UE 3.

05 - Biologie cellulaire des eucaryotes

Fiches techniques

Préparations pour l’observation en microscopie .......................................................................... 2

Microscopie optique ..................................................................................................................... 3
Microscopie confocale .................................................................................................................. 4
Microscopie électronique à transmission ..................................................................................... 5
Microscopie électronique à balayage ........................................................................................... 6
Immunomarquage – détection en microscopie ............................................................................ 7
Purification de molécules par HPLC............................................................................................. 9
Electrophorèse de protéines sur gel d’acrylamide SDS-PAGE .................................................. 10
Western Blot ou Immunoblot ou immunoempreinte ................................................................... 11
Électrophorèse d’ARN en conditions dénaturantes sur gel d’agarose ....................................... 12
Northern Blot .............................................................................................................................. 13
Fiche synthétique des techniques d’analyse des acides nucléiques et des protéines : Southern
blot, Northern blot, Western blot................................................................................................. 14
Réaction de PCR........................................................................................................................ 15
Fiche synthétique sur les techniques d'analyse de l'expression des gènes............................... 17
Plantes transgéniques / mutants ................................................................................................ 18
Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux ...................................................................... 20
Fusion de gènes pour l’expression de protéines recombinantes fluorescentes synthétisées par
les cellules .................................................................................................................................. 22
Méthode d’évaluation de la toxicité cellulaire : Test MTT........................................................... 23
Méthode d’évaluation de la migration cellulaire : Test de blessure ............................................ 24
Méthode d’évaluation de l’invasion cellulaire : Chambre de Boyden/Test Transwell avec matrice
extracellulaire ............................................................................................................................. 25

Équipe pédagogique

Biologie végétale Biologie animale

Dany Afif Hélène Dumond

Mireille Cabané Sandra Kuntz
Linda De Bont Sabine Mazerbourg
Noémie Thomas

2023-2024
 Technique Préparations pour l’observation en microscopie
Les observations microscopiques (microscope optique ou électronique)
But
réalisées en biologie cellulaire nécessitent la réalisation de préparations.
• Préparations extemporanées : cellules fraîches, non fixées, (ex :
cellules végétales ou buccales) avec ou sans coloration puis
montage entre lame et lamelle.
• Frottis cellulaires : prélèvement de cellules, fixation (ex : éthanol,
formol), coloration (ex : bleu de méthylène, hématoxyline) et
montage.
Principe • Coupes histologiques : prélèvement de tissu, fixation (ex : formol,
glutaraldéhyde), déshydratation, imprégnation (paraffine ou résine),
coupes (microtome ou ultramicrotome), réhydratation et coloration
(ex : hématoxyline ou sels de métaux lourds) et montage.
• Cultures de cellules en monocouche : culture cellulaire avec ou sans
fixation (ex : méthanol, éthanol), avec ou sans coloration, avec ou
sans montage.

Préparation extemporanée de feuille d’élodée Frottis sanguin observé au

Exemple observée au microscope optique (pas de microscope optique (fixation éthanol,
coloration). coloration May-Grünwald).

Coupe de peau humaine observée au

microscope optique (coloration hématoxyline et
éosine).

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 2/25

 Technique Microscopie optique
Observation à l’échelle tissulaire de l’organisation des différents types
But de cellules. Mise en évidence de certaines structures cellulaires par
l’utilisation de colorants spécifiques
• Utilise les longueurs d’ondes de la lumière blanche (visible). La
lumière ne traversera pas les structures denses ou épaisses.
Différence de contraste.
• Utilisation de colorants spécifiques pour mettre en évidence des
structures contenant des carbohydrates (sucres), phénols, lipides,
protéines…
Principe • Utilisation de fluorochromes (microscope optique à fluorescence)
se liant à certaines molécules de la cellule. Le fluorochrome après
excitation à une longueur d’onde spécifique émet de la lumière à
une autre longueur d’onde spécifique.
• Immuno-fluorescence (voir le principe par ailleurs) utilise des
anticorps spécifiques de certaines molécules et couplés à un
fluorochrome. Plus spécifiques que les 2 précédentes.

Coupe transversale de tige de fève, Cuticule observée dans une coupe

coloration au carmino-vert. transversale de tige de gui, sans
Planta (2008) 228:1–13 coloration

Exemple

Observation en microscopie à
fluorescence des cellules de fibres du
phloème de tige de chanvre. Mise en
évidence de la cellulose par le
fluorochrome calcofluor (A), ou
localisation d’une protéine pariétale
AGP par immuno-fluorescence en
utilisant un anticorps anti-AGP LM2 (B).
(d’après Blake et al. 2008, 228 :1-13, Planta)

A B
Avantage Préparation rapide (à l'exception de l'immuno-fluorescence, p.7)
Limite Faible résolution, localisation large

Fig. 4 ImmunoXuorescence detection of arabinogalactan-protein
(AGP) and extensin glycoprotein epitopes in relation of hemp phloem
Wbre cells. Top row Equivalent sections of young stem immunolabelled
with anti-AGP probes LM2, JIM14 and MAC207, extensin probe
JIM20 and CalcoXuor (blue) to show all cells. LM2 and JIM14 bound
speciWcally to developing Wbre cells. JIM20 did not bind to developing
Wbre cells or associated parenchyma or collenchyma cells. Arrows
Techniques de Biologie
indicate distalcellulaire UE 3.05
edge of band of developing Wbres. Bottom row Equiva-
lent sections of mature stem showing Wbres immunol
same set of probes. LM2 bound to all cell walls and we
ondary cell walls of Wbres (arrowhead) whereas JIM1
cortical parenchyma was speciWcally to Wbres and MA
tially bound to parenchyma cell walls and only weak
JIM20 bound to parenchyma cell walls but not to Wbr
mis, cl collenchyma, pf primary Wbre, sf secondary Wbr
cell, x xylem. Bars, 100 !m 3/25
 Technique Microscopie confocale
Permet de réaliser des observations précises à l’échelle tissulaire /
cellulaire à différents plans de profondeur de l’échantillon ; possibilité
But de réaliser une représentation en 3D. Les observations peuvent être
réalisées sur des tissus / cellules vivants donc des observations
dynamiques.
Cette technique utilise un balayage de rayon laser contrairement à la
microscopie optique classique qui utilise la lumière blanche. De plus,
Principe ce type de microscopie focalise l’observation sur un plan précis de
l’échantillon (voir le schéma ci-dessous)

Exemple

Microtubules du fuseau mitotique d’une cellule observée en

microscopie optique à fluorescence classique (a) et en microscopie
confocale (b). La microscopie confocale montre une meilleure
résolution des microtubules

Avantage Plus précise que la microscopie optique à fluorescence et visualisation

en 3D
Limite Échelle tissulaire jusqu’à la limite cellulaire

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 4/25

 Technique Microscopie électronique à transmission
Observation à l’échelle cellulaire de l’ultrastructure. Possibilité de
But localiser précisément certaines molécules dans les ultrastructures
(immuno-gold, voir p.7)
• L’objet est traité avec des sels de métaux lourds qui vont plus
ou moins s’associer aux structures de la cellule selon leur
hydrophilie. Il est soumis, sous vide, à un champ d’électrons.
Les ultrastructures cellulaires qui sont denses (liées aux métaux
lourds) stoppent la trajectoire des électrons ; ainsi, ces
Principe
ultrastructures apparaissent sur les clichés en une nuance du
gris au noir.
• Immuno-gold (voir p.7) utilise des anticorps spécifiques couplés
à une particule d’or. Localisation précise de la molécule d’intérêt
dans l’ultrastructure.

Exemple

A B
Structure du noyau en microscopie électronique à transmission (A) ou microscopie
optique (B). Les deux images sont à la même échelle. Noter la résolution en
microscopie électronique qui permet de distinguer nettement l’enveloppe nucléaire
(flèche rouge)
Avantage Fort pouvoir de résolution (0.2nm), localisation fine, ultrastructure 2D
Limite Préparation longue

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 5/25

 Technique Microscopie électronique à balayage
But Observation de la surface / structure des cellules
• L’objet est traité avec des sels de métaux lourds qui vont plus
ou moins s’associer aux structures de la cellule. Il est balayé par
Principe un faisceau d’électrons. Les électrons réfléchis par l’objet sont
détectés par des capteurs pour reconstituer un cliché en relief
(3D) de l’échantillon.

Exemple

Organisation de la paroi des cellules Cils vibratiles des cellules ciliées

de fibres de bois chez 2 lignées de de l'épithélium trachéal de porc
peuplier

Avantage Fort pouvoir de résolution, structure 3D

Limite Préparation longue et complexe

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 6/25

 Technique Immunomarquage – détection en microscopie
Permet la localisation, par microscopie, des molécules d’intérêt
But exprimées par une cellule (protéine ou autres antigènes) à l’aide
d’anticorps spécifiques de ces molécules d’intérêt
• Immunohistochimie : permet de détecter des protéines (ou autres
antigènes) dans des sections de tissus.
• Immunocytochimie : permet de détecter des protéines (ou d’autres
antigènes) au sein d’une ou plusieurs cellules

La mise en évidence des complexes antigènes/anticorps peut se faire

de plusieurs façon :
- Anticorps couplé à un fluorochrome (Immuno-fluorescence) qui
émettra une lumière après avoir été excité par une longueur
d’onde particulière. Les molécules fluorescentes permettent la
visualisation de la distribution de la molécule d’intéret dans
l’échantillon grâce à un microscope optique à fluorescence (voir
ci-dessus).
- Anticorps conjugué à une enzyme qui catalyse une réaction
permettant la production d’un précipité coloré visible avec un
microscope optique (voir ci-dessus).
- Anticorps couplé à des microparticules d’or (Immuno-gold). Il
permet de suivre la localisation d’une molécule d’intérêt grâce à
Principe - Schéma un microscope électronique.

Il existe 2 méthodes de détection.

• Méthode directe : le marqueur (enzyme, fluorochrome ou
microparticule d’or) est directement couplé à un anticorps primaire.
• Méthode indirecte : Utilisation de 2 types d’anticorps. Les
anticorps primaires vont se lier à l’antigène/la molécule cible. Les
anticorps secondaires, couplés à un marqueur et dirigés contre la partie
constante de l’anticorps primaire, vont se lier à l’anticorps primaire

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 7/25

 Exemple

Cellules épithéliales marquées avec des anticorps anti-

tubuline (microtubules en vert), à la phalloidine (filaments
d’actine en rouge) et au DAPI (noyau en bleu)

Avantage Localisation précise des molécules :

• Échelle tissulaire / cellulaire (immuno-fluorescence ou révélation
enzymatique)
• Échelle cellulaire / ultrastructurale (immuno-gold)
Limite Qualité / spécificité des anticorps primaires

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 8/25

 Technique
But
e active wall extract from growing cucum-
uce extension of walls from the basal
(Figure 1A). Evidently, during maturation
ally modified so
Principe - Schéma
that it is not susceptible
aterial. Perhaps peroxidativecross-linking
proteins such as extensin (Smith et al.,
arner, 1988) is involved in this loss of
Purification de molécules par HPLC
La chromatographie en phase liquide à haute performance est une
technique d’analyse pour séparer les constituants d’un mélange.
Les molécules à séparer sont entrainées par un liquide que l’on
appelle phase mobile. Elles vont interagir (ou ne pas interagir) avec
un support fixe que l’on appelle phase stationnaire (support fixe). Le
flux de phase mobile étant continu, c’est le temps de rétention plus
ou moins long des différentes molécules sur la phase stationnaire
(colonne) qui va les séparer les unes des autres.
Suivant les molécules à isoler, elles peuvent être séparées en fonction
de leur taille (chromatographie par exclusion de taille), de leur charge
Wall Extension Proteins
(chromatographie échangeuses d’ions),1427
de leur affinité pour un métal
(chromatographie d’affinité) par exemple.
extension activity, we looked for sbergistic or combinatorial
Principe de l’HPLC
effects of different fractions (modifié d’après
by combining Shimadzu.com)
all C3 fractions to-
gether and all sulfopropyl fractions together and assaying for
wall extension activity. The d e n s i o n activites of these
combined fractions were only those expected from the addi-
tive contributionsof the active C3, S1, and S2 fractions identified
above.

A
1s Effective with Walls from 1.5

y showed an interesting pattern of spe- 1.0

e 1B shows that the cucumber wall extract
-
O
(o
lls of various dicot seedlings (pea, rad- N

d tomato) and on monocots of the 3

U 0.5
n and zephyr lily). In contrast, the extract
effect on the coleoptile wall of gramina-
ize and barley). Because graminaceous
ffer from those of dicots by having less
oline-rich glycoprotein, and also by hav- Exemple de chromatogramme obtenu par HPLC
hemicellulose (McNeil et al., 1984; Fry,
he active fraction extracted from cucum- B
th one or more of these components to
may also be that these grass cell walls
necessarily covalently) in a manner that
ne to the cucumber extract. In contrast, -E
ryllidaceae have a cell wall composition C 0.015-
O
s than to the Gramineae (Redgwell and m
N
nd this may explain their susceptibility ;o.olo-
ived activity. Exemple a
0.005-

on Yields Two Proteins with 0.000-

Activity
O , ( I I I I I I I
i
I 1 b I I 1 1
I

xtract was separated by ammonium sul- O 10 20 30 40

Retention Time (min)
owed by sequential HPLC, as shown in
hydrophobic interactions column, where
Fractionnement par HPLC de l’extrait de protéines pariétales (trait continu, AU
Figure 2. Fractionation of Extension-lnducingCucumber Wall Extracts
vity (designated as the C3 fraction) was 280nm)
by HPLC. et activité sur l’extensibilité de la paroi cellulaire (Activity % h-1) de chaque
ing a cation exchange column from which fraction
(A) Ammonium sulfate precipitates of salt-extracted cucumber wall ex-
Avantage
d as two distinct peaks. These fractions Analyse
tracts rapideand loaded onto a C3 hydrophobicinteractions
were resuspended
Limite
and S2 with respect to their order of elu- column.• Proteins
Faible were pouvoir de séparation
eluted in a descending gradient (0.113des molécules
to O g/mL)
s an analysis of the active fractions by of ammonium sulfate in 50 mM sodium acetate, pH 4.5. Fractions were
aled a major band with a relative molecu- • and
desalted Sélectivité limitée à laactivity
checked for extension-inducing phase stationnaire
with inactivated
ssociated with S1, while S2 contained a cucumber walls, as described in Figure 1. Activity was calculated as
Active extracts have also been separated increase in extension rate divided by the length of the specimen (units,
/ per hr) and is shown as a broken line. Absorbance (AU) at 280 nm
OO
by liquid chromatography with hydrox-
is shown by a solid lhe.
n media, and DEAE anion exchangers,
(B) Active fractions from (A) were concentrated and desalted into 15
nsistently associatedwith these two bands mM Mes, pH 6.5, and loaded onto a sulfopropyl(SP) cation exchange
e S1 fraction required onlyde
Techniques 0.3Biologie
to 1.0 pg cellulaire
columnUE 3.05 with the same buffer. Proteins were eluted with
equilibrated 9/25
tute extension rates similar to that of na- an ascending gradient of NaCl (O to 1 M) in this buffer. Extension-
eas the S2 fraction required 1.0 to 2.0 pg. inducing activity (broken line, calculated as given in [A]) of fractions
 Technique Electrophorèse de protéines sur gel d’acrylamide SDS-
PAGE
But Séparer des protéines selon leur taille dans un gel sous l’influence d’un
champ électrique.
Principe - Schéma

(source : adapté de Molecularstation.com)

Une extraction de protéines est réalisée. L'ajout de SDS (un détergent anionique fort)
empêche leur repliement (dénaturation) tout en leur conférant une charge nette
négative.
L’échantillon protéique est déposé sur un gel de polyacrylamide et le courant
électrique est appliqué. Plus la concentration en acrylamide est importante, plus les
pores du gel seront petits et plus les molécules seront freinées dans le gel.
La séparation des protéines se fera selon leur masse moléculaire. Les protéines
ayant une petite masse moléculaire, seront moins retenues dans les mailles du gel
de polyacrylamide et migreront plus vite que les protéines de forte masse
moléculaire.
Suite à la migration des protéines dans le gel : une coloration au bleu de Coomassie
peut ensuite être réalisée afin de les visualiser et quantifier.
Exemple Exemple de gel d’électrophorèse coloré au bleu de Coomassie

Source:
Hsuan-Yu Huang & Yi-Sheng Cheng 2019. Plant Methods volume 15, Article number: 80 (2019).
Heterologous overexpression, purification and functional analysis of plant cellulose synthase from green
bamboo.
Avantage séparation rapide d'un mélange protéique
Limite • Technique semi-quantitative, pouvoir de séparation limité
• Dénaturation de l’échantillon

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 10/25

 Technique Western Blot ou Immunoblot ou immunoempreinte
Identifier la présence d’une protéine spécifique dans un extrait
But
cellulaire protéique à l’aide d’anticorps et la quantifier
Les protéines sont séparées par électrophorèse, transférées sur une
membrane sur laquelle des anticorps spécifiques de la protéine cible
sont appliqués puis détectés.

Principe du Western blot (source : bio-rad-antibodies.com)

Principe - Schéma

Préparation des échantillons protéiques

Migration sur gel d’électrophorèse
Transfert des protéines du gel vers la
membrane
Blocage des sites non spécifiques d’accrochage
des anticorps sur la membrane
Ajout d’anticorps primaires reconnaissant
spécifiquement la protéine d’intérêt
Lavage
Liaison protéine spécifique-
Ajout d’anticorps secondaires reconnaissant
anticorps primaire-anticorps
l’anticorps primaire
secondaire marqué
Lavage
Détection
Exemple de résultat obtenu par Western Blot :

Exemple

Western blot utilisant des anticorps anti-expansine (kDa= kiloDalton ; M =

marqueur de taille)
Avantage cibler et quantifier une protéine spécifique
Limite • Méthode de diagnostic indirecte : interprétation parfois délicate
(analyse semi-quatitative).
• Risque de réactions croisées dues à la plus ou moins grande
spécificité de l’anticorps primaire

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 11/25

 Électrophorèse d’ARN en conditions dénaturantes sur
Technique gel d’agarose
Séparer les ARN selon leur taille dans un gel sous l'influence d'un
But
champ électrique.
Les ARN totaux sont extraits à partir des différents échantillons. Un gel d'agarose est
préparé contenant des agents dénaturants pour les ARN (empêche les repliements)
afin qu'ils migrent selon leur taille et non selon conformation. Chaque extrait est
déposé dans un puits et subit une migration dans le gel sous l'effet du champ
électrique puisque les ARN sont chargés négativement.

Principe - Schéma

Les ARN totaux migrent dans un gel Après électrophorèse, l'ARN peut
d’agarose, sous l’influence d’un être visualisé à l'aide de bromure
champ électrique, permettant ainsi d'éthidium, qui, lorsqu'il est intercalé
leur séparation. dans l'ARN, est fluorescent sous une
Lorsque le courant électrique est lumière ultraviolette.
appliqué :
- les grosses molécules se déplacent
plus lentement à travers le gel,
- les petites molécules migrent plus
rapidement.
remarque: L'électrophorèse à partir d'un extrait total d’ARN en gel d'agarose
permet de juger de son intégrité. L'ARN est très fragile, c'est un test très utile
pour valider des échantillons ARN
Exemple de gel d’électrophorèse d’ARN totaux (source : thermofisher.com)

Exemple
ARN totaux dégradés (Degraded)
ARN totaux intacts (Intact)
28S, 18S : ARN ribosomiques
Source : https://www.thermofisher.com/

Avantage séparation selon la taille

Limite Technique qualitative

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 12/25

 Technique Northern Blot
Méthode permettant de détecter un ARN spécifique (correspondant à
But
une séquence particulière) et de le quantifier
Principe du Northern blot (modifié à partir de :supagro.fr)

Principe - Schéma

Les étapes :
1- Extraction des ARN
2- Séparation des ARN par électrophorèse selon leur taille
3- Transfert des ARN sur membrane
4- Hybridation des ARN avec une sonde spécifique (séquence
complémentaire) de(s) l' ARN (s) à révéler
5- Visualisation de la sonde marquée sur la membrane

Remarque 1 : Afin de comparer le niveau de transcrits d’intérêts entre différents

extraits, un Northern blot avec une sonde s’hybridant sur un gène de ménage (dont les
transcrits ne varient pas) est réalisée. Ce contrôle permet de vérifier que la variation
observée n’est pas due à une variation de la quantité d'ARN total déposé dans chaque
puits mais due à une variation du taux de transcrit du gène d’intérêt.
Remarque 2 : Le niveau de transcription d’un gène peut également être étudié avec
d’autres méthodes plus sensibles (techniques plus récentes):
- La RT-PCR semi-quantitative
- La PCR quantitative (qPCR) ou PCR en temps réel
Remarque 3 : Une technique similaire utilisant de l'ADN digéré par une enzyme de
restriction s'appelle Southern blot (du nom de Mr Southern qui a mis au point la
technique au départ, voir feuille suivante)
Exemple de résultat obtenu par Northern blot

Exemple

Expression du gene FaExp2 (expansine 2) chez le fraisier cultivé à l’air ambiant ou

enrichi en ethylène. (Civello et al., 1999,12 : 1273-1279, Plant physiology)
Avantage détecter un ARN spécifique
Limite • Technique semi-quantitative
• Sensibilité limitée

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 13/25

 Fiche synthétique des techniques d’analyse des acides nucléiques et des
protéines :
Southern blot, Northern blot, Western blot

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 14/25

 Technique Réaction de PCR
La PCR est une technique qui permet d'amplifier (de multiplier) en très
grande quantité (109 fois), à partir de quantités très faibles, un fragment
But
d'ADN (ADN cible) dont la séquence est comprise entre deux séquences
connues.
Le mélange d'ADN qui contient l'ADN cible est incubé avec des amorces (petite séquence
d'ADN simple brin) de séquence connue, des dNTPs (désoxyribonucléotides), la Taq
polymerase (ADN polymerase extraite de Thermophilus aquaticus) qui conserve son
activité jusqu'à 98°C et fonctionne à 72°C.
Plusieurs cycles de températures vont permettre d'amplifier le fragment d'ADN cible
délimité par les séquences correspondantes aux amorces.
Un cycle de PCR se décompose en trois étapes :
Dénaturation : les deux brins d'ADN sont séparés par chauffage (95 °C)
Hybridation : en abaissant la température (50-70 °C), les amorces viennent
s'hybrider sur la séquence complémentaire des brins d’ADN
Élongation : la Taq polymérase (fonctionne à 72°C), complète la synthèse du brin
d'ADN à partir de l'amorce grâce aux dNTPs présents dans le milieu de réaction. La Taq
polymerase résiste à 95°C ce qui permet d'enchainer avec un autre cycle en conservant
l'activité enzymatique de la Taq polymerase.
Les cycles peuvent être répétés jusqu'à 40 fois.
Un thermocycleur, permet d'automatiser la réaction PCR en programmant des cycles
consécutifs de montée et de baisse de température.

Principe -
Schéma

Source: By Enzoklop - Own work, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=96042657

Le produit de PCR est ensuite quantifié et/ou visualisé après migration sur gel
d'électrophorèse. La quantification est semi-quantitative (quantification dans une gamme
réduite).
De nombreuses variantes existent. Une des plus fréquentes est la RT-PCR (Reverse
Transcriptase PCR) qui part d'un extrait d'ARNs qui sont traités par la transcriptase
reverse afin de synthétiser l'ADN simple brin complémentaire. Ces ADNs subiront ensuite
la PCR. Cette technique permet de quantifier les ARN correspondants à une séquence
spécifique dans un mélange d'ARN, souvent des transcrits d'un gène particulier
(alternative au Northern blot).
Avec quelques modifications et un appareillage adapté la technique peut devenir
quantitative (quantification sur une large gamme). Cette technique est appelée PCR
quantitative ou PCR en temps réel. Elle est très largement utilisée.

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 15/25

 Exemple de gel d’électrophorèse de produits de PCR (source : By Roland Deschain at
en.wikipedia - Own workTransferred from en.wikipedia, Public Domain,
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=17271079)

1 2 3 4 5 6 7 8
Électrophorèse sur gel d'agarose de
produits de PCR issus de différents
tissus: tissu 1 (piste 1et 2), tissu 2
(piste 3 et 4) et tissu 3 (piste 5 et 6).
Exemple 2 lots d'amorces ont été utilisés pour
amplifier la séquence cible donnant
des produits de taille différente. Un
contrôle positif d'amplification (piste
7) et un marqueur de taille (piste 8)
ont été utilisés

Avantage
Détection de quantités très faibles, amplification de séquences spécifiques
Quantitatif dans le cas de la PCR en temps réel
Très rapide

Limite
Technique semi-quantitative dans le cas de la PCR classique

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 16/25

Fiche synthétique sur les techniques d'analyse de l'expression des gènes

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 17/25

 Technique Plantes transgéniques / mutants
But Modifier l'expression des gènes pour étudier leur fonction in vivo
(gène/protéine associée)
Principe - Schéma Une plante transgénique est une plante dans laquelle on a ajouté une
séquence d'ADN (par transgénèse ou transformation génétique) dans
son génome. La séquence ajoutée est appelée le transgène.
Les mutants sont des individus dans lesquels un (ou plusieurs gènes)
ont été modifiés par mutagénèse. La plupart des mutants sont des
mutants nuls c'est à dire qu'il y a inactivation du gène.
Principe de la transgénèse

Selon la nature du transgène, différentes stratégies peuvent être élaborées qui aboutissent à:
l'expression d'un nouveau gène
la surexpression d'un gène (expression plus forte d'un gène déjà présent dans le
génome)
la sous-expression ou inactivation d'un gène (exple: stratégie antisens)

Principe de la mutagénèse

L'observation du phénotype et des analyses variées (dosages,

observations microscopiques, mesures physiologiques....) sont ensuite
réalisées pour caractériser les plants.
Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 18/25
 Exemple Exemple de phénotype d'une plante transgénique

Plant de tabac transgénique (B3) avec une construction antisens pour un gène
impliqué dans la synthèse de lignine comparé à un plant de tabac non transformé
(CT)
Source:
Piquemal J, Lapierre C, Myton K, O'Connell A, Schuch W, Grima-Pettenati J, Boudet A-M. 1998. Down-
regulation of cinnamoyl-CoA reductase induces significant changes of lignin profiles in transgenic tobacco
plants. Plant Journal 13: 71-83.
Avantage analyse in vivo de la fonction d'un gène / protéine
Limite • phénotype peut être complexe et une conséquence indirecte de
la modification
• nécessite de nombreuses analyses

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 19/25

 Technique Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux
But Identifier dans une population non synchrone, les cellules en fonction de
leur stade dans le cycle cellulaire (G0/G1, S, G2/M)
Principe - Schéma Le cytomètre en flux permet de faire défiler des cellules à grande vitesse
dans le faisceau d'un laser et d’analyser plusieurs paramètres dans une
même cellule. Il permet la quantification de paramètres physiques et de
la fluorescence (si ajout de marqueurs fluorescents). Dans le cas de
l’étude du cycle cellulaire, il s’agit de quantifier, dans une population non
synchrone, le pourcentage de cellules pour chacun des stades du cycle
cellulaire (G0/G1, S, G2/M).

Dans le cas d’un marquage fluorescent de l’ADN grâce à la molécule des noyaux (ex :
iodure de propidium (= agent intercalant de l’ADN), le cytomètre permet de quantifier =
molécule fluorescente intercalant de l’ADN) la quantité d’ADN dans chaque cellule, cette
quantité double pendant la phase S (Synthèse) de préparation de la mitose.

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 20/25

 Exemple Répartition des cellules d’une population dans les différentes phases du cycle :
Histogramme (pic) rouge : distribution du nombre de cellules possédant une quantité 2N
(ou Q) d’ADN (donc en phase
G0/G1) ; histogramme bleu : :
distribution du nombre de cellules
possédant une quantité 2N à 4N
(ou Q-2Q) d’ADN (donc en phase
S) ; histogramme (pic) vert :
distribution du nombre de cellules
possédant une quantité 4N (ou 2Q)
d’ADN (donc en phase G2) ;
histogramme rose : distribution du
nombre de cellules possédant une
quantité supérieur à 4N (ou 2Q)
d’ADN (donc quantité anormale
d’ADN) ; histogramme orange :
distribution du nombre de cellules
possédant une quantité inférieur à
2N (ou Q) d’ADN dû à la
fragmentation de l’ADN, il s’agit de
cellules mortes, on parle de
compartiment sub-G1)

Avantage Analyse quantitative, sensibilité de détection, rapidité, analyse

multiparamétrique cellule par cellule
Limite Les cellules doivent être impérativement mises en suspension. Leur
nombre pour envisager une analyse doit être de quelques dizaines de
milliers au minimum. Chaque cellule n'étant analysée qu'à un unique
instant donné, on ne peut faire de véritable étude cinétique portant sur
une même cellule.

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 21/25

 Technique Fusion de gènes pour l’expression de protéines
recombinantes fluorescentes synthétisées par les
cellules
But Suivre, en temps réel, le niveau d’expression, la localisation d’une
protéine et sa dynamique.
Principe - Schéma La GFP (green fluorescent protein) garde sa fluorescence in vivo et in
vitro quand elle est fusionnée à une autre protéine. La séquence
nucléotidique codant la GFP peut en effet être mise en phase à la suite
d’un gène codant la protéine d’intérêt au sein d’une construction (telle un
plasmide) obtenue par manipulation de l’ADN in vitro. Cette séquence
codante, munie des signaux appropriés, est introduite (transfection ou
transgénèse) dans une cellule au sein de laquelle elle s’exprime
normalement en produisant une protéine-chimère. Il est alors possible
d’observer au microscope à fluorescence, dans des cellules vivantes, la
localisation de la protéine X-GFP ainsi synthétisée.

Plusieurs variants de la GFP ont été obtenus par modification de la

séquence primaire de la protéine (grâce au génie génétique), de façon à
diversifier la longueur d’onde d’émission : la CFP fluoresce en cyan, la
YFP en jaune, etc.

Exemple

Ex : Imagerie temps-réelle de Tat-EGFP (Tat: Trans-activator of Transcription, protéine

du VIH) dans les endosomes de cellules vivantes.
La figure montre l'imagerie time-lapse de localisation de fluorescence de Tat86- EGFP
(fluorescence verte) et de la transferrine-TRITC (fluorescence rouge). Les images
confocales ont été prises toutes les 10 s.
Les endosomes représentatifs sont indiqués par des flèches blanches.

Avantage Suivi de protéines en temps réel sur cellules vivantes

Limite Efficacité de transfection (ou transgénèse) dépend du gène rapporteur
et des lignées cellulaires.

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 22/25

 Technique Méthode d’évaluation de la toxicité cellulaire : Test MTT
But Mesurer l’activité métabolique des cellules qui reflète leur capacité de
survie.
Principe - Schéma Le principe du test MTT est basé sur l'activité mitochondriale de la
succinate déshydrogénase. Pour les cellules viables, l'activité
mitochondriale est constante et ainsi une augmentation ou une diminution
du nombre de cellules viables est linéairement liée à l'activité
mitochondriale. L'activité mitochondriale est évaluée par la conversion du
sel de tétrazolium (MTT) en cristaux de formazan qui une fois solubilisés
donnent une coloration violette.. Ainsi, toute augmentation ou diminution
du nombre de cellules viables peut être détectée en mesurant la
concentration de formazan par spectrophotométrie en utilisant un lecteur
de plaques à 540 nm.

Exemple

Evaluation de la cytotoxicité d’un agent de chimiothérapie (Cisplatine) sur 2 lignées de

glioblastome (U87 et U251) par un test MTT. Le pourcentage de cellule viables a été
mesuré par absorbance à 540 nm.

Avantage Rapidité et facilité du test

Limite Sensibilité ; basé sur l’activité métabolique des mitochondries (parfois des
cellules viables peuvent avoir une activité métabolique réduite par un agent de
traitement)

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 23/25

 Technique Méthode d’évaluation de la migration cellulaire : Test de
blessure
But Etudier la migration d’une population de cellules. Permet de comparer la
migration entre les cellules traitées avec des composés inhibiteurs ou
stimulateurs.
Principe - Schéma Une « lésion » est créée dans une monocouche confluente de cellules se
développant dans une microplaque soit manuellement en grattant le tapis
cellulaire, soit en utilisant des microplaques spéciales fournissant une
zone sans cellules, uniforme et reproductible. La migration est observée
au cours du temps à l’aide de la lumière transmise ou de la fluorescence
compatible avec les cellules vivantes. On peut ainsi quantifier la vitesse
moyenne de déplacement d’un groupe de cellules.

Exemple

Effets de molécules sur la migration de cellules cancéreuses par un test de blessure. La molécule 2 inhibe la
migration des cellules.
Avantage Test facile à mettre en place. Possibilité de temps-réel.
Limite Si lésion manuelle : manque de reproductibilité de la blessure +
dommages aux cellules

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 24/25

 Technique Méthode d’évaluation de l’invasion cellulaire : Chambre
de Boyden/Test Transwell avec matrice extracellulaire
But Etudier l’invasion d’une population de cellules. Permet de comparer
l’invasion des cellules traitées avec des composés inhibiteurs ou
stimulateurs.
Principe - Schéma La chambre de Boyden /Test Transwell est un outil qui permet d’étudier
l’invasion cellulaire. Elle consiste en un insert de culture cylindrique
niché au sein d’un puit de plaque de culture cellulaire. L’insert contient
une membrane avec une taille de pores définie, la face supérieure de la
membrane étant revêtue du gel de composition variable mimant la
composition de la matrice extracellulaire.
Les cellules sont ensemencées dans l’insert. Les cellules capables de
dégrader la matrice extracellulaire et de migrer passent à travers les
pores et peuvent être colorées puis quantifiées grâce à un lecteur de
plaque.

Exemple

La molécule 1 inhibe l'invasion des cellules de cancer du sein.L'invasion des cellules MDA-MB-231 a été
détectée à l'aide de Matrigel au fond des chambres Transwell/Boyden après traitement avec le DMSO seul
(contrôle) ou avec différentes concentrations dela molécule 1 pendant 24 h. Les cellules invasives ont été
examinées au microscope optique (grossissement, x200). Les données sont présentées sous forme de
moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes. *P<0,05, **P<0,01 par rapport aux cellules
témoins.
.
Avantage Facile à mettre en place.
Limite Choix de la matrice extracellulaire. Pas de temps réel

Techniques de Biologie cellulaire UE 3.05 25/25