UE Biologie 1 (S1)

Enseignement de biologie cellulaire

COURS 2

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II. STRUCTURES ET ORGANISATIONS CELLULAIRES

II.1. Les méthodes d’étude de la cellule

a) Microscopie photonique ou optique
b) Microscopie électronique
c) Immunocytochimie - immunohistochimie
d) Technique de pulse - chase

II.2. Les plans d’organisation cellulaire

a) Les procaryotes
b) Les eucaryotes
c) Bilan comparaison procaryote – eucaryote
d) Culture cellulaire
e) Fractionnement cellulaire

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II.1. Les méthodes d’étude de la cellule

LES DIFFERENTS TYPES DE TECHNIQUES

√ Techniques d‘observation par microscopie :

- Microscopie optique/fluorescence (Structures)

- Microscopie électronique (Ultrastructures)
§ Histologie -> observation des tissus
§ Cytologie -> observation des cellules

√ Techniques d‘identification et de localisation de molécules :

- Immunocytochimie, immunohistochimie -> protéine

- Hybridation in situ -> séquence d‘acide nucléique

- Technique de pulse – chase -> étude dynamique des macromolécules

(synthèse – déplacement)

Visualisation par microscopie

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√ Techniques analytiques de biochimie et de biologie moléculaire :

- Fractionnement cellulaire -> séparation d‘organites

- Electrophorèse, Western Blot -> analyse de protéines

- Electrophorèse, Northern Blot, Southern Blot, PCR... -> analyse des ARNm, ADN

- Technique de pulse – chase -> étude transformation biochimique d‘une macromolécule

√ Techniques de culture cellulaire

√ Techniques génétiques

√ Techniques électrophysiologiques

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 MICROSCOPIE PHOTONIQUE OU OPTIQUE (MO)
Principe de fonctionnement
§ Utilise des photons
§ Produit 1 image agrandie d’un objet grâce à un système de lentilles de verre ayant le
même axe optique

Agrandit l’image
fournie par l’objectif

Lumière sortant de l’objet est

reprise par la lentille de l’objectif

Concentre les rayons lumineux

dans le plan de l’objet ou specimen

• Pouvoir séparateur moyen du microscope photonique = 0,25 à 0,1 µm

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• Grossissement : objectif x oculaire = 1000 à 2500
Pouvoir séparateur du microscope (résolution)

d = 0,61 λ
n sin α (ouverture numérique)

λ = longueur d’onde de la lumière

α = demi-angle d’ouverture de l’objectif
n = indice de réfraction du milieu transparent qui
sépare la lamelle de l’objectif

Augmentation de la résolution en diminuant d

n = 1 -> air
n = 1,5 -> huile à immersion

n = c/v
c = vitesse de la lumière dans le vide
v = vitesse de la lumière dans un autre milieu transparent

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Microscopie optique à contraste de phase

• Convertit de faibles différences d’indice de réfraction en différences d’intensité

lumineuse

• Utilisé pour accentuer le contraste des échantillons non colorés

• Modification de la vitesse et de la direction de la lumière lorsque celle-ci traverse

les structures intracellulaires

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Microscopie à fluorescence classique
Détection de fluorescence émise par un fluorochrome associé à une protéine
recombinante ou à un anticorps reconnaissant une protéine (immunohistochimie ou
immunocytochimie)

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Microscopie à fluorescence confocale
Microscope classique :
Fluorescence émise par les plans adjacents parasite fluorescence émise par plan focal dans
l’objet (qui a une certaine épaisseur, relief) => image ± floue.

Microscopie confocale :
Laser + diaphragme -> lumière envoyée sur objet dans 1 seul plan
Fluorescence émise par plans adjacents est stoppée par 1 diaphragme
=> image nette dans 1 plan
-> En variant plan focal à ≠ niveaux de profondeur -> succession d’images -> Représentation 3D

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Utilisation du microscope photonique

u Observation directe sans préparation : cellules vivantes

Il faut une faible épaisseur pour que lumière traverse

Contrastes entre constituants cellulaires sont souvent très faibles

Microscopie à contraste de phase pour observer cellules en culture, spermatozoïdes …

Colorants vitaux (vert janus : mitochondries en vert)

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u Observation après préparation : cellules fixées (tuées)

Observation de coupes fines (5 à 50 µm) -> passage lumière

v Techniques de colorations des tissus (histologie) ou cellules (cytologie)

Exemples de colorants classiques :

Ø Hématoxyline (bleu violacé)
Colorant basique -> colore structures histologiques acides : ADN et ARN (noyau et REG)
Ø Eosine (rose)
Colorant acide -> colore structures basiques : cytoplasme
Ø Giemsa (noyau coloré en noir, cytoplasme coloré en bleu pâle)

v Techniques spécifiques de détection :

Ø D’une molécule spécifique -> Protéine : immunocytochimie/immunohistochimie

-> ARNm : hybridation in situ
-> Enzyme : cytoenzymologie

Ø D’une molécule marquée radioactivement -> autoradiographie

Ø D’une molécule marquée avec un fluorochrome -> fluorescence

Permet l’observation des structures cellulaires

MAIS pas des ultrastructures 12
 PREPARATION DES COUPES HISTOLOGIQUES DE MICROSCOPIE OPTIQUE

1. FIXATION
Fixateurs : paraformaldéhyde, glutaraldéhyde, acide acétique, formol…
ð ponts covalents entre différentes protéines voisines
ð arrêt réactions enzymatiques et empêche dégradations cellulaires
ð mort des ¢ glutaraldéhyde

2. DURCISSEMENT DE L’ECHANTILLON
Durcissement réalisé par congélation ou par inclusion dans la paraffine
3. COUPES AU MICROTOME
Coupes de 5 à 50 µm grâce à un microtome muni d’un rasoir en acier.

4. COLORATION OU IMMUNOCYTOCHIMIE

5. MONTAGE 13
 MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
Microscopie électronique à transmission (MET)
§ Utilise des électrons
§ Produit 1 image agrandie de l’objet grâce à un système de lentilles électromagnétiques

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 Préparation et observation des échantillons en MET

Contraintes de préparation beaucoup plus importantes que celles du microscope optique :

§ En raison du faible pouvoir de pénétration des électrons, les coupes doivent être
ultrafines autour de 50 nm d’épaisseur :

=> Fixation plus exigeante (formaldéhyde, glutaraldéhyde, tétroxyde d’osmium)

=> Inclusion en milieu plus dur (dans résine synthétique qui polymérise à chaud ;
ex : araldite ou epon)

§ Souvent peu de contraste des constituants cellulaires :

⇒ Utilisation de métaux lourds absorbant les électrons et se fixant sur certains

constituants pour augmenter contrastes

OBSERVATION DES ULTRASTRUCTURES

Image en noir et blanc observée sur écran fluorescent ou photographique

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PORES

ENVELOPPE
NUCLÉAIRE
MEMBRANE EXTERNE

Image d’une enveloppe nucléaire en MET

Microscopie électronique à balayage

§ Utilise des électrons

§ Produit images de la surface d’un échantillon

• Echantillon fixé et déshydraté

• Recouvert par un matériau conducteur :

une fine couche de carbone ou de platine

• 1 faisceau d’électrons balaye surface de la

préparation
Ø Interaction électrons avec atomes de surface
Ø Emission d’électrons secondaires

• Electrons secondaires captés par différents

détecteurs

Cellule à mucus
• Reconstruction image 3D de surface
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 Fibroblaste en MO
à contraste de phase

Cellules de tube
collecteur de rein en MO
Coloration hématoxyline-éosine

Filaments de kératine
de cellules épithéliales
(microscopie à fluorescence)

Réticulum endoplasmique
granulaire en ME
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Vidéos :

Microscopie électronique
https://www.youtube.com/watch?v=7-Mr19fKIu4

Microscope à fluorescence
https://www.youtube.com/watch?v=-HwG98CUpUc

Microscope optique
https://www.youtube.com/watch?v=GNVid7PGjSQ

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 IMMUNOCYTOCHIMIE - IMMUNOHISTOCHIMIE

Définition anticorps (Ac) = immunoglobuline (Ig)

Structure

2 sites de liaison à Ag identiques => bivalent 20

q Anticorps (Ac) = Glycoprotéine se liant de façon spécifique à une région
limitée (déterminant antigénique ou épitope) de l’antigène qui a provoqué
sa formation

q Antigène (Ag) = molécule étrangère à l’organisme

(=> réaction immunitaire et sécrétion d’Ac)

1 Ag peut avoir plusieurs motifs antigéniques ou épitopes

1 épitope = 1 structure de nature polysaccharidique ou peptidique
généralement d’origine exogène, libre ou à la surface de bactéries, virus…

-> production d’autant d’Ac ≠ qu’il y a d’épitopes ≠

3 épitopes ≠ => 3 Ac ≠

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q Anticorps monoclonaux = Ac reconnaissant spécifiquement 1 seul type
d’épitope d’1 Ag donné -> tous identiques et issus d’un même clone de
lymphocytes
q Anticorps polyclonaux = Mélange d'anticorps monoclonaux reconnaissant
différents types d’épitopes sur un 1 Ag donné

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Techniques utilisant des anticorps

u a) Immunocytochimie / Immunohistochimie
Détection dans les cellules (immunocytochimie) ou tissus (immunohistochimie) d’Ag

u b) Analyses biochimiques

- Identification de protéines dans des extraits cellulaires -> Western Immunoblot

- Purification de protéines -> chromatographie d’affinité

- Isolement de protéines d’un extrait cellulaire -> immunoprécipitation

u c) Immunodosages
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

u d) Etudes fonctionnelles
Neutralisation de la fonction d’une protéine
Mobilité d’une protéine

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Utilisation des anticorps en immunocytochimie
marqueur
Complexes Ac - Ag ne sont pas visibles directement =>
Détection avec anticorps couplés à un marqueur visible au microscope

q Principaux marqueurs :

§ Pour la microscopie photonique

- enzymes : peroxydase
- molécules fluorescentes -> MO à fluorescence
ex : fluorescéine (vert), rhodamine (rouge),
cyanine Cy3 (rouge)...
Marquage anti-actine β de
cellules de chondrosarcome
(MO à fluorescence)

§ Pour la microscopie électronique à transmission

- ferritine : protéine riche en fer dense aux électrons
- or colloïdal : particules sphériques
de tailles calibrables T = terminaison axonale
M = muscle
Marquage anti-transporteur
de choline à une jonction
neuromusculaire (MET) 24
q Méthodes de détection :
Marqueur

Ø Méthode directe : Ac primaire couplé à un marqueur Ac I

Ag
Ø Méthode indirecte (la plus souvent utilisée) :
Ac secondaire (AcII) couplé à un marqueur va reconnaître Ac primaire lié à Ag

=> amplification du signal (car Ac II polyclonaux)

v Méthode indirecte avec un marqueur fluorescent

fluorescent

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v Méthode indirecte avec un marqueur enzymatique (peroxydase)

SUBSTRAT
INVISIBLE

E
Ac II - Immunocytochimie -> précipité
E
PRODUIT - Western immunoblot -> photons
VISIBLE
- ELISA -> produits solubles
Ac I
Ag

Fonctionnement de la péroxydase

§ Enzyme de type oxydase

§ Réaction catalysée du type : AH2 + H2O2 → A + 2 H2O
§ Exemples de substrats :

DAB (3,3'- Diaminobenzidine) HRP produit 1 dépôt coloré marron

Substrat chemoluminescent (ECL) HRP photons

TMB, ABTS, OPD HRP produits solubles (spectrophotométrie)

HRP = Horseradish peroxydase
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q Application en immunocytochimie / immunohistochimie :

v Détection d’épitopes intracellulaires ou extracellulaires

¢ non perméabilisée ¢ perméabilisée (détergent doux, Triton)

-> Seuls les épitopes ou Ag extracellulaires -> Les épitopes ou Ag intracellulaires
sont accessibles aux Ac deviennent accessibles aux Ac

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v Double marquage : détection de 2 Ag ≠

Ac I anti-Ag1
Ac II doit être d’une espèce ≠ de
Ac II Ac I anti-Ag2
Ac I Ac I Si rouge et vert colocalisés => jaune
Ag 1 Ag 2

Exemple de double marquage (coupes de cerveau de rat) :

Rouge = neurone à vasopressine
Vert = anti-récepteur TRPV2

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