Université Akli Mohand OuhadjBouira

Faculté des Sciences de la nature et de la Vie et des Sciences de la Terre

Département des Sciences Biologiques

Deuxième année licence (L2) en Biologie et Biotechnologie

Module : Méthodologie scientifique et techniques d’étude du vivant

Enseignante : Mme HABBI-CHERIFI

Année universitaire 2019/2020

 Partie I: Méthodes d’étude de la morphologie des cellules

Introduction

Un être vivant est un organisme doté d’un certain nombre de propriétés dynamiques
rassemblées sous le terme de physiologie. En effet, il évolue, se reproduit, se nourrit, se
déplace… et meurt.
Un organe est constitué d’un ensemble de tissus composés de différentes cellules. Toute
cellule dérive d’une cellule préexistante par division.

Il existe deux types fondamentaux de cellules :

• Les cellules procaryotes (pro = primitif; caryon = noyau): cellules sans vrai noyau
c’est-à-dire que le matériel génétique n’est pas enfermé dans une enveloppe nucléaire
et sans organites (Ex : bactérie) (Fig. 01).

Cytoplasme

(Cils)

Figure 1 : Cellule procaryote

• Les cellules eucaryotes (eu =vrai, caryon= noyau): Possèdent un vrai noyau : le
matériel génétique est entouré d’une enveloppe nucléaire. De plus, elles comprennent
de nombreux organites membranaires et un cytosquelette.
On distingue deux types de cellules eucaryotes: animale et végétale.
Les cellules animales et végétales sont entourées par une membrane plasmique et
présentent, en grande partie les mêmes organites. Sauf que la cellule végétale se distingue par
la présence : d’une paroi squelettique, des plastes et une vacuole de grande taille pouvant
occuper la plus grande partie du volume cellulaire (Fig.02).

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 Cellule animale Cellule végétale

Figure 2 : Cellule eucaryote

Chapitre I : Méthodes Cytologique

Les cellules sont de très petite taille et d’organisation très complexe. L’étude de leur
structure, de leur composition chimique et de leur fonctionnement (physiologie) a nécessité la
mise au point d’outils et de techniques appropriés qui ont été perfectionnés au fur et à mesure
des progrès scientifiques et technologiques réalisés dans divers domaines.
Trois approches sont développées pour étudier les divers aspects de la cellule :
*- les techniques morphologiques.
*- les techniques chimiques et biochimiques.
*- les techniques physiologiques.
Ces techniques sont toutes basées sur l’emploi de la microscopie.
1. La microscopie

La microscopie est un ensemble de techniques qui permet l’observation des cellules

vivantes ou mortes et d'obtenir une image des structures biologiques.
Le microscope est un instrument d’optique conçu pour observer des objets de très
faible taille. Le terme microscope vient du grec « mikros » qui signifie « petit » et « scope »
qui signifie « observer ».

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Le premier microscope fut sans doute fabriqué par Hans et Zacharias Janssen, deux fabricants
de lentilles néerlandais, en 1590, mais le modèle final fut inventé par Antoine van
Leeuwenhœk en 1664, puis fut amélioré par Christian Huygens.
On distingue deux grands types de microscopes suivant leur résolution :
- les microscopes optiques(MO) qui utilisent la déviation des particulesnon chargées :
les photons ;
- et les microscopes électroniques(ME) qui utilisent la déviation des particules
chargées : les électrons.
Ces particules traversent un système de lentilles de manière à former une image agrandie d’un
objet.
Deux types d’observations sont réalisables en microscopie :
-l’observation par transmission : l’échantillon est traversé par des photons et électrons ; les
lentilles de verre (MO) ou les champs électromagnétiques (ME à transmission) permettent
l’obtention d’une image qui est reprise par l’oculaire (MO) ou écran fluorescent (MET).
- et l’observation par réflexion : le microscope ne capte que les rayons réfléchis par les
parois de la préparation. Ce type de microscopie nécessite « un éclairage latéral » de l’objet,
ildonne une image de la surface des objets et non de leur structure interne.
Ce mode de microscopie est peu utilisé, il correspond au microscope à fond noir en
microscopie optique et au microscope électronique à balayage (MEB) en microscopie
électronique.
1.1.Microscope optique ou photonique (à lumière)
1.1.1. Présentation du microscope optique (MO) (Fig. 01) :
Il est utilisé :
→ en biologie, pour observer les cellules, les tissus,
→ en pétrographie pour reconnaître les roches,
→ en métallurgie et en métallographie pour examiner la structure d'un métal ou d'un
alliage.
Ce microscope a l’avantage de donner une vue générale des cellules ou des tissus et aussi
de permettre l’examen de cellules vivantes ; mais le pouvoir séparateur du microscope optique ne
peut dépasser 0,2 μm, le grandissement étant au maximum de 1000.
Le microscope optique est fondé sur l’utilisation de la lumière dont la source est une
lampe au tungstène.

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 Il est muni d'un objectif et d'un oculaire qui permet de grossir l'image d'un objet de petites
dimensions et de séparer les détails de cette image (ce qui caractérise respectivement son
grossissement et son pouvoir de résolution) afin qu'il soit observable par l'œil humain.
La puissance(ou grossissement)d’un microscope est définie par le produit du
grandissement de l’objectif par la puissance de l’oculaire.
La résolution du microscope optique est fondamentalement limitée par la diffraction de la
lumière.

Figure 1 : Présentation de microscope optique

1.1.2. Les différents types de microscope photonique

Les microscopes photoniques sont classer selon : l’éclairage,l’optique et la source lumineuse.

a. Selon l’éclairage
➢ Le microscope optique à fond clair
Il est souvent utilisé avec la lumière visible (comprise entre 400 et 700 nm) comme
source lumineuse. Il permet d’observer les plus petits objets biologiques dont la taille avoisine
0,5 um telles que les bactéries ou des organites cellulaires (mitochondries, chloroplastes,…),
des tissus …etc. ainsi que des structures cellulaires internes après coloration.
Ce type de microscope permet le grossissement de 1500 à 2000 fois et son pouvoir
séparateur ou limite de résolution est de l’ordre de 0, 2µm.
.
• La résolution ou le pouvoir séparateur (PS) est définie comme étant la distance minimale
séparant deux points individualisables.
• Pour les différentes parties de microscope et leur rôle voir TP

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 ➢ Le microscope optique à fond noir

Dans ce type de microscope, la source de lumière est oblique par rapport à la

préparation cellulaire.
Un dispositif (= un condensateur) à fond noir placé sous la platine du microscope permet
d'éclairer la préparation biologique en lumière rasante, seuls les rayons réfléchis sont captés
par l’objectif et le moindre objet apparaît brillamment éclairé mais sa forme et sa dimension
ne peuvent pas être correctement appréciées.
Il est utilisé pour l’observation des éléments trop transparents (cellules, Bulles d'air dans l'eau)
et non colorés.
b. Selon l’optique
➢ Le microscope à contraste de phase ou le microscope à contraste
d’interférence différentielle

Ce type de microscope est utilisé pour l’étude des cellules vivantes. En effet, il permet
l’observation des mouvements des cellules et de leurs organites tels que les mitochondries, les
chromosomes, et de suivre les étapes de certains processus comme la mitose(Fig.02).
Lorsque la lumière traverse une partie dense(ex:le noyau),elle est retardée par rapport
à celle qui traverse une région moins dense du cytoplasme. De ce cas,Les structures
biologiques induisent des changements de phase de la lumière qui les traverse, et des
interférences se créent par la recombinaison de ces deux séries d’ondes donnant des images
fortement contrastées.
Sans coloration, les éléments cellulaires n’absorbent pas ou très peu de lumière (invisibles au
microscope optique).
Dans un tel microscope, deux dispositifs, appelés anneaux (ou plaques) de phase, sont
placés l'un dans le condensateur (le système optique qui focalise la lumière sur l'objet) et
l'autre dans la monture de l’objectif. Ces anneaux permettent d'exploiter les propriétés de
diffraction des cellules.
Les images de l’observation peuvent être enregistrées par caméra vidéo, les films sont ensuite
projetés sur un écran de télévision.

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 a b

Figure 2 : Image d’une cellule obtenue à l’aide de microscope optique ordinaire (a) et à contraste de
phase (b)

c. Selon la source lumineuse

➢ Microscope à lumière polarisée

C’est un microscope optique auquel sont ajoutés 2 filtres polarisants (Fig.03) :

- 1er filtre = le polariseur, ce premier filtre est placé au dessus de la source de lumière, avant
la platine qui supporte la lame mince. Ce filtre peut être ôté par basculement.
- 2éme filtre = l’analyseur, ce deuxième filtre est placé après la lame mince, il est intégré dans
le porte oculaire.
Ces deux filtres (le polariseur et l’analyseur) sont placés en position croisée, c’est-à-dire que
la direction de vibration imposée par le 1er
polariseur est perpendiculaire à la direction de
vibration imposée par l’analyseur
La platine porte objet est une platine tournante
et graduée en degrés
Ce type de microscope permet de
détecter des structures biréfringentes qui ont
une organisation moléculaire particulière, telles
que les microtubules et les chloroplastes et
parois des cellulesvégétales. Il est également
utilisé en pétrographie pour l'observation et
l'identification des minéraux dans les roches.

➢ Microscope à fluorescence (à rayons UV)

Ce microscope est semblable au microscope photonique ordinaire, sauf qu’il est muni
d’une source de rayon UV (lampe à UV) et d’un système de filtre qui permet de choisir la
longueur d’onde des UV appropriés pour chaque substance.

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Il est le plus souvent utilisé pour détecter les protéines spécifiques ou d’autres molécules
rendues fluorescentes par couplage à un fluochrome ;
Exemple: on peut aussi détecter la présence d’insuline dans une cellule avec anticorps Anti-
insuline marqué par fluorescéine.
➢ Microscope confocal à balayage
Dans ce type de microscope, l’objet est éclairé par un faisceau laser finement focalisé
qui balai rapidement à un seul niveau n’éclairant qu’un plan mince de l’objet = point focal.
Les préparations sont souvent traitées par des colorants fluorescents et la lumière émise par la
coupe optique éclairée donne une image sur un écran vidéo. Après traitement informatique
des images séquentielles on obtiendra des images en trois dimensions de l'échantillon.

1.2.Microscope électronique (ME)

Le premier microscope électronique a été fabriqué en 1931, par Max Knoll et Ernst
Ruska et il s'est répandu à partir des années 60.
Le principe de ME est l’emploi des électrons en mouvement à la place de la lumière.
Le faisceau d’électrons est produit et accéléré par un canon à électrons (cathode et anode
percée = filament chauffé).
Les lentilles de verre sont remplacées par des bobines électromagnétiques
("lentilles"électromagnétiques) seules capables de focaliser les électrons, et de créer des
images.
La résolution d'un microscope électronique peut atteindre 2 angströms, mais généralement les
meilleurs microscopes atteignent 20 angströms seulement.
Les ë ne se propagent que dans le vide très poussé ce qui empêche toute observation sur le
vivant ;
Les coupes destinées à l’observation doivent être très minces (de l'ordre de 0,06 à 0,09 μm ~
0,1 μm) car La pénétration des ë dans la matière est très faible.
Il existe deux types de microscope électronique : le microscope à transmission et le
microscope à balayage.
➢ Microscope électronique à transmission (MET)
Le faisceau d'électron est émis par un canon à électron (filament de tungstène), focalisé
sur la préparation à l'aide de lentilles électromagnétiques (se trouvant dans le tube à vide) et la
traverse,
Les ë sont plus ou moins absorbée. L’image se forme derrière la préparation sur un écran
fluorescent relié à une plaque photographique.

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L’agrandissement des images peut atteindre plus de 100 000 fois et la résolution de ce type de
microscope électronique est de 2 angströms (0.2nm)
Ce type de ME permet d’étudier la structure interne de la cellule et d’analyser la composition
des objets (Fig.04)

a b

Figure 4 : Chloroplaste vue au microscope optique (a) et MET (b).

➢ Microscope électronique à balayage (scaning) :

Dans ce type de microscope, le flux d’électrons balaye la surface de l’objet au

préalable recouvert d’un film de platine obtenu par ombrage métallique. Ce sont les électrons
secondaires, renvoyés par la surface métallique, qui sont utilisés pour fournir une image
(Fig.05).
Il est équipé de détecteurs pour les électrons secondaires et les électrons rétrodiffusés.
Son pouvoir séparateur est de l'ordre de 250A°m, plus faible que celui du microscope à
transmission.
Le microscope électronique à balayagetechnique permet d’obtenir des photos spectaculaires
(à 3 D) de cellules entières, d’organes végétaux et même d’Insectes de petite taille. Toutefois,
cette technique ne donne pas la structure interne des cellules.
Les échantillons biologiques à observer doivent en général être recouverts d’une couche de 5
à 10 nm d’or, de platine ou de palladium, afin de réfléchir les électrons.

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 Figure 5 : Microscope électronique à balayage

1.3. Comparaison entre le microscope optique et électronique

Tableau comparatif entre le microscope optique et électronique

Caractéristiques M. optique M. électronique

Grossissement de 25 à 1500 fois 1500à 200000 fois

Pouvoir séparateur environ 0.2μm 2 à 20A°

Source lumineuse Faisceau de photons Faisceau d’électrons

Propagation de la Dans l’air Dans le vide

source de lumière
Lentilles En verre Electromagnétiques

L’image recueillie sur L’oculaire directement L’écran fluorescent puis sur une
plaque photographique

Les coupes au microtome : 2 à 10 μm à l’ultramicrotome : 0,05μm

Contraste Colorants sélectifs Artifices de coloration= métaux

lourds
Observation Des cellules vivantes ou mortes Cellules mortes

Image Avec sa coloration réelle En noir et blanc

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2. Conditions d'observation aux microscopes
2.1.Méthodes d'études par microscopie à lumière
a. Epaisseur : Dans l'observation par transmission, les rayons lumineux qui contribuent à
la formation de l'image traversent l'objet. Ainsi, l'observation exige que :
→ l'objet soit de faible épaisseur pour être traversé (2 à 5 μm). Si les dimensions des
cellules sont plus grandes, recourir aux méthodes de la microtomie = confection de
coupes.
→ il faut éviter les superpositions des structures pour que l'image ne soit pas trop
confuse.
b. Contrastes : L'observation par transmission au microscope photonique, ne fournit des
renseignements que si certaines régions de l'objet absorbent la lumière plus que d'autres, c’est-
à-dire que cet objet présente des contrastes.
Généralement les constituants cellulaires ont très peu de contrastes les uns par rapport aux
autres, alors :
• Soit amplifier les très faibles différences de contrastes qui existent entre les
différentes régions de la cellule, en recourant à des montages optiques qui utilisent la
nature ondulatoire de la lumière (cas du microscope à contraste de phase).
• Ou créer artificiellement des contrastes au niveau de certaines structures cellulaires en
réalisant des colorations. On exploite alors des combinaisons entre certains
constituants biochimiques cellulaires et des produits absorbant certaines longueurs
d'onde de la lumière (colorants).
2.2.Méthodes d'études par microscopie électronique
Dans un microscope électronique les électrons se déplacent à l'intérieur d'une enceinte où
règne un vide poussé, de l'ordre de 10-5 mm de mercure. Cette nécessité fait que seules des
substances non volatiles peuvent être observées sous cette faible pression.
D'autre part, les spécimens sont soumis à un bombardement d'électrons, dont le premier
effet est d'élever leur température. Il faut donc que les échantillons résistent à cet
échauffement sous vide. De ce fait l’observation par le ME doit se faire sur des cellules
mortes.
Le pouvoir de pénétration des électrons est très faible, or l'image est formée par les
électrons qui traversent l'échantillon. Donc, l'épaisseur des échantillons ne doit pas dépasser le
dixième de micromètre pour profiter au mieux du pouvoir séparateur de l'appareil.

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 -

Figure 06 : les différentes étapes de la préparation de la coupe

2.3.La Coloration
Elle est réalisée sur lames et accentue les contrastes pour mieux reconnaître les
différents éléments de la préparation.
Qu’est-ce qu’un colorant ?
Un colorant est unemolécule qui a la propriété d'absorber certaines longueurs d'onde de la
lumière et de conférer une couleur au composant qui l'a lié.
Les colorants sont en solution aqueuse, de ce fait, les coupes doivent d'abord subir une
réhydratation pour enlever la substance d'inclusion. Celle-ci est effectuée après
déparaffinagedes coupes (par la chaleur et des bains de toluène) en immergeant les lames dans
desbains d'alcool de degré décroissant puis dans l'eau distillée. Puis on procède à la coloration
à l'aide du ou des colorants, avec une étape de rinçage entre chaque étape de coloration.
La coloration peut être
→ simple = utilisation d'un colorant unique pour contraster
→ combinée = utilise plusieurs colorants

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 → progressive = on arrête la coloration au bout d'un temps précis, mis au point pour que
la coloration soit optimale
→ régressive = on surcolore et on enlève ensuite l'excès du colorant au moyen d'un
différenciateur = solvant du colorant utilisé
Les colorations les plus fréquemment utilisées associent deux ou trois colorants différents :
- l'Hématoxyline-Eosine (H.E.) associe l'hématéine qui colore les noyaux en violet
et l'éosine qui colore les cytoplasmes en rose ;
- les colorations trichromiques usuelles sont l'Hématéine-Eosine-Safran (H.E.S.)
par ajout de safran colorant en jaune les fibres de collagène,
- et le trichrome de Masson qui associe un colorant nucléaire (hématoxyline), un
colorant cytoplasmique et un colorant bleu ou vert colorant les fibres de collagène.
De nombreusescolorations spéciales (dites signalétiques) permettent de visualiser
différentes structuresou composants des tissus (par exemple, les fibres de réticuline par des
colorationsargentiques ou les fibres élastiques par l'orcéine : colorant rouge-violet).
Anoter que pour la préparation destinée à l’observation au microscope électronique la
coloration est plutôt une imprégnation (il n’y a que le noir et le blanc en microscopie
électronique) par des sels de métaux lourds, comme les sels de plomb ou d’uranyle, qui
augmente le contraste des structures cellulaires.
Les coupes ainsi colorées sont montées entre lame et lamelle avec unerésine
synthétique dont l'indice de réfraction est voisin de celui du verreet on observe au microscope.
6.3. : TECHNIQUES DE COLORATION Le microscope électronique convient tout autant pour l’étude de
très petites particules, comme les virus, les ribosomes, éléments de cytosquelette et complexes
protéiques. On peut également mettre en évidence la forme des protéines et acides nucléiques
individuels au microscope pour autant qu’ont leur donne un contraste suffisant. Un des meilleurs
moyens de rendre ces substances visibles est l’utilisation de techniques de coloration négative. Il y a
également une autre technique largement utilisée pour rendre visible de très petites particules
isolées est leur ombrage.
A : LA COLORATION NEGATIVE Les échantillons minces (de quelques nanomètres à quelques
dizaines de nanomètres d'épaisseur) sont adsorbés sur une grille métallique recouverte d'un film de
carbone fin (quelques nanomètres). Ce sont typiquement des complexes protéiques ou des virus. On
forme un dépôt de métal lourd sur toute la surface de la grille sauf aux endroits où se trouvent les
particules. Par conséquent, la structure de l’objet se distingue par sa clarté relative sur l’écran
fluorescent .Dans cette technique, on place une goutte de colorant (acétate d’uranyle ou
phosphotungstate de potassium) sur une grille qui porte les particules à étudier et on laisse

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s’évaporer la plus grande partie de la goutte. A cause de la tension superficielle, le colorant a
tendance à envelopper la particule sur le filme qui le supporte et pénètre dans toutes les irrégularités
qui s’ouvrent à la surface de la particule. Le reste de la particule recueille peu de colorant .De par sa
forte masse atomique, le contrastant dévie les électrons dans le diaphragme objectif. Ainsi
l'échantillon biologique apparaît plus clair que ce qui l'entoure, d'où le nom de coloration négative.
L'échantillon apparaît blanc sur un fond sombre sur les photographies.
B : L’OMBRAGE Une autre technique largement utilisée pour rendre visible de très petites
particules isolées est leur ombrage. Les grilles sont placées dans un espace fermé, où l’on fait le vide.
Dans la chambre se trouve un filament composé d’un métal lourd (généralement le platine) avec du
carbone. Le filament est porté à haute température, ce qui provoque son évaporation et le dépôt
d’un revêtement métallique sur toutes les surfaces accessibles dans la chambre. Le métal se dépose
donc sur les surfaces qui font face au filament, tan disque les surfaces opposées de l’objet et les
parties du support qui sont dans l’ombre restent non revêtues et incapable de diffracter les
électrons. Par conséquent, les zones qui sont dans l’ombre sont éclairées sur l’écran, alors que les
régions couvertes de métal sont foncées. Cette relation est inversée sur la plaque photographique,
qui est le négatif de l’image. Par conséquent, on représente les préparations ombrées en imprimant
une image négative dans laquelle la particule parait éclairée par une vive lumière blanche
(correspondant à la surface revêtue), avec une ombre foncée produite par la particule. Cette
technique donne un très bon contraste pour un matériel isolé et produit une impression d’image en
trois dimensions (3D)

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