pour savoir si ce fragment
correspond au gène recherché, il est souvent plus sûr de le cloner dans un plasmide afin de le séquencer. Le clonage des fragments de PCR
dans un plasmide peut se faire par plusieurs méthodes

Clonage bord franc : le vecteur est coupé par une enzyme générant des bords francs tels que Sma I ou ECOR V et les extrémités du
fragment de PCR sont rendues franches à l’aide d’une ADN polymérase ayant une activité 3’5’ exonucléase. De façon à éliminer la
recircularisation du vecteur, il sera déphosphorylé, par contre le fragment de PCR sera phosphorylé.
 Clonage par extrémités cohésives. Les amorces servant à l’amplification peuvent comporter des sites de restriction. Le fragment de
PCR et le vecteur seront coupés par les mêmes enzymes de façon à obtenir des extrémités cohésives.
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