Laboratoire de Cytogénétique et Biologie de

la Reproduction
CHU Farhat Hached Sousse

TEST DE SÉLECTION ET SURVIE DES

SPERMATOZOÏDES ET TECHNIQUES
D’AMP

Dr IBALA-ROMDHANE
samira

ESSTS 2019/2020
TESTS DE SÉLECTION ET SURVIE DES
SPERMATOZOÏDES

Le traitement de l'infertilité masculine passe

souvent par des techniques d'amélioration du
sperme au laboratoire ou tests de sélection des
spzs « tests de migration et survie »
I. OBJECTIF
 Mimer in vitro les étapes de
filtration/sélection des spzs dans le
tractus génital féminin
 Eliminationdu plasma séminal contenant
des facteurs décapacitants (Protéines,
Cholestérol, Zinc…)

Capacitation

 Augmentation de la fluidité membranaire

 Apparition des récepteurs spermatiques

spécifiques de la fixation à la ZP

 Modification de la mobilité du spz qui

devient hyperactif
LE TRAITEMENT DU SPERME EFFECTUÉ DANS
DES LABORATOIRES SPÉCIALISÉS ET AGRÉES
DOIT:

 Sélectionner des spzs mobiles à

morphologie normale aptes à féconder

 Éliminer le plasma séminal

 Éliminer les débris cellulaires, les

leucocytes et les spzs morts (DAO)

 Éliminer les agents infectieux

 Amorcer la capacitation indispensable à

l’aptitude de féconder un ovocyte
II. INDICATIONS

 Tests réalisés en cas de

spermogramme pathologique en
prévision d’une technique d'AMP
(IIU, FIV ou ICSI)
Permettent d’apprécier le comportement des
spzs dans les milieux de culture destinés à
l’AMP.

Assurent une sélection des spzs selon des

critères comme la vitalité, la mobilité et la
morphologie

Renseignent le biologiste sur le nombre, la

mobilité et la morphologie des spzs
disponibles avant AMP
III. TECHNIQUES
Les techniques utilisées sont
multiples à visé diagnostique ou
thérapeutique

Le choix va dépendre des

caractéristiques initiales du
sperme
Sélection par migration
ascendante (Swim-Up)

Sélection sur gradient de

densité
A. CONDITIONS PRÉ ANALYTIQUES
Respect d’une abstinence sexuelle
3-5 jours

Conditions d’aseptie strictes

(lavage des mains, de la verge et
du gland)

Prélèvement par masturbation dans

un respectable stérile adapté

Récupération du prélèvement et
information sur les problèmes
rencontrés

Mise à l’étuve à 37°C pour

liquéfaction
Techniques effectuées de façon stérile sous
hotte à flux laminaire, avec gants et matériel à
usage unique.

B. SÉLECTION PAR MIGRATION

ASCENDANTE « SWIM-UP »
Les spzs préalablement débarrassés du
plasma séminal par lavage, migrent à
partir du fond du tube dans une couche
de milieu de culture.

Sélection active mettant en jeu la

mobilité flagellaire des spzs
A partir d’un culot de spzs
Analyse de la fraction sélectionnée:
 Volume
 Concentration des spzs
 Vitalité
 Mobilité
 Spermocytogramme

Survie des spermatozoïdes (17 à 24h)

 Mobilité et vitalité
 AVANTAGES INCONVENIANTS

 Peu onéreuse facile à  Faible rendement de

réaliser. sélection en nombre
 Sélection de spzs de spzs
mobiles progressifs  Dommages des DAO
 Sélection de spzs à et de la
morphologie normale centrifugation
surtout concernant
l’acrosome
Utilisé surtout sur de
bons spermes avec
bonne concentration
initiale de spzs
Bonne sélection
qualitative mobiles.
 C. SÉLECTION PAR GRADIENT DE
DENSITÉ

Sélectionner les spzs en fonction de leur

densité qui dépend principalement du
compartiment céphalique contenant le
noyau
Superposition de couches à différentes
concentrations de billes de silice solides
recouvertes de silane en solution dans un
milieu de culture

(45%)

(90%)

le nombre et le volume des couches varient

selon la technique envisagée et les
caractéristiques du sperme à traiter
Sélection sur gradient de densité
Analyse de la fraction sélectionnée:
 Volume
 Concentration des spzs
 Vitalité
 Mobilité
 Spermocytogramme

Survie des spermatozoïdes (17 à 24h)

 Mobilité et vitalité
 AVANTAGES INCONVENIANTS

 Concentration des spzs les  Technique onéreuse et

plus mobiles avec les demande plus de temps
meilleures caractéristiques
morphologiques  Moins bonne sélection
 Elimine le plasma séminal, qualitative que le swim-
les leucocytes, les spzs up
morts ou à morphologie
altérée retenus dans les
couches supérieures

Utilisable dans les OAT

Moins de stress oxydatif
pour les spz sélectionnés
 Swim Up Gradient de
densité
Sélection +/- -/+
(% de spz mobiles/
% de spzs typiques)
Rendement Sperme Nl: 21 % 44%
(Nbre de spzs OA: 5% 18 %
mobiles) Sperme congelé: 12 % 40%

Stress oxydatif + -
Pouvoir taux sup de
fécondation et de
fécondant grossesse/transfert
en FIV
D. PRÉPARATIONS PARTICULIÈRES
 Présence d’anticorps anti-spzs:
Recueil du sperme dans un milieu de culture et
centrifugation suivie d’un gradient de densité

 Éjaculation rétrograde:
Alcaliniser les urines avant le recueil du sperme

Lavage-centrifugation des urines recueillies dans un milieu

de culture

Reprise du culot et centrifugation sur gradient de densité

 Sperme hypervisqueux:

Diluer le sperme puis l'aspirer et le refouler plusieurs fois

à l'aide d'une pipette Pasteur.

L’utilisation d’enzyme est à proscrire car non dénué

d'innocuité pour les spzs:

• Action mal contrôlée sur des protéines membranaires

Spermatiques

• Origine le plus souvent animale pose un problème de

sécurité microbiologique
 Spermatozoïdes prélevés chirurgicalement:

 Epididymaire (MESA) Microchirurgical

Epididymal Sperm Aspiration:
Sélection sur gradient de densité

Testiculaire (TESE) Testicular Sperm

Extraction:

Méthode mécanique
Méthode enzymatique (collagénase)
 Sperme cryoconservé:
Débarrasser le sperme des milieux
cryoprotecteurs et restaurer la mobilité des
gamètes (chute de la mobilité 50 %)

Décongeler la paillette par chauffage à la main

Sélection par gradient de densité

 Sperme akinétique:
La mobilité spermatique reste le seule
paramètre qui permet d’avoir la
certitude de la vitalité

Test de gonflement
Stimulants chimiques hypo-osmotique
Pentoxifylline (HOST test)
Caféine?
2-desoxyadénosine?
Bicarbonate
PAF
 Sperme à risque viral (HIV, VHB, VHC):
Le but de la technique est d’obtenir des spzs
mobiles non infectés, séparés du plasma
séminal et des leucocytes

Sélection sur gradient de densité à plusieurs

couches, ensuite le culot est lavé et soumis à
une migration ascendante

Diminution de la charge virale du

sperme (< 200 copies) dans plus de
90% des échantillons testés
Pour le HIV :

Une partie de la fraction finale sera utilisée pour

la validation virologique (l’ADN proviral ou
l’ARN) nécessitant selon les tests de 0.5 à 2 x
106 spzs.

Le restant sera congelé dans des paillettes haute

sécurité, en attendant les résultats virologiques
et l’utilisation en AMP.
Pour le VHC :

La préparation de sperme élimine toute présence

détectable d’ARN VHC dans les spzs

Pour le VHB :

Il n’est pas démontré que les techniques de

traitement de sperme élimine toute particule virale
des spzs
IV. ORIENTATION
THÉRAPEUTIQUE EN AMP

La décision sera donc prise en

fonction:

 Nombre total de spzs mobiles

recueillis

 Pourcentage de formes typiques

 Selon le nombre de spzs mobiles
progressifs sélectionnés

n≥ 1x106 0.5x106 <n<1x106 0.2x106 <n<0.5x106 ≤ 0.2x106

FIV FIV en ICSI

IIU classique microgouttes

Si % de spzs atypiques très élevé : IMSI

Intra Morphologically Sperm Injection
LES TECHNIQUES D’AMP
Faciliter la procréation, en court-
circuitant les obstacles à la
fécondation naturelle par rapport
sexuel

Traitement du sperme in vitro

Stimulation ou induction de
l'ovulation
I. IAC/IIU: INSÉMINATION AVEC SPERME
DU CONJOINT

La plus ancienne des techniques d’AMP:

IIC insémination intracervicale
IIU insémination intrautérine

A. Principe

Déposer du sperme préalablement préparé au

laboratoire dans la cavité utérine le jour de
l’ovulation
B. Indications
 Indications masculines
• Déficits spermatiques:
Anomalies de la qualité du sperme (Faible volume, OAT
ou anticorps antispermatozoides)

• Problèmes d'éjaculation (éjaculation précoce, ou

éjaculation rétrograde)

 Indications féminines
Anomalie du col de l'utérus ou de la glaire cervicale
mais il faut des trompes perméables

 Stérilité inexpliquée.
C. Bilan préalable
 chez l’homme:
• Spermogramme/
Spermogramme/spermocytogramme
spermocytogramme
• Spermoculture
• TMS

 chez la femme:
• TPC
• Réserve ovarienne: Bilan hormonal (FSH, LH, E2)
CFA
• HSG

 chez le couple:
Sérologie virale: Hépatite B,C,HIV, Syphilis,
chlamydiae
 D. Technique:
1. Stimulation ovarienne paucifolliculaire
• La stimulation des ovaires va permettre de
maîtriser et d’améliorer l’ovulation.

• Injections quotidiennes intra-musculaires ou sous-

cutanées de FSH recombinante (Gonal F ou de
Puregon) du 3ème ou 5ème jour du cycle.
• Surveillance de la stimulation vers 10ème jour du
cycle:
-Echographie: compter les follicules et évaluer
l’épaisseur de l’endomètre
-Dosage hormonal
(estradiol et LH)
 2. Déclenchement de l’ovulation:
Lorsque la maturation folliculaire est suffisante (2-
3 follicules d’au moins 18 mm)

injection de hCG recombinante, 36 h après

l’ovulation se produit.
3. Recueil et préparation du sperme:
Le jour de l’IAC par masturbation et après 3 à 5 jours
d’abstinence

La réalisation d’une IAC nécessite au moins

1x106 de spzs progressifs rapides concentrés
dans un volume de O,3 ml de milieu pour avoir
une réelle efficacité en terme de grossesse.
 4. Technique d’insémination:
Injection lente de la préparation de sperme aspirée
dans un cathéter d’insémination couplé à une
seringue

Aucun traitement n’est nécessaire après l’insémination

E. Résultat:

Taux de grossesse de 10 à 15 % par cycle

Taux varie en fonction de:

• Etiologie de la stérilité : cervicale , idiopathique
ou masculine
• Age de la femme: Age Taux de grossesse
F. Inconvénients et avantages:

 Simple, indolore, sans hospitalisation

Peut être répétée plusieurs fois (4x)

 Cout devenue élevé

Risque de grossesse multiple
Pas de preuve de fécondation, sauf si grossesse

G. Complication :
Grossesse multiple +++++++
Rarement : HSO, Allergie, thromboses
veineuses…..
II. FIVC: FÉCONDATION IN VITRO
CLASSIQUE

A. Principe

Reproduire au laboratoire la fécondation et les

premières étapes du développement
embryonnaire.
B. Indications
 Indications féminines+++++
Stérilité tubaire définitive (trompes obturées et
inopérables, des lésions tubaires plurifocales, une
absence de trompes, une salpingectomie)

 Indications masculines OAT

 Autres:
Stérilité inexpliquée
Echecs des IAC
C. Bilan préalable
 D. Technique:
1. Stimulation ovarienne (FSH recombinante)
poly-ovulation afin d’obtenir le maximum
d’ovocytes matures et donc le maximum
d’embryons
Protocoles standards de la stimulation ovarienne
2. Monitorage :
Echographie: nombre et taille des follicules et épaisseur
de l’endomètre
Hormonal (estradiol, LH)

3. Déclenchement de l’ovulation (hCG

recombinante)
4. Ponction folliculaire par échographie
transvaginale (36h après déclenchement)
5. Recherche des ovocytes dans le liquide
folliculaire à la loupe binoculaire

Les complexes cumulo-ovocytaires sont isolés du

liquide folliculaire, mis dans un milieu de culture
adapté et conservés dans une étuve à 37°C et 5° de
CO2 à l’abri de la lumière.
6. Préparation du sperme du conjoint
Le jour de la ponction ovocytaire

7. Insémination des ovocytes:

En puits
Quatre ovocytes peuvent être traités par puits
Environ 100.000 spermatozoïdes préparés par puits.
En microgouttes
Un ovocyte par microgoutte de milieu de culture
(20µl) Seulement 3 000 spzs mobiles sont inséminés
par goutte

Remise des boites en culture à 37° dans

l'obscurité en présence de 5% de CO2, de 5%
d'O2 et de 90% de N2.
La fécondation est vérifiée 17 à 20 H après
l'insémination.
Ovocytes fécondés: deux PN et deux GP
8. Transfert embryonnaire
a. Transfert précoce
Le ou les embryons à quatre ou huit cellules sont
transférés dans l'utérus à J2, J3 à l'aide d'un
cathéter à travers le canal cervical sous contrôle
échographique
J1 J2 J3 J4
b. Culture prolongée : transfert au stade de
blastocystes
But:
• Améliorer le taux d’implantation (x2 / J2-J3)

• Identifier et d’éliminer les embryons ayant

une anomalie de segmentation

• Réaliser un transfert approprié plus

physiologique
Indications de la culture prolongée
• Obtention de grossesses uniques
• Echecs répétés de transfert à J2
• Analyse de l’aptitude au développement des
embryons
• Congélation des embryons surnuméraires

Pour avoir une bonne chance de transférer un

blastocyste à J5 ou J6, il faut obtenir au minimum
3 embryons à 8 cellules à J3
9. Devenir des embryons surnuméraires
Congélation ou cryoconservation
La congélation permet de maintenir les embryons
dans un état de vie suspendue, dans un froid
profond et pour une durée en principe illimitée

Le principe de la congélation repose sur le passage

de l’eau intra et extra cellulaire de l’état de phase
liquide à l’état solide en utilisant des
cryoprotecteurs

a. Congélation lente:
• L’embryon est plongé dans des bains successifs
contenant le cryoprotecteur et du sucrose à des
concentrations différentes et faible (sortie d’eau et
rentrée du cryoprotecteur)
• L’embryon est placé dans une paillette en plastique dans
un volume de 0,3 ml

• On abaisse progressivement leur température

(0.3°C/min), jusqu'à -196°C, dans un appareil automatique,
et selon des critères très stricts. Ils sont stockés à cette
température dans l'azote liquide.
b. Vitrification :
Le principe repose sur le passage de l’eau intra et
extra cellulaire de l’état de phase liquide à l’état
solide en utilisant des concentrations élevées de
cryoprotecteurs avec rapidité de refroidissement

Nette amélioration de la survie des embryons

congelés par cette méthode lorsque comparée à la
CL

la vitrification embryonnaire est une

amélioration technique de la
congélation lente
 c. Décongélation:

Les embryons, réchauffés, sont incubés dans un milieu de

culture de façon à éliminer la solution cryoprotectrice ; ils
sont ensuite transférés in utéro au cours d’un cycle
légèrement stimulé.
 E. Résultat:
les chances de grossesse sont de l'ordre de
25 % par cycle stimulé de FIV

Les chances de succès d’une FIV sont en fait

très variables:

• Nombre et qualité d’embryons transférés

• Age de la femme
• Etiologies de la stérilité
F. Risques et complications:

•Syndrome d’hyperstimulation ovarienne

•Accidents thrombotiques

•Grossesses gémellaires

•Fausses couches spontanées

III. ICSI : INTRACYTOPLASMIC
SPERM INJECTION

A. Principe

Micro-injecter un seul spermatozoïde dans le

cytoplasme ovocytaire
B. Indications

 Indications masculines:+++++
OAT extrême ou azoospermies

 Indications féminines:
Anomalies de la zones pellucide

 Autres:
Echec de FIVc
Technique:

 Stimulation ovarienne et déclenchement de l’ovulation

 Recueil et traitement du sperme le jour de la ponction

 Ponction folliculaire, Recherche, lavage et

décoronisation des ovocytes
 Micro-injection proprement dite
Capture du spz avec la pipette
d’injection.

Maintenir l’ovocyte II pour que

le GP soit à 6h ou 12h.

Injection du spz.
La culture se déroule à 37° dans l'obscurité en présence
de 5% de CO2, de 5% d'O2 et de 90% de N2.

Transfert embryonnaire J2-J3 ou J5-J6

25 à 30% de chance de grossesse par

tentative
IMSI: INTRACYTOPLASMIC MORPHOLOGYCALLY
SELECTED SPERM INJECTION
Cette technologie, quoique actuellement
très lourde semblerait améliorer les
résultats après plusieurs tentatives
d'ICSI sans succès ou en cas d’anomalies
morphologiques importantes dans le
sperme.
CONCLUSION
Pour un patient infécond, la réalisation d'un test
mimant la sélection physiologique des spz
présente

 Un intérêt diagnostique lorsqu'une

anomalie est détectée lors du
spermogramme (OAT)

 Une importance capitale en

thérapeutique permettant de disposer de
la fraction des spzs optimales nécessaires
à l'AMP
Le traitement sur gradient de densité
reste la meilleure méthode et la plus
efficace concernant le rendement de la
sélection de spzs mobiles et à bonne
morphologie dans le cas des spermes
pathologiques
 Merci pour
votre attention