MANNAI Sana, ABDOU MOHAMED Amel, BENMEHIRISSE Heddi, DOUAIR Iskander &

BIO Mathieu.

Groupe 2 : Immunologie

Introduction :
Nous avons observé une vidéo qui nous montrait un
phénomène qui faisait réagir des cellules B et T (Lymphocytes :
cellules immunitaires). Le LT était coloré en bleu, ce qui nous a
permis de le reconnaître. Une fois l'entrée en contact avec la
cellule B, il y a eu changement de couleur (Bleu → Vert/Jaune)
donc forcement il y a eu un autre phénomène qui s'est produit à
ce moment là. Dans notre cas, on sait que c'est l'entrée de
Calcium dans la cellule T qui change sa couleur. On veut donc
étudier les conséquences sur la vie de la cellule T.

Problématique :
Comment mettre en évidence les conséquences du contact
du LB sur les LT : Prolifération, différenciation, sécrétion d'une
protéine ?

Test proposé pour quantifier des cellules :

Turbidimétrie : Lorsque des cellules sont en suspension
dans un milieu liquide traversé par un faisceau lumineux
monochromatique, la quantité de lumière absorbée et
dispersée par la suspension dépend de la concentration des
cellules et de leur taille. La relation entre absorbance et
concentration en cellules est linéaire dans une gamme de
concentrations couvrant environ un ordre de grandeur.
Si on connaît la droite représentant l'absorbance de la
suspension en fonction de la concentration en cellules, il suffit
de mesurer l'absorbance d'une suspension de concentration
inconnue pour déterminer graphiquement le nombre de cellules
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qu'elle contient.
En partant d'une suspension contenant un nombre de
cellules connu, on peut aisément construire cette droite,
appelée droite étalon. Pour cela, on réalise une gamme de
dilutions déterminée de la suspension connue et l'absorbance
de chaque dilution est mesurée avec un spectrophotomètre. La
droite Absorbance = f (concentration en cellules) est alors
construite.
Pour déterminer la concentration en cellules d'une suspension
de concentration inconnue, on mesure l'absorbance d'un
échantillon, après dilution si nécessaire, et on reporte la valeur
obtenue sur la droite d'étalonnage pour en déduire sa
concentration.
Pour connaître la concentration en cellules de la suspension
servant à construire la droite d'étalonnage on la détermine au
préalable avec une lame à numération (cellule de Malassez ou
lame à numération jetable).
La numération sur lame peut aussi être utilisée directement sur
des échantillons prélevés aux moments voulus.

Principe d'immunofluorescence : C'est un principe

d'immunomarquage qui consiste à révéler une protéine
spécifique sur une coupe de tissu. Le principe est d’utiliser un
anticorps spécifique à la protéine recherchée, afin qu’il puisse
s’y fixer. D’un autre côté, on couple ce même anticorps à un
fluorochrome, pour nous permettre de le détecter au
microscope à épifluorescence. La méthode peut également
inclure un deuxième anticorps, qui sera spécifique du premier,
et qui portera dans ce cas le fluorochrome. Ce dernier est excité
grâce à un faisceau lumineux ne laissant passer que les
longueurs d'ondes capables d'exciter. Une fois le fluorochrome
excité, il émet de la fluorescence plus grande que la longueur
d'onde d'excitation.
Protocole : Gamme étalon; à l'aide de concentrations
connues, établir une courbe. Sur 8 puits, introduire une
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concentration différente en cascade de L T spécifique connue en

les activant à l'aide d'une stimulation L B/LT en plus du Calcium.
Les LT possèdent un épitope auquel on va fixer un anticorps
muni d'un fluorochrome qui est capable, après excitation,
d'émettre de la fluorescence. Pour l'exciter on utilise une
longueur d'onde spécifique. A l'aide des résultats trouvés, on
effectue une courbe. Même protocole pour le milieu à tester. En
fonction de la fluorescence trouvée en déduire la quantité de
cellules.

Cytométrie : Elle consiste à évaluer le nombre de cellules

dans un milieu, on fait passer dans un tuyau transparent notre
milieu à tester. Une lumière monochromatique va être coupée
par le milieu. Un spectrophotomètre va récupérer la lumière a
chaque longueur d'onde précisant une cellule fluorescente,
incrémente (de même pour la turbidimétrie).
Autre protocole : Principe de lame Kova ; sur une plaque,
introduire et étaler notre milieu de cellules, faire une moyenne
des cellules dans chaque case, multiplier par X et Y (longueur
et largeur).

On pourrait se servir du principe d'immunofluorescence pour

rendre nos cellules fluorescentes pour la cytométrie.

Suite à ces différents protocoles, et à la sortie à Luminy nous en

avons sélectionné un, qui consiste tout d'abord à déclencher la
sécrétion d'interleukines et la division des LT 8 ; puis une autre
partie qui consiste à quantifier le nombre de cellule avant et
après division : Quantification par principe de fluorescence
(colorimétrie – comme Élisa).
Dans un premier temps, on place dans une boîte de pétrie des
LT4 avec des antigènes. Après un certain temps, nous
récupèrerons le surnageant qui contiendra des interleukines.
Dans un second temps, on prendra trois types de cellules ; des
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LB, des LT8 et des cellules X, on injectera a chacune d'elles un

produit coloré. Suite à la coloration, on mesurera le nombre de
cellule à l'aide d'un spectrophotomètre. Pour finir, on
récupèrera les manipulations faites précédemment et on place
dans le même milieu les interleukines, enfin nous effectuerons
une dernière mesure au spectrophotomètre qui nous
déterminera le nombre de cellule final.
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