1ere année SNV / Biologie cellulaire Méthodes d’étude microscopique de la cellule

Chapitres I :
Méthodes d’étude microscopique de la cellule

Introduction

L’étude de la cellule commence d’abord par l’observation. La Cellule, matériel

biologique, ne peut être vu à l’œil nu, étant donné sa taille, qui est de l’ordre du micromètre (1
micron = 10-6 m). L’observation est possible que grâce à un instrument capable d’agrandir
l’image de la cellule : il s’agit du Microscope. Il existe deux types de Microscope pour
étudier la cellule : Le Microscope Photonique (ou Optique) et le Microscope Electronique.
La puissance d’un microscope se mesure par son pouvoir séparateur (PS) ou pouvoir
de résolution qui correspond à la capacité de distinguer des détails.
La résolution ou le pouvoir séparateur (PS) est définie comme étant la distance
minimale séparant deux points individualisables. Chez l’homme le PS est de 0,1 mm à une
distance de 25 cm. L’œil humain ne peut distinguer à 25cm que deux objets distants l’un de
l’autre que de 0,1 mm. Au-delà l’image des 02 objets sera unique ou nulle.
Le PS du microscope optique est de 0,2 μm alors que celui du microscope électronique
est del’ordre de A° (0.8).
1. Microscope Photonique (Figure 1)
Historique
Hooke, en 1650 observe un morceau de liège sous microscope, il voit alors des cavités qu’il
baptisa cells (cellules). A partir de cette date, de plus en plus de matériel biologique fut observé, et
grâce au progrès des sciences, les microscopes photoniques permettaient des grossissements de
plus en plus importants.
Fonctionnement
Le microscope photonique fonctionne grâce aux particules de lumière (photons), traversant
deux types de lentilles de verre (Oculaire & Objectifs), permettant ainsi, le grossissement de
l’image.
L’Oculaire : Joue le rôle d’une loupe et permet un grossissement (x10).
L’Objectif : Constitué de plusieurs lentilles, chacune permettant un grossissement différent
(x4, x10, x40, x100).
L’oculaire et l’objectif sont séparés par le Tube Optique. Le grossissement de l’image est
établit à partir du produit des grossissements de l’oculaire et de l’objectif.
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Il existe plusieurs types de microscopes photoniques : le microscope à fond blanc, microscope à

fond noir, microscope à fluorescence, le microscope à contraste de phase…. (Voir document
annexe : Image : 1, 2, 3, 4, 5 et 6).

Figure 1: Microscope optique

2. Microscope Electronique (Figure 2)

Historique
Jusqu’au début du XXième siècle, les microscopes optiques restaient limités, car ne
pouvant dépasser un certain grossissement. (Ce qui est observable par le MO : Les tissus, la
formes des cellules, le noyau & les chromosomes en interphase). A partir de 1930, avec
l’avènement de la physique atomique, les premiers microscopes électroniques ont vu le jour. Il
existe deux types de microscopes électroniques : Le Microscope électronique à transmission
(M.E.T) (Voir document annexe : Image : 7, 8 et 9) le Microscope électronique à balayage
(M.E.B) (Voir document annexe : Image : 10, 11 et 12 ), permettant d’obtenir des images en
relief (3D).
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Figure 2 : Microscope électronique

Fonctionnement

Le microscope électronique utilise un faisceau de particules d’électrons pour

illuminer l’échantillon et en créer une image très grande, de l’ordre de l’Angstrom
(soit des grossissements de l’ordre de x 500.000).

Les électrons sont émis par un canon (une cathode) puis sont accélérés par une
anode.

Le faisceau est concentré par des lentilles électromagnétiques qui traverse (ou
pas) la structure de l’échantillon.

Des capteurs permettent l’obtention d’une image électronique agrandie sur un écran
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 Avantage et inconvénients des Microscopes (optique et électronique)

3. Méthodes d’étude de la cellule : De l’échantillon biologique jusqu’à l’observation

Pour observer le matériel biologique en microscopie, des procédés préparatoires de

l’échantillon sont nécessaires. Ces étapes différent légèrement selon qu’on utilise un microscope
photonique ou électronique.

La technique de coupes se réalise selon les étapes suivantes (Figure 3) :

1 – Prélèvement : de l’échantillon biologique à partir du vivant.

2 – Fixation : Technique nécessaire pour éviter le dépérissement de l’échantillon, de le

maintenir dans un état aussi proche que possible de l’état vivant. Elle se fait grâce à des
fixateurs. Formol, acide acétique (pour la microscopie photonique), Glutaraldéhyde et
tétroxyde d’osmium (pour la microscopie électronique).

3 – Déshydratation : se réalise par des passages successifs dans des bains d’alcool à degrés
croissants (70°,95° puis 100°, puis Toluène).

4 – Imprégnation : remplacement progressive du solvant par le milieu d’inclusion (paraffine,

en MP, ou dans une résine telle que l’araldite en ME).
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5 – Inclusion : l’échantillon est enrobé dans le milieu d’inclusion de façon à obtenir un bloc
(en MP) ou une gélule (en ME).

6 – Coupe : s’effectue grâce à une lame de verre Le Microtome (en MP) qui permet des
coupes d’une épaisseur de 2 à 10 μ (Voir document annexe : Image : 13). En
microscopie électronique, on utilise l’Ultra microtome qui permet d’obtenir des coupes
ultrafines d’une épaisseur de 300 à 600 Angstrom.

7 – Etalement et collage des coupes : Les coupes sont récupérées sur des lames de verre (en
MP) ou des grilles métalliques résistantes au passage d’électrons (ME). Le déparaffinage
est nécessaire pour la MP est son principe est l’inverse de celui de la déshydratation.

8 – Coloration : L’échantillon biologique étant souvent transparent (faiblesse de contraste),

il est nécessaire de colorer les coupes. Ceci est possible grâce à l’utilisation de teintures
ou colorants d’origine naturelle ou chimique (Rouge Congo, Vert de Méthyle,…etc.).
Les colorants utilisés dépendent du but de la manipulation. Plusieurs colorants sont
parfois utilisés en mélange pour une meilleure visualisation. En Microscopie électronique,
on utilise des contrastants tels que les sels de métaux lourds opaques aux électrons
(Citrates de plomb, nitrates d’argent…etc.).

9 – Montage : en microscopie photonique, elle se fait entre lame et lamelle de verre et

sur une grille métallique pour la microscopie électronique.

10 – Observation : en plaçant l’œil sur l’objectif et effectuant une mise au point par
rapport à l’objectif choisi (en MO). En microscopie électronique, l’image
recueillie sur l’écran fait apparaitre des zones claires (zones transmissibles aux
électrons) et des zones sombres (structures opaques aux électrons).
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Figure 3 : Technique de préparation de coupes pour le microscope photonique

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4- Techniques d’isolement des organites

Les organites cellulaires ainsi que leurs macromolécules peuvent être séparés pour
permettre leur étude (composition, métabolisme,…etc). Le principe permettant la séparation
des structures cellulaires s’appelle la centrifugation. Sachant que chaque organite possède sa
propre taille, sa propre densité et sa propre forme, chaque organite, donc, possède sa propre
vitesse de sédimentation.
L’appareil permettant d’effectuer la centrifugation est la centrifugeuse (ou
l’ultracentrifugeuse) (Image 14) munie d’un moteur électrique permettant de faire tourner
plusieurs tubes à essais à grande vitesse jusqu’à 100.000 tours/minute.

Image 14 : Centrifugeuse

La technique d’isolement des organites est possible grâce à deux étapes principales :

Fractionnement cellulaire (Homogénéisation)

L’échantillon biologique est placé dans un tube à essais dans une solution
isotonique (Saccharose pour les fragments de foie, solution saline à 9‰,…etc).
Fractionnement suite à un traitement mécanique (un piston tournant ou vertical),
Le traitement peut être également chimique (acide ou base) ou physique
(ultrasons).
Obtention d’un homogénat suite au déchirement des membranes plasmiques et de
la libération du contenu cellulaire dans la solution.

Ultracentrifugation différentielle (Figure 4)

L’homogénat contenu dans le tube à essais est soumis à une centrifugation (10
minutes à 1000xg). Le résultat obtenu est l’apparition d’un culot (représentant les
organites les plus denses) au fond du tube et d’un surnagent au-dessus (représentant
les organites les moins denses).
Le surnagent est récupéré dans un nouveau tube à essais et est soumis à son tour à une
centrifugation (15 minutes à 10000xg). Le résultat obtenu est l’apparition d’un culot et
d’un surnagent, qui est récupéré dans un nouveau tube à essais pour y subir une
nouvelle centrifugation…etc. Cette action est répétée jusqu'à obtenir la fraction qui
nous intéresse.
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Figure 4 : Fractionnement cellulaire par ultracentrifugation différentielle

5. Autres techniques d’étude de la Cellule

Technique des répliques (Figure 5 et Image 15) :

Applicable surtout au MEB, car les images obtenues sont en relief (3D). Cette technique
s’effectue en 3 étapes :

La Congélation : processus de fixation très rapide pratiqué dans l’azote liquide (-

200°C). Le but étant d’assurer la bonne conservation de l’ensemble des organites
cellulaires.
La Cryofracture : se réalise grâce à une lame métallique portée à la surface de
l’échantillon ; ce dernier étant surgelé devient très cassant.

 Le Décapage : se fait par sublimation (passage direct de l’état solide à l’état

gazeux) et permet à la surface glacée d’être enlevée.
 L’Ombrage : permet d’obtenir un moulage de la surface de la fracture. Se
fait grâce à une vaporisation en deux temps :
- 1ère vaporisation verticale d’une mince couche de carbone. C’est
la réplique carbonée.
- 2ème vaporisation oblique de platine. Permet de faire ressortir les
détails superficiels en créant un effet d’ombre.
La Réplique : obtenue par dissolution du support organique à l’aide d’un acide
(sulfurique ou chlorhydrique).
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Figure 5 : Préparation de répliques de cryofracture pour l’observation au microscope électronique

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Image 15 : Image obtenue au microscope électronique à balayage

(MEB) d'une enveloppe nucléaire de cellules musculaires de rat après
cryofracture et cryodécapage. x 200 000.

Techniques de Coloration

Plusieurs techniques de coloration peuvent être utilisées pour l’observation en

microscopie :

Coloration Positive (rappel)

Elle s’effectue grâce aux colorants naturels ou chimiques (en MO) et aux contrastants en
ME (sels de métaux lourds). Les cellules sont directement colorées par des colorants
spécifiques (ou pas).

Coloration Négative (Figure 6 et Image 16)

La coloration dans ce cas est indirecte, on met en évidence les contours des structures à
observer. Elle permet une mise en évidence de fins détails macromoléculaires (Virus, Sous-
unités ribosomales,…etc.) (Image et se fait suivant les étapes :

Les échantillons sont isolés par Ultracentrifugation.

Mis en suspension dans une solution opaque aux électrons (acide phosphotungstique).
Une goutte de cette suspension est déposée sur le porte objet. L’eau s’évapore par
séchage, puis la substance opaque aux électrons se dépose autour de l’échantillon.
A l’observation au MET, l’objet apparait clair sur fond sombre. Ainsi, c’est le pourtour
de l’échantillon qui est contrasté et non l’objet lui-même. (D’où coloration négative !)
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Figure 6 : Principe de la technique de Coloration négative.

Image 16 : Particules de rotavirus* en microscope

électronique en coloration négative au
grossissement × 198 000.

*Le rotavirus est un virus qui cause la

gastroentérite. Il existe plusieurs souches de
rotavirus. La gastroentérite est une inflammation
des parois de l'estomac et de l'intestin.
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L’ombrage (Figure 7 et 8)

Comme la coloration négative, cette technique s’applique aux macromolécules isolées.

Elle consiste à vaporiser sous vide des métaux qui viennent se déposer à la surface de la
préparation. Si la direction des vapeurs métalliques émises fait un angle faible avec le plan de
la préparation, chaque objet forme un obstacle au dépôt métallique. On obtient alors un effet
d’ombre sur la membrane support.

Figure 7 : Principe de la technique de l’ombrage.

Figure 8 : Une portion de cellule observée au MET après cryofracture

et ombrage métallique
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La technique d’Autoradiographie (Figure 9)

Cette technique permet de localiser un composé et de suivre son cheminement à travers

la cellule grâce à l’utilisation d’un traceur, qui est un métabolite renfermant un atome
radioactif (C14 ou H3). Ces isotopes émettent un rayonnement pouvant être révélé par un
procédé spécifique :

L’isotope radioactif est injecté au matériel biologique vivant.

Quelques jours après, le matériel biologique est sacrifié, et l’on extrait

l’échantillonconcerné par le métabolisme de la molécule étudiée.

On recouvre les coupes d’une émulsion photographique préparée à base de sels

d’argent (en MP) ou d’or colloïdal (en ME).

Les coupes sont conservées afin de permettre l’impression de l’émulsion par les émissions
radioactives

On procède à la révélation de l’émulsion, puis à sa fixation.

A l’observation, la molécule recherchée est révélée sous forme de taches noires

localisées dans les structures cellulaires ayant incorporé les atomes radioactifs.
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Figure 9 : Principe de la technique d’autoradiographie.

Isotope radioactif