École Normale Supérieure de Rabat Université Mohammed V -

COURS
BIOLOGIE CELLULAIRE

Pr: SEKKAK. N
Chap II : Méthodes d’étude de la cellule
 Chapitre II : Méthodes d’étude de la cellule

• I- Microscopes.

• II- Méthodes d’étude chimique (Cytochimie, Cyto-

enzymologie , L’immuno-cytochimie ).

• III- Méthodes d’étude biochimique (chromatographie,

électrophorèse, L’ultra-centrifugation ).

• IV- Méthodes d’étude physique (autoradiographie,

fluorescence).

• V- Culture des cellules.

• VI- Technique de l’ADN recombinant.

 INTRODUCTION

• Il y a deux types :

• -Techniques morphologiques.

• -Techniques d’analyses physico-chimiques et

biochimiques.
 A- Techniques morphologiques :
• 1- La microscopie optique :
• 1-1- Le microscope photonique ou optique courant à fond clair
• 1-2- Le microscope optique à fond noir
• 1-3-Le microscope à contraste de phase
• 1-4- Le microscope à contraste d’interférence différentielle :
• 1- 5- Le microscope à fluorescence :

• 2- La microscopie électronique :
• 2-1- Microscope électronique à transmission MET
• 2-2- Microscope électronique à balayage MEB
B- Techniques d’analyse physico-chimiques et biochimiques

I- Méthodes physico-chimiques in situ :

– 1- Méthodes physiques
• Diffraction aux rayons X,
• Fluorescence,
• Autoradiographie
– 2- Méthodes chimiques
– Cytochimie
– Cyto-enzymologie
– L’immuno-cytochimie
– L’autoradiographie
II- Méthodes biochimiques :
- L’ultra-centrifugation
– Chromatographie
– L’électrophorèse
 I- Microscopes.

• Les microscopes utilisent la déviation d’un flux

ondulatoire de particules, soit non chargées les photons,
soit chargées électriquement les électrons au travers d’un
système de lentilles de manière à former d’un objet à
étudier une image agrandie.

• Le microscope composé est un instrument optique où

s’effectue un double grossissement. Une lentille donne une
image primaire agrandie de l’objet, cette image est reprise
et agrandie par une seconde lentille grossissante simple.
 I- Microscopes.
⇒ La lentille de l’objectif effectue le
grossissement primaire et donne une image
réelle.

⇒ La lentille de l’oculaire effectue le

grossissement secondaire. Elle permet à l’oeil
de former une image virtuelle agrandie de
l’image réelle formée par la lentille de l’objectif.
 I- Microscopes
• 1- La microscopie optique :
• 1-1- Le microscope photonique ou optique courant à fond clair
• 1-2- Le microscope optique à fond noir
• 1-3-Le microscope à contraste de phase
• 1-4- Le microscope à contraste d’interférence différentielle :
• 1- 5- Le microscope à fluorescence :

• 2- La microscopie électronique :
• 2-1- Microscope électronique à transmission MET
• 2-2- Microscope électronique à balayage MEB
 1- La microscopie optique
• Un microscope optique en général est composé :

• d’un statif (pied) qui assure la stabilité de l’appareil,

• d’un tube optique le long duquel existe un système de

lentilles en verre et comportant à ses extrémités un
oculaire permettant de recueillir l’image et des objectif
servant à agrandir un certain nombre de fois l’image de
la préparation,

• d’une platine (porte objet) percée d’un trou et munie

de pinces pour immobiliser la lame et

• d’une source lumineuse éclairant la préparation.

1- La microscopie optique
 1- La microscopie optique
• Le microscope est caractérisé par :

• - son grossissement ou puissance : Egal au produit du

grossissement ( ou puissance) de l’objectif et de
l’oculaire Plus le grossissement de l’objectif est
important, plus l’objectif doit être proche de l’objet à
observer.
• - son pouvoir de résolution : La résolution d'un
microscope désigne sa capacité à séparer des détails
très voisins. Indépendamment du capteur utilisé et des
aberrations ou imperfections des lentilles, la résolution
du microscope optique est fondamentalement limitée
par la diffraction de la lumière.
 1- La microscopie optique.

• 1-1- Le microscope photonique ou optique courant à

fond clair

• Utilise comme source lumineuse la lumière visible

(radiations de 400 à 760 nm).
• Son pouvoir séparateur ou limite de résolution est de
l’ordre de 0, 2μm.
• Il est utilisé en microbiologie, parasitologie, cytologie et
histologie.

• Le microscope à fond clair est équipé de:

• ♦ 3 système de lentilles transparentes (verre).
• ♦ 1 condenseur D1 concentre la lumière sur l’objet
• ♦ 1 objectif et un oculaire L1 et L2 grossissent l’image.
 1- La microscopie optique.

• Les microscopes photoniques peuvent subir des modifications

qui portent sur l’éclairage

• 1-2- Le microscope optique à fond noir

Possède un condenseur à fond

noir et les rayons lumineux
arrivent latéralement sur
l’objet.

La cellule apparaît comme un

objet brillant sur le fond noir.
 1- La microscopie optique
Les microscopes photoniques peuvent subir des modifications qui
portent sur l’optique

• 1-3-Le microscope à contraste de phase et

• 1-4- Le microscope à contraste d’interférence
différentielle :

• Possèdent des systèmes optiques conçus pour

exploiter les propriétés de diffraction des cellules
vivantes.

• La lumière traversant les parties relativement

denses ou épaisses de la cellule est retardée par
rapport à celle qui traverse une région voisine plus
mince. Il se crée ainsi des effets d’interférences
produits par la recombinaison de ces deux séries
d’ondes, donnant des images fortement
contrastées.
 1- La microscopie optique
• MO à fond noir et à contraste de phase ou à
contraste d’interférence différentielle,
permettent d’observer des cellules vivantes en
action (déplacement, division, phagocytose,
etc..)

Larve d’oursin
 1- La microscopie optique
• Les microscopes photoniques peuvent subir des
modifications qui portent sur la source lumineuse.

• 1- 5- Le microscope à fluorescence :
• Est un microscope classique avec une lampe à vapeur de
mercure sous pression.
• Certaines substances ont la propriété d’émettre une
lumière visible lorsqu’elles reçoivent un flux de rayons
ultra-violets. L’objet peut émettre directement cette
lumière ou bien après avoir été imprégné de de substances
fluorochromes.
• (un filtre d’arrêt des UV est indispensable à l’oculaire).
 1- La microscopie optique
1- 5- Le microscope à fluorescence :
-Les microscopes optiques à fluorescence nécessitent des cellules fixées,
des coupes minces et entraînent malheureusement des superpositions
d’images. Les microscopes optiques à fluorescence sont souvent équipés
de microscopie confocale qui remédie à la superposition d’images, en
étudiant la cellule plan par plan.
 2- La microscopie électronique
• Les électrons ayant une longueur
d’onde bien inférieure à celle de la
lumière visible ou ultra-violette, la
limite de résolution des
microscopes électroniques se
trouve très améliorée.

• Dans ces microscopes, le faisceau

de photons est remplacé par un
faisceau d’électrons émis sous
vide, accélérés par une forte
différence de potentiel et
canalisés par une série de lentilles
électromagnétiques.
 2- La microscopie électronique

• L’image est formée :

• ⇒ soit à partir d’électrons

transmis à travers l’échantillon
MET et focalisés sur un écran
fluorescent, ou une plaque
photographique.

• ⇒ soit à partir d’électrons

réfléchis par l’objet MEB
collectés par un détecteur,
l’image de l’objet étant
reconstituée sur un écran de
télévision.
 2- La microscopie électronique
• Les microscopes électroniques nécessitent la
déshydratation de l’échantillon et donc la mort des
cellules et du fait du faible pouvoir pénétrant des électrons,
les échantillons doivent être sous forme de coupes ultra
fines et donc soumis à des inclusions.

• la résolution d'un tel microscope devrait être d'environ

0,002 nm.

• Il existe deux types de microscope électronique.

• - Le microscope électronique par transmission ;
• - Le microscope électronique à balayage.
 2-1-Le microscope électronique par transmission MET

• L'objet à observer est placé sur le trajet du faisceau

d'ë.

• Selon la densité locale du matériel, certains ë qui

traversent l'échantillon sont déviés, ils ne figurent
pas sur l'image.

• Les régions denses de l'échantillon se distinguent

donc par des zones de flux électronique réduit,
c'est à dire zones + ou - sombres sur l'image.
 2-1-Le microscope électronique par transmission MET

• Les ë qui traversent l'échantillon sont, eux,

focalisés pour former une image, soit sur un écran
fluorescent, soit sur une plaque photo.

• Ce sont donc les ë qui traversent l'échantillon qui

contribuent directement à la formation de l'image.

• On ne peut qu'observer des objets très minces,

généralement on s'adresse à des coupes.
2-2-La microscopie électronique à balayage : MEB
• Les échantillons sont bombardés par un faisceau
d'ë, mais seuls sont utilisés pour la formation de
l'image, les ë qui sont réémis par la surface de
l'échantillon.

• A la différence du microscope électronique par

transmission, il est donc possible d'étudier des
échantillons massifs dont seule la surface est
observée.

• Pratiquement, la surface de l'objet est balayée

par un faisceau très fin d'ë, d'où le nom donné à
l'instrument.
2-2-La microscopie électronique à balayage : MEB

• Un récepteur recueille les ë réémis par la surface

de l'objet et donne un signal qui, après
amplification, module l'intensité d'un faisceau qui
balaie un écran de télévision en synchronisme
avec le balayage du faisceau d'ë.

• L'image obtenue sur l'écran de télévision donne

avec une très grande profondeur de champ une
vue tridimensionnelle de la surface de
l'échantillon avec une résolution de l'ordre de
250A°m.
Comparaison entre microscopie Photonique et électronique
Chapitre II : Méthodes d’étude de la cellule

• II- Méthodes d’étude chimique

(Cytochimie, Cyto-enzymologie , L’immuno-
cytochimie , L’autoradiographie ).
 II-Méthodes d’étude chimique

1-Techniques cytochimiques et immunocytochimiques :

techniques cytoenzymologiques

Consiste à détecter sur des coupes de tissu ou des cellules

entières (préalablement fixées et perméabilisées) un
antigène cellulaire spécifique à l’aide d’un antisérum (=
anticorps) dirigé contre cet antigène.

2 - Techniques de marquage isotopique

 1-Techniques cytochimiques et immunocytochimiques :
techniques cytoenzymologiques

• Techniques cytochimiques
– Mise en évidence d’un composé chimique de la cellule au
microscope optique/électronique
– Ces méthodes s'adressent à des coupes

• Techniques immunocytochimiques
– En microscopie optique
– En microscopie électronique

• révélation de la présence des complexes immuns.

• Techniques cytoenzymologiques
– Mise en évidence dans une cellule de protéines à activité
enzymatique
 2- Techniques de marquage isotopique

• 2-1. Principaux isotopes utilisés en biologie

–Isotopes non radioactifs : 15N
–Isotopes radioactifs : a, b, g
– 3H ; 14C ; 131I ; 32P ; 35S
–Dosage de la radioactivité dans un
compteur à scintillation
 2- Techniques de marquage isotopique
• 2-2. Détection qualitative de la radioactivité ; localisation de
molécules radioactives dans la cellule par autoradiographie
• a." pulse chase "
» On place une coupe de tissus dans un milieu nutritif
contenant de la Leucine radioactive
» L’acide aminé est incorporé dans la protéine
» Coupes de tissus dans un milieu contenant de la Leucine
froide.
» On peut donc observer le déplacement de la Leucine dans la
cellule
• b. Localisation : autoradiographie
» On recouvre la coupe cellulaire d’une émulsion photo
» Les rayons ionisants ont dégagés
» Apparition de grains d’argent précipités
•
 Chapitre II : Méthodes d’étude de la cellule

• III- Méthodes d’étude biochimique

(chromatographie, électrophorèse, L’ultra-
centrifugation ).
 1- La chromatographie
• La chromatographie est une technique de séparation des
constituants d'un mélange dans laquelle interviennent des
phénomènes d'adsorption et de partage.

• Le mécanisme général correspond à l'entraînement de ces

constituants par une phase mobile (liquide) le long d'une
phase stationnaire ou fixe (solide, gel de silice sur plaque
aluminium par exemple) contenue dans une colonne.

• Le solvant de chromatographie de la phase mobile déposé

en haut de colonne va descendre par capillarité dans la
phase stationnaire entraînant avec lui les composants
protéiques.

• Selon leur hydrophilie, pHi ou encore selon leur P.M, ils

migreront plus ou moins vite dans la phase fixe.
 1- La chromatographie
• La chromatographie liquide haute performance ou CLHP
(HPLC en anglais):
• Améliore les performances de séparation en mettant la
phase mobile sous pression (plus précis, plus rapide).

• Le dispositif est alors modifié : le diamètre de la colonne

est réduit, des pompes sont ajoutées, les phases fixes fixes
employées doivent être capables de résister à la pression
(donc phase stationnaire en silice).

• Dans la chromatographie, ce qui entraîne les molécules

est un flux liquidien, naturel ou forcé.
 2- L’électrophorèse
• La migration différentielle de molécules chargées sous
l'influence d'un champ électrique constitue la base de cette
technique de fractionnement.

• Les acides aminés sont séparables et identifiables par cette

technique par leur dissociation acido-basique.

• Le système est composé:

• D'une plaque de verre recouverte de gel d'agarose ou

d'acrylamide creusé à un bout de puits recevant les
échantillons à étudier.

• De part et d'autre de cette plaque, se disposent cathode et

anode au contact du tampon de migration (solution riche en
ions pour la conduction de l'électricité) placé à chaque bout de
la plaque.
 2- L’électrophorèse

• Une différence de potentiel entre les électrodes est réalisée

par un courant continu haut voltage.

• Plus les composés auront des charges importantes et plus

vite ils migreront.

• A la fin de la migration, il suffit de relever l'emplacement

des composés d'aminoacides via des colorants (tels que le
bleu de Coomassie) et la distance parcourue (leur
déplacement) et de comparer avec des témoins.

• Dans l'électrophorèse, c'est un courant électrique qui

entraîne les molécules. Seules celles qui sont chargées se
déplaceront.
 3-L’ultra-centrifugation
• Le développement de centrifugeuses à haute
vitesse, ou ultracentrifugeuses, imposant des
accélérations supérieures à 20 000 fois la
pesanteur terrestre (20 000 g) a permis le
fractionnement subcellulaire.

• La vitesse de sédimentation des particules

dépend de leur taille, de leur forme (globulaire
ou allongée) et de leur densité, elle est
quantifiée par le coefficient de sédimentation
donné en unités Svedberg (S).
 3-1-La centrifugation différentielle
• La centrifugation différentielle (figure 1):
• Les particules sédimentent à une vitesse donnée,
en fonction de leur taille et de leur densité, dans
le tampon d’homogénéisation.

• Le procédé de purification des composants

cellulaires peut être réalisé en plusieurs étapes,
le surnageant étant chaque fois centrifugé plus
vite et plus longtemps.
3-1-La centrifugation différentielle
 3-2-La centrifugation sur gradient de densité
• La centrifugation sur gradient de densité (figure 2 ):
• L’échantillon est déposé sur un gradient de densité puis
centrifugé à une vitesse adaptée à la séparation des particules
d’intérêt.
• Les molécules utilisées pour former les gradients peuvent être
des sucres (saccharose), des sels métalliques (chlorure de césium
CsCl), des colloïdes (Percoll).
• Il faut distinguer la centrifugation zonale de la centrifugation à
l’équilibre.

• Lors d’une centrifugation zonale, la densité maximale du

gradient est inférieure à la densité maximale des particules. Il y
a donc une séparation basée sur la vitesse de sédimentation. La
durée est contrôlée pour que les particules ne sédimentent pas
jusqu’au fond du tube.
 3-2-La centrifugation sur gradient de densité

• Lors d’une centrifugation à l’équilibre (isopycnique), la densité

maximale à la base du gradient est supérieure à la densité
maximale des particules. La séparation est basée sur la densité.
• La durée de centrifugation peut être très longue jusqu’à ce qu’un
équilibre soit atteint.
• Dans ces procédures, le gradient peut être continu ou discontinu,
on parle alors de centrifugation « sur coussin ».
• Avec le chlorure de césium utilisé pour séparer différentes formes
d’acides nucléiques (ADN génomique, plasmidique, ARN), le
gradient n’est pas préformé. L’échantillon est mélangé à une
solution concentrée de CsCl puis, au cours de la centrifugation, un
gradient de CsCl se forme ce qui entraîne la séparation des acides
nucléiques.
3-2-La centrifugation sur gradient de densité
 Chapitre II : Méthodes d’étude de la cellule

• IV- Méthodes d’étude physique

(autoradiographie, fluorescence).
 1-L'autoradiographie
• - C'est une technique qui peut s'appliquer à de
nombreuses autres techniques, dès lors qu'une
molécule est marquée par un isotope radioactif.

• - On utilise des radioisotopes qui émettent un

rayonnement de particules β, capables d'activer
une émulsion photographique.

• Les applications de l'autoradiographie sont

nombreuses : étude de liaison d'un récepteur à
une hormone, par exemple, hybridation in situ,
étude de prolifération cellulaire, etc .....
 3- Autoradiographie
• Cette technique permet la détection de molécules
radioactives.
• Si on incube un tissu ou des cellules en culture avec :

• De la leucine tritiée (3H–Leu) :

• Les protéines synthétisées pendant l’incubation sont
radioactives suite à l’incorporation de la leucine tritiée.

• Pourquoi la leucine ? Parce qu’elle est retrouvée dans

toutes les protéines et qu’elle est peu métabolisée
(contrairement à la glycine qui est un glucoformateur)
 3- Autoradiographie
• - De la désoxythymidine tritiée :
• L’ADN synthétisée pendant l’incubation est radioactive.
• Pourquoi la désoxythimidine ? Parce qu’elle est retrouvée
dans toutes les protéines et qu’elle est peu métabolisée
(contrairement à l’adénosine qui peut être transfomée pour
l’ARN)

• - De l’uridine tritiée :
• Les ARN synthétisés pendant l’incubation sont radioactifs.

• - Des oses tritiés :

• Les polyosides ou les oligosaccharides synthétisés pendant
l’incubation sont radioactifs (mais pas de glucose tritié
parce qu’il est trop métabolisable)
 2- fluorescence
• Exp: La cytométrie en flux (CMF):

• Est une technique permettant de faire défiler des

particules, molécules ou cellules à grande vitesse dans le
faisceau d'un laser, en les comptant et en les caractérisant.

• C'est la lumière réémise (par diffusion ou fluorescence) qui

permet de classer la population suivant plusieurs critères et
de les trier.

• La cytométrie en flux est définie comme l’étude précise de

particules isolées ou de cellules, bactéries, etc. (vivantes ou
mortes) entraînées par un flux liquide ou gazeux.

• C’est une technique de caractérisation individuelle,

quantitative et qualitative de particules en suspension
dans un liquide.
 2- fluorescence
• Exp: La cytométrie en flux (CMF):

• Est une technique qui permet de mesurer sur une suspension de

particules (cellules, bactéries, parasites, billes..) les
caractéristiques individuelles de chaque particules telles que la
taille, la forme et la complexité et n’importe quel composant ou
fonction qui puisse être détecté par un composé fluorescent.

• Les cellules en suspension passent une à une devant un ou

plusieurs faisceau(x) laser et des détecteurs captent des signaux
émis par chaque cellule tels que :

• - La lumière diffusée aux petits angles (Forward Scatter, FSC) qui

renseigne sur la taille des particules.

• - La lumière diffusée à 90 degrés (Side Scatter – SSC) qui

renseigne sur la forme, la structure interne et la granularité des
particules.
 2- fluorescence
Les signaux de fluorescence:
• - Fluorescence émise par la cellule elle-même
(autofluorescence)

• - Fluorescence émise par un anticorps couplé à un

fluorochrome et qui se lie spécifiquement à la cellule.

• Les données ainsi recueillies se présentent sous forme de

graphiques ou d’histogrammes auxquels s’ajoutent des
statistiques concernant les populations cellulaires et les
paramètres étudiés (%, CV, intensité de fluorescence, etc.).

• Le principal avantage de la cytométrie en flux est la vitesse

d’acquisition des données pour un très grand nombre de
cellules, permettant l’analyse de sous-populations cellulaires
complexes et/ou rares et de les trier pour ensuite les mettre
en culture ou encore les analyser avec des outils de biologie
moléculaire.
 Chapitre II : Méthodes d’étude de la cellule

• V- Culture des cellules.

 V- Culture des cellules.
• Elle permet d'obtenir une grande quantité de cellules, mais
celles-ci ne sont pas dans leur milieu naturel, mais dans un
milieu de culture.

• La culture cellulaire est obtenue après le maintien en vie de

cellules plus de 24 heures dans un milieu de culture artificielle.

• On met en évidence deux types de cultures :

• Les cultures organotypiques sont soumises à un maintien de

la différentiation morphologique et fonctionnelle. Ces
fragments d’organes ou tissus sont appelés des explants.

• Les cultures histiotypiques correspondent à une

multiplication active mais sans maintien de l’organisation.
 V- Culture des cellules.
• 1-Culture de bactéries
• Dans un milieu de culture:
• -Une source de C (glucose)
• -Une source de N (NH4 +)
• -ions: Na+, K+, Ca++
• -Oligoéléments

• Milieu
• - liquide
• - solidifié par de l’agar Colonies de Pseudomonas aeruginosa
cultivées sur agar

• En conditions stériles, laboratoires de sécurité

•
• 24h
• 1 bactérie 1 clone=106 bactéries
 V- Culture des cellules.
• 2-Culture de cellules animales
•
• Dans un milieu de culture liquide:
• -glucose
• -Acides aminés
• -nucléotides
• -ions: Na+, K+, Ca++…
• -Oligoéléments
• -10% de sérum (car contient des facteurs de croissance)

• En conditions stériles, laboratoires de sécurité

• Si cellules normales: culture limitée dans le temps.

• Si cellules tumorales: culture indéfinie.

 V- Culture des cellules.
• 3-Culture de cellules végétales

• Culture en masse de cellules de méristème

• plante

• Culture de cellules isolées: enlever la paroi

Chapitre II : Méthodes d’étude de la cellule

• VI- Technique de l’ADN recombinant.

 VI- Technique de l’ADN recombinant.

La technologie de l’ADN recombinant a révolutionné

l’étude de la cellule en permettant aux chercheurs de
choisir à volonté n’importe quel gène parmi les milliers
d’une cellule et après une étape d’amplification, de
déterminer la structure moléculaire exacte du gène.

Les possibilités de manipulation du matériel génétique

et des approches thérapeutiques qui y correspondent
en découlent.
 Principe
ORGANISME DONNEUR VECTEUR
: Extraction d'un (fragment d'ADN
fragment d'ADN capable de
d'intérêt réplication
autonome)

Exemple : gène associé à une

maladie Insertion du fragment d'intérêt
dans le vecteur

Obtention d'un ADN Recombinant

Amplification de cet ADN, expression des protéines

correspondantes...
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 Définitions
• L'ADN recombinant provient d'une combinaison entre l'ADN d'un
organisme donneur et celui d’un vecteur (qui peut être d'une espèce
totalement différente).

• Génie Génétique ou technologie de l’ADN recombinant : ensemble des

techniques de construction d’un ADN recombinant et ses utilisations.

Les cellules modifiées (ayant intégré un ADN recombinant) peuvent exprimer la

protéine recombinante (par exemple une protéine d’une espèce différente, une
protéine modifiée (mutée, fusionnée à une étiquette…)).

• Le clonage désigne plusieurs choses :

- Une multiplication à l'identique (conservation parfaite de l'information

génétique) : à l’échelle cellulaire (clonage cellulaire) ou à l’échelle de
l’organisme entier (clonage reproductif).

- L’amplification d’un fragment d’ADN par des micro-organismes après

son insertion dans un vecteur.
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