CHAPITRE II.

TECHNIQUES D’ÉTUDE DE LA CELLULE

Le microscope
Le biologiste dispose actuellement d’un grand nombre de techniques et
d’instruments particulièrement adaptés à l’étude de la cellule.
I- Le microscope optique (ou photonique) :

• Le microscope optique en lumière transmise

permet d'étudier les cellules fixées (tuées sans
modifications essentielles de leur structure) et
colorées. Un objet éclairé en lumière
transmise est examiné à travers un système
optique.
• Le système optique d'un tel microscope est
composé d'un premier système de lentilles
appelé objectif, qui donne une image réelle
agrandie de l'objet, et d'un deuxième système
de lentilles appelé oculaire, qui donne une
image virtuelle de cette dernière. L'image
finale se forme au niveau de l'œil ou d'un
appareil photographique associé au
microscope.
• La puissance d'un microscope est définie par
le produit du grandissement de l'objectif par
la puissance de l'oculaire.
• Le pouvoir séparateur d’un microscope est
défini comme la distance minimale séparant
deux points du plan objet dont le microscope
donne des images distinctes ; sa valeur (d) est
donnée par la formule :
𝑑 = 0,6 𝜆 ÷ 𝑛. 𝑠𝑖𝑛α
• λ = longueur d'onde de la lumière utilisée (0,4
à 0,8 μm, si lumière naturelle) ;n = indice de
réfraction du milieu situé entre l'objet et la
lentille objectif ; α = demi-angle d'ouverture
de l'objectif.
• On appelle le produit n.sin α : ouverture
numérique de la lentille.
La valeur de d devant être aussi faible que
possible, il faut donc diminuer au maximum λ et
augmenter l'ouverture numérique. Ceci se fait
en sélectionnant dans la lumière blanche
naturelle des longueurs d'onde proches du
violet, grâce à un filtre approprié.
• L'ouverture numérique peut être
significativement augmentée en remplaçant
l'air (n = 1) entre la lentille et l'objet (cas des
objectifs habituels) par une huile transparente
dont l'indice de réfraction est élevé (n = 1,52) ;
• Dans les meilleures conditions, le pouvoir
séparateur du microscope photonique atteint
sa limite théorique, qui est comprise entre 0,2
et 0,3 µm.
 II- Le microscope électronique
• a. Le microscope électronique à transmission(MET)
Son principe est comparable à celui du microscope
photonique, à la différence près que le faisceau de photons
est remplacé par un faisceau d'électrons. La longueur d'onde
associée à un faisceau d'électrons est d'autant plus courte
que leur vitesse est plus élevée : lorsque ceux-ci sont
accélérés sous vide sous une tension de 50 000 volts, celle-ci
est de 0,005 nm, c'est-à-dire 105 fois plus courte que celle
de la lumière visible moyenne ; cette longueur d'onde est
beaucoup plus petite que la taille d'un atome d'hydrogène
(voisine de 0,1 nm).
• Le pouvoir séparateur du microscope
électronique est de 0,2 nm et est 1 000 fois
plus élevé que pour le microscope classique.
• Lorsque le faisceau incident d'électrons
primaires traverse l'objet à analyser, ceux-ci
sont absorbés ou réfléchis par certains de ses
atomes et ils ne participent donc pas à la
formation de l'image. Les atomes majeurs de
la matière vivante (C, H, O, N) sont
transparents aux électrons, d'où la nécessité
de contraster les structures au moyen
d'atomes lourds, opaques aux électrons, qui
se fixent plus ou moins sélectivement à leur
niveau.
• En raison du faible pouvoir pénétrant des
électrons, les objets observés doivent être
extrêmement fins (coupes de 50 à 100 nm), ce
qui nécessite des techniques spécifiques
d'inclusion et de coupe des échantillons : un
spécimen de 0,5 à 1 µm d'épaisseur apparaît
presque totalement opaque à 50 kvolts. Les
images obtenues avec cette technique
d'observation de coupes en transmission ne
sont que le reflet très incomplet des objets
étudiés.
• b. Le microscope électronique à balayage(MEB)
Un faisceau d'électrons balaie la surface de cellules
ou de tout autre échantillon préalablement
recouverts d'un film de platine obtenu par ombrage
métallique. La résolution du MEB est de l'ordre de 1
nm. L'échantillon est placé sur des céramiques
piézoélectriques, dont la taille change quand on
applique un champ électrique. Une précision de
déplacement de l'ordre de 0,2 nm est ainsi obtenue.
Il est donc possible de balayer l'objet en le déplaçant
par rapport à la pointe avec une très grande
précision. L’image est observée sur un moniteur.
 III. Le microscope à fluorescence
• Ce type de microscope permet de voir les molécules qui
émettent des photons de longueur d'onde déterminée
après excitation par une source lumineuse. Ces
molécules portent le nom de fluorochromes. Un
microscope optique à fluorescence possède une source
de lumière blanche très intense (lampe à mercure).
Cette lumière traverse un filtre dit d'excitation. Les
molécules fluorescentes alors excitées émettent une
lumière visible, qui est concentrée par une lentille
objectif et sélectionnée sur un filtre d'émission.
• Le fluorochrome est fixé par covalence à une
protéine dont on souhaite connaître la localisation
dans la cellule (comme l'actine, la tubuline). Leur
localisation en microscopie à fluorescence est
facile, il est possible de suivre leur parcours
intracellulaire et ainsi d'étudier les activités
dynamiques auxquelles elles participent.
Il existe d’autres types de microscopes qui
permettent l’étude le la cellule comme : le
microscope polarisant, le microscope à contraste de
phase, le microscope confocale ….etc.
• 2. Techniques de l'histologie classique et
électronique
a. HISTOLOGIE CLASSIQUE
Lorsque le matériel biologique est massif (tissus
animaux ou végétaux : foie, cerveau, muscle...,
ou tige, feuille, racine...), il faut préalablement le
débiter en tranches fines et régulières, qui
seront ensuite colorées. Les étapes de ce
protocole sont les suivantes.
1) La fixation a pour but de tuer les cellules tout en
modifiant le moins possible leurs structures internes. On
utilise à cet effet des acides, alcools, aldéhydes, certains
sels... Ces fixateurs, dits coagulants, doivent être adaptés à
la nature du matériel biologique analysé et au type de
coloration employé ultérieurement ; il en existe un
nombre considérable.
2) La déshydratation a pour but d'éliminer l'eau de
l'échantillon et de la remplacer par un solvant du milieu
utilisé pour l'inclusion ; elle consiste en une série de bains
dans des alcools de plus en plus concentrés. Un dernier
bain est réalisé dans un mélange alcool/solvant organique
du milieu d'inclusion (ex. xylène, toluène)
3) L'inclusion a pour objectif d'imprégner totalement les
cellules d'une substance durcissante, qui permettra une
coupe fine et régulière. Cette substance, est souvent la
paraffine qui est liquide à 60 °C et dure à la température
ambiante ; soluble dans les solvants cités plus haut, elle
pénètre très aisément dans les tissus, on obtient à la fin
un «bloc» qui pourra être correctement coupé et qui sert
aussi de moyen de stockage des échantillons.
4) La coupe a pour but de réaliser des sections fines (de 2
à 10 μm d'épaisseur) et transparentes de l'objet inclus.
On utilise un microtome, muni d'un rasoir métallique et
d'un système d'avance mécanique du porte-objet, qui
donne des coupes sériées.
5) La coloration permet de teinter de façon différentielle
les divers territoires de l'échantillon biologique. les
colorants naturels ou synthétiques sont des sels neutres
comportant un radical acide et un radical basique. Les
structures basophiles (hétérochromatine, nucléole) fixent
les colorants basiques, les structures acidophiles fixent les
colorants acides.
6) Le montage a pour but de rendre la préparation
permanente, c'est-à-dire observable pendant des années.
Après une déshydratation rapide de la préparation
colorée, celle-ci est recouverte d'une goutte de résine
naturelle ou synthétique, par dessus laquelle on dépose
une lamelle de verre.
• B. HISTOLOGIE ÉLECTRONIQUE
La réalisation de coupes ultrafines adaptées à la
microscopie électronique a nécessité l'apport de
plusieurs modifications au protocole précédent.
La fixation et l'inclusion sont des opérations
cruciales. De plus, la réalisation de coupes
ultrafines a nécessité la fabrication d'ultra-
microtomes très sophistiqués (coupes de 50 nm
d'épaisseur). L'observation directe se fait sur un
écran fluorescent situé dans l'axe du faisceau
d'électrons :
1) La fixation : Les fixateurs classiques ne suffisent
pas car ils tendent à coaguler les protéines et à
détruire les structures fines. Il faut utiliser ici des
agents chimiques qui réalisent des pontages entre
les molécules voisines (le permanganate de
potassium assure une excellente conservation des
membranes lipoprotéiques, mais les acides
nucléiques sont très mal fixées ; le tétroxyde
d'osmium il pénètre mal dans les cellules ; le
glutaraldéhyde pénètre bien dans les cellules, fixe
efficacement de nombreuses structures, sauf les
membranes).
2) Inclusion en résine : Le principe est le même que pour
l'histologie classique, à la différence presque la déshydratation
préalable doit se terminer dans un solvant de la résine utilisée
pour l'inclusion. On obtient des petits blocs solides et très durs,
incluant et imprégnant l'échantillon à analyser.
3) La coupe : (ultramicrotomie)
Les coupes, de très faible taille (moins de 0,5 mm de côté) et
très fines, sont invisibles à l'œil nu et difficilement manipulables
sans l'aide d'une loupe. Le couteau est en fait muni d'une petite
cuvette contenant de l'eau à la surface de laquelle les coupes
flottent. Celles-ci sont récupérées sur des grilles de 3 à 4 mm de
diamètre, à mailles très fines, qui servent en fait de porteobjet
et seront introduites dans la colonne du microscope.
4) La coloration : Cette étape consiste en un
simple renforcement des contrastes : on parle de
«coloration positive». Certains atomes de métaux
lourds se fixent sélectivement sur diverses
structures cellulaires, fixation qui arrête
efficacement les électrons à leur niveau. Le
résultat est un meilleur contraste des images.
On utilise pour cela des solutions d'acétate
d'uranyle ou de citrate de plomb et on fait flotter
quelque temps les grilles portant les coupes sur
des gouttes de ces substances.
• 3. Méthodes de fractionnement cellulaires
Les méthodes de fractionnement subcellulaire
consistent à séparer les différents composants
cellulaires par destruction de la membrane
plasmique, puis par désorganisation de la
cellule.
• 1- HOMOGÉNÉISATION
Le but de l’homogénéisation est de rompre la membrane
plasmique (ou la paroi pour les cellules végétales et fongique).
Pour se faire on met les cellules en suspension dans un
tampon de pH et de force ionique connus.
L’homogénéiseur est un tube de verre dans lequel on place la
préparation puis un piston en verre. La cellule passera entre le
tube de verre et le piston, sera ainsi comprimée et éclatera,
libérant son contenu dans le tampon. On obtient un
homogénat avec tous les constituants de la cellule. La plupart
des organites restent intactes, mais sans précaution
particulière l’appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique
vont être fragmentés sous forme de vésicules appelées
microsomes.
• 2- PURIFICATION
• A - Centrifugation différentielle : Elle permet la purification de
l’homogénat en fonction de la taille et de la densité de ses
constituants. Pour se faire on centrifuge l’homogénat à différentes
vitesses ; à chaque vitesse, différents organites se déposent dans
le culot, qui sera prélevé :
 à 600g, on observe la sédimentation du noyau et du cytosquelette.
 à 15 000g, on observe la sédimentation des mitochondries, des
lysosomes et des peroxysomes.
 à 100 000g (ultracentrifugation), on observe la sédimentation de la
membrane plasmique, desmicrosomes et des grands polysomes.
 à 200 000g, on observe la sédimentation des ribosomes et des
petits polysomes. Ce qui reste à lafin c’est la fraction hydrosoluble
du cytosol
• B- Centrifugation par gradient préformé : Elle consiste
à déposer une mince couche d’homogénat au dessus
de la solution de saccharose dont la concentration
varie de façon régulière et décroissante du bas vers le
haut. Les différents constituants de l’homogénat
sédimentent tous à des vitesses différentes, on
obtient ainsi différentes bandes (la couche la plus
dense étant au fond) que l’on séparera. La vitesse de
sédimentation dépend de la taille des molécules, de
la forme des particules et de la densité. La vitesse de
sédimentation est définie par le coefficient de
sédimentation en unité Svedberg(S)