II.

Microscopie lectronique
- Principe de fonctionnement: Utilise un faisceau dlectrons; Grossissements: x 1000 500 000 fois; Pouvoir de rsolution = 0,1nm (2nm usuellement en biologie). Do la rvlation des plus fines structures internes de la cellule. Il existe deux techniques d'observation en microscopie lectronique : - La microscopie lectronique transmission. - La microscopie lectronique balayage.

Rappels Le pouvoir sparateur d'un microscope optique est limit par la longueur d'onde de la lumire visible L'utilisation de particules acclres de plus courte longueur d'onde associe permet d'augmenter le grossissement. Le choix d'lectrons acclrs, pour produire un rayonnement de courte longueur d'onde, est dtermin par plusieurs critres : - masse faible de ces particules qui peuvent tre acclres et focalises au moyen de champ lectrique ou magntique - une source d'lectrons est aise mettre en uvre

Analogie avec le microscope photonique La microscopie lectronique en transmission est trs proche de la microscopie photonique conventionnelle. En microscopie photonique on utilise des photons En microscopie lectronique on utilise un faisceau d'lectrons

Exemple de Pseudomonas aeruginosa

Aspect au microscope optique transmission

Aspect au microscope lectronique balayage

Aspect au microscope lectronique transmission

Le microscope lectronique transmission.

Dans sa conception, un MET ressemble un microscope classique, mais en plus dtre plus grand et invers, il est: - coupl un systme de pompage qui ralise le vide dans la colonne du microscope. Ce vide est ncessaire pour permettre le dplacement des lectrons (qui sinon entrent en collision avec les molcules de l air) et leur permettre de traverser lchantillon pour en tablir une image. - Le flux des lectrons provient du chauffage dun filament et de lacclration des lectrons librs par le filament au moyen d une diffrence de potentiel de 60 100 kilovolts. - Le flux des lectrons peut tre focalis au moyen de lentilles magntique situes dans les parois de la colonne du microscope.

A- L a microscopie Electronique (ME) Elle est similaire au microscope optique, sauf qu'elle utilise des Electrons et les lentilles sont lectromagntiques. La colonne surmontant l'installation est occupe par une cathode qui enverra les lectrons, un systme de refroidissement, et un systme permettant de faire le vide (car les lectrons ne voyagent pas dans l'air). Le grossissement est rgl par les tensions appliques sur les lentilles. Il y aura: Une lentille de condensation L'chantillon Une lentille d'objectif Le projectif qui projette l'image sur un cran fluorescent En dessous il y aura une plaque qui permet la capture d'image.

Les contraintes sont dtermines par: l'paisseur de l'objet qui doit tre encore plus fin que 5 microns les lectrons font des contrastes et pas des colorations, donc l'image sera en noir et blanc. 1. Comment avoir une coupe ultrafine de 60-100 nm d'paisseur ? On peut observer les organites qui doivent tre fix trs rapidement, sinon ils seront dtruit. Fixation au Glutaraldhyde, qui fixe les protines trs rapidement Post fixation l'Acide Osmique qui fixe les lipides. Dshydratation en passant par un solvant: Elle consiste remplacer l'eau des cellules par un liquide hydrophobe : l'alcool ou l'actone.

 Le bloc doit tre trs rigide pour pouvoir tre coup finement, il y a donc une inclusion en rsine: Epon ou Araldite semi-liquide froid. La rsine est chauff 60C environ o elle polymrise L'chantillon enrob sera de l'ordre du millimtre cube On dcoupe l'chantillon avec un Ultra-microtome plus sensible (avec un pas de 50nm). Le couteau est fait de diamant et dont le fil fait 3mm. La coupe est maintenant ultra-fine avec une paisseur de 100nm. Les coupes sont regroupes sur des grilles maillage adapt. La coupe flotte la surface d'une cuve d'eau o elle sera rcupre. Avant de couper avec l'ultramicrotome, on vrifie que l'chantillon est intressant en faisant une coupe semi-fine. La coupe semi-fine aura une paisseur de 0.5 microns, et pourra tre colore et observ au Microscope Optique.

La fixation chimique en microscopie lectronique: Consiste reconstituer artificiellement, par adjonction d
une substance chimique, le gel protique du vivant trs hydrat (75% 95% d
eau). Il faut rendre les molcules de l
chantillon insolubles dans l
eau (rticulation), et ainsi bloquer les systmes enzymatiques pour viter toute modification structurelle ultrieure de l
chantillon. L
chelle trs fine laquelle se font les observations en ME impose de conserver, sans modification, les structures correspondant l
tat vivant

L
ultramicrotome (Reichert OMU3)

Avance thermique

Prparation du bloc

Placer le bloc sur son support

A l'aide d'une lame de rasoir : Enlever la rsine superflue Tailler la pointe du bloc en forme de pyramide

Couteau avec "piscine" fixe et tanchifie avec du vernis ongle ou de la paraffine

Couteau utilisable sec par exemple pour entamer les blocs

Couteaux en diamant pour la ralisation des coupes ultra fines

Ralisation de coupes semi-fines

Coupes d
paisseur 0,25
0,5 m Sparer les coupes ( l
aide d
un cil mont sur allumette)

Ralisation de coupes ultra-fines

Utiliser un couteau (en verre ou diamant) muni d'une piscine Remplir la piscine d'eau distille. Ajuster le niveau de faon ce que la surface de l'eau rflchisse la lumire.
Ajuster la distance couteau-bloc. Faire quelques coupes " la main". Afficher l'paisseur de coupe dsire

Dmarrer le moteur et laisser les coupes se faire automatiquement.
Lorsqu'un nombre de coupes suffisant est obtenu :
Rcuprer les coupes sur grilles, soit en posant la grille sur la coupe, soit en glissant la grille sous la coupe

Coupes semi-fines : -0,5 1 m - Elles permettent de se reprer dans l'chantillon - Observes en microscopie photonique aprs coloration topographique au bleu de toluidine (1 goutte, quelques secondes chaud). Coupes ultrafines: - 60 90 nm - Elles seront observes au microscope lectronique Transmission Les grilles : en cuivre pour les colorations ordinaires en nickel ou en or pour les immuno-marquages l'or collodal

2. Comment augmenter la visibilit ? a) Contraste positif On peut augmenter le contraste en utilisant les sels de mtaux: Citrate de Plomb Actate d'Uranyle Les lectrons sont arrts par les mtaux et l'image en tiendra compte b) Coloration ngative Coloration de petits objets isols et dposs sur une grille recouverte d'un filtre. Le produit de contraste (acide phosphotungstique) vient se mouler autour des objets, le MeT affichera alors une image en ngatif (en marquant les contours).

Contraste positif

Vue en microscopie lectronique transmission dune cellule de racine colore lacide osmique

c. Ombrage mtallique Il met en vidence de petits lments dans une cellule (ex: molcules protique de la membrane cellulaire). Le mtal chauff se dpose sur un cot de la structure.

Une fois dpos, il faudra solidariser la structure en appliquant un filtre transparent. L'chantillon pourra ensuite tre dtruit, et on ne gardera que la rplique qu'on passera au MET. On aura alors une image en contraste avec impression de relief. L'ombrage mtallique est souvent associ aux techniques suivante:

c1. La cryofracture
Un chantillon est tremp dans de l'Azote liquide (pour le refroidir), puis cass l'aide d'un couteau. La cassure se fera prfrentiellement entre les deux feuillets d'une membrane. Ainsi les faces internes des deux feuillets de la membrane pourront tre examin. Grce l'ombrage mtallique on pourra dterminer la concentration en protines !

c2. Le cryodcapage
On sublime l'eau du cytoplasme et on fait ainsi apparatre une partie du feuillet externe de la membrane. Cette technique est utilis pour faire apparatre le Cytosquelette.

Cette cellule de racine a t fracture froid. La surface de fracture a t ombre par des vapeurs mtalliques opaques aux lectrons et l'ensemble recouvert d'une couche rsistante de carbone transparente aux lectrons.

Les structures vivantes sont ensuite dtruites et seule la rplique (moulage) est observe en microscopie lectronique transmission. On observe gauche le noyau et les pores nuclaires, au centre du rticulum endoplasmique et droite la membrane plasmique avec des vsicules de scrtion.

Limite de rsolution dun microscope : Elle est lie aux phnomnes de diffraction de la lumire ou des lectrons n : indice de rfraction : moiti de langle douverture de la lentille de lobjectif : longueur donde Lhuile dimmersion a un indice de rfraction suprieur 1, d diminue donc. La microscopie optique utilise la lumire visible : 400 < < 800 nm. Pour la microscopie lectronique transmission, est associe aux lectrons en mouvement.

Pour la microscopie optique : d
2 m Pour la microscopie lectronique : d
1 nm Plus d est faible, plus on peut observer dobjets proches entre eux.

Protocole de base
(MET) Fixation chimique de la cellule Dshydratation Infiltration par une rsine = inclusion Ultra microtomie Contraster avec des sels de mtaux lourd actate duranyle, citrate de plomb Observation au microscope lectronique

III. L a microscopie Electronique Balayage (MEB)

Destin l'tude des surface cellulaire, il permet de voir la forme des objets. Son principe de base est similaire au microscope transmission. Source dlectron: cathode, srie de lentilles (voir disposition prcdente). Les cellules entires seront fixes puis mtallises (afin de maintenir la forme de la cellule), et le tout sera balay par un faisceau dlectron.

Lors du balayage, il y aura une rflexion des lectrons, qui seront dtect par un dtecteur scintillation et transformation en impulsion lectrique par un photomultiplicateur. Ces impulsions lectriques seront transform. L'image affich sera en relief. Ce MEB ne permet que de voir des surfaces et non la structure interne des cellules

MESSAGE
Principe Le principe du balayage consiste explorer la surface de l'chantillon par lignes successives et transmettre le signal du dtecteur un cran cathodique dont le balayage est exactement synchronis avec celui du faisceau incident. Les microscopes balayage utilisent un faisceau trs fin qui balaie point par point la surface de l'chantillon. Interactions du faisceau lectronique avec l'chantillon Sous l'impact du faisceau d'lectrons acclrs, des lectrons rtrodiffuss et des lectrons secondaires mis par l'chantillon sont recueillis slectivement par des dtecteurs qui transmettent un signal un cran cathodique dont le balayage est synchronis avec le balayage de l'objet.

JEOL 6700F 2001

Microscope Balayage

Principe du MEB Ce nest pas proprement dit un microscope conventionnel dans le sens optique du terme: Il ny a pas formation dune image par une lentille objectif (comme cela est le cas en microscopie optique et en microscopie lectronique en transmission). Ici, limage est forme de faon squentielle en balayant la surface de lchantillon par un faisceau dlectrons et en recueillant soit les lectrons secondaires. soit les lectrons rtrodiffuss. Description du MEB La technologie en microscopie photonique ou lectronique comporte deux aspects distincts: La formation du faisceau (photonique , lectronique) La formation de l'image La formation du faisceau utilise la mme technologie que pour la microscopie lectronique en transmission.

La microscopie lectronique balayage permet dobtenir des images de surface

Source dlectrons LIMITE DE RSOLUTION 10nm GROSSISSEMENT X20.000

condensateur

lentille de lobjectif lectrons renvoys par lchantillon

Mode de prparation des objets pour la microscopie lectronique balayage. Le but est dobserver le relief des structures. Donc contrairement la plupart des autres techniques de microscopie, lobjet nest pas coup mais sa surface est recouverte dun film mtallique dpaisseur diffrentielle en fonction du relief. Le matriel biologique est ensuite dissout lacide; le film mtallique est rcupr et analys au microscope lectronique.

Vue au microscope lectronique balayage de globules rouges

Prparation des chantillons 1 Fixation: Elle se fait classiquement aux aldhydes (voir TEM). Dshydratation en bains dactone en concentration croissante dans leau jusqu actone pure. Les chantillons sont placs dans le vide lintrieur de la colonne, ils ne doivent renfermer aucun liquide et doivent donc subir une dessiccation. 2 Dessiccation: Elle consiste limer tout liquide contenu dans l'chantillon tudier. Dans le vide de l'appareil un liquide s'vaporerait immdiatement Souillures effondrement des structures biologiques

Sur cet il de mouche observ en microscopie lectronique balayage, il est possible de voir la topographie de la surface de l'il et l'agencement gomtrique des cellules accompagnes de poils sensoriels. Chaque petite sphre correspond une cellule qui se comporte comme un il lmentaire et donne l'image d'une partie du champ visuel de l'insecte.

Caillot sanguin observ en MEB

Chromosomes humains observs en MEB