TUTORAT SANTÉ RÉUNION

UE1B ET UE1F FICHE SUR L’IMAGERIE

DES STRUCTURES CELLULAIRES
Pr. KREJBICH P.

SUZANNE Flora Année 2022/2023

FONTALIRANT Sara Semaine

TutoratSantéRéunion_Université de la Réunion_REPRODUCTION INTERDITE

 FICHE MÉMO SUR L’IMAGERIE DES STRUCTURES CELLULAIRES

LA MICROSCOPIE OPTIQUE

● composé de lentilles de verre.

● les sujets d'études sont observés grâce à un faisceau de photon, contrairement à
la microscopie électronique qui utilise un faisceau d'électron.
● grossissement x1000 max, soit une limite de résolution d'environ 0,1 micromètre
(=100nm).
● emprunte le même mode de fonctionnement qu'une caméra ou un appareil photo.
● permet l’observation de cellules et organismes vivants.

● Préparation:
- fixation
- inclusion en paraffine
- coupe au microtome (e= 1 à 10µm) = lame de verre
- requiert bien souvent une coloration/traitement préalable pour contraster
les éléments à étudier.

(!) Attention microscopie optique ne veut pas forcément dire image en couleur, par
exemple la microscopie optique à fond noir, la microscopie DIC (contraste d’interférence
différentielle) ou encore la microscopie à contraste de phase peuvent être en noir et blanc.

Origine du faisceau de photon:

- Dans un microscope optique classique la lumière provient du dessous comme ceci

:
 - Pour un microscope optique inversé la lumière provient du dessus, ce qui est utile
pour l’étude des cultures bactériennes :

LA MO À FLUORESCENCE

-Microscopie à épi-fluorescence:

“épi” car éclairage de l’échantillon par le

dessus. L’échantillon est marqué par un
ou des fluorochromes qui sont des
molécules ayant la propriété de pouvoir
être excitées par des longueurs d’ondes
précises et émettant par la suite une
lumière fluorescente visible à une
longueur d’onde plus grande.

Protiste en épi-fluorescence
https://canadiannaturephotographer.com/epifluorescencemicroscopy.html

-Microscopie confocal:

permet de s’affranchir du flou lié à l’épaisseur d’un

échantillon (donc cela permet de conserver l’intégrité
des échantillons). Ici la source lumineuse est un laser
se concentrant sur un point précis de l’échantillon ce qui
permet d’éliminer les interférences dans l’image finale.

Fibroblaste en microscopie confocale

https://fr.dreamstime.com/photo-stock-microscopie-confocal-des-cellules-fibroblaste-image75502640
-L’expression in situ: cette technique repose sur le génie génétique, les chercheurs
introduisent par transfection des constructions génomiques dans les cellules étudiées.

Ces constructions génomiques sont issues de gènes d'intérêt, par exemple le gène
codant pour la GFP, protéine fluorescente verte, qui après son ajout facilitera la
visualisation de la protéine modifiée génétiquement.

Chat génétiquement modifié

https://ici.radio-canada.ca/ohdio/premiere/emissions/le-15-18/segments/entrevue/29917/modification-genetique-animaux-do
mestiques-chats-chiens

-L’hybridation in situ (ISH/HIS):

L’hybridation in situ sert à mettre en évidence du matériel génétique grâce à l’utilisation de
sondes oligonucléotidiques complémentaires de segments d’intérêt.

Lorsque cette technique utilise des sondes couplées à des fluorochromes, on parle de
FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) qui permet grâce aux fluorochromes de révéler
des parties précises de chromosomes.

Exemple d’imagerie en FISH

https://fr.wikipedia.org/wiki/Hybridation_in_situ_en_fluorescence
-Indicateur quantitatif de concentration ionique:
Cette technique est utilisée pour la visualisation de concentration ionique lors de
processus cellulaires. Par exemple, le calcium Ca2+, est détectable par une protéine
fluorescente appelée aequorine, cela est très utile car les ions calciums et les ions en
général sont des éléments majeurs du fonctionnement cellulaire.

-L’immunodétection en microscopie optique: Le principe de l’immunodétection repose

sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre des molécules d’intérêts, les antigènes. On peut
distinguer les anticorps polyclonaux, dont les origines sont variées, et les anticorps
monoclonaux qui sont dérivés d’une seule cellule productrice. Quel que soit le type, les
anticorps sont très spécifiques et sont donc un moyen efficace de mettre en évidence des
éléments. La technique est mise en place comme suivant :

1°) Immunisation d’un animal en laboratoire en lui injectant l’antigène d’intérêt afin qu’il
produise les anticorps spécifiques de cet antigène.

2°) -Dans le cas d’une immunodétection directe: les anticorps produits sont récupérés et
couplés à des marqueurs, par exemple des fluorochromes, qui lors de la liaison de
l’anticorps à l’antigène seront activés et émettront un signal.

-Dans le cas d’une immunodétection indirecte: au lieu que ce soit le premier anticorps
spécifique de l’antigène qui soit couplé à un marqueur, c’est un autre anticorps qui lui est
spécifique du premier anticorps qui va être couplé. Cette méthode permet une
amplification du signal car le nombre d’anticorps se liant aux premiers anticorps est très
important, le signal en est alors démultiplié.

3°) Interprétation des résultats.

Schéma d’immunofluorescence directe à gauche et indirecte à droite.

https://fr.wikipedia.org/wiki/Immunofluorescence
 LA MET

● faisceau d’e- + lentilles/ bobines EM

● résolution = 0,1 nm ( 1000x + que la MO) = 1 angstroem
● grossissement x 1 million
● TTM informatique / caméra CCD :) Cela permet des reconstructions en 3D !
● image en noir( les e- diffusés, renvoyés) et blanc ( e- TRANSMIS, traversant l’objet
biologique)
● Préparation complexe
1. Fixation au formol/ au OsO4 + déshydratation
2. inclusion en résine
3. Coupe à l’ultramicrotome e ≈ 50nm / coupes ultrafines collectées sur grille de
cuivre
4. Contraste le but: créer des interférences avec le faisceau d’e-
métaux lourds ex: Pb (dépôts métalliques font diffuser les e-)

Contraste positif Contraste négatif

Ici c’est l’objet qu’on colore. (Nuances gris/noir)
Fond clair.
Contraste classique créé par les atomes de
l’échantillon.
Assombri le fond, sans colorer l’objet lui même
= contour de l’objet
Utiliser surtout pour des objets « isolables »/
petits de tailles ( ex: bactérie/virus)
Pas pour des cellules en coupe

Immunomarquage = immunogold

= détecter un couple Ag-Ac

L’Ag = molécule qu’on cherche à mettre en évidence

1.Les coupes ultrafines dans solu° d’Ac primaire

2. Lavage
3.Puis ré-incubées dans solution avec Ac secondaire couplé
à de l’or colloïdal ( capable de lier le 1er)
4. Lavage ( permet d’éliminer les molécules non fixées)

Les billes d’or = points noir sur l’image

Or= atome dense aux e-
Ombrage métallique
Le contraste avec les métaux lourds est obtenu par vaporisation.La projection métallique, créée
par ex. par une électrode de Pt, arrive avec un angle α, et s’accumule d’un coté.
Vu que les interférences ne sont que d’un côté, en MET= ombres et reliefs.

LA MEB

● Résolution entre 3 et 20nm

● Grossissement X20 000
● étude du volume des objets biologiques
● exploite les e- diffusés, ceux qui rebondissent à la surface de
l’échantillon

● Peu de préparation
- échantillon fixé ou congelé
- vaporisation métallique
- ne nécessite pas d’épaisseur particulière, c’est la surface qu’on exploite.

LA CRYO

Pour MET = Cryofracture/ cryodécapage

Pour MEB= Cryo-SEM ou cryo-MEB

Principe: 1.congélation ( eg. azote liquide -192°C)

2. fracturation ( mb séparées en leur milieu)
3. Décapage ( optionnel) = réchauffer pour avoir sublimation de l’eau = creusement des reliefs
4. Contraste par vaporisation métallique

:) E face = feuillets extracellulaire

P face = cytoplasmique
les trous = prot TM arrachées
RAPPEL

Sublimation = passage de l’état solide à l’état gazeux

Remarques:

-> pour tout système limite de résolution imposé par λ, dans le cas de la MET, + le voltage
augmente + petite sera λ.
-> e- créés par générateur et accélérés sous vide.
-> Limite de résolution : plus petite distance en dessous de laquelle deux points voisins sont
confondus >> passé cette distance les deux points côte à côte sont flous et donnent
l'impression de ne faire qu'un.
-> Cf cours Histo: En MO l’inclusion se fait en paraffine.

Notes:
Les méthodes d’observations des structures cellulaires sont abordées en UE1B ainsi qu’en
UE1F.
Nous avons décidé de regrouper toutes les informations dans une même fiche.
Il est nécessaire d’avoir compris ces différentes méthodes, pour aborder plus sereinement les
cours de Madame KREJBICH, qui sont riches en images.