METHODES D´ETUDES DE LA

CELLULE
Pr Bourama Coulibaly
 PLAN

• INTRODUCTION

• TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

• TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT DES

CONSTITUANTS CELLULAIRES

• TECHNIQUES DE MARQUAGE CELLULAIRE

 PLAN

• INTRODUCTION

• TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

• TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT DES

CONSTITUANTS CELLULAIRES

• TECHNIQUES DE MARQUAGE CELLULAIRE

 INTRODUCTION
• Les avancées en biologie cellulaire sont
directement liées à:
La mise en œuvre de méthodes et de
techniques nouvelles et
La perfection des méthodes existantes
• La biologie cellulaire reste dépendante de
l´utilisation combinée de plusieurs groupes
de méthodes ou techniques
 INTRODUCTION
 Les méthodes ou techniques le plus souvent
utilisées en biologie cellulaire sont :
• La morphologie
• La biochimie
• L´électrophysiologie
• La biophysique
• La biologie
• La génétique moléculaire…
 PLAN

• INTRODUCTION

• TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

• TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT DES

CONSTITUANTS CELLULAIRES

• TECHNIQUES DE MARQUAGE CELLULAIRE

 TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
Observation des cellules délicate du fait de
leurs très petites tailles, et nécessite un
certain nombre d’appareillages dont les
microscopes
On distingue deux grands types de
microscopes suivant leur résolution
 TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

1- Microscopie photonique

2- Microscopie électronique

 TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

1- Microscopie photonique

2- Microscopie électronique

TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
1-La microscopie photonique
• Généralités
–Définition : examen d’objets agrandis en
présence de photons
–Domaines d’application : jusqu’à 0.2 µm

• Deux types de microscopes photoniques:

Le microscope à fond clair
 Le microscope à fond noir
TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
1-La microscopie photonique (suite)
• Le microscope à fond clair
–Description
Partie mécanique
• Support
• Tube binoculaire
• Tube porte objectif
TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
- Partie optique
• Source lumineuse
• Système condenseur – diaphragme
• Objectifs 4x/10x/40x/100x
• Oculaires 10x/…

–Principe de formation de l’image

Objectif à image agrandie inversée
Oculaire à image intermédiaire agrandie
inversée
TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
–Applications
Histologie/ Cytologie

Hématologie

Parasitologie

Bactériologie
L’observation en histologie
L’observation à
différents
grossissements
TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

• Le microscope à fond noir

–Principe
Eclairage par un condenseur à fond noir
Aucune lumière ne pénètre dans
l’objectif
Observations des contours de la cellule
par diffraction
–Applications
Bactériologie
TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

• Le microscope à fond noir

LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

• Le microscope à contraste de phase

–Principe
»Objectif avec anneau de phase intégré
»Modification de la phase des rayons
lumineux à variation d’intensité
lumineuse
–Applications
»Observation de cellules vivantes
LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

• Le microscope à contraste de phase

LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

–Le microscope à fluorescence

Pour les microscopes optiques à fluorescence la
lumière reçue par l’œil ne traverse pas l’objet ;
 ici on utilise des molécules fluorescentes
appelées des fluorochromes, qui sont utilisés
comme colorant
 La lumière excite les fluorochromes qui
réémettent dans des plus grandes longueurs
d’ondes c’est-à-dire dans des énergies plus basses.
LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

–Le microscope à fluorescence

–Principe de la fluorescence
»C’est l’émission de lumière suite à l’absorption de
photons
»Différents types de fluorescence
Primaire : produite naturellement par certaines
substances biologiques (ex : chlorophylle)
Secondaire : obtenue artificiellement en liant un
composé non fluorescent avec un composé
fluorescent (fluorochromes)
LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

–Le microscope à fluorescence

LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

–Le microscope à fluorescence

–Applications
»Bactériologie (cytométrie sur filtre)
»Immunofluorescence
 TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

1- Microscopie photonique

2- Microscopie électronique

 TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
• Microscopie électronique

Microscope électronique à transmission

Microscope électronique à balayage

 LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
– La microscopie électronique
• Le microscope électronique à transmission
Principe
Utilisation des électrons à la place des photons
 Caractéristiques
 Dimension = 1 nm
 Grossissement = 1400 x à 500 000 x
 Description
Canon à électrodes
Accélérateur d’électrons
Lentille électromagnétique
Ecran fluorescent de visualisation
 LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
– La microscopie électronique
• Le microscope électronique à transmission
 LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
– La microscopie électronique
• Le microscope électronique à transmission
 LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
– La microscopie électronique
• Le microscope électronique à balayage
La microscopie électronique à balayage consiste à
balayer une préparation par un faisceau d’électrons,
permettant la mise en évidence des reliefs de
l’échantillon.
 LES TECHNIQUES MICROSCOPIQUES
– La microscopie électronique
• Le microscope électronique à balayage
Principe
Les cellules sont traitées par des sels de métaux lourds
Les électrons émis par la cathode vont balayer la
surface de la cellule
 Caractéristiques
 d = 10 nm
G = 20 000x
 Applications
Biologie cellulaire
 PLAN

• INTRODUCTION

• TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

• TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT DES

CONSTITUANTS CELLULAIRES

• TECHNIQUES DE MARQUAGE CELLULAIRE

 TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT
DES CONSTITUANTS CELLULAIRES
•  Les méthodes de fractionnement
subcellulaire consistent à séparer les
différents composants cellulaires par
destruction de la membrane plasmique,
puis par désorganisation de la cellule.
 TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT
DES CONSTITUANTS CELLULAIRES
 Homogénéisation
• Le but de l’homogénéisation est de rompre
la membrane plasmique (ou la paroi pour
les cellules végétales et fongique)
• Pour se faire on met les cellules en
suspension dans un tampon de pH et de
force ionique connus.
 TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT
DES CONSTITUANTS CELLULAIRES
 Homogénéisation
• L’homogénéiseur est un tube de verre
dans lequel on place la préparation puis un
piston en verre
• La cellule passera entre le tube de verre et
le piston, sera ainsi comprimée et éclatera,
libérant son contenu dans le tampon.
 TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT
DES CONSTITUANTS CELLULAIRES
 Homogénéisation
• On obtient un homogénat avec tous les
constituants de la cellule
• La plupart des organites restent intactes,
mais sans précaution particulière l’appareil
de Golgi et le réticulum endoplasmique
vont être fragmentés sous forme de
vésicules appelées microsomes.
 TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT
DES CONSTITUANTS CELLULAIRES
•  Purification
• a) Centrifugation différentielle
• La centrifugation différentielle permet la
purification de l’homogénat en fonction de
la taille et de la densité de ses constituants
• Pour se faire on centrifuge l’homogénat à
différentes vitesses ; à chaque vitesse,
différents organites se déposent dans le
culot, qui sera prélevé
 TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT
DES CONSTITUANTS CELLULAIRES
•  Purification
• a) Centrifugation différentielle
• A 600g, on observe la sédimentation du
noyau et du cytosquelette.
• A 15 000g, on observe la sédimentation
des mitochondries, des lysosomes et des
peroxysomes
 TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT
DES CONSTITUANTS CELLULAIRES
•  Purification
• a) Centrifugation différentielle
• A 100 000g (ultracentrifugation), on
observe la sédimentation de la
membrane plasmique, des microsomes et
des grands polysomes
• A 200 000g, on observe la sédimentation
des ribosomes et des petits polysomes
 PLAN

• INTRODUCTION

• TECHNIQUES MICROSCOPIQUES

• TECHNIQUES DE FRACTIONNEMENT DES

CONSTITUANTS CELLULAIRES

• TECHNIQUES DE MARQUAGE CELLULAIRE

 TECHNIQUES DE MARQUAGE
CELLULAIRE
Techniques cytochimiques et
immunocytochimiques ; techniques
cytoenzymologiques
Techniques de marquage isotopique
 TECHNIQUES DE MARQUAGE
CELLULAIRE
 TECHNIQUES CYTOCHIMIQUES ET
CYTOENZYMOLOGIQUES
• Techniques cytochimiques
–Mise en évidence d’un composé chimique de
la cellule au microscope optique/électronique
• Techniques cytoenzymologiques
–Mise en évidence dans une cellule de
protéines à activité enzymatique
 TECHNIQUES DE MARQUAGE
CELLULAIRE
 TECHNIQUES DE MARQUAGE ISOTOPIQUE
• Principaux isotopes utilisés en biologie
–Isotopes non radioactifs : 15N
–Isotopes radioactifs :
– 3H ; 14C ; 131I ; 35S
–Dosage de la radioactivité dans un
compteur à scintillation
TECHNIQUES DE MARQUAGE
CELLULAIRE