LEXPERIMENTATION ANIMALE : REGLEMENTATION, ETHIQUE, ALTERNATIVES

1. Historique de lexprimentation animale Les chiffres Justification La rglementation 2. Ethique et exprimentation animale : Bien-tre Comits dEthique pour lexprimentation animale Mthodes

alternatives, substitutives ou complmentaires

EXPERIMENTATION ANIMALE, BIEN-TRE ET ETHIQUE

Bien-tre = efforts que fait un individu pour faire face son environnement

Son valuation implique : philosophie, psychologie compare, thologie, physiologie

Deux composantes : - physique (se porter bien) - psychologique (se sentir bien) Difficult de dterminer le point partir duquel ce bien-tre devient mdiocre de faon inacceptable

Ethique = Rflexion volutive, pluridisciplinaire, pluraliste, qui ne prtend pas luniversalit et qui vise tablir un quilibre aussi harmonieux que possible entre le progrs des sciences et des techniques et la place de lhomme (et de lanimal) dans la socit (Huriet)

EXPERIMENTATION ANIMALE ET ETHIQUE REGLE DES 3 R

Russel & Burch (1959) Principles of humane experimental technique
REPLACEMENT, REDUCTION, REFINEMENT Remplacement : remplacer les espces sensibles par des espces non sensibles ou par des modles non vivants

Rduction : Si le remplacement nest pas possible, limiter lutilisation danimaux aux expriences essentielles. De mme, rduire le nombre danimaux au minimum (tenir compte de la variabilit du critre mesur et lcart escompt entre tmoins et traits). Pour rduire encore plus : -Choisir les tmoins de sorte accentuer leffet dun traitement
-Rduire la variabilit en choisissant des animaux homognes (consanguins ou animal utilis comme son propre tmoin) -Rpter les expriences sur de petits chantillons significativit -Tests unilatraux plutt que bilatraux pour voir un effet positif

EXPERIMENTATION ANIMALE ET ETHIQUE REGLE DES 3 R

Raffinement : il correspond la rduction de la souffrance animale. Donc lutilisation danesthsiques et danalgsiques est indispensable pour toute intervention douloureuse.
- Choix dun seuil darrt de lexprimentation

- Observation de pathologies spontanes, plutt que provoques

- Etude de situations aigus, plutt que chroniques - Utilisation de mthodes dinvestigation non invasives et de techniques de contention douces (imagerie, tlmtrie,)

La rgle des 3R a reu un large consensus et a t adopte par plusieurs institutions comme :

- Conseil canadien de protection des animaux

- Dpartement amricain de lagriculture - Base de la rglementation europenne

REGLEMENTATION EUROPEENNE
- Dfinit un cadre juridique pour lutilisation danimaux des fins scientifiques - Dispositions bases sur la rgle des 3 R (Russel et Burch, 1959) : Remplacement, rduction, raffinement - Obligation de rsultats - Mthodes pour les atteindre non prcises

-> Mise en place de comits dans une majorit de pays europens :

Comits sur lexprimentation animale

Comits sur les procdures Comits dvaluation Comits dthique

Originalit franaise

En 1990 a t cr le Groupe de Rflexion Interprofessionnel sur les Comits dEthique applique lexprimentation animale (GRICE) qui est une manation du GIRCOR (Groupe Interprofessionnel de Rflexion et de Communication sur la Recherche) En 1992 a t publie une Charte de Comit dthique. Propose aux directions dentreprises qui souhaitaient y adhrer et qui sengageaient moralement la mettre en application. La plupart des entreprises utilisant des animaux ont adhr.

BILAN
- La dmarche va au-del de la lgislation et permet son application - Implication trs marque de la direction des entreprises - Sparation scientifique / thique = charte de protection animale et non de dfense dintrts professionnels - Dialogue au sein de lentreprise - Amlioration de la qualit thique (sous-traitance) et de la qualit scientifique

- Facilitation du dialogue avec les associations de protection animale.

- Mise en place dune concertation au niveau national (Grice) entre membres de comits dthique avec extension progressive tous les domaines de la recherche prive .. publique ?

Les organismes publics de recherche

Jusquen 2001 :
- Cration des bureaux dexprimentation animale : INSERM, CNRS, INRA - Cration de "Comits dthique applique lexprimentation animale " dans certaines rgions (Toulouse, Clermont-ferrand,) - Rflexion au sein des Universits : journe du 21 janvier 1999 : structure intermdiaire entre le chercheur et la Direction de la recherche Pourquoi avoir pris du retard, en particulier dans les universits ? - administration difficult de faire des rformes - chercheurs - corps enseignant HDR - confidentialit des recherches Mais les choses ont boug car : GRICE, public, associations, exprimentateurs eux-mmes, tudiants, pression internationale En 2001, les grands organismes : INSERM, CNRS, INRA, CEA, ont dcid de mettre en place des CEAEA en y associant les universits Charte

CHARTE pour une ETHIQUE de l EXPERIMENTATION ANIMALE

Article 1 : de la ncessit de lexprimentation animale Les ncessits de la recherche biologique, mdicale, ou vtrinaire, et les limites actuelles des mthodes alternatives, rendent incontournable le recours l'exprimentation animale pour faire progresser les connaissances , amliorer le diagnostic et le traitement des maladies, et dune manire gnrale prserver la sant. Article 2 : de la sensibilit et de la souffrance chez les animaux Les animaux sont des tres sensibles et pourvus de capacits cognitives et motionnelles. Ils sont capables de souffrir. Lexprimentateur a le devoir de sassurer que leur sant et leur bientre ne sont pas inutilement menacs. La prvention de toute souffrance inutile sera son premier souci.

CHARTE pour une ETHIQUE de l EXPERIMENTATION ANIMALE

Article 3 : de la qualification de lexprimentateur Les connaissances scientifiques et techniques sont en progression constante. Lexprimentateur doit veiller entretenir et tendre ses propres comptences et celles de ses collaborateurs. Il doit tre mme de garantir la mise en uvre des techniques les mieux adaptes la ralisation de ses objectifs scientifiques dans le respect des besoins physiologiques et comportementaux des espces animales utilises. Article 4 : de la responsabilit de lexprimentateur Exprimenter sur des animaux est un acte de responsabilit personnelle. Lexprimentateur sengage se conformer en tous points aux exigences lgales et rglementaires en vigueur. Lexprimentateur a aussi une responsabilit morale vis vis des animaux qu'il utilise des fins scientifiques. Il lui appartient donc de tout mettre en uvre pour fonder lthique de sa dmarche, notamment quant la lgitimit de lobjet de la recherche et la pertinence des mthodes envisages pour la conduire, et pour sassurer dune probabilit raisonnable que ses tudes conduisent lacquisition de connaissances nouvelles.

CHARTE pour une ETHIQUE de l EXPERIMENTATION ANIMALE

Article 5 : de lutilit dune dlibration thique Lexprimentateur ne peut tre seul juge de la lgitimit thique de ses propres travaux lorsquils mettent en cause ses rapports avec des tres vivants. La communaut scientifique dans son ensemble prouve galement le besoin denrichir sa rflexion sur ce qui est tolrable et ce qui ne l'est pas, appelant ainsi la cration de comits dthique spcifiques.
Article 6 : du rle de Comits dthique en exprimentation animale Ces comits apprcient la compatibilit entre les protocoles exprimentaux proposs et les principes thiques, afin daider lexprimentateur dans sa dmarche lorsque le recours lanimal simpose. Ils ont pour objet de constituer une garantie complmentaire, pour la socit dans son ensemble, du respect de la vie animale et du bien fond de la demande scientifique.

20 Comits rgionaux dthique applique lexprimentation animale

14 en province Creea "Nice-Cte d'Azur" Creea "Strasbourg" Creea "Languedoc-Roussillon" Creea "Normandie" Creea "Provence" Creea "Midi-Pyrnes" Creea "Rhne-Alpes" Creea "Aquitaine - Poitou-charentes" Creea "Nord - Pas-de-Calais" Creea "Nancy-Lorraine - Nord-est" Creea "Bretagne et Pays-de-la-Loire " Creea "Centre-Auvergne-Limousin "

- Creea "Bretagne" - Creea "Pays-de-la-Loire" - Creea "Centre Limousin" - Creea "Auvergne"

Comits rgionaux dthique applique lexprimentation animale

6 en Ile-de-France - Creea "Paris-Comit 1" - Creea "Paris-Ren Descartes" - Creea "Paris-Comit 3" - Creea "Paris-Comit 4" - Creea "Paris-Comit 5"

- Creea "Ile-de-france Sud"

Comit rgional dthique applique lexprimentation animale - "Paris-Ren Descartes " cr en 2002
COMPOSITION : 13 membres
- Reprsentants INSERM - GAREL Marie-Claude (Hmatologiste) - LEVI-STRAUSS Matthieu (Immunologiste) - STADLER Nicolas (Transgense)

- Reprsentants CNRS

- ARRANG Jean-Michel (Neurophysiologiste) - LE HUEN Agns (Immunologiste) - ZYTNICKI Daniel (douleur) Reprsentants UP5 - CLOT Jean-Pierre (Pharmacie, physiologiste) - SARNACKI Sabine (Necker, chirurgien) - SOUBRANE Olivier (Cochin, chirurgien) Vtrinaire - DANGLES Virginie (MCU Immunologie) Expert en animalerie - PAUCHARD Michle (Cochin) Reprsentants de la socit civile - GOLDBERG Jacques (Sociologue) - SIMOND Michel-Pierre (Sciences humaines)

INTRODUCTION

- Mthodes alternatives / substitutives - Remplacement relatif / absolu - Mthodes complmentaires - Techniques in vitro modles cellulaires, cellules souches, tissus humains - Test abiotiques - Mthodes in silico et banques de donnes

1. APPROCHES CELLULAIRES IN VITRO

LES DIFFERENTS MODELES - Les cultures organotypiques : tranches dorgane (Alexis carel)

- Les cultures primaires

- Les lignes cellulaires : cancreuses, immortalises (trsfection P SV40) Problme : Perte de ltat diffrenci Solutions : - Matrice extracellulaire (collagnes, fibronectine,)

- Contacts et changes inter-cellulaires

- Rle de la polarit cellulaire culture tridimensionnelle

1. APPROCHES CELLULAIRES IN VITRO

1.1. Toxicologie : - Cytotoxicit in vitro - Toxicit aigu in vitro DL50 1.2. Hpatotoxicit in vitro ou mtabolisme 1.3. Etude de labsorption intestinale in vitro : - sac intestinal vers

- cellules de la ligne Caco-2

1.4. Clairance rnale in vitro : tranches, cellules 1.5. Modles plus complexes : - Epithlium des voies respiratoires - Epithlium cutan 1.6. Cellules souches 1.7. Rceptologie

1. APPROCHES CELLULAIRES IN VITRO

1.1. Toxicologie : - Cytotoxicit in vitro screening prcoce xnobiotique entre mtabolisme ineraction cibles effets - Ncrose Apoptose Expression de gnes de dfense - Viabilit : nbre C, atteintes membranaires (LDH), colorants vitaux, intgrit mitochondriale (MTT), - Relation effet dose classement des molcules - Toxicit aigu in vitro DL50 DL-50 in vivo - Test de Halle (ligne de C endothliales daorte de veau) - bonne corrlation entre lIC50 (concentration inhibant 50% la croissance des cellules) et la DL50.

1. APPROCHES CELLULAIRES IN VITRO

1.2. Hpatologie : toxicit mtabolisme utilisation de tissu humain Outils : Foie isol perfus Tranches (250m ; 2j) Hpatocytes isols : Suspension (2-4h) Culture primaire (j-sem) phnotype instable peu de divisions Lignes gnotype instable - Ddiffrenciation donc immobilisation, alginate, co-cultures Utilisation Pharmacotoxicologie : Donnes cintiques Prdiction dinteractions mdicamenteuses caractrisation de lsions hpatiques Comparaison in vitro in vivo diffrences quantitatives Utilisation dhpatocytes animaux comme pralable aux tudes toxicologiques in vivo sur une espce donne.

Problmes : - grande variabilit et diffrences inter-espces

1. APPROCHES CELLULAIRES IN VITRO

1.3. Etude de labsorption intestinale in vitro : - sac intestinal vers

O2

Intrt : - Simplicit - Puissance statistique - Absorption locale

1. APPROCHES CELLULAIRES IN VITRO

1.3. Etude de labsorption intestinale in vitro : - cellules Caco-2 (adnocarcinome de colon humain)

Pole apical Filtre Pole basal

Bonne corrlation avec le niveau dabsorption intestinale chez lhomme Bien adapte pour valuer la diffusion passive

1. APPROCHES CELLULAIRES IN VITRO

1.4. Clairance rnale in vitro : tranches, cellules

- Tranches de cortex rnal : permettent dvaluer la scrtion tubulaire par mesure de labsorption dune molcule

- Modles cellulaires exemple : LLC-PK1 = modle de cellules de tube contourn proximal de rein culture sur filtre

1. APPROCHES CELLULAIRES IN VITRO

1.6. Modles plus complexes : muqueuse des voies respiratoires - Epithlium des voies respiratoires humaines (biopsie, dchet opratoire) - Epithlium complexe rle de barrire capital - Reconstitution in vitro : dissociation mise en culture sur filtre puis enlvement du milieu -> interface air / liquide Ce modle permet les tudes de pntration, de diffrenciation, ainsi que les processus de rparation tissulaire (diffrenciation pidermode) tude des pathologies

1. APPROCHES CELLULAIRES IN VITRO

1.6. Modles plus complexes : Epithlium de la membrane cutane

Biopsie

Isolement et culture

Prparation dun derme d-pidermis

Ensemencement

Tolrance cutane Absorption percutane Emersion 10j

Immersion 4 j

Prolifration horizontale

Diffrenciation verticale

1. APPROCHES CELLULAIRES IN VITRO

1.7. Cellules souches utilisables pour les mthodes in vitro, mais aussi pour la thrapie cellulaire 2 types : embryonnaire - adulte Cellules souches embryonnaires : 3 types ( Toti ou pluri-potentes ) - les cellules ES qui proviennent du blastocyste (embryonic stem) - les cellules EG qui proviennent du ftus pour embryonic germ cells - les cellules EC issues d'un tratocarcinome (embryonal carcinome)
- C ES cultives sur une matrice approprie et dans des conditions bien dfinies, elles se diffrencieront en diffrents types cellulaires

- C EG : selon le feuillet. Ex msoderme -> adipoblaste, myoblaste, ostoblaste, chondroblaste,

Cellule souche adulte. Dans tous les tissus de l'organisme. Origine ? Quel est
le signal qui induit la diffrenciation des cellules en un tissu donn ? Existe-t-il un seul type de cellule souche adulte ?

1. APPROCHES CELLULAIRES IN VITRO

1.7. Rceptologie Sont en prsence dans le tube : Membranes plasmiques comportant le rcepteur Radioligand ( concentration fixe) Ligand tester ( diverses concentrations)
Bound, % of control

100

Ligand non affin : Pas de comptition

50

IC50 :ligands plus affins moins affins

0 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

log[Ligand], M

Informations donnes sur un ligand

Affinit Spcificit
Etre sr quil sagit bien dune interaction au niveau du rcepteur dintrt

Slectivit
Evaluer sur d autres types de rcepteurs, une affinit ventuelle du ligand :

Etudes sur tissus : Limites

Nombre d animaux ncessaire Manque de spcificit (htrognit des rcepteurs en prsence) Etudes fonctionnelles trs difficiles Faible rendement de criblage car pas de miniaturisation possible : Nombre rduit de composs tests

Obtention des lignes exprimant les rcepteurs clons

Clonage du gne codant pour le rcepteur par ex.humain Vecteur dexpression Transfection dans une ligne cellulaire (capable de se multiplier) Slection dune ligne stable Intgration dans leur gnome de lADN codant pour le rcepteur Production en masse Expriences : radioliaison et tests fonctionnels (sur membranes ou cellules) en plaque multi-puits.

Avantages lignes cellulaires vs tissus animaux

Pas besoin danimaux Accs aux rcepteurs humains Rcepteurs produits en grande quantit 1 seul rcepteur dintrt (spcificit) Vrifier laffinit dun compos sur d autres rcepteurs (slectivit) Permet les tudes fonctionnelles des composs Miniaturisation-Robotisation Permet de tester un trs grand nombre de composs

2. Bioinformatique Structurale et Drug Design

Connaissance du gne Dtermination de la protine
Cristallisation (rayons X) ou RMN ou Cristallisation (RMN) impossible

Drug Design Criblage

Modlisation partir de protines similaires

Amlioration
Cycles doptimisation

Cocristallisation, RMN Modlisation, criblage Chimie

Premire srie de composs

Tests biochimiques

Meilleur candidat

BASES DE DONNEES
L'exprimentation virtuelle en recherche pharmaceutique

- Systmes de knowledge management : apprendre de ce qui a dj t fait. - Faute de sciences pour rellement faire de la prdiction, voyons si ce qui a t fait dans les 30 ou 40 dernires annes ne va pas nous apprendre dj suffisamment : - Cration de bases de donnes qui concentrent l'information en particulier sur les rcepteurs coupls aux protines G (environ 12 000 publications). Cela reprsente 80 000 100 000 molcules testes. Il y a normment d'information publie inexploite, parce que mal structure. - Lidal serait de crer au niveau de l'Europe une base de donnes sur laquelle figureraient toutes les rfrences concernant telle et telle manipulation faite sur l'animal. - Rsultats ngatifs

LES AVANTAGES Point de vue scientifique :

-rduction du niveau de complexit des phnomnes biologiques observs in vivo -amliore la description des actions pharmacotoxicologiques et permet didentifier plus aisment des cibles -tudier plus facilement les interactions mdicamenteuses

AVANTAGES ET LIMITES DES MODELES IN VITRO

LES LIMITES Point de vue scientifique :

-simplification des systmes biologiques, mme pour lorgane isol -utilisation de milieux de culture encore mal dfinis - problme de la ddiffrenciation

-permet le criblage pharmacologique et toxicologique permettant de dvelopper de nouvelles molcules sur la base des relations structure activit
-travailler avec des systmes biologiques drivs danimaux gntiquement modifis mimant des pathologies humaines - disposer de mthodes permettant de raliser simultanment un grand nombre de conditions exprimentales diffrentes, De mettre profit les dchets opratoires humains

Point de vue conomique : Point de vue conomique :

-rduire la dure du dveloppement dune substance - rejeter des molcules toxiques le plus tt possible -Le cot : seuls les grands groupes peuvent les dvelopper - Risque de rejet de molcules trouves toxiques in vitro et qui ne le seraient pas in vivo ou inversement

LES AVANTAGES

LES LIMITES Point de vue thique :

Point de vue thique :

- augmenter la vitesse danalyse et donc raccourcir le dure de dveloppement pour des mdicaments trs attendus - rduire le recours lanimal de laboratoire

-Rejet de substances intressantes -Utilisation exclusive des mthodes in vitro pour valuer efficacit ou toxicit pose un problme dthique et de scurit -Emploi dorganes et de cellules dorigine humaine pose des problmes : contamination possible par divers agents pathognes scurit sanitaire - Certaines mthodes in vitro ne permettent pas de saffranchir du recours lanimal