Cours d’analyses instrumentales Microscopie et microscope

Université : Abderrahmane Mira de Bejaia

Faculté : Sciences de la Nature et de la Vie
Département : Sciences Alimentaires
Niveau : 3ème année licence professionnelle emballage et qualité
Module : Analyses instrumentales

Microscope et microscopie

I. INTRODUCTION
La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des
structures à l’échelle microscopique. Le principe est dans tous les cas le même : une onde est
envoyée sur la préparation ou émise par la préparation. Cette onde est captée par un objectif
qui la concentre et passe par un oculaire qui crée une image observable. Cette image est soit
observée à l’œil nu, soit photographiée, soit enregistrée par caméra et stocké sur ordinateur
pour retraitement.

L'image obtenue est beaucoup plus qu'un instantané de la préparation. Les techniques
de révélation permettent aujourd'hui d'identifier de façon précise toutes sortes de molécules et
les photographies (sur pellicules ou numériques) peuvent être analysées pour des études
quantitatives (taille, nombre et emplacement des éléments observés).
Il n'y a pas une technique microscopie mais plusieurs dizaines aboutissant à des résultats
différents. Il n'y a aucune comparaison entre les images plates et peu contrastées d'un
microscope en contraste de phase, celles très fines d'un microscope électronique ou les
reconstitutions multichromes en 3D d'un microscope confocal., toutefois seule la première
technique permet de travailler sur des tissus vivants.
Aujourd'hui la microscopie est divisée en deux grands groupes, différents par la nature de la
particule élémentaire impliquée :

• le microscope optique, aussi appelé photonique, parce qu'il utilise des photons,

• le microscope électronique qui utilise des électrons pour étudier l'objet.

II. MICROSCOPIE OPTIQUE
II.1. Types de microscopie optique
La technique de microscopie optique est la plus ancienne utilisée. Elle est également
celle dont il existe le plus de variantes. Le principe est le suivant, la préparation est éclairée
par une lampe. Les molécules à observer vont interagir avec la lumière de plusieurs façons :
• soit en absorbant certaines longueurs d'onde de la lumière. C'est la microscopie en
lumière directe.

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• soit en provoquant un déphasage des différents rayons lumineux. C'est la microscopie en

contraste de phase.
• soit en émettant de la lumière à une autre longueur d'onde que celle d'origine. C'est la
microscopie à fluorescence.
Donc il existe trois types de la microscopie optique :
• La microscopie en lumière directe
• La microscopie en contraste de phase
• La microscopie à fluorescence

II.1.1. La microscopie en lumière directe

C'est le cas le plus simple. Les structures à observer sont colorées, soit qu'elles le
soient naturellement, soit que ce soit le résultat d'un marquage. La lumière blanche émise par
une lampe est concentrée sur la préparation et la traverse. Selon l'intensité de la coloration, la
lumière sera plus ou moins absorbée et l'endroit apparaîtra plus ou moins sombre, les zones
peu marquées restant relativement claires. La coloration est due soit à un colorant qui se fixe
de façon préférentielle à une molécule particulière ou une famille de molécules, soit à un
précipité sombre.

II.1.2. La microscopie en contraste de phase

Cette technique permet d'observer les cellules sans préparation ni coloration dans leur
milieu d'origine. C'est donc l'une des rares qui permet d'observer des cellules vivantes. Elle
est ainsi très utilisée en ingénierie cellulaire. Le principe est basé sur le fait que les structures
biologiques sont transparentes, mais qu'elles ont un indice de réfraction différent. Les rayons
lumineux vont donc subir des déviations en passant d'un milieu à un autre, cela se traduit par
un déphasage entre les rayons. En supprimant les rayons lumineux en fonction de leur
déphasage, on obtient une image en niveau de gris qui visualise tous les changements de
milieu à l'intérieur de l'objet observé. En pratique, on supprime ces rayons déphasés en
plaçant des diaphragmes qui bloquent la lumière dans l'axe de l'objectif, mais laissent passer
ceux de la périphérie.

II.1.3. La microscopie à fluorescence

Cette variante exploite la capacité qu'ont certaines molécules d'émettre de la lumière
quand on les éclaire avec une lumière de longueur d'onde supérieure. Dans son principe, la
lumière émise par une source de lumière blanche est filtrée pour isoler la longueur d'onde qui

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va exciter la préparation puis focalisée sur la zone d'observation par l'objectif. La lumière
émise est captée par l’objectif, filtré

Figure 1

pour isoler les longueurs d'ondes parasites qui pourraient brouiller le signal (comme la longueur
d'onde d'excitation par exemple) puis observée.

L'image obtenue est inverse de celle obtenue en lumière directe, les objets observés se détachent
en lumineux sur le fond sombre, le contraste final étant alors beaucoup plus élevé.

II.1.4. Principe de fonctionnement du microscope optique

Figure 2

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Schéma du microscope

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II.1.5. Résolution du microscope

- Résolution et distance de travail

La résolution est la plus petite distance séparant deux objets que l'on peut distinguer à l'aide
du microscope: elle dépend de la qualité des lentilles et de la nature même de la lumière: elle
est au maximum de 0,2 μm. On peut l'augmenter en plaçant une goutte d'huile à immersion
(huile incolore dans laquelle la lumière se propage à la même vitesse que dans le verre) sur la
préparation: on réalise alors une observation "à l'immersion", l'huile remplaçant l'air entre
l'objet et l'objectif.

La distance de travail est la distance entre l'objectif et l'objet: elle doit être d'autant plus
petite que le grossissement recherché est fort.

La résolution du microscope dépend de l’ouverture numérique ON de l’objectif:

ON = n sin α
n = index de réfraction du milieu le moins réfringent dans le trajet optique
α = angle de déviation du faisceau par rapport à l’axe optique

Grossissement du microscope:

Le grossissement d'un objet est le produit du grossissement de l'objectif par celui de

l'oculaire. Le grossissement peut être défini de façon approchée par

750 X: optimum théorique.

En pratique, à partir de 1000 x ON, on n’augmente plus la résolution de l’appareil du fait des
limites physiologiques de l’œil.

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III. MICROSCOPIE ELECTRONIQUE

La classification des microscopes repose sur la nature du rayonnement utilisé, c’est-à-dire de

la longueur d’onde. La microscopie optique utilise les radiations électromagnétiques du
spectre visible tandis que, la microscopie électronique utilise les propriétés des faisceaux
d’électrons accélérés au quelle peut être associée une courte longueur d’onde (Fig.1). La
valeur de la longueur d’onde est donnée par la relation de De Broglie

λ = h/mυ

ou h est la constante de Planck et mυ la quantité de mouvement de l’électron. La microscopie

électronique permet ainsi d’atteindre des résolutions bien meilleures que la microscopie
optique.

Il existe plusieurs sortes de microscope électronique. Les plus connus sont : le microscope
électronique en transmission (MET); le microscope électronique à balayage (MEB). On
distingue 3 types d’électrons : primaires, secondaires et rétrodiffusés.
- Les électrons primaires sont ceux qui traversent l’échantillon : utilisés en MET ;
- Les électrons secondaires sont des électrons arrachés des atomes de l’échantillon (par
les électrons primaires): utilisés en MEB; permettent d’obtenir une bonne résolution .
- Les électrons rétrodiffusés : sont renvoyé par les noyaux, ne permettent d’obtenir
qu’une faible résolution
II.1. Microscope électronique à balayage

Le pouvoir séparateur d'un microscope optique (i.e. son grossissement) est limité par la
longueur d'onde de la lumière visible; aucun détail de dimension supérieure à 0,2 µm ne peut
être observé. Aussi l'utilisation de particules accélérées de plus courte longueur d'onde
associée permet-elle d'augmenter le grossissement ? Le choix d'électrons accélérés, pour
produire un rayonnement de courte longueur d'onde, est déterminé par plusieurs critères :

la masse faible de ces particules qui peuvent être accélérées et focalisées au moyen de
champ électrique ou magnétique
une source d'électrons est aisée à mettre en œuvre
les électrons sont plus facilement focalisés que les particules plus lourdes
L’interaction des électrons avec la matière est plus faible que pour des particules plus
lourdes

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- Principe: 1935
- Réalisation commerciale: 1965
- Permet de forts grossissements avec de fortes profondeurs de champs.
- Permet, avec l'équipement adéquat, de réaliser des analyses élémentaires.
- Utilise les informations provenant des électrons secondaires et des électrons
rétrodiffusés.
- Pouvoir séparateur 20 nm à 0,4 nm
- Cette nouvelle technologie a permis, du fait de sa profondeur de champ, l'observation
du relief d'échantillons massifs.

II.1.2. Equipement et principe de fonctionnement

Le principe du balayage consiste à explorer la surface de l'échantillon par lignes
successives et à transmettre le signal du détecteur à un écran cathodique dont le balayage est
exactement synchronisé avec celui du faisceau incident.
- Les microscopes à balayage utilisent un faisceau très fin qui balaie point par point la surface
de l'échantillon

Figure : Schéma d'un MEB

Le microscope électronique à balayage comporte 4 parties majeures: (1): la colonne, (2): la

chambre de l'échantillon, (3): le système de pompage, (4): l'électronique de contrôle

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- La colonne
Elle comprend le canon à électron, un système de condenseurs (2 lentilles en général) qui
donne une image très réduite du cross-over. Cette image est projetée par une autre lentille
électromagnétique appelée lentille objective sur l'objet. Typiquement do le cross-over est de
60 μm et la taille de la sonde à la surface de l'échantillon peut-être inférieure à 2 nm (d3), ce
qui fait un "grossissement" de 30 000.
- La chambre de l'échantillon : Elle comprend:
- la platine goniométrique qui permet de déplacer l'échantillon suivant divers mouvements de
translation et de rotation;
- le système d'introduction de l'échantillon.
- les divers détecteurs.
- Le système de pompage
Pour éviter la dispersion et l'absorption des électrons, la colonne et la chambre de
l'échantillon sont sous un vide secondaire (10 -5 - 10-6 torr). En général, on utilise des pompes à
diffusion de vapeur d'huile, mais pour des problèmes de contamination par les vapeurs d'huile,
on utilise parfois des pompes turbomoléculaires.
- L'électronique de contrôle
Le système de balayage permet de déplacer la sonde. Le nombre de lignes peut varier de 50
à 160, la durée du balayage de 10 -3 s à 5 s. L'appareillage comporte 2 oscilloscopes dont le
balayage est synchrone avec celui de la sonde.
Pour l'observation visuelle: écran à grande rémanence
Pour la photographie: écran à faible rémanence.

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Figure : Microscope électronique à balayage ou Scanning Electron Microscope

(SEM)

II.1.3. Théorie de formation des images

Il n'existe pas d'image réelle en microscopie électronique à balayage.

L'image est formée par la position en X et Y de la sonde qui balaye l'échantillon et les intensités
mesurées par chaque détecteur qui mesure l'interaction électron-échantillon.
Cette information peut être fournie par deux fonctions:
+ La fonction balayage d'une ligne (line scans).
Dans ce cas, le balayage a lieu suivant une ligne sur l'échantillon et l'écran de visualisation
présente suivant l'axe horizontal la position et suivant l'axe vertical l'intensité mesurée par un des
détecteurs
+ La fonction balayage d'une surface.
Dans ce cas, les informations provenant des détecteurs sont converties en intensité lumineuse sur
l'écran de visualisation.

Pour comprendre le principe de formation des images en microscopie électronique il faut

comprendre la nature de l’interaction entre les électrons et la matière qui constitue
l’échantillon observé

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Interactions du faisceau électronique avec l'échantillon

Sous l'impact du faisceau d'électrons accélérés, des électrons rétro diffusés et des électrons
secondaires émis par l'échantillon sont recueillis sélectivement par des détecteurs qui
transmettent un signal à un écran cathodique dont le balayage est synchronisé avec le
balayage de l'objet.

Figure: Représentation schématique de l’interaction entre un faisceau d’électrons et la surface

d’un échantillon

- En pénétrant dans l'échantillon, le fin pinceau d'électrons diffuse peu et constitue un volume
d'interaction (poire de diffusion) dont la forme dépend principalement de la tension
d'accélération et du numéro atomique de l'échantillon. Dans ce volume, les électrons et les
rayonnements électromagnétiques produits sont utilisés pour former des images ou pour
effectuer des analyses physico-chimiques. Pour être détectés, les particules et les
rayonnements doivent pouvoir atteindre la surface de l'échantillon. La profondeur maximale
de détection, donc la résolution spatiale, dépend de l'énergie des rayonnements.

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Figure : Poire de diffusion

- La figure ci-après montre un spectre de distribution d'énergie selon le type d'électron émis.

Figure 3 : Représentation schématique de l'énergie de distribution

des électrons émis par un échantillon

Contrairement au MET et au microscope optique, l'image n'est pas formée par une
lentille objective. L'image est formée de manière séquentielle en balayant la surface de
l'échantillon par un faisceau d'électrons. Le MEB fournit des images de la surface en relation
avec le mode de diffusion des électrons par l'échantillon. Le nombre d'électrons secondaires et

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rétrodiffusés émis varie en fonction du point d'impact du faisceau d'électrons sur la surface.
Ces électrons sont détectés dans des détecteurs. Une image est obtenue en relation avec
l'intensité du courant électrique produit en chaque point de la surface. La topographie de
l'échantillon est ainsi obtenue.

Formation du contraste de l'image par émission d'électrons

- Contraste topographique
• Contraste d'inclinaison: électrons secondaires; électrons rétrodiffusés.
• Contraste d’ombrage : les électrons secondaires attirés par le champ du collecteur
proviennent aussi de surfaces cachées au détecteur. Elles apparaîtront donc de façon plus
sombre. C'est ce qui détermine la grande profondeur de champ du M.E.B. Les électrons
rétrodiffusés n'arrivent au détecteur que s'ils sont émis par un point vu du détecteur.
• Contraste d'arêtes ou de pointes : l'émission d'électrons secondaires et d'électrons
rétrodiffusés augmente sur des arêtes ou des pointes. Ces détails apparaissent brillants.
- Contraste de composition ou de numéro atomique
Si métallisation ou contamination : inexistant en électrons secondaires.
Existe en électrons rétrodiffusés.

La préparation des échantillons

La plupart des échantillons massifs non hydratés ne réclament aucune préparation spéciale.
Les autres types d'échantillons poudres, matériaux hydratés, matériaux biologiques, réclament
un savoir-faire que l'on peut retrouver dans des articles scientifiques. Une règle de base: la
propreté

II.2. Microscope électronique à transmission :

Principe

Un MET fonctionne essentiellement comme un microscope optique, le rôle dévolu aux

photons dans ce dernier étant assumé par les électrons dans le premier. Il possède le pouvoir
séparateur le plus performant de l’ordre de quelques Angstroms.
- La Figure ci-aprés schématise le fonctionnement d’un MET. Un canon à électron permet de
produire un faisceau. Ce faisceau passe alors par une série de lentilles condenseur, dont le rôle
est de pouvoir régler la taille et l’angle d’incidence du faisceau. Ce dernier atteint alors
l’échantillon, dont une première image est produite par la lentille objectif. Il est à noter que
cette dernière est l’élément le plus important, car de sa qualité va dépendre la résolution de

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L’image. De plus, la lentille objective n’agrandit pratiquement pas (≈×10), ce rôle étant
dévolu aux lentilles protectrices. Après la traversée de la lentille objective, la lentille
intermédiaire va soit former une deuxième image, si son plan objet coïncide avec le plan
image de la lentille objective, soit former une image du cliché de diffraction, si son plan objet
coïncide avec le plan focal de la lentille objectif. On voit ainsi un des avantages manifeste de
la microscopie électronique en transmission : en modifiant la valeur de la distance focale de la
lentille intermédiaire (en pratique, un simple bouton à appuyer modifiant le courant dans les
bobines intermédiaires), on obtient facilement l’image ou le cliché de diffraction de la même
zone. Finalement, les lentilles protectrices vont agrandir l’image ou le cliché de diffraction
formé et le projeter sur le détecteur, qui peut être un écran fluorescent, une plaque photo ou
plus communément un scintillateur couplé à une caméra.

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